JP2722205B2 - プロチドの改質方法と改質されたプロチド - Google Patents
プロチドの改質方法と改質されたプロチドInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はプロチド（protide）の化学的改質のための
新規な方法に関する。この新規な方法は、プロチドの物
理化学的性質を変えることができる一つ以上の有機基を
プロチド分子に固定せしめる反応から成る。本発明は特
にタンパク質の改質、詳細には酵素の改質を明らかにす
る。本発明の重要な用途は、ペプチドまたはタンパク質
の溶解性を変化させること、とりわけ酵素を有機溶媒に
溶解させることにある。
新規な方法に関する。この新規な方法は、プロチドの物
理化学的性質を変えることができる一つ以上の有機基を
プロチド分子に固定せしめる反応から成る。本発明は特
にタンパク質の改質、詳細には酵素の改質を明らかにす
る。本発明の重要な用途は、ペプチドまたはタンパク質
の溶解性を変化させること、とりわけ酵素を有機溶媒に
溶解させることにある。
本発明はまた、物理化学的性質を改質する有機基を有
するプロチドから成る。特に本発明は、有機基の固定に
よって有機溶媒中に溶解せしめられる酵素を明らかにす
ることにある。
するプロチドから成る。特に本発明は、有機基の固定に
よって有機溶媒中に溶解せしめられる酵素を明らかにす
ることにある。
化学的反応剤の作用によってタンパク質の性質が多少
の程度変わることは知られている。このことは、一般に
酵素の場合には、溶解性、移動性、すなわち分子量、安
定性などの物理的性質を変える目的を有する。また、こ
のような方法によって、改質前の天然の酵素に要求され
るよりも苛酷でない条件、特にpH、温度、イオン力、禁
止剤に対する抵抗力などの条件下でこれら注目すべき触
媒（改質された酵素）の使用を可能にするこころみがな
されている。
の程度変わることは知られている。このことは、一般に
酵素の場合には、溶解性、移動性、すなわち分子量、安
定性などの物理的性質を変える目的を有する。また、こ
のような方法によって、改質前の天然の酵素に要求され
るよりも苛酷でない条件、特にpH、温度、イオン力、禁
止剤に対する抵抗力などの条件下でこれら注目すべき触
媒（改質された酵素）の使用を可能にするこころみがな
されている。
他の目的は酵素の触媒的性質自体の改質、すなわち与
えられた酵素に好適な基質の範囲の拡大にあり、或いは
一方ではより大きな特異性の意味における触媒活性の方
向づけにある。
えられた酵素に好適な基質の範囲の拡大にあり、或いは
一方ではより大きな特異性の意味における触媒活性の方
向づけにある。
このことは、例えば、プロテアーゼをある種のペプチ
ド結合に対してより活性化させ、改質前よりも極めて多
数種のペプチドをたとえば加水分解することができるこ
と、または非水媒体における酵素の使用、または水が関
与する反応の方向を逆転することができる水中における
より低濃度の酵素の使用に関する。
ド結合に対してより活性化させ、改質前よりも極めて多
数種のペプチドをたとえば加水分解することができるこ
と、または非水媒体における酵素の使用、または水が関
与する反応の方向を逆転することができる水中における
より低濃度の酵素の使用に関する。
タンパク質の化学的改質の既知の方法の多くは、ペプ
チド鎖の天然アミノ酸残基が有する官能基または糖タン
パク質または核タンパク質の糖部分または核部分と反応
することができる特定の化合物を使用することにある。
チド鎖の天然アミノ酸残基が有する官能基または糖タン
パク質または核タンパク質の糖部分または核部分と反応
することができる特定の化合物を使用することにある。
従って、リジン残基のε−NH2基の活性化された救電
子試薬への求核力がしばしば使用された。
子試薬への求核力がしばしば使用された。
従来、最もしばしば使用された反応剤は、酸無水物、
トリニトロベンゼンスルホン酸である。かかる既知の方
法によって改質された酵素は一般に実質的に低下した活
性を有する。
トリニトロベンゼンスルホン酸である。かかる既知の方
法によって改質された酵素は一般に実質的に低下した活
性を有する。
多くの反応剤は結局は酵素の活性を著しく変化させ、
または触媒活性の保存と矛盾する操作条件をむしろ要求
し、または酵素の活性構造の維持に必須な他のアミノ酸
と反応するので、反応剤の選択は極めて制限される。
または触媒活性の保存と矛盾する操作条件をむしろ要求
し、または酵素の活性構造の維持に必須な他のアミノ酸
と反応するので、反応剤の選択は極めて制限される。
プロチド特に酵素の適切な改質の興味の観点から、適
当な反応剤の必要性は引続き大きい。
当な反応剤の必要性は引続き大きい。
本発明は、この分野における実質的な進歩を提供する
ものである。本発明は、プロチドのアミノ残基と容易に
反応してプロチドに望ましい有機基を固定し、一方、プ
ロチドが酵素であるときに触媒活性を低下しないか、ま
たは比較的わずかに低下するにすぎず、かつ酵素の有機
溶媒に溶解させる性質を有する化合物の群に関する。
ものである。本発明は、プロチドのアミノ残基と容易に
反応してプロチドに望ましい有機基を固定し、一方、プ
ロチドが酵素であるときに触媒活性を低下しないか、ま
たは比較的わずかに低下するにすぎず、かつ酵素の有機
溶媒に溶解させる性質を有する化合物の群に関する。
本発明の方法は、その酸残基がプロチドに固定される
べき有機基から成り、分子の他の部分が排出基の構造を
有するジチオ酸、塩またはエステルを与えられたペプチ
ドと反応させることに特徴がある。
べき有機基から成り、分子の他の部分が排出基の構造を
有するジチオ酸、塩またはエステルを与えられたペプチ
ドと反応させることに特徴がある。
用いられるジチオ酸エステル、酸または塩は下記の
（１）式によって表わされる。
（１）式によって表わされる。
（１）式中、ＲはＣ＝Ｓを介してプロチドに固定され
る有機基を示し、一方、ＸはＨまたはカチオンまたはＸ
−Ｓが良好な排出基であるように選択された基である。
る有機基を示し、一方、ＸはＨまたはカチオンまたはＸ
−Ｓが良好な排出基であるように選択された基である。
後者（プロチド）の分子をＥで示すことによって、本
発明による反応を下記（２）式のように書き表わすこと
ができる。
発明による反応を下記（２）式のように書き表わすこと
ができる。
このようにして、HSXが除去され、プロチド分子は一
つ以上の基 の固定によって改質される。
つ以上の基 の固定によって改質される。
この改質剤基は、たとえば炭化水素への溶解性、塩基
との反応性、耐熱性などのような、プロチドに付与する
ことが望まれる新規な性質に従って当然選択される。
との反応性、耐熱性などのような、プロチドに付与する
ことが望まれる新規な性質に従って当然選択される。
すなわち、Ｒは脂肪族または芳香族炭化水素基であ
り、従って疎水性であり、とりわけC1〜C20アルキルま
たはC2〜C20アルケニル、フエニル、フエニレニル、ナ
フチルまたはナフチレニルまたは対応するアルキルアリ
ールまたはアリールアルキルであり、またはＲは極性の
ある親水性の陰性、陽性または中性の有機基であっても
良い。
