NO20140777A1

NO20140777A1 - Analysemetode

Info

Publication number: NO20140777A1
Application number: NO20140777A
Authority: NO
Inventors: Stig Morten Borch; Torgeir Hamsund; Jostein Geir Holtlund; Anja Gulliksen
Original assignee: Spinchip Diagnostics As
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2015-12-21
Also published as: CN106461654A; CN106461654B; JP2017518504A; US10228308B2; CN106461655A; EP3158334A1; US20170138823A1; KR20170020893A; US20170138939A1; KR102006556B1; EP3158334B1; EP3158333B1; JP2017518503A; NO3158333T3; KR102006555B1; NO337444B1; US10408713B2; KR20170020891A; KR102006554B1; US20170138938A1

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å analysere en prøve som inneholder en analytt som skal bestemmes kvalitativt og/eller kvantitativt, omfattende et bindingstrinn og et vasketrinn, hvor bindingstrinnet omfatter: å 5 tilveiebringe kuler i stand til å binde analytten, kulene eventuelt omfattende en definert mengde med analytt-sporingsstoffenheter, og kulene har en tetthet m1; å interagere analytten med kulene analytten eventuelt interagert med et sporingsstoff enten før, i løpet av eller etter interaksjon med kulene å oppnå en struktur av pakkede kuler omfattende kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt komplekser som har en tetthet 10 m2; og vasketrinnet omfatter: å dispergere de pakkede kulene i en væske som har en tetthet d > m2 og m1; og å separere væsken og kulene omfattende de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene.

Description

Analysemetode

Oppfinnelsens fagområde

Den foreliggende oppfinnelsen angår fagområdet analysemetoder, og fortrinnsvis en fremgangsmåte for å utføre en analyse av en forbindelse tilstede i en biologisk prøve. Fremgangsmåten blir fordelaktig brukt når en analyseanordning (lab-på-a-chip) i hvilken mikrofluidprosessering forekommer blir brukt i forbindelse med en sentrifuge, og fortrinnsvis en sentrifuge som tilveiebringer midler for å endre orienteringen av analyseanordningen i forhold til retningen av den påførte sentrifugalkraften.

Bakgrunn

En vanlig fremgangsmåte for å analysere etter en viss substans eller analytt innebærer bruken av en fastfase som vil binde selektivt til målsubstansen eller - analytten som typisk er en biomarkør. I noen assay, slik som et ikke-kompetitivt immunoassay, kan fastfasen bære eller presentere spesifikke innfangingsmolekyler på sin overflate som spesifikt vil binde biomarkøren. For å detektere og kvantifisere nevnte biomarkør, kan fastfase-biomarkør komplekset også reagere med et annet sett av biomarkørspesifikke bindingsmolekyler festet til ett eller flere sporingsstoff(er) under dannelse av fastfase-biomarkør-sporingsstoff kompleks(er). I andre assay, slik som kompetitive immunoassay, vil biomarkøren i prøven konkurrere med en definert mengde biomarkør, som bærer sporingsstoffet, i forhold til bindingen til fastfasen. Det eksisterer en rekke måter for å arrangere og bruke de involverte spesifikke bindingsstoffer og målanalytter, inkludert forskjellige typer fastfase-materialer og sporingsstoffer.

I mange analysesystemer omfatter fastfasen en stasjonær enhet slik som veggene til hulrom (brønner i mikrotitrerplater eller mikrokanaler og mikrohulrom) eller stasjonære strukturer slik som søyler eller porøse membraner, på hvilke innfangingsmolekylene, for eksempel antistoffer, som er komplementære med biomarkøren, for eksempel et antigen, er festet. Lateral eller transversal strømning, av prøven som inneholder mål-biomarkøren, gjennom porøse membraner er et foretrukket fastfase-konsept når det kommer til binding av mål-biomarkøren. Dette er på grunn av det faktum at forholdet mellom overflate og volum er veldig stort i disse membranene, noe som muliggjør et stort overskudd av innfangingsmolekylene, f. eks. antistoffer, og følgelig veldig effektiv binding av mål-biomarkøren. Imidlertid er disse membranene vanskelige å vaske, spesielt når sporingsstoffet er en nano-partikkel eller agglomerater derav. Vanskelighetene er forårsaket av ikke-spesifikk binding eller fanging av sporingsstoffet i lomme-lignende strukturer inne i membranen.

I andre analysesystemer kan fastfasen fordelaktig være kuleformede nano- eller mikrostørrelsespartikler lagd av polymere materialer som fremviser et stort overflateareal.

Sporingsstoffet kan være ethvert type stoff som kan bli detektert og målt ved enten optiske, kjemiske, elektriske, magnetiske, radioaktive metoder eller kombinasjoner derav. Videre kan sporingsstoffet også være formulert som, eller assosiert med, en partikkel. Slike partikler, ofte anvendt og detektert ved optiske midler, inkluderer metallkolloider (gull, sølv, jern og andre), kvantepunkter (eng. quantum dots), polymer (lateks) partikler som inneholder eller bærer fargestoffer eller fluorokromer, polymer, silika eller andre partikler som bærer signalgenererende molekyler, inkludert enzymer eller uorganiske krystaller slik som oppkonverterende nanopartikler (UCNPer). Partiklene brukt som sporingsstoffer eller bærere er vanligvis i nanometer-området, typisk mellom 2 nm til 200 nm, men større partikler opp til 100 um kan bli brukt i noen tilfeller. De biomarkørspesifikke molekylene knyttet til henholdsvis fastfasen og sporingsstoffet, kan for eksempel være antistoffer som vil binde spesifikt til mål-biomarkøren, som da blir referert til som antigenet. Ofte anvendte alternativer til antistoffer inkluderer nukleinsyreprober, avidin/streptavidin, lektiner og aptamere så vel som enhver (bio)reseptor som vil gjenkjenne og spesifikt binde til definerte molekylære strukturer til liganden (dvs. analytten eller del av analytten). Faktisk interagerer hoveddelen av alle proteiner i naturen mer eller mindre spesifikt med en eller annen ligand som kan være en definert struktur hos et stort molekyl eller små molekyler. Desto mer spesifikk binding og desto høyere affinitet, dess mer egnet er vanligvis reseptor-ligand systemet for å utforme analytiske assay. For å kvantifisere fastfase-biomarkør-sporingsstoff komplekset, (i det følgende også referert til som et kvalitativt og/eller kvantitativt bestembart kule-analytt kompleks) sporingsstoffet må fremvise visse egenskaper som tillater identifisering og måling. Optiske avlesningssystemer er ofte spesielt passende ettersom detektoren kan bli plassert utenfor assay-anordningen. Egenskaper hos optiske sporingsstoffer inkluderer lysabsorpsjon, lysspredning som målt ved transmittans eller reflektans så vel som lysdiffraksjon og luminescensfenomen som kjemoluminescens, fluorescens, oppkonverterende fosforescens og andre inkludert kombinasjoner derav. Fenomenene blir typisk referert når man måler farge, luminescens slik som fluorescens og fosforescens, diffraksjon, plasmon-effekter og andre.

I de fleste heterogene typer av analytiske assay tillates mål-biomarkørene først å reagere med fastfasen og sporingsstoff i overskudd. Deretter blir sporingsstoffet som ikke er spesifikt bundet til fastfasen fjernet ved vasking.

For å få mål-biomarkøren å binde til henholdsvis fastfasen og sporingsstoffet, vil de måtte interagere direkte. Med bindingsstoffer med høy affinitet, desto oftere reaktantene, dvs. biomarkøren, fastfase og sporingsstoff, interagerer eller kolliderer desto raskere er bindingsreaksjonen. Følgelig, for å oppnå et raskt assay bør man etablere reaksjonsbetingelser med veldig høye lokale konsentrasjoner av de spesifikke bindingsstoffene med høy affinitet. For å oppnå slike betingelser bør fastfasen fremvise et stort overflateareal tett sammenpakket med spesifikke reseptormolekyler med høy affinitet. Tilsvarende bør sporingsstoffet, som bærer det andre settet med spesifikke reseptormolekyler med høy affinitet, være tilstede i høye konsentrasjoner. Suspensjoner av nano- og mikropartikler fremviser store overflate til volum forhold, i likhet med porøse strukturer slik som porøse membraner. Fluidbevegelser som ytterligere vil lette kollisjoner mellom de involverte reaktantene bør anvendes. Slike bevegelser kan oppnås ved moderat varming og røring, men mer fortrinnsvis ved å få prøven og reagensene, inkludert sporingsstoffet i tilfellet av ikke-kompetitive assay, til å passere/strømme gjennom fastfasen. Væsker som strømmer gjennom fastfase-materialer som porøse membraner, mikro-kanaler, mikro-søylestrukturer eller stablede partikler er følgelig foretrukket ved utforming av effektive bindingsassay.

Den same vurderingen som diskutert i det forutgående avsnittet gjelder like mye for et kompetitivt heterogent assay. I slike assay fremviser fastfasen et stort overflateareal tettpakket med bundne og merkede biomarkører.

Kuleformede mikro- og nanopartikler blir ofte foretrukket som fastfase materialer av flere grunner:

• Partikler har et veldig stort overflate til volum forhold.

• Partikler blir effektivt funksjonalisert i mengder og kan følgelig bli blandet for å danne homogene suspensjoner. • Partikkelsuspensjoner kan dispenseres i alikvoter som kan brukes direkte i væskeform eller bli formulert som tørkede alikvoter slik som tabletter eller frysetørkede kuler (Lyospheres). • Partikler kan lades/fylles med eller lages av materialer som tilfører distinkte trekk til partiklene. Dette inkluderer distinkte optiske trekk som lysabsorpsjon, lysspredning, lysemisjon (luminescens) og mer, så vel som magnetisme, radioaktivitet, katalytisk/enzymatisk, elektrokjemisk, og andre målbare trekk.

• Partikler kan bli transportert inne i mikrofluidsystemer når i suspensjon.

• Partikler kan bli blandet effektivt med prøven i løsning.

