PT87858B

PT87858B - Processo para a modificacao quimica de protidos

Info

Publication number: PT87858B
Application number: PT87858A
Authority: PT
Inventors: Guy Levesque; Jerome Souppe; Jean-Louis Seris; Valerie Bellenger
Original assignee: Elf Aquitaine
Priority date: 1987-06-30
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1992-10-30
Also published as: CA1331571C; NO882836L; DK359788A; JP2722205B2; ES2056946T3; DE3881774D1; EP0300849A1; PT87858A; EP0300849B1; NO882836D0; GR890300105T1; JPS6467185A; DE3881774T2; DK359788D0; NO302184B1; US4870016A

Description

PROCESSO PARA A MODIFICAÇÃO QUTMICA DE PRflTIDOS¹¹

A presente invenção diz respeito a um novo processo para a modificação química de protidos. Compreende uma reacção que permite fixar a molécula do protido um ou vários grupos orgânicos, susceptíveis de modificar as propriedades físico-químicas deste protido.

A presente invenção visa, particularmente, a modificação de proteínas e, em particular, de enzimas. Uma aplicação importante da presente invenção reside na modificação da solubilidade de peptidos ou proteínas e, especialmente, no facto de tornar eni zimas solúveis em dissolventes orgânicos.

A presente invenção compreende, igualmente os protidos com portando grupos orgânicos, modificadores das suas propriedades fí sico-químicas. Visa em particular os enzimas tornados solúveis em dissolventes orgânicos, pela fixação dos referidos grupos.

A modificação mais ou menos das propriedades de uma proteí na por acção de um reagente químico e conhecida. No caso de enzi_ mas, esta tem geralmente por objectivo modificar as suas propriedades físicas, tais como a solubilidade, a mobilidade, quer dizer a massa molecular, a estabilidade, etc. Procura-se igualmente , por este meio, tornar possível a utilização destes catalisadores notáveis em condições menos drásticas do que as que exige o enzima nativo, particularmente o pH, a temperatura, a força iónica , a resistência aos inibidores, etc. Outros objectivos residem na modificação das propriedades catalíticas, ou seja no alargamento

do leque de substratos justificáveis do enzima dado, ou então - pelo contrário - na orientação da actividade catalítica no sejn tido de uma maior especificidade; pode-se tratar por exemplo de tornar uma protease mais específica de uma certa ligação peptídj_ ca, se ela hidrolisa, no estado nativo, um largo espectro de pejo tidos ou da utilização de enzimas em meio não aquoso ou fracamein te concentrado em ãgua que e susceptível de inverter o sentido das reacções nas quais a ãgua intervém.

A maior parte dos processos conhecidos para a modificação química de proteínas consiste na utilização de compostos específicos, capazes de reagir com grupos funcionais , suportados pelos resíduos dos aminoácidos naturais da cadeia peptídica ou pela par te glucídica ou nucleica de glieoproteínas ou de nucleoproteínas.

Assim, utilizou-se muito correntemente o poder nucleofíl^ co do grupo E-NH^ dos resíduos de lisina sobre reagentes electrofílicos activados.Os reagentes mais frequentemente utilizados na técnica anterior, são os anidridos de ácidos e o ãcido trinitro-benzeno-sulfÕnico. Os enzimas, modificados por estes processos conhecidos, têm em geral uma actividade sensivelmente diminuída.

A escolha dos reagentes e muito limitada, visto muitos dos eventuais reagentes alterarem muito a actividade do enzima, ou então exigem condições de realização incompatíveis com a conservação da actividade catalítica ou reagem com outros aminoácidos essenciais a manutenção da estrutura activa do enzima.

Daqui resulta, que dado o interesse da modificação apropriada de prõtidos, em particular de enzimas, a necessidade de reagentes adequados se continua a fazer sentir.

A presente invenção proporciona neste domínio um progres/

-3- / so sensível; aplica-se a uma classe de compostos que têm a propriedade de reagir facilmente com restos aminados de protidos p_a ra fixar sobre estes qualquer grupo orgânico determinado, sem di_ minuir ou diminuindo relativamente pouco a actividade catalítica, quando o prõtido e um enzima, e tornando-o solúvel em um dissolvente orgânico.

processo de acordo com a presente invenção caracteriza-se pelo facto de se fazer reagir o prõtido dado com um acido , sal ou ester ditioico em que o resto do ãcido comporta o grupo orgânico que se deseja fixar ao prõtido, enquanto o resto da molécula tem uma estrutura de grupo que parte.

Õster, o ãcido ou sal ditioico utilizado pode ser repr£ sentado pela formula geral

R-C-S-X ll (1) na qual R representa o grupo orgânico a fixar, por intermédio do grupo C=S, sobre o prõtido, enquanto X representa um atomo de hidrogénio ou um catião ou um grupo escolhido de tal maneira que o grupo de formula geral X - S seja um bom grupo que parte.

