KR102006554B1 - 분석 방법 - Google Patents

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KR102006554B1
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스티그 모르텐 보르흐
토르게이르 함순드
요스타인 게이르 홀트룬드
아냐 귤릭센
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스핀칩 다이아그노스틱스 에이에스
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Abstract

본 발명은 정성적(qualitatively) 및/또는 정량적으로(quantitatively) 측정될 분석물을 함유하는 샘플의 분석 방법을 제공하며, 상기 방법은 결합 단계 및 세정 단계를 포함하고, 상기 결합 단계는: 밀도 m1의 비드(bead)와 분석물을 상호작용시키는 단계; 밀도 m2의 정량 가능 비드 착물을 포함하는 충전된 비드의 구조를 얻는 단계를 포함하고; 세정 단계는: 밀도 d > m2 및 m1의 액체 매체 중에 충전된 비드를 분산시키는 단계; 및 액체 매체와 정량 가능 비드 착물을 포함하는 비드를 분리하는 단계를 포함한다.

Description

분석 방법{ANALYTICAL METHOD}
본 발명은 분석 방법, 바람직하게는 샘플 중에 존재하는 화합물의 분석을 행하는 방법의 분야에 관한 것이다. 상기 방법은 유체 또는 미세 유체 처리가 일어나는 분석 장치(랩온어칩(lab-on-a-chip))가 원심분리기, 바람직하게는 가해지는 원심력의 방향에 대한 분석 장치의 배향을 변경하기 위한 수단을 구비한 원심분리기와 연결되어 사용되는 경우에 유리하게 사용된다.
특정 물질 또는 분석물(analyte)에 대한 일반적인 방법은 전형적으로 생체지표(biomarker)인 표적 물질 또는 분석물에 선택적으로 결합하는 고체상의 사용을 포함한다. 일부 어세이(assay)에 있어서, 고체상은 그 표면 상에 생체지표와 특정적으로 결합하는 특정 포획 분자(capturing molecule)를 담지하고, 표시할 수도 있다. 상기 생체지표를 검출 및 정량하기 위해서, 고체상-생체지표 착물은 또한 고체상-생체지표-추적자 착물을 형성하는 하나 이상의 추적 물질에 결합되는 다른 생체지표 특정 결합 분자의 세트와 반응할 수도 있다. 경쟁 면역 어세이 등의 다른 어세이에 있어서, 샘플 중의 생체지표는 고체상으로의 결합에 있어서 추적 물질을 담지하는 규정량의 생체지표와 경쟁한다. 각종 유형의 고체상 재료 및 추적 물질을 포함하는, 관련된 특정 결합제 및 표적 분석물을 배치 및 사용하는 수많은 방법이 있다.
많은 분석 시스템에 있어서, 고체상은 고정된 실시형태, 예를 들어 캐비티(cavity)의 벽(마이크로타이터 플레이트웰 또는 마이크로채널 및 마이크로캐비티) 또는 고정된 구조, 예를 들어 필러(pillar) 또는 다공질막 포함하며, 포획 분자, 예를 들면 생체지표, 예를 들면 항원에 상호 보완적인 항체가 결합된다. 다공질막을 통한, 표적 생체지표를 함유하는 샘플의 측면 또는 횡단 유체는 표적 생체지표의 결합이 되는 경우에 바람직한 고체상 개념이다. 이것은 이들 막 중에서 표면 대 부피비가 매우 커, 포획 분자, 예를 들면 항체를 매우 과잉으로 하고, 따라서 표적 생체지표의 결합을 매우 효율적으로 하는 사실 때문이다. 그러나, 이들 막은, 추적자가 나노 입자 또는 그 응집체인 경우에 특히 세정하는 것이 어렵다. 이 어려움은 막 내의 포켓 형상 구조의 추적 물질의 비특정 결합 또는 포획에 의해 야기된다.
다른 분석 시스템에 있어서, 고체상은 유리하게는 차지하는 부피에 대해 큰 표면적을 노출하는 구형의(spherically shaped) 나노 또는 마이크로 크기의 입자일 수도 있다.