り、従って疎水性であり、とりわけC1〜C20アルキルま
たはC2〜C20アルケニル、フエニル、フエニレニル、ナ
フチルまたはナフチレニルまたは対応するアルキルアリ
ールまたはアリールアルキルであり、またはＲは極性の
ある親水性の陰性、陽性または中性の有機基であっても
良い。
すなわち、たとえば、Ｒはカルボキシル、ヒドロキシ
ル、ハロゲン、スルフイニル、スルホニル、ホスホリ
ル、ホスホニル、スルフイドリル、アミド、アンモニウ
ム、ホスホニウムまたは他の基である。
ル、ハロゲン、スルフイニル、スルホニル、ホスホリ
ル、ホスホニル、スルフイドリル、アミド、アンモニウ
ム、ホスホニウムまたは他の基である。
特殊の例においては、Ｒはたとえばポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリアクリル、ポリエチレングリコール
などのようなポリマーまたはオリゴマーの鎖である。
リプロピレン、ポリアクリル、ポリエチレングリコール
などのようなポリマーまたはオリゴマーの鎖である。
或いは、Ｒ自体を のジチオエステル残基によって構成することができる。
ここでＲ′は２価の炭化水素基、特にアルキレン、シク
ロアルキレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンを
示し、アルキレンは好ましくは１〜20炭素原子から成
り、他の基は６〜16炭素原子から成る。
ここでＲ′は２価の炭化水素基、特にアルキレン、シク
ロアルキレン、アリーレンまたはアルキルアリーレンを
示し、アルキレンは好ましくは１〜20炭素原子から成
り、他の基は６〜16炭素原子から成る。
Ｙは前記Ｘと同じ型の基であるが、必ずしもＸと同一
である必要はない。
である必要はない。
かかる変形においては、反応剤は下記（３）式のビス
−ジチオエステルである。
−ジチオエステルである。
このビス−ジチオエステルの使用によって、ポマリー
鎖、特に少なくとも鎖の末端がアミノ化されているポリ
アクリル、ポリビニルアルコール、ポリアルキレングリ
コールまたは他のオリゴマーまたはポリマーを有する、
改質された特別のプロチドを形成することができる。
鎖、特に少なくとも鎖の末端がアミノ化されているポリ
アクリル、ポリビニルアルコール、ポリアルキレングリ
コールまたは他のオリゴマーまたはポリマーを有する、
改質された特別のプロチドを形成することができる。
かかるアミノ化されたポリマーをＱ−NH2で表わす
と、Ｑ−NH2は下記（４）式の反応によってビス−ジチ
オエステルと結合される。
と、Ｑ−NH2は下記（４）式の反応によってビス−ジチ
オエステルと結合される。
従って、（４）式で得られたＱの化合物をプロチド
−NH2と反応させることによって、下記（５）式の反応
が行なわれる。
−NH2と反応させることによって、下記（５）式の反応
が行なわれる。
すなわち、ポリマーＱおよびプロチドＥのビスチオア
ミドが得られる。
ミドが得られる。
本発明の実施に使用することができる、これら種々の
ジチオエステルおよびビスジチオエステルの式を、非限
定例な説明として下記に示す。
ジチオエステルおよびビスジチオエステルの式を、非限
定例な説明として下記に示す。
n-C12H25-CS2-CH2-COOH HOOC-CH2-S-CH2CH2-CS2-C2H5 処理されるプロチドおよび使用されるジチオエステル
の性質によって、本発明の方法は水性溶液、有機または
水性−有機溶媒溶液中で、一般的には０℃〜70℃の範囲
の温度で行なわれる。
の性質によって、本発明の方法は水性溶液、有機または
水性−有機溶媒溶液中で、一般的には０℃〜70℃の範囲
の温度で行なわれる。
酵素の場合には、好ましい温度範囲は10℃〜50℃であ
り、特に好ましくは20℃〜45℃である。
り、特に好ましくは20℃〜45℃である。
反応剤の比率は、ジチオエステルと結合されるべきプ
ロチドの−NHまたはNH2基の数から出発して計算され
る。
ロチドの−NHまたはNH2基の数から出発して計算され
る。
改質剤基が固定されるべきプロチドの遊離−NH−また
は−NH2基当り、ジチオエステル官能基の過剰を使用す
ることが一般に実際的である。
は−NH2基当り、ジチオエステル官能基の過剰を使用す
ることが一般に実際的である。
反応媒体は、もしも要求されるならば、特に本発明に
よる反応がジチオエステルの有機溶媒中にプロチドを溶
解させる場合においては、たとえばジチオエステルの有
機溶媒溶液へのプロチドの分散のような不均一系とする
ことができる。
よる反応がジチオエステルの有機溶媒中にプロチドを溶
解させる場合においては、たとえばジチオエステルの有
機溶媒溶液へのプロチドの分散のような不均一系とする
ことができる。
従ってプロチドは、反応が進行するにつれて、この溶
媒の溶液中に溶解するようになる。
媒の溶液中に溶解するようになる。
本発明の変形においては、Ｘおよび／またはＹは同一
かまたは異なり、炭化水素部分(-CH2-)nによって構成さ
れる。
かまたは異なり、炭化水素部分(-CH2-)nによって構成さ
れる。
ここでｎは１〜６であり、ハロゲン、カルボキシル、
スルフイン酸基、スルホン酸基、亜リン酸基、亜ホスホ
ン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、活性水素、SH、アミ
ドまたはヒドロキシ官能基を有する。
スルフイン酸基、スルホン酸基、亜リン酸基、亜ホスホ
ン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、活性水素、SH、アミ
ドまたはヒドロキシ官能基を有する。
本発明によるプロチド、特にプロテアーゼまたはパー
オキシダーゼは、ベンゼン、トルエン、エーテル、エタ
ノール、クロロホルムおよび／またはジメチルスルホキ
シドに可溶であり、 を介してC1〜C20脂肪族基、C6〜C16アリール基またはポ
リマー鎖、特にポリエチレングリコールから成るＲ基を
有する多くのリジン基を含む。
オキシダーゼは、ベンゼン、トルエン、エーテル、エタ
ノール、クロロホルムおよび／またはジメチルスルホキ
シドに可溶であり、 を介してC1〜C20脂肪族基、C6〜C16アリール基またはポ
リマー鎖、特にポリエチレングリコールから成るＲ基を
有する多くのリジン基を含む。
（１）式においてＸが水素原子の場合、すなわちジチ
オ化合物がジチオ酸Ｒ−CSSHのときは、Ｒは上述した基
の一つである。
オ化合物がジチオ酸Ｒ−CSSHのときは、Ｒは上述した基
の一つである。
特に本発明の実施にあたって、酸Ｒ−CSSHおよびこれ
らのアミンまたは第４級アンモニウム塩で、Ｒ基がC4〜
C18アルキル、たとえばn-C4H9またはn-C11H23-、フエニ
ル、-C6H5、またはトリルCH3-C6H4-などであることが好
都合である。
らのアミンまたは第４級アンモニウム塩で、Ｒ基がC4〜
C18アルキル、たとえばn-C4H9またはn-C11H23-、フエニ
ル、-C6H5、またはトリルCH3-C6H4-などであることが好
都合である。
本発明に好適なジチオ酸塩は弱酸基から導かれたカチ
オンを含む。本発明で使用可能なジチオ酸塩Ｒ−CSSXと
なる弱塩基はアンモニア、ヒドラジン、ヒドロキシルア
