NO301692B1 - Bærersubstans for bruk med farmakologisk aktiv forbindelse og fremgangsmåte for fremstilling av en blanding omfattende en slik bærer - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en bærersubstans for bruk med minst en farmakologisk aktiv forbindelse, slik det framgår av den innledende del av patentkrav 1, og en framgangsmåte for framstilling av en blanding omfattende en slik bærer slik det framgår av den innledende del av patentkrav 4.

Bakgrunn

Et hovedproblem ved administrering av medikamenter er den effektive absorpsjon av høymolekylære forbindelser slik som proteiner og peptider gjennom biologiske membraner. Slike molekyler blir normalt ikke opptatt i kroppen dersom de tildeles fordøyelseskanalen, slimhinnene i munnhulen, i rektum, i vagina eller i nesen. Senere studier med insulin har vist at absorpsjonen av en slik forbindelse kan økes dersom den tildeles sammen med en såkalt absorpsjons-promotor. Disse absorpsjons-promotorene har vært representert ved overflateaktive stoffer av ikke-ionisk type så vel som ulike gallesalt-derivater. Det har blitt oppnådd en økt permeabilitet av membraner i nærvær av disse typer overflateaktive forbindelser, og litteraturen innen området gastroenterologi omfatter et bredt spekter av slike absorpsjons-promotorer. (For et oversyn vises det til Davis et al (forfattere), "Delivery systems for Peptide Drugs", Plenum Press, NY, 1987.) Slike forbindelser vil imidlertid sannsynligvis ikke være akseptable for den kroniske administrering av farmasøytiske preparater på grunn av deres irriterende effekter på membraner. Dette omfatter ikke bare det ikke-ioniske utvalg av overflateaktive forbindelser men også gallesalt og gallesalt-derivater (f.eks. fusidinsyre)).

EP patentpublikasjon 023.359 og EP patentpublikasjon 122.023 beskriver en pulverformig farmasøytisk blanding for anvendelse i neseslimhinnen og framgangsmåter for administrering av denne. Den farmasøytiske blandingen tillater at polypeptider og derivater av disse effektivt absorberes gjennom neseslimhinnen. US patentskrift 4.226.848 beskriver tilsvarende en framgangsmåte for administrering av pulverformig medikament til neseslimhinnen hvor den foretrukkete blanding har slimhinne-adhesive egenskaper.

EP patentpublikasjon 230.264 beskriver et vannbasert nasalt medikament-tilførselssystem for vaksiner som inneholder et høymolekylært medikament, et gelemiddel (f.eks. hydroksyetylcellulose) og i noen tilfeller andre additiver (f.eks. overflateaktive stoffer, glyserol og polyetylenglykol) men igjen blir blandingen tildelt i form av et pulver.

Mikrosfære-holdige blandinger er beskrevet i WO patentpublikasjon 88/09163. Blandingene inneholder visse promotorer for å hjelpe til ved penetrering av medikamentet gjennom slimhinnen. WO patentpublikasjon 89/03207, hvor søker er identisk med foreliggende, beskriver dessuten blandinger som ikke krever noen promotor. Disse blandingene kan omfatte medikament-holdige mikrokapsler som er belagt med DEAE-dextran.

DEAE-dextran har blitt foreslått for bruk i orale medikament-tilførselssystemer, hvor de er antatt å samvirke med slimhinner i fordyelseskanalen (Anderson, M.T. et al, oral presentation at a meeting of the Society for Experimental biology, 24-29 July 1988, Manchester, UK) og har blitt tildelt til nesehulen i kaniner som en modellforbindelse for å studere absorpsjonen av peptider av ulike størrelser (Maitani, Y., et al, Int. J. Pharm. 1989, 49, 23-27).

Igawa et al (1988 Chem. Pharm. Bull. 36(8) 3055-3059) tildelte menneske-interferon-B intranasalt til kaniner med et DEAE-dextran bindemiddel. Dextran-delen av sistnevnte hadde en gjennomsnittlig molekylvekt på 9000 og ga ingen forbedring i absorpsjon av medikamentet, og forfatterne konkluderte med at lavmolekylære bindemidler var foretrukket framfor høymolekylære komponenter.

GB patentpublikasjon 2.092.002 beskriver magnesium- og kalsium-syklidiserende forbindelser for å fremme absorpsjonen av medikamenter gjennom et fordøyelsesorgan. Slike forbindelser inkluderer polyaminosyrer. Sawanagi et al (1982) Chem. Pharm. Bull. 30(11), 4216-4218) beskriver bruken av chitosan for å binde bestanddelene i tabletter for opprettholdelse i munnen. Administrering til ikke-orale slimhinneoverflater er ikke beskrevet.