Designando pelo símbolo E a molécula deste último, pode-se, esquematizar como se segue a reacção de acordo com a preseri te invenção:

ll

NH-C-R ll

Assim, sendo o grupo de formula geral HSX eliminado, a mo (2) f *

-4-/ lécula de prÓtido é modificada mediante fixação de um ou de vã-

Este grupo modificador ê escolhido, naturalmente, de acor do com as novas propriedades que se pretenda fazer adquirir ao prÓtido, por exemplo solubilidade em hidrocarbonetos, reactivida de com bases, resistência ao calor, etc. Pode então compreender um símbolo R que representa um radical hidrocarbonado, alifático ou arTlico, portanto hidrofobo, em particular alquilo C^-C₂O ou alquenilo C₂-C₂₀, fenilo, fenilenilo, naftilo ou naftileno, ou então um alquilarilo ou aril-alquilo correspondente, podendo o símbolo R representar, igualmente, um grupo orgânico hidrófilo , polar, negativo, positivo ou neutro: pode, por exemplo, comportar um grupo carboxilo, hidroxi, halogéneo, sulfinilo, sulfonilo , fosforilo, fosfonilo, sulfidrilo, amida, amonio, fosfõnio, etc.

De acordo com uma forma de execução particular, o símbolo R representa uma cadeia polimerica ou oligomerica, por exemplo , de polietileno, polipropileno,poliacrílica, polieti1enoglicol ou semelhante.

Alem disso, o símbolo R pode representar um grupo constituído, sÓ por si, por um resto de ditioéster de fórmula geral

Y-S-C-R na qual R' representa um grupo hidrocarbonado divalente , particularmente alquileno, cicloalqui1eno, arileno ou alqui 1 -a ri 1 eno , comportando o primeiro, de preferencia, entre 1 e 20 átomos de carbono, e os outros entre 6 e 16.

símbolo Y representa um grupo do mesmo tipo que X mas não forçosamente idêntico a este. Nesta variante, o reagente é / * um bis-ditioéster de formula geral

Y-S-C-R¹-C-S-X ................. (3)

S S

A utilização de um bis-di tioéster permite formar um prÓti_ do modificado, especial, portador de uma cadeia polimerica , em particular poliacrílica, de álcool polivinílico , polialquileno-glicol ou outro oligomero ou polímero susceptível de ser aminado pelo menos no fim da cadeia. Designando por Q-Nl·^ um tal polímero aminado, pode-se combiná-lo com o bi s-di ti oéster mediante uma reacção.

Q-NH₀ + Y-S-C-R'-C-S-X-^-—> —> Q-NH-C-R'-C-S-X . . . (4) ² II l| >à. II II

S S HSY S S

Fazendo reagir em seguida o composto de Q obtido em (4) com um prÕtido de fórmula geral(e)-NH₂, obtém-se

Q-NH-C-R'-C-NH — © .............. (5) ii ii s s ou seja uma bis-tioamida em vez do polímero Q e do prótido E.

A título de ilustração não limitativa, dã-se a seguir as fórmulas de alguns dos ditioésteres e bis-ditioésteres utilizáveis no processo de acordo com a presente invenção.

ⁿ“^Cl2^H25^CS2“^CH2“^C00H hooc-ch₂-s-ch₂ch₂-cs₂-c₂h₅ /-\ ^C2^H5°\ <o y~ CS₂-CH₂-C00H ^P-CK₂-CS₂-C₂H₅ \' c₂H₅o 0

/ ( ·*

NHCOCH hooc-ch₂-s-c—

ⁿ“^C12^H25^CS2^_CH2^CH c-s-ch₂-cooh

COOH nhcoch₃

COOH

H00C-CH₂-S-C-(CH₂)g-C-S-CH₂-C00H

II II s s

Consoante a natureza do protido a tratar e a do ditioestes utilizado, o processo de acordo com a preente invenção realiza-se em solução aquosa, orgânica ou hidro-orgânica, geralmente a uma temperatura compreendida entre 0° e 70°C. No caso dos enzimas as temperaturas preferidas estão compreendi das entre 10° e 50°C e sobretudo entre 20° e 45°C.

-7As proporções dos reagentes são calculados a partir do nú mero de grupos -NH- ou -NH2- do protido que se pretende combinar com 0 ditioéster. £ em geral conveniente utilizar um excesso de funções ditioésteres por grupo -NH ou -NH₂ livre do propósito sobre 0 qual se pretende fixar 0 grupo modificador. 0 meio reaccio nal pode eventualmente ser heterogéneo, podendo por exemplo ser constituído por uma dispersão do produto em uma solução orgânica do ditioéster; é em particular 0 caso em que a reacção de acordo com a presente invenção solubiliza 0 prototido no dissolvente orgânico do ditioéster; assim, 0 protido, antes de sofrer a reacção, passa para solução neste dissolvente.

De acordo com uma variante, os símbolos X e/ou Y, semelhari tes ou diferentes, representam uma parte hidrocarbonada de formula geral (CH₂)_n na qual n representa um número compreendido entre 1 e 6, comportando uma função halogéneo, carboxilo, sulfínica , sulfonica, fosforosa, fosfonosa, fosfórica, fosfonica, H activo,

SH, amida ou hidroxi.

Um protido de acordo com a presente invenção , em particular protease ou peroxidase, solúvel em benzeno, tolueno, éter , etanol, clorofórmio ou/e dimeti1-sulfõxido, compreende vãrios mo tivos lisina que comportam, por intermédio de um grupo -C=$- , um grupo representado pelo símbolo R 0 qual é constituído por um radical alifático ^C1^-C2O’ arílico Cg“C-|g ou uma cadeia polimérica, em particular de polieti1eno-glicol.