• Partikler i suspensjoner kan bli separert fra løsningen ved gravitasjon, sentrifugering, filtrering, magnetisk kraft (magnetiske partikler) eller elektrisk kraft eller kombinasjoner derav. • Partikler kan sedimentere, forbli i suspensjon eller flyte, avhengig av deres tetthet relativt til mediet i hvilket de er dispergert. • Partikler kan lages monodisperse og helt kuleformede, både porøse eller med en glatt fast overflate uten porer. • Partikler kan bli pakket eller stablet i forskjellige beholdere, inkludert kolonner. • Partikler kan være ugjennomsiktige (fargede) eller hovedsakelig transparente noe som tillater kompatibilitet og bruk i en rekke optisk-baserte målesystemer. • Når kompakte monodisperse partikler blir stablet på et filter, som i kolonner, kan de danne en porøs gitterstruktur med jevn og definert avstand. Væsker kan strømme på en kontrollert og reproduserbar måte gjennom slike kolonner.

Den mest effektive måten å få en analytt, og eventuelt et sporingsstoff i tilfellet av ikke-kompetitive assay, til å interagere med immobiliserte innfangingsmolekyler, festet til overflaten av fastfase-partikler, er å pakke partiklene på et filter eller spalte i form av en kolonne og la en løsning som inneholder analytten, og/eller reagenser slik som et sporingsstoff, passere gjennom kolonnen med partikler. Dette kan gjøres sekvensielt og i repetitive trinn eller ved å påføre en blanding av både analytten(e) og sporingsstoff(ene) og la dem passere i ett trinn.

Etter reaksjonen eller bindingstrinnet(ene), blir løsningen separert fra fastfasen og fastfasen vasket for å fjerne gjenværende overskudd av sporingsstoff, merket ikke-bundet analytt (som i kompetitive assay) osv., for å oppnå en konsistent og nøyaktig analyse.

Bruken av kulekolonner for å oppnå en effektiv interaksjon mellom kulene og forskjellige sporingsstoffer og/eller analytter er kjent fra analysemetoder som bruker mikrofluidbrikker (eng. microfluidic chips).

US 2009/0104077Al beskriver en metode for å utføre et ELISA-assay (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) i en mikrofluidbrikke. Den viste mikrofluidbrikken har en fluidkrets som omfatter en kolonnestruktur fylt med kuler som virker som fastfasen. En ELISA-type reaksjon blir utført på kulene i kolonnestrukturen ved først å danne et kule - biomarkør - enzym-merket antistoffkompleks. Overskuddet av enzym-merket antistoff blir deretter fjernet ved å la en vaskevæske strømme gjennom kolonnen ved anvendelse av en sentrifugalkraft. Et viktig trekk med nevnte metode er evnen til å sirkulere den samme vaskevæsken flere ganger gjennom kolonnen for å oppnå et forbedret vasketrinn. Etter rense- eller vasketrinnet blir et fargegenererende substrat påført de enzym-merkede kompleksene og den genererte fargen kan for eksempel bli målt ved kolonnestrukturen. Minst en ende av kolonnestrukturen ender i en innsnevret passasje som hindrer fastfasekulene i å passere ut av kolonnen.

WO 2011/081530 Al viser en prosesseringskassett (dvs. en mikrofluidbrikke) for å analysere en prøve, for eksempel en biologisk prøve slik som helblod. Kassetten er tilpasset for bruk i et sentrifuge-analyseinstrument. Kassetten kan omfatte spesifikke fluidkretselementer beskrevet som feller. Et slikt element blir brukt for å danne en kolonne av fastfase-partikler (kuler), hvor partiklene kan bli holdt tilbake mens et fluid blir passert gjennom kolonnen. Ved passende å endre retningen tile n påført sentrifugalkraft relativt til kassetten blir et fluid, inneholdende forskjellige reaktanter (feks. biomarkør og sporingsstoff) som reagerer med fastfase-partiklene, passert gjennom kolonnen flere ganger. Utformingen av fellene unngår bruken av et filter, eller en smal fluidvei, for å oppnå en kolonne av partikler eller kuler. Fjerning av overskudd reagenser blir oppnådd ved repeterte vaskinger av partiklene. Beskrivelsen av fellene og deres anvendelse, så vel som konseptet med mikrofluidbrikker som har en fluidkrets gjennom hvilken krets en prøve omfattende en analytt, og forskjellige eventuelle reagenser og løsemidler, kan bli flyttet ved bruken av sentrifugalkraft, er herved inkorporert ved referanse.

I andre assaysystemer blir ferromagnetiske partikler brukt som fastfasen for å forenkle vaske- eller separasjonstrinnene. En magnet blir da midlertidig brukt til å trekke partiklene til en vegg i en reaksjonsbeholder og å holde dem tilbake under separasjon fra væsken. Når reaksjonsbeholderen blir flyttet bort fra magneten er partiklene frie til å bli re-suspendert i løsning. Imidlertid er de magnetiske partiklene optisk tette grunnet deres innhold av ferromagnetiske materialer og de vil følgelig betydelig dempe den optiske avlesningen. Av denne grunn er ikke ferromagnetiske partikler egnet for bruk i kombinasjon med sporingsstoff - merkelapper som blir bundet til partiklene gjennom assay et.

I det tekniske området relater til prøveanalyse, slik som analyse av biomarkører, er både bruken av en stasjonær og en mobil fastfase i assay kjent. Den foreliggende oppfinnelsen angår inter alia bruken av slike assay i mikrofluidbrikker (dvs. prosesseringskassetter) som har en fluidkrets gjennom hvilken krets en prøve omfattende en analytt, og forskjellige valgfrie reagenser og løsemidler, kan bli flyttet ved bruken av sentrifugalkraft. Slike mikrofluidbrikker er vist i for eksempel Schultz et al. Clin. Chem. 1985, 31, 1457, US patent nr. 488763, og de overnevnte patentsøknadene US 2009/0104077 Al og WO 2011/081530 Al.

I heterogene analytiske assay er effektiv og reproduserbar separasjon (vasking) av overskuddet ikke-bundet sporingsstoff fret sporingsstoffet som er bundet til fastfasen essensielt for pålitelige analytiske resultater. Effektiv vasking er spesielt viktig i analyser med høy følsomhet.

En fastfase som har en porøs struktur, slik som porøse membraner, er vanskeligere å vaske effektivt enn fastfaser som har glatte overflater slik som de tilgjengelig på brønnvegger, mikro-søyler eller kuleformede partikler. Imidlertid opplever en fastfase omfattende kuleformede partikler (f.eks. kuler) tettpakket til en kolonne noen av de samme vanskelighetene som de man opplever i porøse membraner med hensyn til effektiv og reproduserbar vasking. Den tette interaksjonen mellom kulene i en pakket kolonne tilveiebringer en temporær porøs struktur (dvs. på grunn av hulrom som dannes i mellom kulene) i hvilken ikke-bundne sporingsstoffer (dvs. sporingsstoff ikke bundet til fastfasen) lett blir fanget på en ikke-spesifikk måte. I kjent teknikk blir slike kolonner vasket ved å passere en vaskevæske gjennom kolonnen. Imidlertid, selvom en slik vasking blir repetert flere ganger (ref. beskrivelsen til US 2009/0104077A1), vil i det minste noe av det ikke-bundne sporingsstoffet forbli fanget i den porøse strukturen og følgelig ha en negativ virkning på reproduserbarheten og sensitiviteten til assayet.

Basert på kjent teknikk er det et behov for en fremgangsmåte for å utføre en analyse av en analytt i en prøve (f.eks. en biologisk prøve) som unngår i det minste noen av ulempene ved de kjente fremgangsmåtene. Dette er hovedsakelig knyttet til både det å ha en konstellasjon av analytten, fastfase-kulene og sporingsstoff, som forenkler effektiv interaksjon (binding) mellom dem og deretter å skape en annen konstellasjon i hvilken effektiv separasjon (vasking) av overskudd sporingsstoff (dvs. sporingsstoff ikke bundet til kulene inkludert analytt-sporingsstoff komplekser som i kompetitive assay) blir oppnådd.

Den foreliggende oppfinnelsen angår et nytt fremgangsmåteprinsipp for heterogene analytiske assay som involverer binding, eller blokkering av binding (som i et kompetitivt assay), av en analytt til en fastfase og etterfølgende effektiv separasjon av ikke-bundet sporingsstoff i en forenklet vaskeprosess.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å analysere en analytt i en prøve som unngår eller minsker i det minste noen av ulempene ved den kjente teknikken. Fremgangsmåten er definert i de vedlagte krav, og i det følgende: I en første utførelsesform tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for å analysere en prøve som inneholder en analytt som skal bestemmes kvalitativt og/eller kvantitativt; fremgangsmåten omfattende et bindingstrinn og et vasketrinn, hvor bindingstrinnet omfatter: a) å tilveiebringe kuler i stand til å binde analytten, kulene eventuelt omfattende en definert mengde med analytt-sporingsstoffenheter, og kulene har en tetthet ml; b) å interagere analytten med kulene, analytten eventuelt interagert med et sporingsstoff før, under eller etter interaksjon med kulene; c) å oppnå en struktur av pakkede kuler omfattende kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt komplekser som har en tetthet m2; og

vasketrinnet omfatter:

d) å dispergere de pakkede kulene i en væske som har en tetthet d > m2 og ml; og e) å separere væsken og kulene omfattende de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir strukturen av pakkede kuler oppnådd ved å hen kulene anordnet i et hulrom eller fluidkrets, hulrommet eller fluidkretsen omfatter en første og en andre åpning, og et

partikkeltilbakeholdingselement, fortrinnsvis et filterelement, anordnet ved en av nevnte åpninger. Minst en del av hulrommet eller fluidkretsen er fortrinnsvis hovedsakelig kolonneformet.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er hulrommet eller fluidkretsen del av en indre fluidkrets til en mikrofluidbrikke, gjennom hvilken fluidkrets forskjellige reaktanter, inkludert kuler og en prøve som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er partikkeltilbakeholdingselementet i stand til å holde tilbake kulene og kule-analytt kompleksene i hulrommet eller fluidkretsen.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir trinn b) utført i en første væske som har en tetthet dl < ml.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter bindingstrinnet et trinn med å separere den første væsken og kulene.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir trinn d) forutgått ved å tilsette en andre væske, som har en tetthet d2 > m2 og ml, til de pakkede kulene.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kulene av syntetisk polymer, slik som polystyren og PMMA. Kulene har fortrinnsvis en diameter i området 0.1 til 50 um, 0.5 til 50 um og 2 um til 20 um.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kulene og/eller sporingsstoffene tilveiebrakt som tørkede formuleringer.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter bindingstrinnet å pakke kulene ved å påføre en sentrifugalkraft i en første retning relativt til hulrommet eller fluidkretsen, slik at strukturen av pakkede kuler i trinn c) kan bli oppnådd.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omfatter vasketrinnet å påføre en sentrifugalkraft i hovedsakelig den første retningen i løpet av trinn d).