Chitosan har tidligere blitt brukt til å felle proteinholdig materiale, for å lage kirurgiske sømmer og som en immunostimulant. Det har også tidligere blitt anvendt i orale medikament-blandinger for å fremme oppløsning av svaktløselige medikamenter (Sawayanagi et al, Chem. Pharm. Bull., 31, 2062-2068 (1983)) eller for den vedvarende frigjøring av medikamenter (Naiagi et al, Proe. Jt. US-Jpn. Semin. Adv. Chitin, Chitosan, Relat. Enzymes, 21-39. Zikakis J.P. (forfatter), Academic Press. Orlando (1984)) ved en prosess med langsom erosjon fra en hydratisert komprimert matrise.

Formål

Det generelle formål med oppfinnelsen er å anvise en bærersubstans for bruk med en farmakologisk aktiv forbindelse med forbedret absorpsjon av den farmakologiske aktive forbindelse gjennom slimhinner.

Oppfinnelsen

Dette formål oppnås med en bærersubstans ifølge den karakteriserende del av patentkrav 1 og en framgangsmåte for framstilling av en blanding omfattende en slik bærersubstans ifølge den karakteriserende del av patentkrav 4.

Oppfinnelsen angår en bærersubstans for bruk med minst en farmakologisk aktiv forbindelse, slik som insulin, for å fremme absorpsjon av den farmakologisk aktive forbindelse ved administrering gjennom slimhinner.

I henhold til oppfinnelsen omfatter bærersubstansen en polymerisk substans med et flertall kationiske grupper (polykationisk substans) valgt blant gruppen bestående av polykationiske karbohydrater, DEAE-dextran, chitosan samt derivater og salter av samme, polyaminosyrer slik som polysin, polykvaternære forbindelser, protamin, polyimin, DEAE-imin, polyvinylpyridin, polythiodietylaminoetyletylen (P(TDAE)), polyhistidin, DEAE-metakrylat, DEAE-akrylamid, poly-p-aminostyren, polyoksyetan, ko-polymetakrylat, GAFQUAT og polyamidoaminer, unntatt:

- polyaminosyrer som syklidiserer kalsium- eller magnesiumioner,

- mikrokapsler belagt med DEAE-dextran,

- en løsning av DEAE-dextran i forbindelse administrering i tarmen, og

- chitosan i forbindelse med oral administrering i form av tablett.

I lys av den kjente teknikk beskrevet innledningsvis er det overraskende å oppdage, i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, at en oppløsning eller en dispersjon av relativt høymolekylær DEAE-dextran eller andre polykationiske substanser slik som chitosan kan danne grunnlag for en forbedret blanding som ikke krever andre promotorer, selv om nærvær av andre promotorer kan forbedre effekten av blandingene ytterligere.

Den polykationiske substansen kan være tilstede som en løsning i et vandig medium, som en dispersjon i et vannbasert system, som et pulver eller som mikrosfærer. Slike mikrosfærer er fortrinnsvis dannet fra den polykationiske substansen i seg selv (vanligvis kombinert med den farmasøytisk aktive substansen) med eller uten andre aktuelle mikrosfære-dannende substanser slik som (menneske) serum albumin og derivater av og analoge til denne.

Konsentrasjonen av den polykationiske substansen i en slik løsning er fortrinnsvis 0.01 til 50 vekt%, helst 0.1 til 50%, eller aller helst 0.2% til 30%, men det mest foretrukne er 0.5-15%.

Dietylaminoetyl-dextran (DEAE-dextran) er et polykationisk derivat av dextran som inneholder dietylaminogrupper koplet til glykoserestene med esterbindinger. Det foreliggende dextran kan ha en gjennomsnittlig molekylvekt på omlag 5000 til 40xl06, men er typisk omlag 500 000.1 forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen er betegnelsen avgrenset til dextran med molvekt 10 000 eller høyere. Nitrogeninnholdet er vanligvis omlag 3.2% som overensstemmer med en ladet gruppe pr. tre glykose-enheter. "Tanden<T->grupper, som er introdusert som resultatet av sidereaksjoner, resulterer i nærvær av tre ulike basiske grupper i omtrent like forhold.

Chitosan er deacetylert chitin, eller poly-N-acetyl-D-glykosamin. Det er tilgjengelig fra Protan Laboratories Inc, Redmond, WA 98052, USA og kan, avhengig av den valgte kvalitet, være løselig i vann opp til pH 6.0. En 1% løsning av vannuløselig chitosan (Sea Cure) kan tilvirkes ved å lage en slurry (f.eks. 2g/100 ml) i vann og tilsette et like stort volum organisk syre (f.eks. 100 ml 2% eddiksyre) og røre voldsomt i en time. Vannløselig chitosan (Sea Cure<+>) kan løses uten at organiske eller uorganiske syrer er tilstede.