ミン、ピペリジン、第１級、第２級または第３級アミ
ン、ジまたはトリアミン、ピリジン、テトラアルキルア
ンモニウム、ジまたはトリアルキルアンモニウム、ジま
たはモノアリールアンモニウムまたはZn,Al,Mn,Pbなど
の水酸化物などであり、一般にいずれの塩基も通常の温
度で好ましくは10-10〜10-3の程度の、特に好ましく10
-6〜10-4の水中でのイオン解離定数を有する。
オンを含む。本発明で使用可能なジチオ酸塩Ｒ−CSSXと
なる弱塩基はアンモニア、ヒドラジン、ヒドロキシルア
ミン、ピペリジン、第１級、第２級または第３級アミ
ン、ジまたはトリアミン、ピリジン、テトラアルキルア
ンモニウム、ジまたはトリアルキルアンモニウム、ジま
たはモノアリールアンモニウムまたはZn,Al,Mn,Pbなど
の水酸化物などであり、一般にいずれの塩基も通常の温
度で好ましくは10-10〜10-3の程度の、特に好ましく10
-6〜10-4の水中でのイオン解離定数を有する。
従って使用可能な塩の非限定的例において、Ｘはアン
モニウム、テトラメチルアンモニウム、フエニルトリエ
チルアンモニウム、トリメチルヘキサデシルアンモニウ
ム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、ジプ
ロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペラジン、ト
リイソブチルアミン、トリエチルアミン、ベンジルアミ
ン、フエニルエチルアミンなどのカチオンである。
モニウム、テトラメチルアンモニウム、フエニルトリエ
チルアンモニウム、トリメチルヘキサデシルアンモニウ
ム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、ジプ
ロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペラジン、ト
リイソブチルアミン、トリエチルアミン、ベンジルアミ
ン、フエニルエチルアミンなどのカチオンである。
本発明によるプロチドの枝分れは、選択されたペプチ
ドを適切なpHの緩衝溶液中でジチオ化合物と接触させる
ことによって行なわれる。プロチドに対して、ジチオ化
合物の大過剰、好ましくはプロチドにおいて利用可能な
NH2基当りＲ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｘの10〜100当量の使用が有
益である。この過剰量は反応終了後に溶液から特に透析
によって除去される。
ドを適切なpHの緩衝溶液中でジチオ化合物と接触させる
ことによって行なわれる。プロチドに対して、ジチオ化
合物の大過剰、好ましくはプロチドにおいて利用可能な
NH2基当りＲ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｘの10〜100当量の使用が有
益である。この過剰量は反応終了後に溶液から特に透析
によって除去される。
このプロチドとジチオ化合物との接触は、数時間にわ
たって、最もしばしば、かつ温度および存在する反応剤
の性質に応じて１〜20時間に延長するのが好適である
が、この指摘は決してこれに限定するものではない。
たって、最もしばしば、かつ温度および存在する反応剤
の性質に応じて１〜20時間に延長するのが好適である
が、この指摘は決してこれに限定するものではない。
注意すべき操作条件下におけるプロチドの安定性であ
り、生成物の安定性を越えて反応を延長すべきではない
ことを理解すべきである。
り、生成物の安定性を越えて反応を延長すべきではない
ことを理解すべきである。
一般的な方法として、本発明の方法はpH3〜11.5、特
に４〜９の媒体中において行なうことができる。しかし
ながら、処理されるプロチドおよび使用したジチオ化合
物の性質に応じていくつかの好ましい範囲が存在する。
に４〜９の媒体中において行なうことができる。しかし
ながら、処理されるプロチドおよび使用したジチオ化合
物の性質に応じていくつかの好ましい範囲が存在する。
すなわち、塩基性媒体に耐久性のないプロチドを処理
する場合には、７を越えないpH下で操作することが推賞
できる。一方、pHが７〜11.5、特にpH8〜11の場合に
は、ジチオエステルによって構成されたジチオ化合物Ｒ
−CSSXによって良好な結果が得られる。
する場合には、７を越えないpH下で操作することが推賞
できる。一方、pHが７〜11.5、特にpH8〜11の場合に
は、ジチオエステルによって構成されたジチオ化合物Ｒ
−CSSXによって良好な結果が得られる。
これに対して、ＸがＨまたは弱塩基カチオンの場合に
は、好ましいpH値は３〜７の範囲、または好ましくは3.
5〜6.5、一般に最適には４〜６の範囲である。
は、好ましいpH値は３〜７の範囲、または好ましくは3.
5〜6.5、一般に最適には４〜６の範囲である。
下記の実施例は、本発明の実施の詳細を非限定的に示
す。
す。
実施例１ ここに述べる操作は、（Ｉ）nucleofugeを単に変える
ことによって他のジチオエステルを製造することが可能
であること、従って（II）アミノ酸のNH2-がどのように
してジチオエステルと反応するかを示すのに役立つ。
ことによって他のジチオエステルを製造することが可能
であること、従って（II）アミノ酸のNH2-がどのように
してジチオエステルと反応するかを示すのに役立つ。
I.S−ジチオベンゾイル−Ｎ−アセチルシステイン（DTA
C）の製造 NaOHの１モル溶液2mlを、Ｎ−アセチルシステイン1.6
32gおよびジチオベンゾイルメルカプト酢酸（またはカ
ルボキシメチルジチオベンゾエート）2.123gの50mlエタ
ノール溶液に加えた。混合物を20℃で２時間撹拌して下
記（６）式の反応を行なわせ、次いでエタノールを蒸発
濃縮し、6N HClで酸性にした。
C）の製造 NaOHの１モル溶液2mlを、Ｎ−アセチルシステイン1.6
32gおよびジチオベンゾイルメルカプト酢酸（またはカ
ルボキシメチルジチオベンゾエート）2.123gの50mlエタ
ノール溶液に加えた。混合物を20℃で２時間撹拌して下
記（６）式の反応を行なわせ、次いでエタノールを蒸発
濃縮し、6N HClで酸性にした。
ヘキサン／クロロホルム混合物を溶出剤とするシリカ
クロマトグラフィによって、Ｓ−チオベンゾイル−Ｎ−
アセチルシステイン2.45gを分離した。
クロマトグラフィによって、Ｓ−チオベンゾイル−Ｎ−
アセチルシステイン2.45gを分離した。
これは、はじめのアセチルシステインに対して86.5％
の反応収率を示す。
の反応収率を示す。
II.ジチオベンゾイル−アセチルシステイン（DTAC）を
出発物質とするＮ−チオベンゾイルリジンの製造 上記I.で製造したDTACの0.425gまたは1.5ミリモル
と、リジン0.220gまたは1.5ミリモルを0.25N NaOH水溶
液10mlに溶解した。混合物の溶解性はエタノール１滴の
添加によって促進された。室温下、５時間の下記反応
（７）の後に、反応混合物を酸性化し、Ｎ−チオベンゾ
イルリジンを分離した。
出発物質とするＮ−チオベンゾイルリジンの製造 上記I.で製造したDTACの0.425gまたは1.5ミリモル