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir kulene, omfattende de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene, overført fra hulrommet, eller fluidkretsen, ved å påføre en sentrifugalkraft som har en andre retning forskjellig fra den første retningen nevnt over.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfatter fremgangsmåten et trinn med å analysere de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene, slik at analytten i prøven blir kvalitativt og/eller kvantitativt bestemt. Analysemidlene vil avhenge av typen sporingsstoff tilstede i de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen har sporingsstoffet en tetthet n > m2.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir kuler og et sporingsstoff reagert med en standardisert analytt for å oppnå kulene omfattende en definert mengde med analytt-sporingsstoff i trinn a). For eksempel, i tilfellet av å utføre fremgangsmåten i en mikrofluidbrikke, blir kulene omfattende en definert mengde med analytt-sporingsstoff vanligvis fremstilt på forhånd, og ofte tilveiebrakt som en tørket formulering i mikrofluidbrikken.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er analytten en biomarkør.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er sporingsstoffet en nanopartikkel og/eller har en tetthet på minst 1.1, minst 1.5, minst 2.0, og enda mer foretrukket minst 3.0 g/cm<3>.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er sporingsstoffet, og følgelig de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene, optisk detekterbare, fortrinnsvis ved å være luminescerende eller ved å ha distinkt målbar absorbans eller lysspredningsegenskaper.

I en ytterligere utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, har kulene en tetthet på mindre enn 1.5, mindre enn 1.3, mindre enn 1.2, eller mindre enn 1.1 g/cm<3>.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen også for bruken av en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen i en mikrofluidbrikke for et sentrifugeapparat i stand til å variere orienteringen av mikrofluidbrikken relativt til en påført sentrifugalkraft,

mikrofluidbrikken omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter i fremgangsmåten, inkludert kulene og en prøve som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraften.

I nok et ytterligere aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen en mikrofluidbrikke for bruk i en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, mikrofluidbrikken tilpasset for et sentrifugeapparat i stand til å variere orienteringen av mikrofluidbrikken relativt til en påført sentrifugalkraft, og omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter i fremgangsmåten, inkludert kulene og prøven inneholdende minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft.

Kort beskrivelse av tegningene

Figurer la - lk er skjematiske tegninger som viser trinnene anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Figurer 11 - lp er skjematiske tegninger som viser et oppfinnerisk konsept for å flytte kuler i en mikrofluidkrets. Konseptet kan fordelaktig bli kombinert med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Figurer 2a - 2b er skjematiske tegninger som viser et oppfinnerisk konsept for å separere kuler av forskjellige tettheter i en fluidkrets.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Definisjon av uttrykk

Uttrykket «analytt» er i sammenheng med den foreliggende oppfinnelsen å bli forstått å dekke enhver forbindelse som kan bli bestemt, kvantitativt eller kvalitativt, i fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Spesielt er uttrykket "analytt" ment å omfatte enhver forbindelse som kan brukes som en indikator for en spesifikk sykdomstilstand eller en annen fysiologisk tilstand til en organisme, fortrinnsvis menneskekroppen (dvs. en biomarkør). Biomarkøren kan for eksempel være en biomarkør for Anemi, slik som Erytropoietin (EPO) Ferritin, Løselig Transferrin Reseptor (sTrR), Folsyre (folater), Transferrin, Hemoglobin, Vitamin Bl2, en biomarkør for bensykdommer slik som Alkalisk fosfatase (ALP), Osteokalsin, Paratyroid Hormon (PTH), Benspesifikk Alkalisk Fosfatase (BSAP), Vitamin D, 1,25 Dihydroksy, C-Terminal Type I Kollagen Telopeptid (CTx), Vitamin D, 25 Hydroksy, N-terminal Type I Kollagen Telopeptid (NTx), en biomarkør for en hjertesykdom slik som Apolipoprotein E (Apo E), Hjerne Natriuretisk Peptid (BNP), LDH, CK, CKMB, Pro-B-type Natriuretisk Peptid (Pro-BNP), C-Reaktivt Protein (CRP), Troponin I, Troponin T, CRPhs (ultrasensitiv), en biomarkør for Diabetes slik som C-Peptid, HbAlc, IA-2 Antistoff, Insulin, Fruktosamin, Insulin Vekstfaktor (IGF-1), Glukagon, Mikroalbumin, Glukose, Proinsulin, Antistoff, en biomarkør relatert til Endokrinologi slik som Alfa-Føtoprotein, Veksthormon, Adrenalt Kortikotropisk Hormon (ACTH), Vekstfrigjørende faktor (GRF), Kortikosteron, Prolaktin, Kortisol, Testosteron, Hårsekkstimulerende Hormon (FSH), en biomarkør relatert til Gastroenterologi slik som Gastrin, Lipase, en biomarkør relatert til smittsomme sykdommer slik som Anti-Borrelia, Anti-Rubella, Anti HBs, Anti-HBc, Anti-HBe, Anti-HCV, Anti-HIV I/II og andre antistoffer mot smittsomme agens så vel som spesifikke antigener som er del av den smittsomme agens slik som HIV-p24, HBsAg og andre, biomarkører relatert til Betennelse/Immunitet slik som Immunoglobuliner (IgA, IgG, IgM, IgE, IgD og underklasser derav), Klusterin (Apolipoprotein J), C-Reaktivt Protein (CRP), CRPhs (ultrasensitiv), Prokalsitonin (PCT), Heparinbindende Protein(HPB), Kalprotektin, Humant Nøytrofilt Lipokalin/Nøytrofil Gelatinase-Assosiert Lipokalin (HNL/NGAL), Endotelin-1, Fibrinogen, Glukose-6-Fosfat Dehydrogenase (G-6-PDH, Monokin Indusert ved IFNy (MIG/CXCL9), IFN-alfa, Neopterin, IFNy (IL-2, IL-4, IL-10) - 4-plex, IL-10, IL-10 (IL-2, IL-4 ,IFNy) - 4-plex, IL-10, Rantes/CCL5, IL-2 (IL-4, IL-10, IFNy) - 4-plex, IL-4 (IL-2, IL-10, IFNy) - 4-plex, Tumor Vekstfaktor (TGF-01), IL-6, Tumor Nekrosefaktor (TNFa), IL-8, biomarkører relatert til Lipidmetabolisme slik som Apolipoprotein AI (Apo AI), Kolesterol, Apolipoprotein All (Apo All), HDL-Kolesterol, Apolipoprotein B-100 (Apo B), LDL-Kolesterol, Apolipoprotein B48 (Apo B48), Lekitin Kolesterol Acyltransferase (LCAT), Apolipoprotein CII (Apo CII), Paraxonase (PON1), Apolipoprotein CIII (Apo CIII), Fosfatidyl Inositol Glykan F (PIGF), Apolipoprotein E (Apo E), Triglyserider, biomarkører relatert til Nefrologi slik som Alfa-GST, Beta-2-Mikroglobulin (serum), Mikroalbumin, Beta-2-Mikroglobulin (urin) Cystatin C, Kreatinin, biomarkører relatert til Onkologi slik som Karbohydrat Antigen 19-9 (CA19-9), Prostataspesifikt Antigen (PSA), Karsinogent Embryonisk Antigen (CEA), Vaskulær Endotel Vekstfaktor (VEGF), Fibroblast Vekstfaktor (FGFb), og biomarkører relatert til Tyroidtilstander slik som Anti-Tyroid Peroksidase Ab (TPO), Tyroidstimulerende Hormon (TSH), Anti-Tyroglobulin Ab, Totalt Tyroksin (T4), Fritt Tyroksin (FT4), Totalt Trijodtyronin (T3), Fritt Trijodtyronin (FT3), TSH Reseptor Ab, og Tyroglobulin.

Uttrykket "sporingsstoff er ment å omfatte ethvert stoff som enten er i stand til å binde til en analytt av interesse (f.eks. en biomarkør) eller en kule (uttrykket kule er definert under), og har egenskaper som gjør dem kvantifiserbare eller identifiserbare ved enhver egnet teknikk vanlig innen fagområdet analytisk kjemi/biologi (dvs. de kan bli detektert optisk, magnetisk, elektrisk eller ved stråling). Egenskaper av spesiell interesse er de som muliggjør optisk detektering, f.eks. at sporingsstoffet kan absorbere og/eller spre lys slik som en kromofor, eller viser luminescerende egenskaper slik som fluorescens eller fosforescens, eller sporingsstoffet er ikke direkte optisk detekterbare, men i stand til å reagere med et ytterligere stoff for å tilveiebringe et reaksjonsprodukt som er optisk detekterbart. Bindingsdelen til sporingsstoffet som er egnet for å binde til analytten (f.eks. en biomarkør) av interesse, eller kulen, omfatter for eksempel proteiner, nukleinsyrer, karbohydrater og kelaterende forbindelser. Spesifikke bindingsdeler inkluderer antistoffer, antigener, nukleinsyreprober eller andre bio-spesifikke reseptorligand-systemer.