추적자는 광학적, 화학적, 전기적, 자기적, 방사성 수단 또는 그 조합 중 어느 하나에 의해 검출 및 측정될 수도 있는 임의의 유형의 물질일 수 있다. 또한, 추적 물질은 또한 입자로서 제형화되거나 입자와 혼합될 수도 있다. 광학적 수단에 의해 자주 사용 및 검출되는 이러한 입자로는 금속 콜로이드(금, 은, 철 등), 퀀텀닷(quantum dot), 염료 또는 형광색소를 함유하거나 담지하는 폴리머(라텍스) 입자, 폴리머, 실리카, 또는 효소 또는 무기 결정, 예를 들어 업컨버전(upconversion) 나노 입자(UCNP)를 포함하는 신호 생성 분자를 담지하는 다른 입자를 들 수 있다. 추적 물질 또는 담체로서 사용되는 입자는 전형적으로는 2nm 내지 200nm의 나노미터 범위에 있는 것이 일반적이지만, 일부 설정에 있어서, 100μm 이하의 보다 큰 입자를 사용할 수도 있다. 고체상 및 추적 물질에 각각 결합되는 생체지표 특정 분자는, 예를 들면 이후에 항원이라 칭하는 표적 생체지표에 특정적으로 결합하는 항체일 수도 있다. 자주 사용되는 항체의 대안으로는 핵산 탐침, 아비딘/스트렙타아비딘, 렉틴 및 압타머뿐만 아니라, 리간드의 규정된 분자 구조(즉, 분석물 또는 분석물의 일부)를 인식하여, 특정적으로 결합하는 임의의 (생체) 수용체를 들 수 있다. 실제로는, 자연계의 모든 단백질의 대부분이, 대분자 또는 소분자의 규정된 구조일 수도 있는 일부 리간드와 많게 또는 적게 특정적으로 상호 작용한다. 일반적으로, 보다 특정적이고, 보다 높은 친화성인 결합은, 분석 어세이를 설계하기 위한 것인, 보다 적합한 수용체 리간드 시스템이다. 고체상-생체지표-추적 물질 착물(이하에서는 정량 가능 비드(bead) 착물이라고도 함)을 정량하기 위해, 추적 물질은 동정(identification) 및 측정을 가능하게 하는 특정의 성질을 나타내야 한다. 검출기가 어세이 장치의 외부에 배치될 수도 있기 때문에, 광학적 판독 시스템이 종종 특히 편리하다. 광학 추적 물질의 성질로는 광흡수, 투과율 또는 반사율에 의해 측정되는 광산란뿐만 아니라, 화학 발광, 형광, 업컨버전 인광 및 그 조합을 포함하는 그 밖의 것과 같은 발광 현상 및 광회절을 들 수 있다. 상기 현상은 색상, 발광, 예를 들면 형광 및 인광, 회절, 플라즈몬 효과 등을 측정할 때에 참조되는 것이 전형적이다.
대부분의 이종형(heterogeneous type) 분석 어세이에 있어서는, 표적 생체지표를 우선 고체상 및 추적 물질과 과잉으로 반응시킨다. 이는 동시에 존재하는 비드, 생체지표 및 추적 물질에 의한 하나의 단계에서, 또는 비드와 생체지표 사이의 제 1 상호작용 후에 추적 물질이 도입되는 2개의 단계에서 행해질 수도 있다. 그 후, 고체상에 특정적으로 결합되지 않는 추적 물질이 세정에 의해 제거된다.
표적 생체지표를 각각 고체상 및 추적 물질에 결합시키기 위해서는, 그것들을 직접 상호작용시켜야 한다. 고친화성 결합제에 의해, 반응물, 즉 생체지표, 고체상 및 추적 물질이 보다 자주 상호작용하거나 충동할수록 결합 반응이 보다 빨라진다. 따라서, 빠른 어세이를 얻기 위해서는, 고친화성 및 특정 결합 물질의 매우 높은 국소 농도를 갖는 반응 조건을 설정해야 한다. 이러한 조건을 설정하기 위해서, 고체상은 특정의, 고친화성 수용체 분자가 밀집된 큰 표면적을 노출해야 한다. 마찬가지로, 특정 및 고친화성 수용체 분자의 제 2 세트를 담지하는 추적 물질이 고농도로 존재해야 한다. 나노 및 마이크로 입자의 현탁액은 다공질막 등의 다공질 구조와 비슷한 부피비에 대해 큰 표면을 노출한다. 포함되는 반응물 사이의 충돌을 더 용이하게 하는 유체 운동이 적용되어야 한다. 이러한 운동은 적절한 가열 및 교반에 의해 얻어질 수도 있지만, 보다 바람직하게는 비경쟁 어세이의 경우에는 추적 물질을 포함하는 샘플 및 시약을 고체상을 통과/유통시킴으로써 얻어질 수도 있다. 따라서, 다공질막, 마이크로채널, 마이크로필러 구조 또는 적층 입자와 같은 고체상 재료를 통해 흐르는 액체는 효율적인 결합 어세이를 설계하는데 바람직하다.
앞의 단락에서 논한 바와 동일한 고찰이 경쟁적 이종 어세이에서도 마찬가지로 잘 적용된다. 이러한 어세이에 있어서, 고체상은 결합 및 라벨링된 생체지표가 밀집된 큰 표면적을 노출한다.
구형의 마이크로 및 나노 입자는 몇몇 이유로 고체상 재료로서 종종 바람직하다:
· 입자는 부피비에 대해 매우 큰 표면을 갖는다.
· 입자는 배치식으로 효율적으로 기능화되고, 따라서 혼합되어 균일한 현탁액을 형성할 수 있다.