と、リジン0.220gまたは1.5ミリモルを0.25N NaOH水溶
液10mlに溶解した。混合物の溶解性はエタノール１滴の
添加によって促進された。室温下、５時間の下記反応
（７）の後に、反応混合物を酸性化し、Ｎ−チオベンゾ
イルリジンを分離した。
実施例２ トリドデシル チオメルカプト酢酸 によるホースラディッシュ（horseradish）パーオキシ
ダーゼの改質 市販のホースラディッシュパーオキシダーゼ（シグマ
II型）の6mgまたは0.15μモル（402nmの吸収による，ε
＝102mM-1・cm-1）およびトリデシル チオメルカプト
酢酸の1.6mgまたは５μモル（あらかじめエタノール0.1
mlに溶解）をpH＝8.5の0.1Mリン酸緩衝液3mlに溶解し
た。混合物を室温下で18時間、攪拌した。次いで溶液を
蒸留水に対して４℃で18時間透析し、次いで凍結乾燥し
た。得られた酵素を分析したところ、下記の特徴を有す
る。
ダーゼの改質 市販のホースラディッシュパーオキシダーゼ（シグマ
II型）の6mgまたは0.15μモル（402nmの吸収による，ε
＝102mM-1・cm-1）およびトリデシル チオメルカプト
酢酸の1.6mgまたは５μモル（あらかじめエタノール0.1
mlに溶解）をpH＝8.5の0.1Mリン酸緩衝液3mlに溶解し
た。混合物を室温下で18時間、攪拌した。次いで溶液を
蒸留水に対して４℃で18時間透析し、次いで凍結乾燥し
た。得られた酵素を分析したところ、下記の特徴を有す
る。
UVスペクトル:277nmにおけるスペクトルバンドの出現は
形成されたチオアミド官能基に起因する。
形成されたチオアミド官能基に起因する。
影響を受けたリジンの数：遊離リジンを古典的なTNBS
（トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定し、この結
果、３〜４リジンが影響を受けていることが見出され
た。
（トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定し、この結
果、３〜４リジンが影響を受けていることが見出され
た。
溶解性：天然の酵素は水に不溶であるが、改質された新
規酵素はmlのエタノール、クロロホルム、トルエン、エ
ーテルおよび水に5ml以上可溶性であった。
規酵素はmlのエタノール、クロロホルム、トルエン、エ
ーテルおよび水に5ml以上可溶性であった。
比活性：これは酵素化水（oxygenated water）によるオ
ルソジアニシジンの酸化によって測定された活性であ
る。
ルソジアニシジンの酸化によって測定された活性であ
る。
444nm（ε＝30mM-1・cm-1）に吸収を有するダイマー
が形成された。得られた比活性はタンパク質のmg当り85
0Uまたは天然酵素の比活性の97％であった。
が形成された。得られた比活性はタンパク質のmg当り85
0Uまたは天然酵素の比活性の97％であった。
有機溶媒中の活性：ホースラディッシュパーオキシダ
ーゼは、９−メトキシエリプテイシン（ellipticine）
の酸化反応の触媒となることが知られている。
ーゼは、９−メトキシエリプテイシン（ellipticine）
の酸化反応の触媒となることが知られている。
この反応は、９−オキソエリプテイシンがアスコルビ
ン酸によって容易に９−ヒドロキシエリプテイシンに還
元される故に興味がある。
ン酸によって容易に９−ヒドロキシエリプテイシンに還
元される故に興味がある。
唯一の欠点は、９−メトキシエリプテイシンが水にほ
とんど不溶であることである。この低い濃度の故に、酵
素による酸化反応の速度が制限される。
とんど不溶であることである。この低い濃度の故に、酵
素による酸化反応の速度が制限される。
従って、この反応は本発明によって改質されたパーオ
キシダーゼによりエーテル中で行なわれた。分光光度測
定用の容器に、９−メトキシエリプテイシン１ミリモル
のエーテル溶液0.5ml、エーテルml当り改質パーオキシ
ダーゼ1mg溶液の0.5ml、200ミリモルの酸素が吸収され
た水の水溶液10〜50μｌを共に混合し、エーテルで最終
容積を2mlにした。
キシダーゼによりエーテル中で行なわれた。分光光度測
定用の容器に、９−メトキシエリプテイシン１ミリモル
のエーテル溶液0.5ml、エーテルml当り改質パーオキシ
ダーゼ1mg溶液の0.5ml、200ミリモルの酸素が吸収され
た水の水溶液10〜50μｌを共に混合し、エーテルで最終
容積を2mlにした。
すると20℃で486nmに吸収が見られ、この吸収波長は
形成された９−オキシエリプテイシンの吸収（ε＝9.2m
M-1・cm-1）であった。
形成された９−オキシエリプテイシンの吸収（ε＝9.2m
M-1・cm-1）であった。
異なる量の酸素化、水による数回の試験の結果、酸化
速度は下記ミハエルの式で表わされることが明らかにな
った。
速度は下記ミハエルの式で表わされることが明らかにな
った。
実施例３ チオ安息香酸基のパパインへの固定によるパパインのジ
メチルスルホキシドへの可溶化および活性化 市販パパイン（シグマIV型）の0.32gおよびチトベン
ゾイルメルカプト酢酸100mg（予めエタノール3mlに溶
解）をpH＝8.5の0.1Mリン酸塩緩衝液の40mlに溶解し
た。
メチルスルホキシドへの可溶化および活性化 市販パパイン（シグマIV型）の0.32gおよびチトベン
ゾイルメルカプト酢酸100mg（予めエタノール3mlに溶
解）をpH＝8.5の0.1Mリン酸塩緩衝液の40mlに溶解し
た。
混合物を40℃で２時間放置し、次いで凍結乾燥した。
0.26gまたは81％の化学的収率が得られた。得られた酵
素は下記の特徴を有する。
0.26gまたは81％の化学的収率が得られた。得られた酵
素は下記の特徴を有する。
UVスペクトル：吸収帯が278nmから280nmに移動した。
影響されたリジンの数：パパイン中に含まれる10の中２
個。
個。
溶解性：天然酵素はベンゼンに不溶であり、水およびDM
SOにのみ可溶であるが、改質後はベンゼンン、DMSOおよ
び水にml当り10mgの割合で可溶であった。
SOにのみ可溶であるが、改質後はベンゼンン、DMSOおよ
び水にml当り10mgの割合で可溶であった。
アミダーゼ活性：トリス緩衝液中、およびシテスインお
よびEDTAの存在下、pH＝7.5および50℃での加水分解に
よって、Ｎ−ベンゾイル−D,L−アルギニン−パラニト
ロアニリド（BAPA）は410nmに吸収を有する（ε＝8.8mM
-1・cm-1）パラニトロアリニンを分離する。
よびEDTAの存在下、pH＝7.5および50℃での加水分解に
よって、Ｎ−ベンゾイル−D,L−アルギニン−パラニト
ロアニリド（BAPA）は410nmに吸収を有する（ε＝8.8mM
-1・cm-1）パラニトロアリニンを分離する。
一方、天然の酵素は凍結乾燥物のmg当り28mUの活性を
有するが、改質された酵素は凍結乾燥物のmg当り11mUま
たは初期活性の32％の活性を有する。
有するが、改質された酵素は凍結乾燥物のmg当り11mUま
たは初期活性の32％の活性を有する。
しかしながら、改質された酵素は、有機溶媒中で活性
を有するので極めて興味がある。従って、この改質酵素