Eksempler på sporingsstoffer egnet for bruk i den foreliggende fremgangsmåten inkluderer de som omfatter nanopartikler, fortrinnsvis metallbaserte nanopartikler, og enzymer. Nanopartikkelen til et sporingsstoff er typisk 3 til 100 nm i diameter. Foretrukne nanopartikler inkluderer metallbaserte partikler slik som gull (p=19.3 g/cm<3>), sølv (p=10.5 g/cm<3>), eller jern (p=7.9 g/cm<3>) kolloider og uorganiske krystaller slik som oppkonverterende nanopartikler (UCNPer; p typisk 4 til 5<g>/cm3).

Bruk av metallbaserte nanopartikler som sporingsstoffer er velkjent, for en oversiktsartikkel om gull-nanopartikler se for eksempel S. Zeng et al; "A review of functionalized gold nano particles for biosensing applications". Plasmonics 6 (3): 491-506.

For en oversiktsartikkel om UCNPer egnet for bruk i den foreliggende fremgangsmåten se for eksempel Cheng et al. Nanoscale, 2013, 5, 23 og Ang et al. Nanomedicine, 2011, 6, 1273.

Bruk av fluoroforer som sporingsstoffer er omfattende referert i for eksempel The Molecular Probes® Handbook— A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, by Life Technologies™.

Andre stoffer som ikke er optisk detekterbare per se kan også bli brukt som sporingsstoffer. For eksempel, når den foreliggende fremgangsmåten blir brukt for å utføre et ELISA-type assay er ikke sluttanalysen av det resulterende kule - analytt - sporingsstoff komplekset avhengig av en direkte optisk deteksjon av sporingsstoffet, men av reaksjonsproduktet (som tilveibringer et farge-, fluorescerende eller elektrokjemisk signal) fra en reaksjon mellom et enzym på sporingsstoffet og et egnet substrat.

Eksempler på metoder for å syntetisere egnede sporingsstoffer er omfattende vist i kjent teknikk, og å oppnå sporingsstoffer egnet for fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelsen er godt innenfor kunnskapen til en fagperson innen syntetisk kjemi eller biokjemi.

Uttrykket "kule" er ment å omfatte enhver type fastfase-partikler eller kuler, og er fortrinnsvis kuleformede mikro- eller submikro-partikler som har en diameter på 0.1 til 50 um, 0.5 til 50 um, fortrinnsvis en diameter på 2 um til 20 um. Disse partiklene kan være porøse eller ha en glatt fast overflate. De kan være kompakte eller ha ett eller flere skall som omslutter ett eller flere kjernematerialer inne i kulene som kan være faste materialer, væsker eller gasser. Kulene kan være ugjennomsiktige eller transparente. Fortrinnsvis er kulene hovedsakelig transparente og lagd av polymere med en volumetrisk massetetthet (p) litt over tettheten til vann (p=1.0 g/cm<3>). Typisk er kulene lagd av polystyren (p=1.05 g/cm<3>), polymetylmetakrylat (p=1.18 g/cm<3>) eller andre egnede materialer. Videre omfatter en kule flere kovalent koblede molekylstrukturer eller enheter i stand til å binde en analytt av interesse. Slike molekylære strukturer eller enheter kan for eksempel være et antistoff eller fragmenter derav, en nukleinsyre, en aptamer, en kelaterende struktur og liknende. I den foreliggende søknaden kan kulene i tilfellet av kompetitive assay også omfatte en definert mengde med analytt-sporingsstoffenheter (dvs. en enhet bestående av en analytt bundet til et sporingsstoff). Uttrykket "definert mengde" er i denne sammenhengen ment å bety at kulene er standardiserte for å tilveiebringe et kjent analytisk resultat eller signal. Ved å analysere kulene, som til å begynne med har en definert mengde med analytt-sporingsstoffenheter, etter interaksjon med en konkurrerende analytt fra en prøve og å sammenligne analyseresultatet med nevnte kjente analytiske resultat, kan analytten bli bestemt/målt.

Uttrykket "kvalitativt og/eller kvantitativt bestembart kule-analytt kompleks" er i den foreliggende søknaden ment å bety et kompleks omfattende en kule, en analytt og et sporingsstoff. En kvalitativ og/eller kvantitativ analyse av et slikt kompleks vil tilveiebringe en indirekte kvalitativ og/eller kvantitativ analyse av analytten som skal bestemmes fra en prøve. Den spesifikke strukturen til et bestembart kule-analytt kompleks vil variere ifølge typen assay som blir utført. For eksempel vil komplekset i et ikke-kompetitivt assay ideelt omfatte en kule, hvor kulen bare er bundet til minst en analytt-sporingsstoffenhet, mens i et kompetitivt assay kan komplekset omfatte en kule bundet til både en analytt-sporingsstoffenhet og en analytt uten et sporingsstoff.

Uttrykket "sandwich-kompleks" er i den foreliggende søknaden ment å bety et kompleks omfattende en kule, en analytt og et sporingsstoff. Et "sandwich-kompleks" er typisk et kvalitativt og/eller kvantitativt bestembart kule-analytt kompleks, men uttrykket kan i forbindelse med kompetitive assay også benevne en kule omfattende en definert mengde med analytt-sporingsstoffenheter som beskrevet over.

Uttrykkene d, dl, d2 osv. er ment å betegne den volumetriske massetettheten til en gitt væske i g/cm<3>.

Uttrykkene m, ml, m2 osv. er ment å betegne den volumetriske massetettheten til et gitt fast materiale i g/cm3.

Uttrykket "væske" er ment å omfatte enhver væske egnet for bruk i det spesifikke assay som blir utført. Egnetheten til en spesifikk væske i et spesifikt assay kan lett vurderes av en fagperson. Videre kan den nødvendige volumetriske massetettheten til enhver væske bli endret ved additiver som blir løst i eller blandet med væsken. Dette er tilfellet for enhver type materiale involvert, slik som forskjellige stoffer, salter, væsker eller gasser, forutsatt at de vil blande og løse seg ordentlig. Endringen av tetthet er relatert til konsentrasjon og relativ tetthet av de involverte stoffende. Alle løsbare forbindelser som har en tetthet forskjellig fra løsemiddelet vil påvirke tettheten til løsningen/væsken. Sjøvann har typisk en høyere tetthet (omtrent 1.025 g/cm<3>) enn rent ferskvann (1.00 g/cm<3>). En rekke stoffer blir brukt for å endre tettheten til vandige løsninger, spesielt i fagområdet av tetthetsgradient-sentrifugering. Disse inkluderer stoffer som sukrose, sukrosepolymerer, forskjellige belagte kolloider og Cesiumklorid, så vel som en rekke jod-inneholdende stoffer, slik som jodiksanol, jodheksol, metrizamid og andre som lett løser seg i vann i høye konsentrasjoner.

Uttrykket "reaktant" i forbindelse med den foreliggende søknaden er ment som et generelt uttrykk for en komponent tilstede i analysemetoden, slik som en analytt, sporingsstoff eller en bindende molekylær enhet på en kule.

Uttrykket "tørket formulering" refererer til reagenser, inkludert preparater av kuler og nanopartikler som kan bli inkorporert i en anordning brukt for å kjøre assay et. Disse tørkede formuleringene kan bli fremstilt ved vakuumtørking eller ved frysetørking. Frysetørkede formuleringer som uniforme dråpeformede alikvoter med en størrelse mellom mindre enn 1 uL til 200uL, blir ofte referert til som Lyospheres. Disse kan produseres i bulk og deretter dispensert e netter en inn i analyseanordningen.

Det generelle prinsippet for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelsen beskriver en analysemetode hvori en veldig effektiv interaksjon mellom reaktant(er) i en første løsning og reaktant(er) festet til overflaten til fastfase-partikler, blir kombinert med en veldig effektiv vasking av fastfase-partiklene ved å bringe dem i suspensjon ved å bruke en andre løsning.

Fastfase-partiklene er kuler, eller kuleformede partikler, i mikro-størrelse.

Reaktantene, både i løsning og festet til overflaten av fastfase-partiklene vil variere i henhold til type assay som blir utført.

I et sandwich type ikke-kompetitivt immunoassay vil reaktantene i løsning være en analytt (for eksempel en type biomarkør tilstede i en biologisk prøve) og et sporingsstoff (for eksempel et merket antistoff selektivt for den spesifikke biomarkøren). Nevnte reaktanter kan blandes før interaksjon med fastfase-partiklene, dvs. tilført samtidig eller som en ferdigdannet analytt - sporingsstoffenhet, eller tilført sekvensielt (dvs. analytten er festet til fastfase-partiklene før et sporingsstoff blir påført). Reaktantene på overflaten til fastfase-partiklene vil være en molekylstruktur (f.eks. et antistoff) i stand til å binde analytten og/eller analytt - sporingsstoff enheten.

I et kompetitivt immunoassay kan reaktantene i løsning være en blanding av analytten tilstede i prøven og en mengde med analytt-sporingsstoffenheter fortrengt fra kulen av prøveanalytter. Reaktantene på overflaten til fastfase-partiklene (dvs. kuler) vil omfatte en molekylær enhet eller struktur (f.eks. et antistoff) i stand til å binde analytten tilstede i prøven, og hvor den molekylære strukturen opprinnelig er bundet til en analytt-sporingsstoffenhet.

For å oppnå en effektiv interaksjon blir fastfase-partiklene pakket tett sammen i en struktur, slik som en kolonne. Dette blir fortrinnsvis oppnådd ved å ha fastfase-partiklene tilbakeholdt i en seksjon, eller hulrom, til en fluidkrets i en assay-anordning (f.eks. en mikrofluidbrikke). Seksjonen eller hulrommet kan fordelaktig være hovedsakelig kolonneformet, men andre utførelser eller former er egnet. Fastfase-partiklene blir fortrinnsvis holdt tilbake i hulrommet ved et partikkeltilbakeholdingselement, slik som et filterelement, anordnet i seksjonen, eller hulrommet, til fluidkretsen. Fellene vist i WO 2011/081530 Al er en alternativ løsning for å tilveiebringe et hulrom omfattende et partikkeltilbakeholdingselement som ikke krever bruk av et filterelement.