DEAE-dextran og chitosan er foretrukket, men andre polykationiske substanser som kan brukes i blandingene i henhold til oppfinnelsen inkluderer andre polykationiske karbohydrater slik som uorganiske eller organiske salter av chitosan og modifiserte former av chitosan (særlig mere positivt ladete), polyaminosyrer slik som polysin, polykvaternære forbindelser, protamin, polyimin, DEAE-imin, polyvinylpyridin, polythiodietylaminometyletylen (P(TDAE)), polyhistidin, DEAE-metakrylat, DEAE-akrylamid, poly-p-aminostyren, polyoksyetan, ko-polymetakrylater (f.eks. koplymerer av HPMA, N-(2-hydroksypropyl)-metakrylamid), GAFQUAT (US patentskrift 3 910 862) og polyamidoaminer. De polykationiske substansene som anvendes med oppfinnelsen har en molekylvekt på 10 000 eller mere, fortrinnsvis minst 100 000 eller 200 000 og aller helst omlag 500 000. Chitosanet (eller saltet av dette) har fortrinnsvis en indre viskositet på minst 400 ml/g, helst minst 500, 750 eller 1000 ml/g. Dersom det er ønskelig kan andre promotorer inkluderes i bærersubstansen ifølge oppfinnelsen, for eksempel lysofosfatidylcholin og generelt alle som er nevnt i WO 88/09163. Gelemidler eller viskositetsøkende substanser kan tilsettes for å fremme opprettholdelse av blandingen på slimhinnen. Chitosanet i særdeleshet kan lages i form av mikrosfærer med eller uten albumin.

Blandingen av bærersubstans og farmakologisk aktiv forbindelse kan lages ved en nøytral pH, dvs. pH 6.5-7.5, fortrinnsvis omlag 7.3, for eksempel ved bruk av en standard fosfatbuffer eller ved lavere pH, for eksempel pH 4, ved tilsats av HC1 til ovennevnte eller ved bruk av et alternativt buffersystem. Det har imidlertid blitt oppdaget at DEAE-dextran eller chitosan i kombinasjon med i det minste noen medikamenter, for eksempel insulin og de fleste om ikke alle proteiner, danner et kompleks. Ved lavere eller høyere pH-verdier, dvs. vekk fra det isoelektriske punkt for polykationet og medikamentet, kan dette komplekset være tilstede som en virkelig løsning istedet som en dispersjon. Dette kan være fordelaktig, selv om det også er tilfelle at svært lave pH-verdier har en tendens til å irritere eller selv skade slimhinnen. Følgelig vil en fagkyndig være i stand til å bestemme den optimale pH, som kan ligge mellom 1.0 og 11.0, fortrinnsvis 4.0 til 7.5, for eksempel 4.0 til 6.0, eller 9.0 til 11.0. Dette komplekset kan isoleres.

Betegnelsen "farmakologisk aktiv forbindelse" omfatter medikamenter, vaksiner og bestanddeler av disse (for eksempel isolerte antigener eller deler av disse) og monoklonale antistoffer.

Blandingene kan anvendes med medikamenter slik som insulin, calcitoniner (for eksempel fra gris, menneske laks, kylling eller ål) og syntetiske modifikasjoner av disse, enkefaliner, LHRH og analoge (Napharelin, Buserelin, Zolidex), GHRH (veksthormon-frigjørende hormon), niphedipin, THF (thymic humoral factor), CGRP (calcitonin genrelatert peptid), atrialt natriuretisk peptid, antibiotika, metoclopramid, ergotamin, Pizotizin, nasale vaksiner (særlig ADIS-vaksiner, meslinger, rhinovirus type 13 og respiratorisk syncitialt virus), pentamidin og CCK (cholecystykinin).

Andre medikamenter omfatter: antibiotika og antimikrobiske midler slik som tetracyclin hydroklorid, leucomycin, penicillin, penicillin-derivater, erythromycin, sulfathiazol og nitrofiirazon; lokale anaestetika slik som benzocain; vasokonstriktorer slik som fenylephrin hydroklorid, tetrahydrozolin hydroklorid, naphazolin nitrat, oxymetazolin hydroklorid og tramazolin hydroklorid; kardiotoniske midler slik som digitalis og digoxin; vasodilatorer slik som nitroglycerin og papaverin hydroklorid; antiseptiske slik som klorhexidin hydroklorid, heksylresorcinol, dequaliniumklorid og etacridin; enzymer slik som lysozymklorid, dextranase; ben- metabolismekontrollerende midler slik som vitamin D, og aktivt vitamin D3; kjønnshormoner; blodtrykksmedikamenter; smertestillende: anti- tumor- preparater: steroide anti- betennelsesmidler slik som hydrokortison, prednison, fluticason, prednisolon, triamcinolon, triamcinolon acetonid, dexametason, betametason, beclometason, og beclametason dipropionat; ikke- steroide anti- betennelsesmidler slik som acetaminophen, aspirin, aminopyridin, phenylbutazon, mefanamsyre, ibuprofen, diclofenac natrium, indometacin, colchine, og probenocid; enzymatiske anti- betennelsesmidler slik som chymotrypsin og bromelain seratiopeptidase; antihistaminer slik som dipfenhydramin hydroklorid, klorfeniramin maleat og clemastin; og antiallergiske midler og antitussive slimløsende antiasmatiske midler slik som natriumkromglycat, codeinfosfat, og isoproterenol hydroklorid.

