SU1097558A1 - Химически модифицированный носитель на основе кремнезема и способ его получени - Google Patents

Abstract

1.Химически модифицированный носитель на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащий на поверхности группы формулы -(с1Нг)з-0- Нг-с1н-енг дл  иммобилизации биологически активных соединений. (Л со -vj ел СП 00

Description

2.Способ получени  химически мо-дифицироваиного носител  на основе кремнезема, включающий обработку кремнезема J - глицидилоксипропилтриэтоксисиланом до содержани  на поверхности носител  эпоксидных групп в количестве 15-1000 мкмоль/г, Отличающийс  тем, что

обработанный у-глицйдиоксипропилтриэтоксисиланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного металла или тиомочевиной в количестве 20 - 100 моль на 1 моль эпоксигрупп в среде апротонного растворител  при 50100°С .

Изобретение относитс  к способу получени  химически модифицированных кремнеземных носителей и может быть использовано дл  иммобилизации биологически активных соединений ферментов , их ингибиторов, кофакторов . Известны модифицированные органи ческими соединени ми кремнеземные носители, используемые дл  иммобили зации биологически активных веществ Однако известные носители предна значены дл  иммобилизации соединени содержащих лишь определенные функци нальные группы и во многих случа х их необходимо дополнительно активировать . Наиболее близким к предлагаемому i вл етс  носитель 2J на основе мак . ропористого кремнезема,- содержащий поверхности группы формулы -(ЙНг),- О-ЙНг- dH- ОН 5 / . Указанное соединение привито к поверхности кремнезема гидролитичес ски прочной системой св зей 5 Si -О - Si - С. Эпоксидные группы носител  способны реагировать с функциональными группами ( - ОН,- NHg - SH) биологически активных молекул что определ ет возможность использо вани  данного носител  дл  иммобилизации широкого набора ферментов, ингибиторов и др. Носитель с привитыми эпоксигруппами получают обработкой кремнезема раствором у -глицидилоксипропилтриэтоксисилана в воде или органическом растворителе 2 . Однако при иМ14обилиэации на данном носителе биологически активных молекул , содержащих тиольные группы, помимо эффекта иммобилизации наблюдаетс  потер  биологической активноети . При этом полученные препараты им мобилизованных биологически активных молекул данного химического строени  под воздействием кислорода быстро те р ют свою активность, так как тиольные группы легко окисл ютс  кислоро-, дом. При обычных услови х иммобилизации (водный раствор, воздух), а также при хранении готового продукта, иммобилизируемое вещество (или иммобилизованное на носителе вещество) соприкасаетс  с кислородом, что и приводит к потере их биологической активности. Дл  избежани  данного нежелательного  влени , процесс иммобилизации биологически активных молекул, содержащих тиольные группы, на носителе известного строени  обычно осуществл ют в Инертной атмосфере или в присутствии восстанавливающих агентов 2-меркаптоэтанрла, дитиотреитола . Последние снижают выход и загр зн ют целевой продукт. Цель изобретени  - получение химически модифицированного носител  на основе кремнезема дл  иммобилизации биологических соединений, в том числе биологически активных молекул, со/держащих тиольные группы. Поставленна  цель достигаетс  тем, что химически модифицированный носитель на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащей на поверхности группы формулы (еНг)з-0- 2Нг-Сн-йНг л  иммобилизации биологически акивных соединений. Способ получени  химически модиицированного носител  на основе ремнезема, включающий обработку ремнезема -глицидилоксипропилтритоксисиланом до содержани  на поерхности носител  эпоксидных групп количестве 15-1000 мкмоль/г обработанный у-глицидилоксипропилтритоксисиланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного еталла или тиомочевиной в кпли«естве 20-100 моль на 1 моль эпоксигрупп, в среде апротонного растворител  при 50-100°с Сущность способа заключаетс  в iTOM, что носитель, содержащий на inosepxHOCTH эпоксидные группы в количестве 15-1000 мкмоль/г обрабатывают в соответствии со схемой Р-((1Нг)з- 0-dH2-«iH-dH2 + )2 О «- Р-{ЙНг)з-0-с Нг-с5н-ОН+ О-СйШг), т «f J р где Р - кремнезем; tt - щелочной металл. Носитель общей формулы (1) получ ют с выходов 80-100% в зависимости от структуры кремнеземной матрицы и условий реакции. Носитель представл ет собой макропористый кремнеземный материал, с держащий на поверхности тиирановой группы в количестве 15-460 мкмоль/г носител . Тиирановые группы носител как и эпоксидные группы, способны реагировать с нуклеофильными функци ональными группами биологически активных молекул, что приводит к иммо билизации последних. Иммобилизаци  протекает по следу щей схеме Р-( ОНг)з- 5Нг-Ь НЫ-3- . i - Р-(с н4-0- Нг-ЙН-бНг-У-Ъ где Р - кремнезем; 8 - молекула биологически акти ного вещества; Ч - О, NH, S. Таким образом, в процессе иммоби лизации биологически активных молекул на носителе общей формулы (1) образуютс  свободные тиольные группы . Образование этих групп позвол е использовать носитель дл  иммобилиз ции активных молекул, содержащих ти ольные группы: свободные тиольные группы, наход щиес  на поверхности носител , служат в качестве восстанавливающего агента. Полученный модифицированный кремнеземный носитель общей формулы (1) в процессе иммобилизации исполн ет две функции: матрицы дл  иммобилизации и восстанавливающего аген та. Способ получени  носител  осуществл етс  следующим образом. Обработку исходного носител , со держащего эпокси-группы, провод т избытком тиоцината щелочного метгшла или тиомочевины (на 1 моль эпоксидных групп исходного вещества используют 20-100 молей соответствующего агента), обработку исходного вещества провод т в среде пол рного апротонного растворител , например диметилформамида (ДМФА), диметилсульфоксида (ДМСО) и др., при 50 100°С . При-мольном соотношении тиоцината щелочного металла или тиомочевины к эпоксигруппам меньше чем 20:1 снижаетс  выход реакции, соотношение больше чем 100:1 нецелесообразно. При температуре меньше 50 С значительно увеличиваетс  врем  проведени  реакции. При температуре выше протекают побочные реакции, привод щие к разрушению тиирановых групп. Применение протонного растворител  приводит к раскрытию тиирановых групп до тиольных. Полученный модифицированный кремнеземный носитель общей формулы (1) представл ет собой белое вещество в форме гранул сферической или нерегул рной (JjOpNttJ, нерастворимое в воде и органических растворител х, которое разлалаетс  в концентрированных щелочах и в растворе фтористого водорода . Структура нового соединени  подхвержена элементным анализом, титриметрическим определением тиоэпоксидных групп. Пример. 10,О г силохрома С-80, модифицированного -глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и содержащего 130 мкмоль/г эпоксидных групп, суспендируют в 50 мл диметилформамида (ДМФА) и при перемешивании добавл ют раствор реагента, содержащего 5,8 г (60 моль) тиоцината кали  в 50 мл ДМФА (соотношение 50:1). Перемешивают при 80 С в течение 2ч, фильтруют. Нерастворимый продукт промывают последовательно ДМФА, холод-, ной водой и ацетоном до полного удалени  растворимых компонентов. Сушат в вакуумэксикаторе 5 ч. Получают 10,0 целевого продукта. Найдено, % : 5-0,38 Вычислено,%: S - 0,35 Содержание титрируемых тиопоксидных групп 112 мкмоль/г. Выход по функциональным группам 93%. Пример2. По примеру 1 осуществл ют синтез носител , измен   температуру реакции, соотношение реагентов и тип исходного кремнеземного носител . В таблице представлены характерно тики носителей в зависимости от ус.поВИЙ обработки (тип и количество реагента , температура, растворитель, врем  реакции).