は、水の非存在下、DMSO中でのペプチド合成に使用する
ことができる。
を有するので極めて興味がある。従って、この改質酵素
は、水の非存在下、DMSO中でのペプチド合成に使用する
ことができる。
DMSOは多数のペプチドを溶解させるのに特に好適であ
るが、天然酵素はDMSO中では活性を有しない。
るが、天然酵素はDMSO中では活性を有しない。
これに対して、改質された酵素は凍結乾燥物のmg当り
1.2mUの活性を有する。
1.2mUの活性を有する。
実施例４ エチルチオプロピオネート基の分子への固定によるパパ
インの改質 ジチオエステル エチルカルボキシメチル３−スルフ
イドジチオプロピオネート を水質媒体中でパパインと反応させた。
インの改質 ジチオエステル エチルカルボキシメチル３−スルフ
イドジチオプロピオネート を水質媒体中でパパインと反応させた。
このために、市販のパパイン（シグマIV型）の36mgを
エタノール0.1mlに予め溶解したジチオエステルの23mg
とpH＝8.5の0.1Mリン酸塩緩衝液4.5ml中で混合した。混
合物を40℃で２時間保持し、次いでpH＝7.2の0.1Mリン
酸塩緩衝液に対して４℃で16時間透析した。得られたタ
ンパク質溶液を分析し、下記の特徴を見出した。
エタノール0.1mlに予め溶解したジチオエステルの23mg
とpH＝8.5の0.1Mリン酸塩緩衝液4.5ml中で混合した。混
合物を40℃で２時間保持し、次いでpH＝7.2の0.1Mリン
酸塩緩衝液に対して４℃で16時間透析した。得られたタ
ンパク質溶液を分析し、下記の特徴を見出した。
UVスペクトル：最高の吸収が278nmから270nmに移動し
た。
た。
影響されたリジン数:10個中４。
水中での酵素活性:50％の損失。
改質された分子中の位置は式（II）によれば下記式で
表わされる。
表わされる。
この例は、-NH3基が-COO-基によって置換されること
を示し、このことは改質された酵素の等電点および最適
pH範囲を変化せしめる。
を示し、このことは改質された酵素の等電点および最適
pH範囲を変化せしめる。
実施例５ ポリエチレングリコールビス−ジチオエステル（PEG−
ジチオエステル）のホースラディッシュパーオキシダー
ゼへの固定 官能基を有するポリマーを下記の方法で製造した。
ジチオエステル）のホースラディッシュパーオキシダー
ゼへの固定 官能基を有するポリマーを下記の方法で製造した。
市販のビスアミノPEG20000（シグマ）0.25g、遊離NH2
官能基の、25μモルに相当、を蒸留水10mlに溶解した。
官能基の、25μモルに相当、を蒸留水10mlに溶解した。
トリエチルアミン0.4mlおよび予めエタノール0.1mlに
溶解したカルボキシメチルテトラチオオクタンジオエー
ト 44mgを添加した。これはジチオエステル官能基の25μモ
ルを表わす。pHを10.8に固定した。混合物を室温下で48
時間攪拌した。次いで、この溶液に蒸留水に対して室温
下で16時間透析した。pH＝6.6の溶液13mlを回収し、こ
れを分析した。
溶解したカルボキシメチルテトラチオオクタンジオエー
ト 44mgを添加した。これはジチオエステル官能基の25μモ
ルを表わす。pHを10.8に固定した。混合物を室温下で48
時間攪拌した。次いで、この溶液に蒸留水に対して室温
下で16時間透析した。pH＝6.6の溶液13mlを回収し、こ
れを分析した。
UVスペクトルによると枝分かれしたジチオエステル官
能基か3.08nm（ε＝12.2mM-1・cm-1）に測定され、チオ
アミド官能基が263nM（ε＝12.8mM-1・cm-1）に形成さ
れた。ジチオエステル官能基の過剰で処理したので遊離
-NH2官能基は存在しないことが明らかである。
能基か3.08nm（ε＝12.2mM-1・cm-1）に測定され、チオ
アミド官能基が263nM（ε＝12.8mM-1・cm-1）に形成さ
れた。ジチオエステル官能基の過剰で処理したので遊離
-NH2官能基は存在しないことが明らかである。
従って、下記式（８）の生成物が得られたことにな
る。
る。
チオアミド（1.31mM）およびジチオエステル（0.18m
M）官能基濃度の比率は重合度ｎから計算される。
M）官能基濃度の比率は重合度ｎから計算される。
この比率は、 実験的には、下記結果が得られた。
市販のホースラディッシュパーオキシダーゼ（シグマ
II型）6mgを、予め製造した溶液（パーオキシダーゼ0.1
5μモルおよびジチオエステル2.3μモル）に溶解し、混
合物中にNa2HPO4を溶解してpHを8.5とした。室温下、18
時間攪拌し、次いで溶液を透析し、最後に凍結乾燥し
た。得られた酵素は下記特徴を有する。
II型）6mgを、予め製造した溶液（パーオキシダーゼ0.1
5μモルおよびジチオエステル2.3μモル）に溶解し、混
合物中にNa2HPO4を溶解してpHを8.5とした。室温下、18
時間攪拌し、次いで溶液を透析し、最後に凍結乾燥し
た。得られた酵素は下記特徴を有する。
UVスペクトル：チオアミド官能基に起因する287nm吸収
帯の出現。
帯の出現。
影響されたリジンの数:2 溶解性：得られた酵素はアセトン、クロロホルム、ジオ
キサン、トリエン、ジメチルホルムアミドおよび水溶媒
にml当り5mg以上溶解する。
キサン、トリエン、ジメチルホルムアミドおよび水溶媒
にml当り5mg以上溶解する。
比活性：タンパク質のmg当り780Uまたは天然酵素の比活
性の89％。
性の89％。
クロロホルム中における活性:97−メトキシエリプテ
イシンの酸化には活性は十分であった。
イシンの酸化には活性は十分であった。
分光光度測定用容器中に、９−メトキシエリプテイシ
ン1mMのクロロホルム溶液0.5ml、改質したパーオキシダ
ーゼのクロロホルムmg当り1mg溶液の0.3ml、酸素化水20
0mMの10〜40μｌ（水性溶液）を共に混合し、クロロホ
ルムで容積を1.5mlにした。異なる量の酸素化水によっ
てミハエルの反応速度を求めた。
ン1mMのクロロホルム溶液0.5ml、改質したパーオキシダ
ーゼのクロロホルムmg当り1mg溶液の0.3ml、酸素化水20
0mMの10〜40μｌ（水性溶液）を共に混合し、クロロホ
ルムで容積を1.5mlにした。異なる量の酸素化水によっ
てミハエルの反応速度を求めた。
実施例６ ポリエチレングリコールビス−ジチオエステルによるパ
パインの改質 官能基化されたポリマーを実施例５に従って、しかし
より希釈された条件下で製造した。生成物の同一量に、
実施例５における10mlの代わりに蒸留水100mlを使用し
た。
パインの改質 官能基化されたポリマーを実施例５に従って、しかし
より希釈された条件下で製造した。生成物の同一量に、
実施例５における10mlの代わりに蒸留水100mlを使用し
た。
より軽いポリマーが得られ、UV測定の結果、ｎ＝０で
あった。従って、下記（９）式が得られた。
あった。従って、下記（９）式が得られた。
市販パパイン（シグマIV型）の1.9mgおよびNaHPO489m
gを上述した官能基化されたポリマー溶液23ml中に溶解
した。蒸留水で容積を50mlにした。得られたpHは8.5で
あった。この溶液を40℃で２時間保ち、次いで蒸留水に
対して４℃で16時間透析した。透析された溶液はpH＝6.