Blandingene kan administreres via den nasale ruten ved bruk av en nesespray-anordning, trykksatt aerosolbokser eller enkle inndryppingsmidler. Blandingene kan gele på slimhinnen, i det minste i en viss grad, og dette kan tillempe opprettholdelsen av blandingen på slimhinnen. Blandinger som passer for administrering av medikamenter til tykktarmen kan deles inn i et antall tekniske kategorier som er kjent for de fagkyndige innen farmasi. Disse kan anvende belagte faste doseringsformer, slik som tabletter, pellets, minitabletter, harde gelatinkapsler osv. eller belagte delvis faste preparater, slik som myke gelatinkapsler og tilsvarende. Enteriske belagte systemer, basert for eksempel på metakrylat-kopolymerer slik som Eudragit L (Poly(metakrylsyre, metylmetakrylat)), er kun løselige ved pH 6 og høyere, slik at polymeren kun starter oppløsning ved ankomst til tynntarmen. Posisjonen for desintegrasjon er dermed avhengig av hastigheten for intestinal overføring og mengde polymer tilstede, hvor et forholdsvis tykt polymerbelegg har blitt definert for administrering til den sentrale fordøyelseskanalen (Hardy et al, Aliment. Pharmacol. Therap., 1, 273-280,

(1987)). Polymerer med evne til å framskaffe posisjons-spesifikk administrering i fordøyelseskanalen kan anvendes. Disse avhenger typisk av bakteriefloraen i tykktarmen for å framskaffe enzymatisk degradering av polymerbelegget og dermed frigjøring av medikamentet. Et antall kandidat-substanser ser ut til å være lovende, slik som azopolymerene (Saffran et al, US patentskrift 4.633.308); glykosider (Friend et al, J. Med. Chem., 27, 261-266, (1984)) og et utvalg av naturlig forekommende og modifiserte polysakkarider (Archer & Ring PCT/GB89/00581).

Ny pulsbasert frigjøringsteknologi (Magruder et al, US patentskrift 4.777.049) og tilsvarende, som tillater administrering av medikament over en forutbestemt tidsperiode, er nå tilgjengelig. Slike systemer kan anvendes for å tildele både medikament og en polykationisk substans, sammen med andre additiver som kan endre den lokale mikroomgivelse for å fremme medikamentstabilitet og opptak, direkte til tykktarmen, og er ikke avhengig av eksterne betingelser for å framskaffe frigjøring in vivo. bortsett fra nærværet av vann.

Oppfinnelsen er i det etterfølgende beskrevet ytterligere i lys av eksempler.

Eksempel 1 Insulin og DEAE- dextran

En in vivo eksperimentell rottemodell, modifisert fra den opprinnelig beskret av Hirai et al (1981 Int. J. Pharm., 7 317-362) og Fisher et al (1987 J. Pharm. Pharmacol., 39 357-362), ble brukt for å studere den intranasale absorpsjon av insulin i vannløsninger. Wistar hannrotter (Bantin og Kingman) med en høvelig vekt på 200-250 g, som ble fastet over natta i omlag 20 timer, ble bedøvd med i.p. injeksjon av 80 mg/kg pentobarbiton natrium (60 mg/ml Sagatal (handelsnavn) May og Baker) med ytterligere i.p. injeksjoner av 0.05 ml når nødvendig for å opprettholde et passende nivå av anaestetika. Rottene ble trakeotomert, spiserøret ble forseglet og halsarterien og halsvenen ble kanylert.

Insulin-løsninger (halvsyntetisk menneske Na-insulin) ble laget i 1/75 M fosfatbuffer med pH 7.3 til å gi en konsentrasjon på 167 IU/ml, og DEAE-dextranet ble tilsatt til å gi konsentrasjoner på 10%, 5% eller 1% (vekt). DEAE-dextranet som ble brukt i disse forsøkene hadde en molekylvekt på 500 000.

Det er også mulig å lage en løsning av 334 IU/ml insulin i fosfatbuffer og tilsette like volumdeler DEAE-dextran i fosfatbuffer med styrke på 20, 10 eller 2%. Dette vil gi de samme sluttløsningene. Når insulin-løsningen blandes med DEAE-dextran blir løsningen uklar, noe som indikerer at det har funnet sted en gjensidig påvirkning.

En insulinløsning med innhold av Laureth-9 systemet ble laget på en tilsvarende måte. Insulinløsningen alene eller insulinløsningene med innhold av Laureth-9 eller de ulike konsentrasjonene av DEAE-dextran ble tildelt nasalt til rotter (n=4) med 16.7 IU/kg kroppsvekt ved bruk av en Hamilton mikrosprøyte. Det ble tildelt et volum på 20 ul.