Quando 0 símbolo X, na formula geral 1, representa um ãt£ mo de hidrogénio, ou seja que 0 composto ditioico é um ditioãcido de formula geral R-CSSH, 0 símbolo R pode representar um dos radi_ cais definidos antes. Convém particularmente bem para a realiza^

-8τ,.

ção do processo de acordo com a presente invenção os ácidos de formula geral R-CSSH e seus sais de amina ou de amonio quaternã rio, em que o símbolo R representa um grupo alquilo ^C4^C18’ como por exemplo n-C^Hg ou ^n-CnH₂₃-, fenilo ou tolilo -C^Hg, CHg-CgH^, etc.

Os sais de ãcidos ditioicos apropriados para o processo de acordo com a presente invenção, tem um catião proveniente de uma base fraca. A base fraca, em que o sal de ditioacido de for mula geral R-CSS-X e utilizável de acordo com a presente invenção pode ser por exemplo amoníaco, hidrazina, hidroxilamina, piperidi_ na, amina, di- ou tri-amina, primaria, secundaria ou terciária , piridina, tetra-alqui1-amonio, di- ou tri-alquilo respectivamente di- ou mono-ari 1-amcini o, hidróxido de Zn, Al , Mn, Pb, etc., e - de um modo geral - uma base em que a constante de dissociação ionica na agua, a temperatura ordinária, estã de preferencia compreendida entre 10^θ e 10^ e sobretudo entre 10^ e 10^. Assim, pode-se utilizar, a títulos de exemplos não limitativos, sais em que o símbolo X representa um catião de amonio, de tetra-amÕnio, feni1-trieti1-amonio, trimeti1-hexadeci1-amonio, mono-etanolamina, di-etanolamina, dipropi1amina, di-isopropi1amina, piperazina, tri-isobuti1-amina, trietilamina, benzilamina, feni1-eti1-aminas , etc.

enxerto de acordo com a presente invenção efectua-se mediante contacto do protido escolhido com o composto ditioico, no seio de uma solução tampão de pH apropriado. E vantajoso utilizar um grande excesso deste composto em relação ao protido, de preferência entre 10 e 100 equivalentes de composto de formula geral R-C-S-S-X por um grupo NH₂ disponível no protido. Este excesso e 1 i_ mina-se da solução final, especialmente mediante diálise. Convêm i

-9prolongar este contacto durante algumas horas, a maior parte das vezes e de acordo com a temperatura e a natureza dos reagentes em presença, durante 1 a 20 horas, não sendo esta indicação de modo nenhum limitativa. Como é evidente, deve-se ter em conta a estabilidade do prõtido nas condições de realização da operação, para não prolongar a reacção para além do tempo de estabilidade do composto.

De um modo geral, o processo de acordo com a presente invenção pode realizar-se em meios de pH compreendido entre 3 e

11,5 e, sobretudo, entre 4 e 9. Contudo, existem domínios prefe ridos, consoante a natureza do protido tratado e a do compostos ditiõico utilizado. Assim, é recomendável proceder com um pH i_n ferior a 7, quando se trabalha com prõtidos que suportam mal o meio alqalino. Por outro lado, obtem-se bons resultados com compostos ditioicos de formula geral R-CSSX constituídos por um diti£ éster quando o pH esta compreendido entre 7 e 11,5 e sobretudo entre 8 e 11 . Pelo contrãrio, quando o símbolo X representa um ãtomo de hidrogénio ou um catião de base fraca, os pH preferidos estão compreendidos entre 3 e 7, ou melhor entre 3,5 e 6,5 com , em geral, um valor Óptimo compreendido entre 4 e 6.

Os exemplos que se seguem descrevem, sem qualquer limitação, detalhes da realização pratica do processo de acordo com a presente invenção.

EXEMPLO 1

As operações aqui descritas servem para mostrar (I) que é possível preparar um ditioester a partir de um outro, por simples troca de nucleÓfugo e - em seguida - (II) como o grupo —NH^ de um aminoácido reage com um ditioéster.

I. Preparação de S-ditiobenzoí1-N-aceti1-cisteína (DTAC).

A 1,632 g de N-aceti1-cisteTna e 2,123 g de ácido tiobenzoíl -mercapto-aceti co (ou ditiobenzoato de carboximetilo), dissolvidos em 50 ml de etanol, adiciona-se 2 ml de uma solução aqu£ sa de hidróxido de sódio M. Agita-se a mistura reaccional a 20°C, durante 2 horas e concentra-se em seguida, mediante evaporação do etanol, e acidifica-se com ácido clorídrico 6N.

Mediante cromatografia sobre sílica, tendo como eluente uma mistura de hexano/clorofÕrmio, isola-se 2,45 g de S-tiobenzoíl-N-aceti1-cisteína, o que representa um rendimento de 86,5%, em relação'a aceti 1-cisteína inicial, da reacção:

S

~h|s-ch₂-CH-COOH

Acido tiobenzoíl -mercaptoaceti co

Aceti1-ci steína

-c-s-ch₂ch-cooh

II

HS-CH₂C00H

NH.Ac

S-di tiobenzoíl-N-aceti1 -cisteína (DTAC)

Acido mercapto -aceti co

-η

11. Preparação da Ν-tiobenzoíl-I isina a partir de di ti obenzof 1 -aceti1-cisteTna (DTAC)

Dissolve-se 0,425 g ou seja 1,5 mmoles, de DTAC, preparada de acordo com o processo descrito em I, e 0,220 g de lisina, igualmente 1,5 mmoles, em 10 ml de uma solução aquosa de hidroxi_ do de sodio 0,25N. A solubi1ização da mistura e facilitada por adição de uma gota de etanol. Apos 5 horas de reacção ã tempe ratura ambiente, acidifica-se o meio reaccional e liberta-se a N-tiobenzoTl-1i si na.