6を有し、容積は58mlであった。凍結乾燥の後に、45mg
が回収された。すなわち化学的収率は76％であった。
gを上述した官能基化されたポリマー溶液23ml中に溶解
した。蒸留水で容積を50mlにした。得られたpHは8.5で
あった。この溶液を40℃で２時間保ち、次いで蒸留水に
対して４℃で16時間透析した。透析された溶液はpH＝6.
6を有し、容積は58mlであった。凍結乾燥の後に、45mg
が回収された。すなわち化学的収率は76％であった。
このようにして改質された酵素の分析により下記の結
果が得られた。
果が得られた。
UVスペクトル:278nmにおける吸収帯が308nmにピークを
有する269nmに変り、すべてのジチオエステルが反応し
なかったことを示している。
有する269nmに変り、すべてのジチオエステルが反応し
なかったことを示している。
影響されたリジンの数:10の中の５リジン。
溶解性：得られた酵素はクロロホルム、DMSOおよび水の
ml当り、10mgまで溶解する。
ml当り、10mgまで溶解する。
アミダーゼ活性：凍結乾燥物のmg当り1.5mUまたは活
性収率は 実施例３と同様の試験によるDMSO中の活性：凍結乾燥
物のmg当り3.0mU。クロロホルム80％と試験に必要な配
合物を溶解させるためのDMSO20％との混合物で改質酵素
の溶液を製造した。凍結乾燥物のmg当り4.2mUの活性を
見出した。
性収率は 実施例３と同様の試験によるDMSO中の活性：凍結乾燥
物のmg当り3.0mU。クロロホルム80％と試験に必要な配
合物を溶解させるためのDMSO20％との混合物で改質酵素
の溶液を製造した。凍結乾燥物のmg当り4.2mUの活性を
見出した。
これに対して、同一試験における天然酵素の懸濁物
（天然酵素はクロロホルムに不溶）は全く活性を示さな
かった。
（天然酵素はクロロホルムに不溶）は全く活性を示さな
かった。
この実施例５および６は、PEG−ジチオエステルによ
る改質はクロロホルム中での良好な活性が得られること
を示し、これは実質的な技術的進歩である。
る改質はクロロホルム中での良好な活性が得られること
を示し、これは実質的な技術的進歩である。
実施例７ ジチオペンタン酸による血液タンパク質の改質 処理されたタンパク質は等電点7.2を有するホースラ
ディッシュパーオキシダーゼである。
ディッシュパーオキシダーゼである。
ホースラディッシュパーオキシダーゼ（シグマII型）
25mgおよび純CH3(CH2)3CSSHジチオ酸2mgをpH6.0の0.2M
リン酸塩緩衝液5ml中に溶解した。これは、ジチオ酸の3
mM当り酵素の0.05mM濃度に相当する。
25mgおよび純CH3(CH2)3CSSHジチオ酸2mgをpH6.0の0.2M
リン酸塩緩衝液5ml中に溶解した。これは、ジチオ酸の3
mM当り酵素の0.05mM濃度に相当する。
混合物を室温下で16時間攪拌した。次いで溶液をpH6.
5の5mMクエン酸塩緩衝液に対して16時間透析した。透析
物を回収し、分析した。
5の5mMクエン酸塩緩衝液に対して16時間透析した。透析
物を回収し、分析した。
全体的を化学的収率を、初めに使用した血液タンパク
質のモル数（402nm,ε＝102mM-1・cm-1における吸収に
よって決定）と、改質後に回収したもののモル数との比
較によって計算した。収率は100％であった。
質のモル数（402nm,ε＝102mM-1・cm-1における吸収に
よって決定）と、改質後に回収したもののモル数との比
較によって計算した。収率は100％であった。
活性に関しては、ヘムのｎモル当り比活性Ｕに導く血
液タンパク質の濃度と溶液の活性（ml当りのＵ）に関し
て各パーオキシダーゼ溶液について決定した。
液タンパク質の濃度と溶液の活性（ml当りのＵ）に関し
て各パーオキシダーゼ溶液について決定した。
溶液の酵素活性は、0.1Mクエン酸塩緩衝液、酸素化水
0.2Mの20ml、13mMオルソジアニシジンの20μｌおよび予
め20倍に希釈した酵素溶液20μｌが満たされたプラスチ
ック容器中で30℃で測定した。
0.2Mの20ml、13mMオルソジアニシジンの20μｌおよび予
め20倍に希釈した酵素溶液20μｌが満たされたプラスチ
ック容器中で30℃で測定した。
オルソジアニシジンの酸素生成物は、444nmにε＝30m
M-1・cm-1の吸収を有した。
M-1・cm-1の吸収を有した。
本実施例においては、天然酵素の比活性125U/ヘムｎ
モルは改質酵素では67U/ヘムｎモルまたは収率54％に増
加した。
モルは改質酵素では67U/ヘムｎモルまたは収率54％に増
加した。
化学的収率は100％なので、活性の全収率は54％であ
る。
る。
しかしながら、改質された酵素はヘムのμモル当り1.