Blodprøver på 0.2 ml ble samlet i fluoridoksalat-rør fra halsarterien ved 10 og 5 minutter før tilførselen av insulin og ved 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 og 300 minutter etter tilførsel. Prøvene ble holdt i kort tid på knust is inntil de ble analysert i en Yellow Springs 23 AM glykoseanalysator med glykoseoksidase-metoden.

Tabell 1 viser de omtrentlige glykosenivåene (mmol/1) i rotter som ble gitt en dose insulin i fosfatbuffer og doser med insulin i fosfatbuffer (pH 7.3) med innhold av 1%, 5% eller 10% DEAE-dextran målt 120 minutter etter administrering. Nivået ved tilførselstidspunktet var omlag 3.5-4.0 mmol/1. Resultatene viser at insulin gitt intranasalt i form av en enkel fosfatbuffer-løsning (pH 7.3) ikke reduserer blodsukkernivået vesentlig mens tilsatsen av DEAE-dextran forårsaker raske og betydelige reduksjoner i blodsukkernivå. Effekten øker med økende konsentrasjon DEAE-dextran. Rottene som ble gitt 10% konsetrasjon døde tidlig av for lavt blodsukkernivå. Administrering av fosfatbuffer alene viser en tilsvarende trend som med insulinløsningen alene, dvs. en økning i plasmaglykose fra omlag 3.5-4.0 mmol/1 til omlag 5 mmol/1.

For sammenlikning viser glykosenivåene i rotter gitt en dose av insulin i fosfatbuffer og i rotter gitt en dose insulin i fosfatbuffer med innhold av 0.5% Laureth-9 at dette velkjente effektive promotorsystemet gir en reduksjon i blodsukkerkonsentrasjonen tilsvarende 1% DEAE-dextran (omlag 1.9 mmol/1 ved 120 minutter).

Eksempel 2 Effekt av pH på insuliti/ DEAE- dextran- løsninger

Det ble laget løsninger med innhold av 1 vekt% DEAE-dextran og 167 IU/ml Na-insulin, separat og kombinert, i fosfatbuffer (pH 7.3), og deres pH ble målt ved bruk av en

Gallenkamp pH Stick. Utseendet av hver løsning ble notert. Effekten av tilsats av IM natriumhydroksid-løsning (NaOH) eller 0.1M saltsyre (HC1) ble bestemt. De to separate løsningene var begge klare (DEAE-D pH 6.58; insulin pH 7.38) mens blandingen (pH 6.65) var uklar.

Tilsatsen av 0.1M HC1 til løsninger av DEAE-dextran alene hadde ingen effekt på løsningens utseende som forble klar. Løsninger av Na-insulin ble imidlertid uklare når pH nådde 6.65 men klarnet etter ytterligere tilsats av syre hvor pH ble senket til 4.14. Løsninger av DEAE-dextran kombinert med Na-insulin ble mindre uklare etter tilsatsen av syre og ble klare ved pH 4.14. Tilsatsen av 1 .OM NaOH til løsninger av DEAE-dextran og Na-insulin alene hadde ingen effekt på løsningens utseende som forble klar. Kombinerte løsninger av DEAE-dextran og Na-insulin ble imidlertid mindre uklare ettersom pH økte, og dannet en klar løsning når pH nådde 9.32. Løsninger av DEAE-dextran og Na-insulin ved omlag pH 4.0 ble funnet å være minst like effektive som de ved omlag pH 6.6 i rottemodellen beskrevet ovenfor.

Eksempel 3 Giftighet av en blanding ifølge oppfinnelsen

Insulin 100 IU/ ml med DEAE- dextran 5 vekt%

Effektene av DEAE-dextranblandinger på neseslimhinnen i rotter (etter 60 minutters inkubasjon) var mindre dramatisk enn de med tidligere kjente overflateaktive promotorer. Noen få celler tapt fra septum og turbinater var synlige og slimavsetning på den doserte siden resultere i en liten økning i epitelhøyden. Den klare cellestrukturen var ikke så godt definert og cytoplasmisk rom så ut til å være redusert. Epitel så fremdeles ut til å være mere enn en celle tykk (dvs. delvis lagdelt) og dannet et kontinuerlig lag, selv om arrangementet av kjerner over grunnmembranen var endret. Randhårene var ikke alltid tydelige i det frigitte slimet.

Betydelige mengder AB-farget slim var fremdeles synlig i celler på den doserte siden selv om det generelt ikke var sammenflytende spredning av fylte begerceller som på den udoserte siden. Noe slim var igjen tilstede i det udoserte hulrom på noen dyr.

Effekter av denne blandingen var generelt begrenset til den ventrale halvdel av hulrommet lateralt nasoturbinat dvs. dorsal meatus var upåvirket.