- c-)s-ck₉ch-cooh + '9 Ί

NH.Ac

-ch₂ch₂ch₂ch₂ch-cooh

Lisina

NH,

DTAC

EXEMPLO 2

Modificação da peroxidase de rábano silvestre com acido tridecil-tiomercaptoacetico C-j ₂H₂₅C-S-CHg-COOH(quer dizer carboximeti lo)

Em 3 ml de tampão de fosfato O,1M (pH=8,5) dissolvem-se 6 mg de peroxidase de rábano silvestre comercial (Sigma tipo II), ou seja 0,15 yjmole (apos absorção a 402 nm com m=102 mM .cm ) e 1,6 mg de acido trideci1-tiomercaptoacético, ou seja 5 jjmoles (previamente dissolvidas em 0,1 ml de etanol). Agita-se a mist£

ΎΖ

-12ra reaccional durante 18 horas a temperatura ambiente. Dialisa-se, em seguida, a solução durante 18 horas a 4°C contra agua destilada e liofilisa-se depois. Analisa-se o enzima obtido que apresenta as seguintes acracterTsticas.

Espectro UV; aparecimento de uma banda a 277 nm devida as funções tioamida formadas.

Número de lisinas atingidas: as lisinas livres são doseadas de acordo com o método clássico com TNBS (ãcido tri ni trobenzeno-su_l_ fónico), e verificou-se assim que 3 a 4 lisinas foram atingidas.

Solubilidades: Enquanto o enzima nativo só e solúvel novo enzima e solúvel em mais de 5 mg/ml em etanol, tolueno, eter e agua.

em agua, o cl oroformi o,

Actividade especifica: trata-se da actividade medida sobre a oxi dação da ortodianisidina pela ãgua oxigenada. Forma-se um dimero que absorve a 444 nm (com =30 mM - cm ). A actividade especifica obtida e igual a 850 U por mg de proteína, ou seja 97% da actividade especifica do enzima nativo.

Actividade em dissolvente orgânico: a peroxidase de rabano silvestre e conhecida por catalisar a reacção de oxidação da 9-metq xieli pti ci na:

Esta e facilmente reacção e interessante visto que a 9-oxoelipticina reduzida com obtenção da 9-hidroxielipticina por /

ί ’ meio de acido ascõrbico. 0 único inconveniente reside na fraca solubilidade da 9-metoxielipticina em agua. A fraca concentração em substrato, que resulta para o enzima, limita a velocidade da reacção de oxidação.

Portanto, pode-se utilizar esta reacção em eter com a peroxidase modificada de acordo com a presente invenção. Em uma tina de espectofotÕmetro mistura-se 0,5 ml de 9-metoxielipticina 1 mM em éter, 0,5 ml de peroxidase modificada 1 mg/ml em eter , a 50 yil de solução aquosa de ãgua oxigenada 200 mM e completa-se com éter até um volume final de 2 ml. Segue-se então a 20°C a adsorvância a 486 nm, comprimento de onda da absorção da 9-oxo elipticina formada ( & =9,2 mM~\ cm ^). Vários ensaios, efectua_ dos com diferentes quantidades de ãgua oxigenada, permitiram demonstrar que a cinética de oxidação é michaelienne com:

mM

0,25 yumol/mn por mg de 1iofi1isado de peroxidase modificada

EXEMPLO 3

Fixação de grupos tiobenzoicos sobre a papaTna tornando-a solúvel e activa em dimetil-sulfóxido

Em 40 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH=8,5 dissolve-se 0,32 g de papaTna comercial (Sigma Tipo IV) e 100 mg de Scido tiobenzofl-mercapto-acético, previamente dissolvidas em 3 ml de etanol. Deixa-se a mistura reaccional durante 2 horas a 40°C e dialisa-se depois durante 16 horas a 4°C contra agua; liofiliza-/4/ ί

.,.

(

-se depois. Obtem-se deste modo 0,26 g ou seja 81% de rendimento químico. 0 enzima assim obtido apresenta as seguintes característi cas.

Espetro UV : deslocamento da banda de absorção de 278 nm para 280 nm

Numero de lisinas atingidas: 2 das 10 que compreende a papaína.

Solubilidade: solúvel em benzeno, DMSO e agua a razão de 10 mg/ml, enquanto o enzima nativo e insolúvel em benzeno, sendo solúvel somente em água e DMSO.

Actividade amidase: é a da hidrólise, a pH = 7,5 e a 50°C em tampão tris e na presença de cisteína e de EDTA, da N-benzoílo, L-arginina-para-nitroani1ida (ΒΑΡΑ) que liberta a para-nitroani: 8,8 mM .cm ). Enquanto o enzima nativo tem uma actividade de 28 mU por mg de liofilizado, o enzima modificado tem 11 mU por mg de liofilizado, ou seja 32% da actividade inicial, apesar disso, o enzima modificado e muito interessante, visto apresentar uma actividade em dissolvente orgânico; pode-se portanto utilizar em DMSO, na ausência de agua, para a síntese peptídica. 0 DMSO convém particularmente bem para solubilizar numerosos péptidos, mas o enzima nativo não tem qualquer actividade neste dissolvente: pelo contrario, o enzima modificado apresenta uma actividade de 1,2 mU por mg de liofilizado .