4Uのリグニアーゼ活性を与える利点があり、一方、天然
酵素は全くリグニアーゼ活性を有しない。
4Uのリグニアーゼ活性を与える利点があり、一方、天然
酵素は全くリグニアーゼ活性を有しない。
実施例８ ジチオ安息香酸塩によルホースラディッシュパーオキシ
ダーゼの改質 ホースラディッシュパーオキシダーゼ（シグマII型）
の2.6mgおよびテトラメチルアンモニウムジチオベンゾ
エート 1.2mgをpH5.0の0.1Mクエン酸塩緩衝液100ml中に溶解
した。
ダーゼの改質 ホースラディッシュパーオキシダーゼ（シグマII型）
の2.6mgおよびテトラメチルアンモニウムジチオベンゾ
エート 1.2mgをpH5.0の0.1Mクエン酸塩緩衝液100ml中に溶解
した。
初期濃度は従って酵素0.26μＭおよびジチオ酸塩5.3m
Mである。室温下２時間の攪拌の後に、溶液をpH6.0で5m
Mクエン酸塩緩衝液に対して16時間透析した。実施例１
と同様の分析により下記結果が得られた。
Mである。室温下２時間の攪拌の後に、溶液をpH6.0で5m
Mクエン酸塩緩衝液に対して16時間透析した。実施例１
と同様の分析により下記結果が得られた。
化学的収率 72％ 活性における全収率 110％。
分枝されたリジン基の数:6 本発明による処理によって、酵素の活性が増大し、存
在する全てのリジン基にチオカルボニルが固定されてい
ることが明らかである。
在する全てのリジン基にチオカルボニルが固定されてい
ることが明らかである。
実施例９ ジチオペンタン酸CH3(CH2)3CSSHによるPhanerochaete C
hrysosporiumのリグニンパーオキシダーゼの改質 使用されたタンパク質は3.9の等電点を有する。pH6.0
の0.2Mリン酸塩緩衝液80mlに、Phanerochaete Chrysosp
oriumの培養物（TIEN,MおよびKIRK,T.K,により1984,Pro
c.Natl,Acad.Sci.US.81,2280〜2284に記述されている）
から得られたリグニンパーオキシダーゼの粗製造物の20
mlおよび純ジチオ酸の1.5μｌを加えた。
hrysosporiumのリグニンパーオキシダーゼの改質 使用されたタンパク質は3.9の等電点を有する。pH6.0
の0.2Mリン酸塩緩衝液80mlに、Phanerochaete Chrysosp
oriumの培養物（TIEN,MおよびKIRK,T.K,により1984,Pro
c.Natl,Acad.Sci.US.81,2280〜2284に記述されている）
から得られたリグニンパーオキシダーゼの粗製造物の20
mlおよび純ジチオ酸の1.5μｌを加えた。
血液タンパク質およびジチオ酸の濃度は従って、夫々
0.52μＭおよび130μＭである。
0.52μＭおよび130μＭである。
混合物を常温下で７時間攪拌し、次いでpH6.0でビス
−トリス1mM緩衝液に対して40時間透析した。
−トリス1mM緩衝液に対して40時間透析した。
分析は前記実施例７および８と同様に行なった。
化学的収率:404nm（ε＝102mM-1・cm-1）における吸
収によって決定した。改質収率は初期酵素に関して73％
であった。
収によって決定した。改質収率は初期酵素に関して73％
であった。
活性における全収率:65％、pH3.0の0.1M乳酸塩緩衝液
2mlおよび10mM酸素化水0.1ml、ベラトルムアルコール0.
1mlおよび酵素変換物0.1mlを含むプラスチック容器中、
30℃において、ε＝9.1mM-1.cm-1を 要求する310nmにおける吸収による上記ベラトルムアル
デヒドの出現によって活性度を決定することができる。
2mlおよび10mM酸素化水0.1ml、ベラトルムアルコール0.
1mlおよび酵素変換物0.1mlを含むプラスチック容器中、
30℃において、ε＝9.1mM-1.cm-1を 要求する310nmにおける吸収による上記ベラトルムアル
デヒドの出現によって活性度を決定することができる。
酵素活性におけるわずかな低下は、改質されたタンパ
ク質は凍結乾燥することができ、一方、天然酵素はその
全ての活性を凍結乾燥によって失なう事実によって償う
ことができる。
ク質は凍結乾燥することができ、一方、天然酵素はその
全ての活性を凍結乾燥によって失なう事実によって償う
ことができる。
改質酵素の凍結乾燥物はクロロホルムおよびDMSOに溶
解する。
解する。
実施例10 リグニンパーオキシダーゼの改質へのpHの影響の検討 実施例９と同様な酵素および同様なジチオペンタン酸
を用いて操作を行なった。
を用いて操作を行なった。
リグニンパーオキシダーゼの粗製造物20mlおよびジチ
オペンタン酸２μｌをpH3.0の0.1Mクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液80mlに加えた。室温で３1/2時間攪拌した後
に、混合物をpH6.0の5mMクエン酸−リン酸塩緩衝液に対
して18時間透析した。
オペンタン酸２μｌをpH3.0の0.1Mクエン酸塩−リン酸
塩緩衝液80mlに加えた。室温で３1/2時間攪拌した後
に、混合物をpH6.0の5mMクエン酸−リン酸塩緩衝液に対
して18時間透析した。
pHの関数としての結果を下記表に示す。
全ての試験について、ジチオ酸による改質の後に遊離
リジン基が全く存在しないことが観察された。
リジン基が全く存在しないことが観察された。
従って、pH5.0はリグニンパーオキシダーゼの改質に
最適であることが明らかである。このpHにおいて、酵素
の活性はCH3(CH2)CS-基の結合によって増大した。もし
も操作を実施例２〜４におけるようにpH8.5で行なう
と、酵素はここで使用したジチオ化合物によってその活
性を失なうことは注目すべきことである。
最適であることが明らかである。このpHにおいて、酵素
の活性はCH3(CH2)CS-基の結合によって増大した。もし
も操作を実施例２〜４におけるようにpH8.5で行なう
と、酵素はここで使用したジチオ化合物によってその活
性を失なうことは注目すべきことである。
実施例11 ジチオペンタン酸によるパパイン改質pHの影響 パパインプロテアーゼの等電点は8.8である。パパイ
ン（シグマIV型）36mgおよびジチオ酸23mgをpH6.0、6.5
または8.5の0.1Mリン酸塩緩衝液4.5mlに溶解した。
ン（シグマIV型）36mgおよびジチオ酸23mgをpH6.0、6.5
または8.5の0.1Mリン酸塩緩衝液4.5mlに溶解した。
混合物を40℃に２時間加熱し、次いで蒸留水に対して
４℃で16時間透析した。pHの関数としての結果は下記表
のとおりである。
４℃で16時間透析した。pHの関数としての結果は下記表
のとおりである。
pH値の低下は、改質反応にとって好都合であることが
明らかである。一方、この実施例は、パパインは活性シ
ステインの酵素である故に重要である。活性はジチオ酸
の改質によって実際に影響されないので、プロテアーゼ
の活性点においてシステインは操作条件においてジチオ
酸によっておかされず、一方、リジンはおかされると結
論することできる。
明らかである。一方、この実施例は、パパインは活性シ
ステインの酵素である故に重要である。活性はジチオ酸
の改質によって実際に影響されないので、プロテアーゼ
の活性点においてシステインは操作条件においてジチオ
酸によっておかされず、一方、リジンはおかされると結
論することできる。
実施例12 ジチオ安息香酸によるPhanerochaete Chrysosporiumの
リグニンパーオキシダーゼの改質 タンパク質は実施例９の場合と同一であり、等電点は
3.9である。
リグニンパーオキシダーゼの改質 タンパク質は実施例９の場合と同一であり、等電点は
3.9である。
pH5.0の0.1Mクエン酸塩緩衝液80mlおよびリグニンパ
ーオキシダーゼの粗透析改質物の20mlが共に混合され
た。
ーオキシダーゼの粗透析改質物の20mlが共に混合され
た。
次いで、テトラメチル−アンモニウム−ジチオベンゾ
エート1.2mgを加えた。
エート1.2mgを加えた。
血液タンパク質およびジチオ酸塩の初期濃度は夫々、
0.46μＭおよび5.3μＭである。室温下で２時間攪拌の
後に、混合物をpH6.0で5mMクエン酸塩緩衝液に対して16
時間、４℃で透析した。透析物を実施例３で述べたよう
にして分析し、下記結果を得た。
0.46μＭおよび5.3μＭである。室温下で２時間攪拌の
後に、混合物をpH6.0で5mMクエン酸塩緩衝液に対して16
時間、４℃で透析した。透析物を実施例３で述べたよう
にして分析し、下記結果を得た。
化学的収率 100％。
活性による全収率 86％。
改質後に遊離リジンなし。
活性は若干低下したが、分枝した酵素は特に安定であ
る利点を有する。一方、天然の酵素は同一条件下で貯蔵
して月当りその活性の２〜５％を失なうが、改質された
酵素は２か月後もその活性を100％保持する。
る利点を有する。一方、天然の酵素は同一条件下で貯蔵
して月当りその活性の２〜５％を失なうが、改質された
酵素は２か月後もその活性を100％保持する。
実施例13 比較試験 パパイン（等電点8.8）の分枝を実施例６におけるよ
うにして、しかしpH8.5の代りにpH6で行なった。
うにして、しかしpH8.5の代りにpH6で行なった。
しかし、使用したジチオエステルはタンパク質に固定
されていないことが見出された。これに対して、上記実
施例11においては、ジチオ酸はpH6で全てのリジン基に
固定された。
されていないことが見出された。これに対して、上記実
施例11においては、ジチオ酸はpH6で全てのリジン基に
固定された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジャン−ルゥイ・スリ フランス共和国、64110 ジュランソン、 シュメン・ヴィニヤ（番地なし) (72)発明者 ヴァレリ・ブランジェ フラランス共和国、14000 カン、リ ュ・ド・ラ・ピガシェル 39
Claims (2)
- 【請求項１】プロチドを下記式、 （式中ＲはＣ＝Ｓ結合を介して前記プロチドに固定され