Eksempel 4 ( Sammenlikningseksempel) Gitfighet av tidligere kjente blandinger

Insulin 100 IU/ ml med STDHF1 vekt%

Som sammenliknet med 5 vekt% DEAE-dextran, viste STDHF (natriumtaurodi-hydroksyfusidat) tildelt på samme måte til rotter og inkubert i 60 minutter åpenbar sprengning på det nasale epitel. Store volum av slim var synlig sammen med tapte celler, epitel-forflytning og betydelig reduksjon i epitelhøyden til omlag halvparten av den på den udoserte siden. Generelt ble hele lengden av det doserte septum og turbinatene påvirket. AB misfarging viste at noe slim ble igjen i mange av epitelcellene men andre hadde utskilt hele sliminnholdet, særlig hvor epitelet var redusert til et tynt enkelt cellelag slik som i det midtre meatus.

Noe slim var tilstede på det udoserte septum eller drenert inn i dorsal meatus, men uten celletap. De udoserte turbinatene var upåvirket. Epitelhøyden på den doserte siden var overensstemmende mindre enn på den udoserte "kontroll"-siden.

Eksempel 5 Insulin og chitosan i rotte

Dette eksemplet ble gjennomført for å evaluere effekten av chitosan, lav eller medium viskøse vannløselige blandinger (Sea cure<+>), ved ulike konsentrasjoner og ved pH-verdier på 4 og 7.3-7.4 på den intranasale absorpsjon av insulin i rotter (n=4).

Det ble brukt halvsyntetisk Na-insulin og chitosan (Sea cure<+>) (vannløselig pulver) med lav viskositet (l.v.) og medium viskositet (m.v.) fra Protan Laboratories Inc.

Alle insulinløsninger ble i utganspunktet laget i 14.65 mM fosfatbuffer med pH 7.3-7.4 laget fra 1.904 g/l Na2HPCy2H20 og 0.616 g/l NaHN2PCy2H20 i dobbeltdestillert vann. Justering av pH til 4 ble etter behov utført ved tilsats av 150 ul 0.1M HC1 pr. ml løsning. Hvert mg insulin ble ansett som ekvivalent med 28 IU. Basisløsninger av insulin med dobbelt styrke ble laget friske som følger: 159.9 IU/ml (6.74 mg/ml) for administrering ved pH 7.3-7.4 og 183.8 IU/ml (7.75 mg/ml) for administrering ved pH 4, iregnet fortynningen ved tilsats av 0.1M HC1. Det forventede vanninnholdet i insulin er 15.3%.

Chitosanløsninger med dobbelt styrke ble laget som følger: 0.2 vekt% l.v. (2 mg/ml) for bruk ved pH 7.3-7.4; 1.0 vekt% l.v. (10 mg/ml) for bruk ved pH 7.3-7.4; 0.2 vekt% l.v. (2.3 mg/ml) for bruk ved pH 4; 1.0 vekt% l.v. (11.5 mg/ml) for bruk ved pH 4; og 0.2 vekt% m.v. (2.3 mg/ml) for bruk ved pH 4.

Insulin/chitosan-blandinger ble laget ved å blande like volum av de aktuelle basisinsulin-og chitosanløsninger og tilsats av 150 ul/ml av 0.1M HC1 etter behov. Løsninger ble tildelt intranasalt til rotter med 100 ul/kg, i overensstemmelse med doser på 8 IU/kg insulin med 0.1 eller 0.5 mg/kg l.v. chitosan eller 0.1 mg/kg m.v. chitosan. En dose på 100 ul/kg av insulin (167 IU/ml) ble dryppet inn i nesehulen via en mikrosprøyte (Hamilton) og et rør av polypropylen med ytre diameter 0.61 mm (Portex).

Blodprøver på 150 ul (8-12 dråper) ble tatt fra halsarterien i fluoridoxalat ved 10, 6 og 2 minutter før administrering og ved 5, 10, 15, 20, 40, 60, 90, 120, 180 og 240 minutter etter administrering. Væskeerstatning ble gitt i form av 0.9% saltvann via halsvenen. Glykosenivåene i prøvene ble målt innen 2 timer etter prøvetakning ved bruk av glykoseoksidase-metoden med en Yellow Springs 23 AM glykoseanalysator.

Løsningene med pH 4 var ikke bufrete systemer. Et passende bufret system kan framskaffes etter behov.

Alle blandingene ga et hurtig fall i blodsukkernivåene, hvor løsningen med 0.5% l.v. og pH 4 reduserte nivået fra 100% til omlag 16% etter 60 minutter. Generelt var 0.5% preparatet mere effektivt enn 0.1%, og pH 4.0 var bedre enn pH 7.3-7.4

Eksempel 6 Insulin og chitosan i sau

Halvsyntetisk menneske Na-insulin levert av Nordisk, Gentofte ble brukt. Vanninnholdet i prøven ble bestemt ved spektrofotometri til å være omlag 15%. Chitosan SEA CURE<+>, som er vannløselig, med lav (indre viskositet på 388 ml/g) og medium viskositet (indre viskositet lik 1010 ml/g) ble skaffet fra Protan Laboratories Inc. Disse er henvist til som henholdsvis CSN LV og CSN MV. Det ble brukt seksten sauer av blandingsrase. Dyrene ble ikke fastet før administrering av insulin. En stasjonerbar Viggo secalon kanyle med indre diameter på 1.2 mm, forsynt med en secalon standard strømningsbryter, ble plassert omlag 15 cm inn i en av de utvendige halsvenene i hvert dyr på første dag under eksperimentet, ble holdt i stand ved å spyle den med heparinisert normalt saltvann (25 IU/ml). Denne kanylen ble fjernet ved studiens avslutning.