EXEMPLO 4

Modificação da papaína por fixação de grupos tiopropionato de etilo sobre a sua molécula

Faz-se reagir, em meio aquoso, o ditioester carboximeti 1 -3-sulfuro-ditiopropionato de etilo de formula C^Hg-S-C-CH^CH^-S-Cl^COOH com a papaína. S

Para isso, mistura-se em 4,5 ml de tampão de fosfato O,1M pH=8,5 , 36 mg de papaTna comercial (Sigma Tipo IV) com 23 mg de ditioester previamente dissolvido em 0,1 ml de etanol. Aquece-se a mistura reaccional ate 40°C durante 2 horas e dialisa-se depois durante 16 horas a 4°C contra tampão de fosfato O,1M pH=7,2. Analisa-se a solução proteica assim obtida e encontra-se:

Espectro UV: deslocamento máximo de absorção de 278 nm para 270 nm.

Numero de lisinas atingidas: 4,5 em 10.

Actividade enzimãtica em agua, perto de 50%.

Os sítios da molécula modificada podem ser representados, de acordo com a formula geral 2, por ©-NH-C-CH_?CH_?-S-CH_?COOH

II s

Este exemplo demonstra que se pode substituir um grupo + -NH por um grupo -COO 0 que permite trocar 0 ponto isoelectrico 3 e 0 domínio Óptimo de pH do enzima modificado.

EXEMPLO 5

Fixação de um polietileno-glicol bis-ditioéster (PEG-ditioéster) sobre a peroxidase de rábano silvestre

Prepara-se um polímero funcionalizado do seguinte modo.Em ml de agua destilada, dissolve-se 0,25 g de PEG 20000 bis-ami

-16/.....X

Ϊ » nado, comercial (Sigma), correspondente a 25yjmoles de funções -NH₂ livres, adiciona-se 0,4 ml de trietilamina e 44 mg de tetra tiooctanodioato de carboximeti1 o, de fórmula

H00C-CH_o-S-C-(CH₉)z--C-S-CH₉-COOH, previamente dissolvido em 0,1 ml 2 ,| 2 o 2

S S de etanol; isto representa 250yjmoles de função ditioéster. Fj_ xa-se o pH a 10,8. Deixa-se sob agitação durante 48 horas a tem peratura ambiente. Dialisa-se , em seguida a solução durante 16 horas a temperatura ambiente contra agua destilada. Obtém-se des^ te modo 13 ml de uma solução de pH=6,6 que se analisa.

espectro de UV permite dosear a 308 nm as funções di ti c -1 -1 ester enxertadas (com <3:12,2 mM .cm ) e a 263 nm as funções tioamida formadas (6: 12,8 mM~\ cm’^). Tendo trabalhado com um excesso de funções ditioesteres, pode-se admitir que jã não se encontram funções -NH₂ livres. Obtem-se então um composto de formula geral

XS-C-(CH₂)₆-C-NH^PE6-NH-C-(CH₂)₆-C-NH?-PEG-NH-C-(CH₂)₆-C-SX s s s s s s

X=CH₂COOH ......(8) a relação das concentrações em função tioamida (1,31 mM) e ditio ester (0,18 mM) permite calcular o grau de polimerização n; esta relação Õ igual a:

2n + 2 r =------2 experimentalmente obtém-se:

,31 = 7,3 ou seja n= 6,3

0,18

Dissolve-se 6 mg de peroxidase de rãbano silvestre comercial (Sigma Tipo II) na solução anteriormente preparada (0,15yim£ le de peroxidase e 2,3^umoles de ditioester) e leva-se o PH a 8,5 por dissolução de Na₂HP0₄ na misqura reaccional. Deixa-se sob agitação durante 18 horas a temperatura ambiente, dialisa-se, depois a solução e liofiliza-se finalmente. 0 enzima assim obtido apresenta as seguintes caracteristicas.

Espetro UV: aparecimento de uma banda a 287 nm devida as funções ti oami da.

Numero de li si nas atingidas: 2

Solubilidade: a enzima e solúvel a mais de 5 mg/ml nos dissolven tes: acetona, cloroformio, dioxano, tolueno, dimetilformamida, ãgua.

Actividade especifica: 780 U por mg de proteínas ou seja 89% da actividade específica do enzima nativo.

Actividade em cloroformio: para a oxidação da 9-metoxielipticina, a actividade é satisfatória. Em uma tina de espectrofotõmetro, mistura-se: 0,5 ml de 9-metoxielipticina 1 mM em clorofórmio ,

0,3 ml de peroxidase modificada a 1 mg/ml em cloroformio, 10 a 40^ul de ãgua oxigenada 200 mM (em solução aquosa) e ajusta-se o volume a 1,5 ml com cloroformio. Para diferentes quantidades de ãgua oxigenada, observa-se uma cinética michaelienne com:

K : 6,25 mM m

: 83 nmoles/minuto por mg de liofi lizado de peroxj.

dase modificada.