Filterelementet er utformet eller valgt til å ha en porestørrelse eller spaltestørrelse som ikke tillater at fastfase-partiklene passerer gjennom det. Væskeløsningen blir fjernet fra fastfase-partikkelkolonnen eller partikkelsuspensjonen ved å påføre en sentrifugalkraft som virker fra siden av kolonnen som er på motsatt side av filterelementet og mot nevnte element. På denne måten blir væskeløsningen tvunget gjennom fastfase-partikkelkolonnen og filterstrukturen.

Strømmen av væske gjennom filteret kan bli kontrollert ved å bruke en ventil som kontrollerer utløpet av væske som passerer gjennom filteret. Det kan alternativt bli gjort ved å kontrollere mottrykket påført den utgående væsken som fra en væskekolonne som går hovedsakelig parallelt til det kolonneformede hulrommet som inneholder fastfase-partiklene. Væsken kan deretter bli fjernet fra partiklene ved å endre orienteringen av assay-anordningen (f.eks. en mikrofluidbrikke) relativt til sentrifugalkraften.

For å oppnå en effektiv vasking av fastfase-partiklene blir partiklene suspendert ved å tilsette en andre væskeløsning. Den andre væskeløsningen har en tetthet som er høyere enn den volumetriske tettheten til fastfase-partiklene. Fastfase-partiklene vil i denne væsken, når eksponert for sentrifugalkrefter, begynne å pakke seg løs fra deres kolonneformet struktur og migrere ved flottering mot den overflaten av høytetthetsvæsken som er nærmest sentrifugeringsaksen. På denne måten vil fastfase-partiklene på deres vei mot overflaten bli dispergert i løsningen og også separert fra ikke-bundne sporingsstoffreagenser (f.eks. ikke-bundne sporingsstoff eller ikke-bundne analytt-sporingsstoff enheter) og andre løselige eller dispergerbare komponenter, som var fanget i den kolonneformede strukturen av pakkede fastfase-partikler i løpet interaksjonen av reaktantene i løsning med fastfasen. Dispergeringen av fastfase-partiklene i den andre væskeløsningen som oppnådd ved flottering vil herved tillate en effektiv vasking av disse partiklene når den andre væskeløsningen blir tappet fra det kolonneliknende hulrommet ved filtrering.

Separasjonen mellom "lav-tetthet" fastfase-partikler og andre dispergerbare materialer kan bli ytterligere forenklet når sistnevnte materialer inkluderer partikler med høyere tetthet enn den andre væsken. Disse partiklene kan være høy-tetthets nanopartikler slik som metallkolloider eller polymer-mikropartikler med høyere tetthet enn den andre væsken. I denne situasjonen blir partiklene med høyere tetthet enn den andre væsken trukket vekk fra sentrifugeringsaksen, mens partiklene med lav tetthet beveger seg mot sentrifugeringsaksen. Graden av separasjon vil avhenge av forskjellene i tetthet til de involverte komponentene og væsker, størrelsen på partiklene, sentrifugalkraften som blir påført og sentrifugeringstiden.

De pakkede fastfase-partiklene blir således suspendert ved å endre tettheten til løsningen som omgir partiklene. Når tettheten til denne løsningen, dvs. den andre væskeløsningen, er høyere enn den til selve partiklene vil partiklene flyte, dvs. bevege seg i en retning motsatt av retningen til den påførte gravitasjons- eller sentrifugalkraft. Når sentrifugalkrefter virker på partikler med lavere tetthet enn væsken som omgir dem vil de gradvis migrere til overflaten av løsningen som er nærmest sentrifugalsenteret, mens komponenter med høyere tetthet enn væsken vil ha en tendens til å sedimentere, dvs. migrere til det volumet av løsningen som er lengst borte fra sentrifugalsenteret. En viktig fordel oppnådd ved å suspendere fastfase-partiklene etter å ha utført bindingstrinnet til et assay er at overskudd sporingsstoff som er fanget eller tilbakeholdt på en ikke-spesifikk måte grunnet den porøse strukturen, oppnådd ved å pakke fastfase-partiklene i en kolonne, blir frigjort og følgelig letter fjernet.

På denne måten kan for eksempel sporingsstoffer med høyere tetthet enn væsken bli effektivt separert fra komponenter med lavere tetthet enn væsken. Væsken inkludert komponentene med høyere tetthet dispergert i væsken kan deretter tappet ut gjennom filteret, mens fastfase-partiklene vil bli stoppet når de når filteret. Gjentatte vasketrinn av fastfase-partiklene kan bli utført ved gjentatte re-suspensjoner og tappetrinn.

Å ha sporingsstoffer med en tetthet høyere enn fastfase-partiklene er fordelaktig, men re-suspensjonen av fastfase-partiklene pakket i en kolonne vil også tilveiebringe et sterkt forbedret vasketrinn når sporingsstoffene har lik eller lavere volumetrisk tetthet enn fastfase-partiklene. I det siste tilfellet blir sporingsstoffet fortsatt frigjort fra den porøse strukturen som diskutert over, og følgelig lettere fjernet fra fastfase-partiklene når den andre væskeløsningen blir tappet gjennom filterelementet.

Denne løsningen tilveiebringer en enkel måte for å vaske av overskuddet av sporingsstoff.

En ytterligere fordel med å bruke fastfase-partikler eller kuler i en «lab-on-a-chip»-anordning (dvs. mikrofluidbrikke, prosesseringskassett eller liknende) er at kuler i suspensjon kan, gjennom hele assayet, bli overført til forskjellige posisjoner/steder inne i anordningen. Dette kan inkludere mikrofluidoverføring av partiklene til hulrom i en fluidkrets som ikke er tidligere blitt forurenset med sporingsstoffet og/eller til hulrom som er spesifikt utformet for optimalisert funksjonalitet for de individuelle trinn. Dette kan for eksempel gjøre det mulig å først ha kulene i et hulrom optimalisert for lagring, deretter overføre kulene til et hulrom optimalisert for fast interaksjon (dvs. en kolonneformet struktur), deretter overføre kulene til et hulrom optimalisert for vasking, videre til et hulrom optimalisert for avlesing og til slutt overføring til et hulrom for avfallslagring.

Som beskrevet kan anordningen brukt for å analysere prøven være en mikrofluidbrikke eller kassett spesifikt utformet for mikrofluidprosessering av både prøvene og reagensene ifølge en spesifikk prosedyre. Disse kassettene blir vanligvis drevet ved et instrument som vil prosessere fluidene inne i kassettene ved pumper, ventil, sentrifugalkraft eller andre fysiske midler. Spesielt angår den foreliggende oppfinnelsen assay-systemer som blir kjørt inne i en mikrofluidbrikke ved sentrifugalkraft eller gravitasjon.

I et første oppfinneriske konsept beskriver den foreliggende søknaden også en effektiv fremgangsmåte for å separere kuler, eller fastfase-partikler, av forskjellig tetthet. Dette konseptet muliggjør analyse av flere analytter på samme tid, etterfulgt av enkel separasjon av de forskjellige resulterende kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene. Det første konseptet er videre beskrevet under.

I tillegg til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, omfattende et interaksjons- eller bindingstrinn etterfulgt av et svært effektivt og enkelt vasketrinn, beskriver denne søknaden også et andre oppfinnerisk konsept ved hvilket konsept kulene kan bli effektivt overført fra et hulrom til et annet, ved å bruke en væske med høyere tetthet enn kulene, ved dekantering av, følgelig å overføre, kulene som flyter i den øvre delen av væsken, dvs. kulene som har migrert (eller fløtet) i en retning mot sentrifugeringsaksen som genererer sentrifugalkraften, inn i et annet hulrom. Det andre konseptet er videre beskrevet under.

Både det første og det andre oppfinneriske konseptet kan fordelaktig bli kombinert med oppfinnelsen ifølge den foreliggende søknaden, men er ikke på noen måte begrenset til slik bruk.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

En skjematisk representasjon av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vist i fig. la-k. Fremgangsmåten er ment for å analysere en prøve med hensyn til en eller flere analytter av interesse. Fremgangsmåten er egnet for enhver type prøve som kan bli løst i en væske, og også for å detektere/kvantifisere enhver type forbindelse eller stoff i nevnte prøve for hvilken et assay for å utføre en slik analyse kan tilveiebringes.

I det følgende er prøven antatt å være en biologisk prøve, og målforbindelsene eller -stoffene er fortrinnsvis biomarkører, og kan være proteiner (antigener, enzymer, antistoffer), nukleinsyrer, legemidler, hormoner, næringsstoffer, metabolitter, mikroorganismer, celler eller ethvert slikt molekyl eller sammenstilling av molekyler som kan bli målt i et assay inkludert en eller flere selektive bindere. Fremgangsmåten er basert på det velkjente prinsippet med å reagere en biomarkør med en fastfase-partikkel (dvs. kuler og kuleformede partikler i mikro-størrelse osv.), hvor fastfase-partikkelen omfatter en molekylærstruktur eller enhet i stand til å binde til biomarkøren. Egnede molekylære enheter er for eksempel antistoffer hvis biomarkøren er et antigen. I tillegg til fastfase-partiklene og biomarkøren må et sporingsstoff være tilstede. Sporingsstoffet har en molekylær enhet i stand til å binde biomarkøren.

Fastfase-partiklene eller kulene er som definert over.

Sporingsstoffet(ene) er som definert over.