; Примерз, 1,0г модифицированного носител , полученного по примеру 1, суспендируют в 10 )уш фосфатного буферного раствора (рН 7,6) в котором растворено 10 мкмоль трилона Б, смесь встр хивают 15 мин. Добавл ют 100 мг трипсина, растворенного в 10 мл буферного раствора, и выдерживают смесь в течение суток -при 5°С, периодически встр хива . Продукт фильтруют, промывают фосфатным буферным раствором и дистиллированной водой. Продукт содержит 38 мг белка на 1 г сухого веса, удельна  активность иммобилизованного трипсина 42 ед/г..

Пример4. 50 мг уреазы в бикарбонатном буфере (10 мл 0,05 М, рН 8,6) инкубируют с 5,0 модифицированного кремнеземного носител , полученного по примеру 1, при 2-5°С в течение 2 сут. Продукт фильтруют, промывают буферным раствором с добавлением 0,5 М NaCl. Продукт содержит 8 мг/г белка, удельна  активность 70 ед/г,

И р и М е р 5. Образец препарата, полученного по примеру 4, инкубируют -в фосфатном буферном растворе .(0,01 М, рН 7,5) при 15°С, В аналоги1 . Силикагель,

(пор 250 нм)

15

2. Силикагель

(d,p 10 нм) 570

3.

110

Алюсил

Пористое

БС(НП2)2

90 стекло

ных услови х инкубируют уреазу, иммобилизованную на носителе, полученного по прототипу. Через определенные промежутки времени определ ют уреазную активность препарата.

На чертеже изображена зависимость удельной активности уреазы от времени хранени .

Крива  А описывает изменение удел ной активности уреазы, иммобилизованной на предлагаемом носителе, крива  Б уреазы иммобилизованной на носителе - прототипе.

Таким образом, предлагаемый носитель за счет возникновени  тиольных групп при иммобилизации соединений позвол ет получать препараты иммобилзованных биологически активных веществ более устойчивые к окислению и сохран ющие свою активность на высоком уровне длительное врем .

Технико-экономическа  эффективность изобретени  состоит в том, что использование предлагаемого носител  дл  И1 мобилизации биологически активных соединений позволит расширить ассортимент иммобилизованных препаратов, в частности биологически активных веществ, содержащих тиольные группы.

100

ДМФА

KSCH

20

ДМФА

WaSCN

50

ДМФА

KSCN

50

ДМСО

1, Силикагель,

{d,p 250 нм) 50

Продолжение таблицы

J

100

0,05 15

Claims (2)

1. ι 1.Химически модифицированный носитель 'на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащий на поверхности группы формулы

   - (сад_з- О- йн_г- ciH-ен 2 для иммобилизации биологически актив ных соединений.

   Уд.

   SU .,,1097558 >
2. 2.Способ получения химически модифицироваиного носителя на основе кремнезема, включающий обработку кремнезема $ - глицидилоксипропилтриэтоксисиланом до содержания на поверхности носителя эпоксидных групп в количестве 15-1000 мкмоль/г, отличающийся тем, что обработанный у-глицйдиоксипропилтриэтоксисиланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного металла или тиомочевиной в количестве 20 - 100 моль на 1 моль эпоксигрупп в среде апротонного растворителя при 50100 °C.