·

-18EXEMPLO 6

Modificação da papaína com ajuda de um polietileno-glicol-bis-diti oéster polímero activado foi preparado de acordo com o processo descrito no exemplo 5, mas em condições de maior diluição. Fo_ ram utilizadas as mesmas quantidades de composto em 100 ml de água destilada em vez dos 10 ml no exemplo 5. Obtem-se deste m£ do um polímero mais leve, visto que o doseamento UV conduz a n=0. Esta-se portanto na presença de um composto de formula

H00C-H_?CS-C-(CH₂)_g-C-NH-PEG-NH-C-(CH₂),-C-SH_?C00H...... (9)

II II ll Ij s s s s

Dissolve-se 1,9 mg de papaína comercial (Sigma tipo IV) e mg de Na₂HP0₄, em 23 ml da solução referida antes do polímero funcionalizado. Ajusta-se o volume a 50 ml com agua destilada . Obtém-se um pH igual a 8,5. Aquece-se a solução até 40°C durante 2 horas e dialisa-se depois durante 16 horas a 4°C contra agua destilada. A solução dialisada tem um pH de 6,6 e um volume de 58 ml. ApÕs. liofilização obtem-se 45 mg, ou seja um rendimento químico de 76%. A anãlise do enzima assim modificado dã os seguintes resultados.

Espectro UV: a banda a 278 nm Õ deslocada para 269 nm com um pa tamar a 308 nm mostrando que todas as funções ditioéster não reja gi rara.

Numero de lisinas atingidas: 5 lisinas em 10.

Solubilidade: o enzima é solúvel a 10 mg/ml em clorofórmio, DMSO e agua.

-19- /

Actividade amidase: 1,5 mU por mg de liofilizado ou seja um re_n dimento em actividade:

x 1,5

- = 125%

1,9 x 28

Actividade em DMSO de acordo com o ensaio descrito no exemplo 3: 3,0 mil mg de liofilizado. Prepara-se a solução de substrato em clorofórmio, em uma mistura de 80% de clorofórmio com =0% de DMSO para solubilizar os ingredientes necessários ao ensaio. Encontra-se uma actividade de 4,2 mU por mg de liofilizado. Pelo coji trário, o enzima nativo, em suspensão (visto que ê insolúvel em clorofórmio), em um ensaio idêntico, não fornece qualquer activi_ dade.

Os dois exemplos 5 e 6 demonstram que a modificação com PEG-di tioesteres permite ter boas actividades em clorofórmio, o que proporciona um apreciável progresso técnico.

EXEMPLO 7

Modificação de uma hemoprotefna pelo ácido ditiopentanÕico

A proteína tratada é a peroxidase de rábano silvestre de ponto isoelectrico 7,2.

Em 5 ml de tampão de fosfato 0,2 M pH‘6,0, dissolve-se 25 mg de peroxidase de rãbano silvestre (Sigma Tipo II) e 2 mg de ditioacido puro de formula CH₃(CH₂)3CSSH, 0 que corresponde a concentrações de 0,05 mM de enzima puro por 3 mM de ditioacido.

Deixa-se agitar durante 16 horas a temperatura ambiente. Dialisa-se, em seguida, a solução durante 16 horas contra tampão de citrato 5 mM pH 6,5.

-20-/

Recupera-se em seguida o dialisado e analisa-se:

rendimento químico global e calculado mediante compara ção do numero de moles de hemoproteína (determinada pela absorcom o numero de moles recuperadas após modificação. 0 rendimento é de 100%. De acordo com a actividade, determina-se para cada solução de peroxidase a relação da actividade da solução (em U/ ml) pela concentração em hemoproteína (em nmole/ml) o que cojn duz a actividade específica, em U por nmole de heme.

A actividade enzimática da solução é medida a 30°C em uma tina de plástico cheia com 1,5 ml de tampão de citrato 0,1 M pH 3,5, 20 yil de água oxigenada 0,2 M, 20 jli 1 de o—di ani si di na 13 mM e 20 jj! de solução enzimatica previamente diluída 20 vezes. 0 produto de oxidação da o-dianisidina é seguido a 444 nm com ô : 30 mM \ cm \

No presente exemplo, passa-se de uma actividade específica de 125 U/nmole de heme para o enzima nativo a 67 U/nmole de heme para o enzima modificado ou seja 54% de rendimento: visto que o rendimento químico e de 100%, o rendimento global em actividade é também de 54%. Mas, em compensação, o enzima modifica do apresenta a vantagem de possuir uma actividade ligninase de

1,4 U //jmol de heme, enquanto o enzima nativo não a possui.

número de grupos lisina é determinado pelo método com TNBS (acido trinitrobenzeno-sulfónico): verifica-se que 3 lisinas em cada 6 foram modificadas pelo acido ditiopentanÓico.

/ ζ *

EXEMPLO 8

Modificação da peroxidase de rábano silvestre por um sal do ãcido ditiobenzõico

Em 100 ml de tampão de titrato 0,1 M pH 5,0 dissolve-se

2,6 mg de peroxidase de rãbano silvestre (Sigma Tipo II) e 1,2 mg de ditiobenzoato de tetrameti1amõnio

C,H₅-C-S-NH₂(CK₃)₄ i| s

As concentrações iniciais são assim de 0,26 juM em enzima e 5,3yjM em sal de ditioãcido. Após 2 horas de agitação a tempe ratura ambiente, dialisa-se a solução durante 16 horas, contra tampão de citrato 5 mM pH 6,0.