る下記（ｉ）、（ii）、（iii）、或いは（iv）である
有機基を示し、ＸはＳ−Ｘと前記プロチドのアミン残基
との反応によって除去される基である）を有するジチオ
化合物と反応させることを特徴とする、プロチド分子に
有機基を固定させることによるプロチドの改質方法。 （ｉ）脂肪族又は芳香族炭化水素基、特にC1〜C20アル
キル、C2〜C20アルケニル、フェニル、フェニレニル、
ナフチル、ナフチレニル、アルキルアリール、又はアリ
ールアルキル基。 （ii）陰性、陽性、又は中性の極性を有する親水性有機
基、特にカルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、スル
フィニル、スルホニル、ホスホリル、ホスホニル、スル
フィドリル、又はアミド基を有する有機基。 （iii）ポリマー鎖又はオリゴマー鎖、特にポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、又はポ
リビニルアルコール鎖。 （iv）下記式、 （式中Ｒ′は２価の炭化水素基、特にC1〜C20アルキレ
ン、C6〜C16シクロアルキレン、アリーレン、又はアル
キルアリーレンであり、ＹはＳ−Ｙと前記プロチドのア
ミン残基との反応によって除去される基である）を有す
る基。 - 【請求項２】基−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ（Ｒは下記（ｉ）、（i
i）、（iii）、或いは（iv）である有機基）を有する窒
素原子の少なくとも１つを有するプロチド。 （ｉ）脂肪族又は芳香族炭化水素基、特にC1〜C20アル
キル、C2〜C20アルケニル、フェニル、フェニレニル、
ナフチル、ナフチレニル、アルキルアリール、又はアリ
ールアルキル基。 （ii）陰性、陽性、又は中性の極性を有する親水性有機
基、特にカルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、スル
フィニル、スルホニル、ホスホリル、ホスホニル、スル
フィドリル、又はアミド基を有する有機基。 （iii）ポリマー鎖又はオリゴマー鎖、特にポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、又はポ
リビニルアルコール鎖。 （iv）下記式、 （式中Ｒ′は２価の炭化水素基、特にC1〜C20アルキレ
ン、C6〜C16シクロアルキレン、アリーレン、又はアル
キルアリーレンであり、ＹはＳ−Ｙと前記プロチドのア
ミン残基との反応によって除去される基である）を有す
る基。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8709198A FR2617487B1 (fr) | 1987-06-30 | 1987-06-30 | Procede de modification chimique de protides et produits ainsi modifies |
| FR8709198 | 1987-06-30 | ||
| FR8806914 | 1988-05-25 | ||
| FR8806914A FR2631971B1 (fr) | 1988-05-25 | 1988-05-25 | Greffage de dithioacides sur des protides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6467185A JPS6467185A (en) | 1989-03-13 |
| JP2722205B2 true JP2722205B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=26226066
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0300849B1 (ja) |
| JP (1) | JP2722205B2 (ja) |
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| DE (1) | DE3881774T2 (ja) |
| DK (1) | DK359788A (ja) |
| ES (1) | ES2056946T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5719039A (en) | 1995-06-01 | 1998-02-17 | University Of Iowa Research Foundation | Enzyme-surfactant ion-pair complex catalyzed reactions in organic solvents |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0199644A1 (fr) * | 1985-04-19 | 1986-10-29 | Societe Nationale Elf Aquitaine | Perfectionnement à l'immobilisation d'enzymes |
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|---|---|---|---|---|
| FR39628E (fr) * | 1931-01-12 | 1932-01-22 | Ig Farbenindustrie Ag | Procédé pour l'activation des protéases |
| US2567747A (en) * | 1948-03-18 | 1951-09-11 | Wallerstein Co Inc | Stabilization of enzyme preparations |
| US3940420A (en) * | 1974-07-15 | 1976-02-24 | Pierce Chemical Company | Compound, dithiobis-(succinimidyl propionate) |
| US4609625A (en) * | 1983-11-14 | 1986-09-02 | Owens-Illinois, Inc. | Process for the production of modified proteins and product thereof |
-
1988
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- 1988-06-23 ES ES88401579T patent/ES2056946T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-23 DE DE88401579T patent/DE3881774T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1988-06-28 PT PT87858A patent/PT87858B/pt not_active IP Right Cessation
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- 1988-06-29 DK DK359788A patent/DK359788A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-06-29 CA CA000570714A patent/CA1331571C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1988-06-29 JP JP63159557A patent/JP2722205B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-10-31 GR GR89300105T patent/GR890300105T1/el unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0199644A1 (fr) * | 1985-04-19 | 1986-10-29 | Societe Nationale Elf Aquitaine | Perfectionnement à l'immobilisation d'enzymes |
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| Publication number | Publication date |
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| CA1331571C (fr) | 1994-08-23 |
| DE3881774D1 (de) | 1993-07-22 |
| EP0300849A1 (fr) | 1989-01-25 |
| NO882836D0 (no) | 1988-06-27 |
| GR890300105T1 (en) | 1989-10-31 |
| NO882836L (no) | 1989-01-02 |
| PT87858A (pt) | 1988-07-01 |
| DK359788D0 (da) | 1988-06-29 |
| US4870016A (en) | 1989-09-26 |
| DK359788A (da) | 1988-12-31 |
| DE3881774T2 (de) | 1993-11-18 |
| PT87858B (pt) | 1992-10-30 |
| NO302184B1 (no) | 1998-02-02 |
| JPS6467185A (en) | 1989-03-13 |
| ES2056946T3 (es) | 1994-10-16 |
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