En insulinløsning på 19.32 mg/ml (460 IU/ml) ble laget i 14.65 mM fosfatbuffer (0.476 G NA2HPCy2H20 + 0.154 g NajP04-211,0 i 250 ml vann) med pH 7.3-7.4, og filtrert på et 0.2 um membranfilter (Corning 21052-25). Chitosanløsninger ble laget i 14.65 mg/ml CSN LV, 2.3 mg/ml CSN MV eller 11.5 mg/ml CSN MV. Insulin/chitosan-blandinger ble laget ved å blande like volumdeler av insulin-basisløsningen og den aktuelle chitosanløsningen, etterfulgt av tilsats av 0.15 ml 0.166 M saltsyre for hver 1.0 ml av blandingen. Tilsatsen av saltsyre viste seg å være nødvendig for å sikre at chitosanet ble i løsning.

De siste blandingene som ble laget på denne måten hadde følgende sammensetning:

Blanding 1: 200 IU/ml insulin + 0.1% CSN LV, pH 3.6

Blanding 2: 200 IU/ml insulin + 0.5% CSN LV, pH 4.4

Blanding 3: 200 IU/ml insulin + 0.1% CSN MV, pH 3.6

Blanding 4: 200 IU/ml insulin + 0.5% CSN MV, pH 4.4

Sauene ble delt inn i 4 grupper hver med 3 dyr, hvor hver sau fikk 2.0 IU/kg insulin intranasalt i form av en vannløsning med sammensetning 1,2,3 eller 4, i overensstemmelse med gruppe 1 til 4.

For de intranasale studier ble sauene bedøvet ved bruk av en intravenøs dose av ketamin hydroklorid på 2.25 mg/mg. Dette skulle tjene som mottiltak mot nysing under administreringen. Bedøvelsen virket omlag 3 minutter. Blodprøver på 6 ml ble plassert på knust is fra den kanylerte halsvenen på sauen ved 15 og 5 minutter før administreringen av insulin og ved ulike tidspunkter etter administreringen. Hver blodprøve ble delt inn i to deler. For insulinanalyse ble blodprøvene (4.0 ml) blandet forsiktig i 5 ml hepariniserte rør (Li Heparin). For glykoseanalyse ble blodprøvene forsiktig blandet i 5 ml fluoridoxalat-rør. Plasmaet ble fraskilt ved sentrifugering ved 4°C og 3000 opm, og deretter lagret ved -20°C i påvente av insulin- og glykoseanalyse. Følgende resultater ble oppnådd:

Eksempel 7 Insulin ogpolyamidoamin i sau

En insulinløsning (humant insulin, Eli Lily, USA) på 400 IU/ml ble laget ved å løse 380.23 mg insulin i 15 ml vann med pH 4. pH ble justert til 4 med 1 M HC1 og tynnet til 50 ml med vann pH 4. (rå insulinløsning)

En basisløsning av polyamidoamin (PAA, 4% vekt/volum) (Polyamidoamin NG30, University of Brescia, Italia) ble laget ved å løse 200 mg PAA i 2.5 ml vann. Løsningen ble justert til pH 4 med 0. IM HC1 og tynnet til 10 ml med vann pH4.

Det ble laget en kontrolløsning av insulin 200 IU/ml ved å tilsette et like stort volum av vann pH 4 til basisløsningen av insulin 400 IU/ml.

Det ble laget blandinger omfattende insulin og 0.5%, 1% eller 2% (vekt/volum) av PAA ved å tilsette henholdsvis 625 ul, 1.25 ml eller 1.5 ml PAA basisløsning til 2.5 ml insulinløsning og tilsette vann med pH 4 til 5 ml. De ferdige blandingene hadde følgende sammensetning:

Blanding 1: Insulin kontrolløsning (200 IU/ml)

Blanding 2: Insulin (200 IU/ml) + 0.5% PAA NG30

Blanding 3: Insulin (200 IU/ml) + 1% PAA NG30

Blanding 4: Insulin (200 IU/ml) + 2% PAA NG30

Sauene ble inndelt i 4 grupper på 4 dyr og hver sau mottok 2.0 IU/kg insulin intranasalt. De nasale blandingene ble dosert som beskrevet i eksempel 6 og de samlete blodprøvene ble behandlet som beskrevet i dette eksemplet. Resultatene av plasmainsulin-konsentrasjon er vist i figur 1.