De første trinnene i et typisk heterogent immunoassay består av å interagere, kontakte, inkubere, spyle eller blande den biologiske prøven, omfattende biomarkøren som skal kvantifiseres eller identifiseres, med kuler og/eller sporingsstoffer i en første væske, se fig. la-e. En "sandwich"-type konfigurasjon blir i dette tilfellet etablert hvor mål-biomarkøren virker som linker mellom fastfase-partikkelen og sporingsstoffet. Disse interaksjonene kan bli utført sekvensielt i begge rekkefølger eller med alle de involverte reaktanter påført sammen. Det blir fortrinnsvis etablert et fast støkiometrisk forhold mellom biomarkør og sporingsstoff på 1:1 i disse "sandwich-kompleksene". I et ikke-kompetitivt assay er både kulene og sporingsstoffene i stand til å binde biomarkøren. Sporingsstoffene og fastfase-partiklene kan bære flere biomarkør-spesifikke reseptorer og kan følgelig binde til flere biomarkørmolekyler. Vanligvis er imidlertid assayene utformet for å inneholde et stort overskudd av sporingsstoffer relativt til biomarkøren. Statistisk vil dermed hvert biomarkørmolekyl kun binde til ett sporingsstoff. Hver mikrosfæriske kule fremviser imidlertid en veldig stor overflate og kan binde flere målbiomarkører og følgelig sporingsstoffer.

I denne spesifikke forenklede utførelsesformen som vist for å illustrere prinsippet, blir assay et utført i et W-formet hulrom, fluidkrets eller prøverørsarrangement 1. Hulrommet 1 omfatter et første utløp 2 og et andre utløp 3, et innløp 4 og et første filterelement 5 og et andre filterelement 6. Det første filterelementet 5 anordnet mellom innløpet 4 og det første utløpet 2. En seksjon anordnet mellom innløpet og det første filterelementet danner en kolonnestruktur 7. Pilen G viser retningen til en påført sentrifugalkraft (eller gravitasjonskraften, selv om bruken av gravitasjon kun ville tilveiebringe et betydelig tregere assay) i forhold til hulrommet eller prøverøret. Hulrommet 1 kan være en del av en fluidkrets i en mikrofluidbrikke, for eksempel en mikrofluidbrikke som vist i den kjente teknikken beskrevet i bakgrunnen for den foreliggende søknaden. I det tilfellet kan hulrommet bli sett som å være anordnet i et plan som er vinkelrett i forhold til en rotasjonsakse utenfor mikrofluidbrikken. Den nødvendige sentrifugalkraft G blir således oppnådd ved rotasjon av mikrofluidbrikken rundt nevnte akse, og retningen til sentrifugalkraften i forhold til hulrommet i mikrofluidbrikken kan bli endret ved å rotere selve mikrofluidbrikken.

Det spesifikke assayet illustrert ved figurer la-e er et ikke-kompetitivt assay. I et slikt assay kan rekkefølgen som de forskjellige komponentene til assayet blir interagert, kontaktet eller blandet, velges tilfeldig da både kuler 8 og sporingsstoffer 9 (se fig. Id) er tilveiebrakt i et stort overskudd, og de vil ikke reagere med hverandre uten nærvær av en mellomliggende biomarkør. Videre kan blandingen, interageringen eller kontakten (dvs. bindingstrinnet) fordelaktig omfatte å passere den overnevnte første væsken gjennom en plugg, eller kolonne, dannet av kulene 8 for å sikre at reaksjonen mellom kulene, sporingsstoffene 9 og biomarkøren er så komplett som mulig. Pluggen eller kolonnen blir oppnådd ved å ha kulene pakket i et kolonneformet hulrom 7 eller volum. Det kolonneformede hulrommet 7 kan fortrinnsvis være en del av en fluidkrets i en «lab-on-a-chip»-anordning (dvs. en fluidkrets i en mikrofluidbrikke eller prosesseringskassett).

I figurer la og lb blir kuler suspendert i en væske introdusert gjennom innløpet 4. Væsken har en tetthet som er lavere enn tettheten til kulene Tettheten til kulene er betegnet ml g/m<3>. På grunn av sentrifugalkraften G vil kulene pakkes til en kolonneformet struktur avgrenset ved det kolonneformede hulrommet 7 og det første filterelementet 5, se fig. lc. Kulene blir holdt tilbake i det kolonnen-formede hulrommet på grunn av det første filterelementet 5 anordnet ved en ende av nevnte hulrom. Filterelementet kan omfatte et filter, gitter, sil, smal(e) spalte(er) eller liknende, og er i stand til å forhindre kulene fra å passere gjennom det.

I et neste trinn, se. Fig ld, blir sporingsstoff 9, suspendert i en væske omfattende en biomarkør, introdusert gjennom innløpet 4. I denne spesifikke utførelsesformen har prøven omfattende biomarkøren blitt tillatt å interagere med sporingsstoffet før interaksjon med kulene, og prøven kan følgelig utgjøre en del av væsken i hvilken sporingsstoffet blir suspendert. Den kombinerte væsken, oppnådd fra væsken som suspenderer kulene og væsken som suspenderer sporingsstoffet, har en tetthet som er lavere enn kulene Den kombinerte væsken blir betegnet den første væsken, og tettheten til nevnte væske blir betegnet dl g/cm<3>.

Den første væsken omfattende sporingsstoff og biomarkør, så vel som komplekser dannet ved interaksjonen av sporingsstoff og biomarkør, blir ledet gjennom de pakkede kulene. Når man leder den første væsken gjennom de pakkede kulene blir det dannet "sandwich-komplekser" omfattende en kule, en biomarkør og et sporingsstoff. Filterelementet 5 er slik at sporingsstoff 9, og komplekser dannet ved interaksjonen av sporingsstoff og biomarkør, kan passere gjennom, se fig. Id. Den første væsken blir ledet gjennom kolonnen og ledet ut av det W-formede hulrommet 1 eller prøverøret ved å endre retningen til den påførte sentrifugalkraften G, se figurer lf-h. I alternative utførelsesformer kan den første væsken for eksempel bli ledet ut av hulrommet ved bruk av en ventil plassert under det første filterelementet.

Rekkefølgen på interaksjonen mellom kulene 8, sporingsstoff 9 og biomarkør er avhengig av hvilken løsning som er mest egnet, eller passende, i et spesifikt tilfelle. Prøven omfattende biomarkøren kan således være en del av væsken i hvilken sporingsstoffet 9 er suspendert, eller en del av væsken som kulene 8 er suspendert i.

Interaksjonen mellom kuler, sporingsstoff og biomarkør behøver ikke være komplett etter en enkelt gjennomstrømming av den første væsken gjennom kolonnen med pakkede kuler. Den første væsken som kan omfatte ureagert sporingsstoff, biomarkør og komplekser dannet ved interaksjonen av sporingsstoff og biomarkør (dvs. analytt-sporingsstoff enheter) blir fordelaktig ledet gjennom de pakkede kulene gjentatte ganger ved reintroduksjon inn i innløpet 4. Slik reintroduksjon kan for eksempel oppnås ved å ha en sløyfestruktur (f.eks. en fluidkrets formet som en sløyfe) som kobler det første utløpet 2 med innløpet 4. Sistnevnte løsning er spesielt fordelaktig når det W-formede hulrommet er en del av en fluidkrets i en «lab-on-a-chip»-anordning. Etter reintroduksjon kan trinnene ifølge figurer, le-h bli repetert.

Avhengig av utformingen av assayet og konsentrasjonen av biomarkøren i prøven, kan hver av kulene bære fra ingen til mange tusen biomarkør-sporingsstoffkomplekser. Ettersom volumet til hver kule i en foretrukket utførelsesform er betydelig større enn volumet til et biomarkør-sporingsstoffkompleks, vil ikke bindingen av mange biomarkør-sporingsstoffkomplekser per kule påvirke den volumetriske massetettheten til kulene i noen betydelig grad. I et typisk eksempel er volumet til en kuleformet 5um

(diameter) kule nærmere 2 millioner ganger større enn volumet til et sporingsstoff på 40 nm.

Interaksjonen mellom kuler, sporingsstoff og biomarkør tilveiebringer en kolonne av pakkede kuler omfattende "sandwich-komplekser" (dvs. kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt komplekser) og ureagert sporingsstoff. Tettheten til "sandwich-kompleksene" blir betegnet som m2 g/cm<3>. I løpet av interaksjonen blir noe av det ureagerte sporingsstoffet 9 fanget eller holdt tilbake på en ikke-spesifikk måte på grunn av den porøse strukturen dannet av de pakkede kulene. For å oppnå et sensitivt og reproduserbart analyseresultat må så mye som mulig av det ureagerte sporingsstoffet bli separert fra kulene og "sandwich-kompleksene". I kjent teknikk blir separasjon av ureagert sporingsstoff utført ved gjentatte vaskinger ved å passere en vaskevæske gjennom kolonnen med pakkede kuler. Som diskutert over vil imidlertid slik vasking ikke fjerne alt av det fangede ureagerte sporingsstoffet, eller kreve et overdrevent og tidkrevende antall gjentatte vaskinger.

For å forbedre, eller til og med muliggjøre, separasjonen av det ureagerte sporingsstoffet fra kulene og "sandwich-kompleksene", blir en andre væske tilsatt til de pakkede kulene, se fig. li. Den andre væsken har en tetthet på d2 g/cm<3>, hvor d2 > ml og m2. Det skal påpekes at når brukt i et alternativt analytisk system, hvor den første væsken blir fjernet ved dekantering (dvs. i stedet for å passere den første væsken gjennom et filterelement), kan tettheten til kombinasjonen av den lille fraksjonen med den første væsken og den andre væsken bli betegnet d2'. Imidlertid vil tallverdien til d2' være omtrent identisk med d2, dvs. d2' > ml og m2 på grunn av det høye mengdeforholdet mellom volumet til den andre og den første væsken.