As analises efectuadas de acordo com o processo descrito no exemplo 1 dão:

- rendimento químico 72%

- rendimento global em actividade 110%

- número de grupos lisina enxertados: 6

Verifica-se que o tratamento de acordo com a presente invenção aumenta a actividade do enzima e que os tiocarboni1 os são fixados sobre todos os grupos lisina presentes.

EXEMPLO 9

Modificação da 1ignina-peroxidase de Phanerochaete Ghrysosporium pelo ãcido ditiopentanõico , de formula CH^(CH?)gCSSH .

A proteína utilizada apresenta um ponto isoeléctrico de

3,9.

A 80 ml de tampão de fosfato 0,2 M pH 6,0 adiciona-se 20 ml de preparação bruta de 1ignina-peroxidase resultante de uma cultura de Phanerochaete chrysosporium (descrita em: TIEN, M. e KIRK, T. K. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8Ί, 2280-2284) e 1 ,5 jul de ditioaciodo puro. As concentrações em hemoproteína e ditioãcido são assim de 0,52 juM e 130 juM respectivamente.

Deixa-se a mistura reaccional sob agitação durante 7 horas a temperatura ordinária e dialisa-se depois durante 40 horas contra tampão bis-tris 1 mM pH 6,0.

As analises são efectuadas de acordo com o processo descrito nos exemplos anteriores 7 e 8:

- rendimento químico, determinado pelas absorvãncias a 404 nm (^: 102 mM \ cnT^), após modificação, 73% em relação ao enzima inicial.

- rendimento global em actividade: 65%; a actividade foi determinada a 30°C em uma tina de plástico contendo 2 ml de tampão de lactato 0,1 M pH 3,0, 0,1 ml de ãgua oxigenada 10 mM,

0,1 ml de álcool veratrílico 12 mM e 0,1 ml de preparação enzimãtica, sendo o aparecimento do aldeído veratrílico

seguido a 310 nm apresentando δ :9,1 mM“\cm~\ A ligeira diminuição da actividade do enzima é compensada pelo facto de a proteína modificada poder ser 1iofilizada, com um rendimento de acti vidade de 23%, enquanto o enzima nativo perde toda a sua activi-23ζ dade por 1iofi1ização. 0 liofilizado do enzima modificado Ó solúvel em clorofórmio e em DMSO.

EXEMPLO 10

Estudo do efeito do pH sobre a modificação da l i gni na-peroxi das e_

Procede-se utilizando o enzima descrito no exemplo 9 e o mesmo acido ditiopentanÓico.

A 80 ml de tampão de citrato-fosfato 0,1 M de pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 ou 6,8 adiciona-se 20 ml de preparação bruta de lignina-peroxidase e 2 jjl de acido di ti opentanÓi co. ApÓs 3 horas e meia

de agitação a temperatura ambiente, nal contra tampão de citrato-fosfato Os resultados em função do pH	dialisa-se a mistura reacci£ 5 mM pH 6,0 durante 18 horas. são dados no quadro seguinte:
PH	Rendimento químico	Rendimento global em
	. %	acti vi dade %
3,0	25	1
4,0	43	60
5,0	70	115
6,0	56	85
6,8	51	45
8,5	90	0
Para	todos os ensaios observa	-se a ausência total de gru-
pos li si na	livres, após modificação	pelo ditioãcido. Parece pojr

tanto que pH 5,0 é Óptimo para esta modificação da 1ignina-pero-

xidase. A este pH a actividade do enzima aumenta pelo enxerto de grupos CHjíCHgJCS-. E impressionante ver que , se se trabalhar com um pH de 8,5, como nos exemplos 2 a 4, o enzima perde a sua actividade com o ditiocomposto aqui utilizado.

EXEMPLO 11

Modificação da papaTna pelo ãcido ditiopentanoico. Efeito do pH ponto isoeléctrico da protease - papaTna ê de 8,8.

Em 4,5 ml de tampão de fosfato 0,1 M pH 6,0, 6,5 ou 8,5 dissolvem-se 36 mg de papaTna (Sigma Tipo IV) e 23 mg de ditioãcido. Aquece-se a mistura reaccional a 40°C durante 2 horas e dialisa-se depois a 40°C durante 16 horas contra agua destilada. Os resultados em função do pH são:

pH Rendimento em actividade Numero de lisinas _ _%___ ati ngi das_

6,0	100	6
6,5	92	3
8,5	113	0

Parece claramente que os pH mais fracos favorecem a rea£ ção de modificação. Por outro lado, este exemplo e importante, visto a papaTna ser um enzima com cisteTna activa visto as actividades não serem praticamente afectadas pela modificação com ditioacido, pode-se concluir que a cisteTna do sTtio activo da protease não é atingida pelo ditioacido nas condições de realiz^ ção, enquanto as lisinas o são:

EXEMPLO 12

Modificação da 1ignina-peroxidase de ¹¹ Phanerochaete Chrysosporium¹¹ por um sal do ãcido ditiobenzoico

A proteína e a utilizada no exemplo 9, de ponto isoelécrj_ co igual a 3,9.