Eksempel 8 Insulin og stivelse i sau

Det ble laget en kontrolløsning av insulin med konsentrasjon 200 IU/ml som i eksempel 7.

En 2% vekt/volum (20 mg/ml) løsning av kationisk stivelse (CAT 142, Roquette Freres, Frankrike) i 14.65 mM fosfatbuffer (framstilt som beskrevet i eksempel 6). Insulin ble oppløst direkte i denne løsningen for å gi en sluttkonsentrasjon på 200 IU/ml (7.143 mg/ml), og pH ble justert til 4 med konsentrert saltsyre.

Sauene ble inndelt i to grupper på fire dyr der hver sau mottok 2.0 IU/kg insulin intranasalt. De nasale blandingene ble dosert som beskrevet i eksempel 6 og de oppsamlete blodprøvene ble behandlet som beskrevet. Resultatene er vist i figur 2.

Claims (7)

1. Bærersubstans for bruk med minst en farmakologisk aktiv forbindelse, slik som insulin, for å fremme absorpsjon av den farmakologisk aktive forbindelse ved administrering gjennom slimhinner,karakterisert vedat bærersubstansen omfatter en polymerisk substans med et flertall kanoniske grupper (polykationisk substans) valgt blant gruppen bestående av polykationiske karbohydrater, DEAE-dextran, chitosan samt derivater og salter av samme, polyaminosyrer slik som polysin, polykvatemære forbindelser, protamin, polyimin, DEAE-imin, polyvinylpyridin, polythiodietylaminoetyletylen (P(TDAE)), polyhistidin, DEAE-metakrylat, DEAE-akrylamid, poly-p-aminostyren, polyoksyetan, ko-polymetakrylat, GAFQUAT ogpolyamidoaminer, unntatt: - polyaminosyrer som syklidiserer kalsium- eller magnesiumioner, - mikrokapsler belagt med DEAE-dextran, - en løsning av DEAE-dextran i forbindelse administrering i tarmen, og - chitosan i forbindelse med oral administrering i form av tablett.

2. Bærersubstans ifølge krav 1,karakterisert vedat den polykationiske substans oppviser en molvekt på minst 10.000, særlig 100.000 - 200.000, og allerhelst omlag 500.000.

3. Bærersubstans ifølge krav 1, karakterisert vedat den polykationiske substans er chitosan eller et salt av samme med en indre viskositet på minst 400 ml/g.

4. Framgangsmåte for framstilling av en blanding omfattende en bærer og minst en farmakologisk aktiv forbindelse og valgfritt omfattende andre komponenter som ordinært anvendes i slike blandinger, for administrering gjennom slimhinner,karakterisert vedå: velge en bærer omfattende en polymerisk substans med et flertall kationiske grupper (polykationisk substans) valgt blant gruppen bestående av polykationiske karbohydrater, DEAE-dextran, chitosan samt derivater og salter av samme, polyaminosyrer slik som polysin, polykvatemære forbindelser, protamin, polyimin, DEAE-imin, polyvinylpyridin, polythiodietylaminoetyletylen (P(TDAE)), polyhistidin, DEAE-metakrylat, DEAE-akrylamid, poly-p-aminostyren, polyoksyetan, ko-polymetakrylat, GAFQUAT og polyamidoaminer, unntatt: - polyaminosyrer som syklidiserer kalsium- eller magnesiumioner, - mikrokapsler belagt med DEAE-dextran, - en løsning av DEAE-dextran i forbindelse administrering i tarmen, og - chitosan i forbindelse med oral adrninistrering i form av tablett, kombinere bæreren med den farmakologisk aktive substans ved (i) å blande den polykationiske substans og den farmakologisk aktive forbindelse i et vandig medium, hvorved konsentrasjonen av den polykationiske substans i den resulterende løsning er fra 0.01 til 50%, særlig fra 0.5-15%, eller (ii) å framstille mikrosfærer av den polykationiske substans, for separat administrering med den farmakologisk aktive substans eller å framstille mikrosfærer av den polykationiske substans og den farmakologisk aktive substans, eller (iii) å framstille en pulverblanding eller en tablett av den farmakologisk aktive substans og den polykationiske substans.

5. Framgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat det anvendes en polykationisk substans med en molvekt på minst 10.000, særlig 100.000 - 200.000, og aller helst omlag 500.000.

6. Framgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat det som polykationisk substans anvendes chitosan eller et salt eller derivat av samme med en indre viskositet på minst 400 ml/g.

7. Framgangsmåte ifølge krav 5 eller 6, ved bruk av en farmakologisk aktiv substans omfattende insulin eller proteiner,karakterisert vedat det framstilles et kompleks av den farmakologisk aktive substans og chitosan eller DEAE-dextran ved å framstille en løsning av den polykationiske substans og den aktive substans ved en pH-verdi vekk fra det isoelektriske punkt, slik som pH = 1.0-11, særlig i området 4.0-7.7 eller i området 9.0-11.0, hvoretter komplekset isoleres.