Et essensielt trekk ved den foreliggende fremgangsmåten er at den andre væsken har en tetthet som er høyere enn den til kulene og "sandwich-kompleksene". Tilsettingen av den andre væsken vil da sørge for at kolonnen med pakkede kuler desintegrerer, slik at den tette interaksjonen mellom kulene brytes opp. Når den tette interaksjonen mellom kulene brytes opp blir det fangede/tilbakeholdte ureagerte sporingsstoffet frigjort inn i den andre væsken. På grunn av deres lavere tetthet relativt til tettheten til den andre væsken, vil kulene og "sandwich-kompleksene" bevege seg imot retningen til den påførte sentrifugalkraften G, bort fra det første filterelementet 5, se fig. lj. For å fjerne ureagert sporingsstoff tidligere fanget/tilbakeholdt mellom de pakkede kulene, blir den andre væsken ledet ut av det W-formede hulrommet eller prøverøret gjennom det første utløpet 2 ved å endre retningen til den påførte sentrifugalkraften G, se fig. lk. I alternative utførelsesformer kan den andre væsken for eksempel bli ledet ut av hulrommet ved bruk av en ventil plassert under det første filterelementet 5.

Den viktigste effekten som oppnås ved å bruke en første og en andre væske med forskjellige tettheter er at kulene vil "sedimentere" i den første væsken, dl < ml mens de vil "flyte" i den andre væsken, d2 > ml. Uttrykkene "sedimentere" og "flyte" blir brukt for å beskrive posisjonen til kulene i væsken i forhold til en påført sentrifugalkraft G, dvs. når kulene "flyter" har de migrert i en retning motsatt av retningen til den påførte sentrifugalkraften, og omvendt for uttrykket "sedimentere".

Hvis den gjenværende mengden av ureagert sporingsstoff er for høy etter fjerning av den andre væsken kan trinnene med å tilsette og fjerne en andre væske, ifølge figurer li-k (dvs. vasketrinn), bli repetert et nødvendig antall ganger ved å bruke nye alikvoter av den andre væsken.

Som vist i denne spesifikke utførelsesformen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan sporingsstoffene fordelaktig ha en volumetrisk massetetthet på n g/cm<3>, hvor n > ml, m2 og d2. En slik tetthet vil sørge for at overskuddet av sporingsstoff vil "sedimentere" når den andre væsken blir tilført kulene og videre forenkle separasjonen av sporingsstoffet fra kulene og "sandwich-kompleksene". Dette kan være spesielt fordelaktig i en alternativ utførelsesform hvor kulene blir flyttet fra det kolonneformede hulrommet ved dekantering som nevnt over.

Imidlertid er det ikke påkrevd at sporingsstoffet har en spesifikk tetthet. Bare det faktum at kolonnen med pakkede kuler desintegrerer, slik at den tette interaksjonen mellom kulene blir brutt opp, vil sørge for at en forbedret fjerning av overskuddet med sporingsstoff blir oppnådd når den andre væsken blir fjernet. I tillegg til den volumetriske massetettheten kan andre egenskaper hos sporingsstoffene bestemme hvordan de vil oppføre seg i den andre væsken. For eksempel, hvis sporingsstoffene er assosiert eller omfatter nanopartikler vil de ha en tendens til å forbli suspendert i en væske over en lengre tidsperiode selv om deres volumetriske massetetthet er lavere enn tettheten til den andre væsken. Andre egenskaper eller trekk som vil påvirke oppførselen til sporingsstoffene inkluderer deres løselighet i den involverte væsken eller tilstedeværelsen av en påført kraft (dvs. magnetisk, elektrisk) som kan holde dem separert fra de flytende kulene.

Som beskrevet over blir blandingen av kuler, sporingsstoff og "sandwich-komplekser" i den andre væsken utsatt for en sentrifugalkraft som har en første retning. Kulene, inkludert "sandwich-kompleksene" (dvs. kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt komplekser), har en volumetrisk massetetthet (ml og m2) som er mindre enn den til den andre væsken (d2), og vil "flyte" (dvs. bevege seg mot væskeoverflaten til den andre væsken som er nærmest rotasjonsaksen til et sentrifugesystem), mens overskuddet av ikke-bundet sporingsstoff, avhengig av dets egenskaper slik som tetthet n, størrelse, løselighet osv. som diskutert over, vil enten "sedimentere", dvs. bevege seg bort fra sentrifugeringsaksen som skaper sentrifugalkraften, eller forbli suspendert i det minste i en tidsperiode som er tilstrekkelig for å separere den andre væsken, og følgelig det suspenderte sporingsstoffet, fra kulene og "sandwich-kompleksene".

Etter fjerning av det ureagerte sporingsstoffet kan biomarkøren bli kvantifisert, eller identifisert, in situ (dvs. i det kolonneformede hulrommet 7) ved å analysere de mange "sandwich-kompleksene".

I alternative utførelsesformer blir kulene og "sandwich-kompleksene" transportert til et forskjellig sted eller hulrom for analyse. Når fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir brukt i en «lab-on-a-chip»-anordning omfattende en mikrofluidbrikke som har en indre fluidkrets gjennom hvilken fluidkrets forskjellige reaktanter, inkludert kuler, og en prøve som inneholder minst en analytt kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft, kan kulene omfattende «sandwich-kompleksene" for eksempel bli transportert til en fluidkrets eller hulrom spesifikt utformet for analysen av slike kuler.

I denne spesifikke utførelsesformen blir kulene inkludert "sandwich-komplekser" overført til et andre kolonneformet hulrom 10. Overføringen blir oppnådd ved å tilsette en ytterligere alikvot med den andre væsken, eller en forskjellig væske som har den samme eller høyere tetthet som den andre væsken, til kulene se figurer 11-m. Alikvoten er fortrinnsvis større enn mengden brukt i vasketrinnene i figurer li-k, slik at kulene kan migrere nærmere innløpet 4. En fraksjon av den andre væsken som er nærmest sentrifugeringsaksen (eller innløpet) som inneholder alle kulene inkludert «sandwich-kompleksene", blir overført til det andre kolonneformede hulrommet 10 ved dekantering, se fig. lo. Dekanteringen blir oppnådd ved en liten endring av retningen til sentrifugalkraften G i forhold til det første kolonneformede hulrommet. Det andre kolonneformede hulrommet 10 er optimalt utformet for den neste foretrukkede handlingen i assayet, dvs. det andre hulrommet kan være utformet for mer omfattende vasking og/eller for å kvantifisere «sandwich-kompleksene".

I denne spesifikke utførelsesformen er hulrommet 7 i hvilket kulene er pakket, vist og beskrevet som kolonneformet. Hulrommet kan imidlertid i andre utførelsesformer ha enhver form så lenge det tilveiebringer en pakket struktur av kuler som tillater en tett interaksj on mellom reaktantene, og en etterfølgende spredning av den pakkede strukturen i en væske.

Detaljert beskrivelse av et første oppfinnerisk konsept for å separere kuler med forskjellig tetthet i en fluidkrets

I utførelsesformen beskrevet ved figurer la-k, blir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen vist ved å analysere en analytt av gangen. Fremgangsmåten er imidlertid ikke begrenset til å analysere kun en analytt av gangen.

Ved å bruke flere typer av kuler med forskjellige tettheter, hver type selektiv for en forskjellig analytt, og respektive komplementære sporingsstoffer i interaksjonen med en prøve som inneholder flere typer av analytter, kan flere typer av "sandwich-komplekser", som tilsvarer de flere typene av analytter, bli oppnådd samtidig. De flere typene av "sandwich-komplekser" kan bli analysert samtidig eller sekvensielt. Etter et bindings- eller interaksjonstrinn som beskrevet over, vil en kolonne av pakkede kuler omfatte flere typer av kuler og korresponderende "sandwich-komplekser" som representerer de forskjellige analyttene som skal analyseres. I noen tilfeller kan de flere typene av "sandwich-komplekser" bli analysert uten separasjon fra hverandre. For å oppnå et ønsket nivå av følsomhet og reproduserbarhet kan imidlertid separasjon av de flere typene av "sandwich-komplekser" være nødvendig.

Den foreliggende søknaden tilveiebringer et første oppfinneriske konsept for å oppnå en separasjon av flere typer av kuler/fastfase-materialer, inkludert "sandwich-komplekser" som beskrevet gjennom hele denne beskrivelsen. Det første konseptet er ikke avhengig av, heller ikke er det en essensiell del av, fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Det første konseptet er spesielt fordelaktig for bruk i en «lab-on-a-chip»-anordning, slik som en mikrofluidbrikke omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter, inkludert kuler, og en prøve som inneholder minst en analytt kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft.

En utførelsesform av det første oppfinneriske konseptet er illustrert i figurer 2a og 2b. Et hulrom egnet for å separere kuler som har forskjellig tettheter er vist i fig. 2a og 2b. Hulrommet omfatter et innløp 12, et første utløp 13 og et andre utløp 14. I dette spesifikke tilfellet er hulrommet tilveiebrakt med et første sett med kuler 8a har en tetthet ml og et andre sett med kuler 8b som har en tetthet m2. En væske 11 som har en tetthet d3, ml<d3<m2, blir deretter satt til kulene i hulrommet. En sentrifugalkraft G får det første settet med kuler 8a til å migrere (eller flyte) i retningen av det første utløpet 13, mens det andre settet med kuler 8b migrerer (eller sedimenterer) mot det andre utløpet 14. Ved å endre retningen til sentrifugalkraften, dvs. orienteringen av hulrommet i forhold til sentrifugalkraften, blir det første settet med kuler 8a og deler av væsken 11 overført gjennom det første utløpet 13, mens det andre settet med kuler 8b og deler av væsken 11 blir overført gjennom det andre utløpet 14.

Det første oppfinneriske konseptet er også anvendbart for andre hulrom-utforminger slik som det allerede vist i fig. la. I et hulrom som vist i fig. la kan en væske som har en tetthet d3 (som beskrevet i forbindelse med Figurer 2a og 2b) først bli brukt for å separere to sett med kuler (tilsvarende utførelsen i fig. 2a). Ved å endre retningen til den påførte sentrifugalkraften G etter at de to settene med kuler er separert kan det første settet med kuler bli dekantert fra det kolonneformede hulrommet 7 (tilsvarende dekanteringen av kuler i fig. lo). Et første og andre sett med kuler kan således bli separert. Ved tilsetting av en ytterligere væske som har en tetthet d4, d4>m2, til det kolonneformede hulrommet 7, kan det andre settet med kuler deretter bli dekantert fra nevnte hulrom på samme måte som brukt for det første settet med kuler.