Mistura-se 80 ml de tampão de citrato 0,1 M pH 5,0 e 20 ml de preparação bruta, dialisada, de 1ignina-peroxidase. Adicionais -se em seguida 1,2 mg de ditiobenzoato de tetrameti1amónio. As concentrações iniciais em hemoproteína e sal de di tioãcido são assim de 0,46 juM e 5,3 juM, respectivamente. Apos 2 horas de agi_ tação ã temperatura ambiente, dialisa-se a mistura reaccional a 4°C durante 16 horas contra tampão de citrato 5 mM pH 6,0. Anja lisa-se o dialisado tal como se descreveu no exemplo 3, obtendo-se:

- rendimento químico 100%

- rendimento global em actividade 86%

I

- nenhuma lisina livre apos modificação

Ainda que a actividade seja um pouco baixa, o enzima enxertado comporta a vantagem de ser particularmente estável, enquanto o enzima nativo perdeu 2 a 5% da sua actividade por mes, conservada nas mesmas condições, o enzimo modificado mantém 100% da sua actividade apos 2 meses.

EXEMPLO 13

Comparati vo enxerto da papaína (ponto isoelécrito 8,8) efectuou-se de acordo com o processo descrito no exemplo 6, mas a pH 6 em vez de 8,5; verifica-se então que o ditioester utilizado não se fixa sobre a proteína. Pelo contrario, como se viu antes no exemplo

11, o ácido ditiõico fixa-se sobre todos os grupos lisina a pH 6.

Claims

Reivindicaçoes

1.- Processo para a modificação de um prótido por fixação de um grupo orgânico sobre a sua molécula, caracterizado pelo facto de se fazer reagir o prótido com um ãcido, sal ou éster ditiõico em que o resto do ãcido comporta o grupo orgânico a fixar, enquanto o resto da molécula tem uma estrutura de grupo que parte, de modo que o composto ditióico reage com os grupos -Ní^ ou -NHda molécula protídica.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ditióico responder â fórmula geral

R - C - S - X

I!

s na qual R representa o grupo orgânico a fixar, por intermédio do grupo C=S, sobre o prótido, enquanto

X representa um grupo eliminãvel por reacção do grupo

-S-X com um resto de amina do prótido.
3. - Processo de acordo con a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o símbolo R representar um radical hidrocarbo nado, alifático ou arílico, particularmente alquilo alcenilo ^C2^_C2O' fenilenilo, naftilo, naftilenilo, alquilarilo ou aril-alquilo.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o símbolo R representar um grupo orgânico, hidrófilo, polar, negativo, positivo ou neutro, em particular portador de um grupo carboxilo, hidroxilo, halogêneo, sulfinilo, sulfonilo, fosforilo, fosfonilo, sulfidrilo ou amida.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o símbolo R representar uma cadeia polimêrica j ou oligomérica, em particular polietilénica, polipropilênica, poliacrílica, polietilenoglicólica ou álcool polivinílico.
6. - Processo de acordo con a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o símbolo R representar um grupo de fórmula geral Y-S-C-R'-, na qual R' representa um grupo hidrocarbonado S divalente, em particular um grupo alquileno ^C1 ^C20' ou cicloalquileno, arileno ou alquil-arileno enquanto Y representa um grupo eliminãvel mediante reacção do grupo de fórmula geral -S-Y com um resto da amina do prótido.
7.-29/

7. - Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo facto de os símbolos X ou / e Y, iguais ou diferentes, representarem, cada um, uma parte hidrocarbonada de fórmula geral , ^{na n} representa um número de 1 a 6, comportando uma função halogéneo, carboxilo, sulfínica,sulfõnica, fosforosa, fosfonosa, fosfórica, fosfõnica, H activo, SH, amida ou hidroxi.
8, - Processo de acordo com uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo facto de o símbolo X representar um átomo de hidrogénio ou um catião proveniente de uma base fraca.
9, - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de se realizar no seio de um dissolvente aquoso, orgânico ou hidro-orgânico ou então em meio heterogéneo, a uma temperatura compreendida entre 0 e 70 C, de preferencia entre 20° e 45°C, estando o pH do meio compreendido entre 3 e 11,5, de preferência entre 4 e 9, particularmente no caso do enzimas.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o pH do meio reaccional estar compreendido entre 7,0 e 11,5, quando o composto ditiõico for um ditioester, e entre 3 e 7 quando este composto for um ácido ditiõico ou um sa] de base fraca de um tal ácido.
11 .3011. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de menos um dos átomos de azoto do prótidc modificado quimicamente comportar um grupo de fórmula geral -C-R,

Ί . s na qual R representa um radical orgânico, narticularmente hidrocarbonado, podendo compreender uma parte polar, positiva, negativa ou neutra, ou então ser constituída por uma cadeia polimérica.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o prõtido modificado ser constituído por um enzima solúvel em dissolventes orgânicos.
13.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o prõtido ser em. particular uma protease ou peroxidase, solúvel em benzeno, tolueno, éter, etanol, clorofórmio ou/e dimetilsulfõxido; em que vários motivos lisina comportam, por intermédio de um grupo -C=S-, um grupo R constituído por um radical alifático C.-C_nr, 1 20 polimérica, em particular um radical arílico C,-C., ou uma cadeia o 16 polietilenogiicol.
14.- Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o prõtido modificado ser constituído por um enzima, particularmente hidrolase, susceptível de catalisar uma reacção inversa, em particular a síntese de ésteres, de amidas, de tioamidas e péptidos.

Lisboa, 28 de Junho de 1988

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