Det første oppfinneriske konseptet for å separere kuler med forskjellige tettheter er ikke begrenset til bare to sett med kuler som har forskjellige tettheter, men kan bli brukt for å separere ethvert antall sett med kuler så lenge de har forskjellige tettheter som muliggjør separasjon ved å tilsette en væske med passende tetthet. For eksempel i tilfellet av et hulrom som vist i fig. la, kan fire sett med kuler som har henholdsvis tettheter ml, m2, m3 og m4, bli separert sekvensielt ved først å tilsette en væske som har en tetthet d3, m4<d3<m3,m2,ml, dekantere av kulene som har en tetthet m4 (tilsvarende kulene i fig. lo), filtrere av den gjenværende væsken som har en tetthet d3 og tilsette en ytterligere væske som har en tetthet d4, m3<d4<m2,ml (alternativt blir ikke den gjenværende væsken som har en tetthet d3 filtrert fra, men dens tetthet blir økt til d4 ved tilsetting av et tetthetsøkende tilsetningsstoff slik som en ytterligere væske med høy tetthet), dekantere av kulene som har en tetthet m3 osv.

En ytterligere mulighet er å separere kulene i to kombinerte sett med kuler, hvor det første kombinerte settet omfatter kulene med tetthet ml og m2, mens det andre kombinerte settet omfatter kulene med tetthet m3 og m4. Dette kan oppnås ved først å tilsette en væske som har en tetthet d4, m4,m3<d4<m2,ml, og dekantere av kulene som har en tetthet m4 og m3. Hvert kombinerte sett med kuler kan deretter, for eksempel, bli overført til et hulrom som vist i fig. 2a for videre separasjon. Når det første konseptet blir brukt en analysemetode, for eksempel fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan et sett med kuler også omfatte "sandwich-komplekser" som skal analyseres.

Det første konseptet kan bli definert som i det følgende:

En fremgangsmåte for å separere kuler i en mikrofluidbrikke omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter, inkludert kuler og en prøve som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft, fremgangsmåten omfattende trinnene å: - tilveiebringe minst et første sett med kuler som har en tetthet ml og et andre sett med kuler som har en tetthet m2 i et hulrom til fluidkretsen, hulrommet omfattende minst et første utløp;

tilveiebringe en første væske til hulrommet, væsken har en tetthet d3, slik at

ml < d3 < m2; og

- påføre en sentrifugalkraft slik at det første settet med kuler og det andre settet med kuler migrerer i motsatt retning inne i hulrommet.

I en utførelsesform av fremgangsmåten for å separere kuler i en mikrofluidbrikke, migrerer det første settet med kuler mot det første utløpet.

I en utførelsesform av fremgangsmåten for å separere kuler i en mikrofluidbrikke omfatter fremgangsmåten trinnet å: overføre det første settet med kuler ut av hulrommet ved å endre retningen til sentrifugalkraften, mens det andre settet med kuler forblir i nevnte hulrom, fortrinnsvis slik at det første settet med kuler blir dekantert gjennom det første utløpet.

I en utførelsesform av fremgangsmåten for å separere kuler i en mikrofluidbrikke omfatter hulrommet et andre utløp, og fremgangsmåten omfatter trinnet å: endre retningen til sentrifugalkraften slik at det første settet med kuler blir overført gjennom det første utløpet og det andre settet med kuler blir overført gjennom det andre utløpet.

Detaljert beskrivelse av et andre oppfinnerisk konsept for å overføre kuler i en fluidkrets

I forhold til transport av kuler presenterer den foreliggende søknaden også et ytterligere oppfinnerisk konsept som ikke er avhengig av, heller ikke er det en essensiell del av, fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. En utførelsesform av konseptet er vist i figurer 11-p. Konseptet løser et problem som er spesielt relevant i forhold til «lab-on-a-chip»-anordninger, slik som mikrofluidbrikker, hvor kuler skal transporteres gjennom fluidkretser ved bruk av sentrifugalkraft. I kjent teknikk blir transporten av kuler alltid utført i den samme retningen som sentrifugalkraften, og de tilgjengelige mulighetene for utforming av fluidkretsene er således begrenset. Det ytterligere oppfinneriske konseptet muliggjør transporten av kuler i en motsatt retning av en påført sentrifugalkraft ved å tilsette en væske som har en tetthet d2, til kuler som har en tetthet lik som, eller lavere enn, ml, hvor d2>ml.

Selv om det andre oppfinneriske konseptet er illustrert ved referanse til det kolonneformede hulrommet 7 i figurer 11-lp, er konseptet like egnet for hulrom av en rekke forskjellige former. Et ytterligere eksempel på et egnet hulrom er vist i Figurer 2a og 2b. Som vist i beskrivelsen av det første oppfinneriske konseptet over blir det første settet med kuler 8a forårsaket til å migrere (eller flyte) i retningen av det første utløpet 13, retningen er motsatt av den til den påførte sentrifugalkraften

G.

Det andre oppfinneriske konseptet kan bli definert som følger:

En fremgangsmåte for å overføre kuler i en mikrofluidbrikke omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter, inkludert kuler og en prøve som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft, fremgangsmåten omfattende trinnene å: tilveiebringe kuler som har en tetthet lik, eller lavere enn, ml i et hulrom til

fluidkretsen, hulrommet omfattende minst et første utløp;

tilveiebringe en første væske til hulrommet, væsken har en tetthet d2, slik at

d2>ml; og

- påføre en sentrifugalkraft slik at kulene migrerer i motsatt retning av den til sentrifugalkraften.

I en utførelsesform av fremgangsmåten for å overføre kuler i en mikrofluidbrikke migrerer kulene mot det første utløpet.

I en utførelsesform av fremgangsmåten for å overføre kuler i en mikrofluidbrikke omfatter fremgangsmåten trinnet å: overføre kulene ut av hulrommet ved å endre retningen til sentrifugalkraften,

fortrinnsvis slik at kulene blir dekantert gjennom det første utløpet.

Claims

1. En fremgangsmåte for å analysere en prøve som inneholder en analytt som skal bestemmes kvalitativt og/eller kvantitativt, omfattende et bindingstrinn og et vasketrinn, hvor bindingstrinnet omfatter: a) å tilveiebringe kuler i stand til å binde analytten, kulene eventuelt omfattende en definert mengde med analytt-sporingsstoffenheter, og kulene har en tetthet ml; b) å interagere analytten med kulene, analytten eventuelt interagert med et sporingsstoff, enten før, i løpet av eller etter interaksjon med kulene; c) å oppnå en struktur av pakkede kuler omfattende kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt komplekser som har en tetthet m2; og vasketrinnet omfatter: d) å dispergere de pakkede kulene i en væske som har en tetthet d > m2 og ml; og e) å separere væsken og kulene omfattende de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene.

2. En fremgangsmåte ifølge krav 1, hvor strukturen av pakkede kuler blir oppnådd ved å ha kulene anordnet i et hulrom eller fluidkrets, hulrommet eller fluidkretsen omfatter en første og en andre åpning og et partikkeltilbakeholdingselement, fortrinnsvis et filterelement, anordnet ved en av nevnte åpninger.

3. En fremgangsmåte ifølge krav 2, hvor hulrommet eller fluidkretsen er del av en indre fluidkrets til en mikrofluidbrikke, gjennom hvilken fluidkrets forskjellige reaktanter, inkludert kuler og en prøve som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft.

4. En fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, hvor partikkeltilbakeholdingselementet er i stand til å holde tilbake kulene og kule-analytt kompleksene i hulrommet eller fluidkretsen.

5. En fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor trinn b) blir utført i en første væske som har en tetthet dl < ml.

6. En fremgangsmåte ifølge krav 5, hvor bindingstrinnet videre omfatter et trinn med å separere den første væsken og kulene.

7. En fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor trinn d) blir forutgått ved å tilsette en andre væske som har en tetthet d2 > m2 og ml, til de pakkede kulene.

8. En fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor kulene er kuler i syntetisk polymer, slik som polystyren- og PMMA-kuler.

9. En fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor kulene og/eller sporingsstoffer blir tilveiebrakt som tørkede formuleringer.

10. En fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, hvor bindingstrinnet omfatter å pakke kulene ved å påføre en sentrifugalkraft i en første retning relativt til hulrommet eller fluidkretsen, slik at strukturen av pakkede kuler i trinn c) kan bli oppnådd.

11. En fremgangsmåte ifølge krav 10, hvor vasketrinnet omfatter å påføre en sentrifugalkraft i hovedsakelig den første retningen i løpet av trinn d).

12. En fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11, hvor kulene omfattende de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene blir overført fra hulrommet, eller fluidkretsen, ved å påføre en sentrifugalkraft som har en andre retning forskjellig fra den første retningen.

13. En fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, videre omfattende et trinn med å analysere de kvalitativt og/eller kvantitativt bestembare kule-analytt kompleksene, slik at analytten i prøven blir kvalitativt og/eller kvantitativt bestemt.

14. Bruk av en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav i en mikrofluidbrikke for et sentrifugeapparat i stand til å variere orienteringen av mikrofluidbrikken relativt til en påført sentrifugalkraft, mikrofluidbrikken omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter i fremgangsmåten, inkludert kulene og en prøve som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraften.

15. En mikrofluidbrikke for bruk i en fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de forutgående krav, mikrofluidbrikken tilpasset for et sentrifugeapparat i stand til å variere orienteringen av mikrofluidbrikken relativt til en påført sentrifugalkraft, og omfattende en indre fluidkrets gjennom hvilken forskjellige reaktanter i fremgangsmåten, inkludert kulene og prøven som inneholder minst en analytt, kan bli flyttet ved bruk av sentrifugalkraft.