· 입자 현탁액은 액체 형태로 직접 사용할 수도 있는 앨리쿼트에서 제조되거나, 정제 또는 동결 건조 구체(sphere) 등의 건조 앨리쿼트로서 제형화될 수 있다.
· 입자는 입자에 뚜렷한 특징을 부가하는 재료로 적재되거나 그로부터 제조될 수도 있다. 이는 광흡수, 광산란, 광방사(발광) 등 뿐만 아니라, 자기, 방사능, 촉매/효소, 전기화학 및 다른 측정 가능한 특징과 같은 뚜렷한 광학 특징을 포함한다.
· 현탁액 중에 있는 경우에 입자는 미세 유체 시스템 내에서 이송될 수도 있다.
· 입자는 용액 중의 샘플과 효율적으로 혼합될 수도 있다.
· 현탁액 중의 입자는 중력, 원심분리, 여과, 자기력(자성 입자) 또는 전기력, 또는 그 조합에 의해 용액으로부터 분리될 수도 있다.
· 입자는 그것들이 분산되어 있는 매체에 대한 밀도에 따라서 침전(sediment)되거나 현탁액 중에 남아 있거나 부유(float)한다.
· 입자는 단분산, 또한 완전 구형으로 할 수 있고, 양방 모두 다공질이거나 구멍이 없는 매끈한 고체 표면을 갖는다.
· 입자는 컬럼을 포함하는 각종 용기에 충전되거나(packed) 적층될 수도 있다.
· 입자는 불투명(유색)하거나 실질적으로 투명하여, 각종 광학 기반 측정 시스템에서의 양립 및 사용을 가능하게 할 수도 있다.
· 조밀한 단분산 입자를 컬럼에서와 같이 필터 상에 적층할 경우, 규칙적이며 규정된 간격으로 다공질 격자 구조를 형성할 수도 있다. 액체는 이러한 컬럼을 통해, 제어되며 재현 가능한 방법으로 흐를 수도 있다.
고체상 입자의 표면에 결합된 고정된 포획 분자와 상호작용하는 분석물을, 비경쟁 어세이의 경우에는 광학적으로 추적 물질을 제조하기 위한 가장 효율적인 방법은 입자를 컬럼의 형태로 필터 또는 슬릿 상에 충전하고, 분석물, 및/또는 추적 물질 등의 시약을 함유하는 용액이 입자의 컬럼을 통과하도록 하는 것이다. 이는 순차적이며 반복적인 단계에 의해, 또는 분석물 및 추적 물질 양방의 혼합물을 적용하고, 한 단계에서 그들을 통과시킴으로써 완료될 수 있다.
반응 또는 결합 단계 후, 용액을 고체상으로부터 분리하고, 고체상을 세정하여 잔존하는 과잉의 추적 물질, 라벨링된 비결합 분석물(경쟁 어세이의 경우와 같음) 등을 제거하여 일관되고 정확한 분석을 얻는다.
비드와 각종 추적 물질 및/또는 분석물 사이의 효율적인 상호작용을 달성하기 위한 비드 컬럼의 사용은 미세 유체칩을 사용한 분석 방법으로부터 알려져 있다.
US 2009/0104077A1에는 미세 유체칩에 있어서 ELISA 어세이(효소 결합 면역 흡착 어세이, Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)를 행하기 위한 방법이 개시되어 있다. 개시된 미세 유체칩은 고체상으로서 작용하는 비드로 채워진 컬럼 구조를 포함하는 유체 회로를 갖는다. 우선 비드-생체지표-효소 라벨링 항체 착물을 형성함으로써 컬럼 구조 중의 비드 상에서 ELISA형 반응을 행한다. 그 후에 원심력의 적용에 의해 세정액이 컬럼을 통해 흐르도록 함으로써 과잉의 효소 라벨링 항체를 제거한다. 상기 방법의 중요한 특징은 컬럼을 통해 동일한 세정 유체를 복수회 순환시켜 개선된 세정 단계를 달성할 수 있는 능력이다. 청소(cleaning) 또는 세정 단계 후, 발색 기질을 효소 라벨링 착물에 도포하고, 생성된 색상을, 예를 들면 컬럼 구조에서 측정할 수도 있다. 컬럼 구조의 적어도 일단은 고체상 비드가 컬럼의 외부를 통과하는 것을 방지하는 제한된 통로에서 끝난다.
WO 2011/081530 A1에는 시험 샘플, 예를 들면 전혈 등의 생물학적 샘플을 분석하기 위한 처리 카트리지(즉, 유체 또는 미세 유체칩)가 개시되어 있다. 카트리지는 원심분리 분석 기기에 사용하기에 적합하다. 카트리지는 트랩(trap)으로서 기재된 특정 유체 회로 소자를 포함할 수도 있다. 이러한 소자를 사용하여 고체상 입자(비드)의 컬럼을 형성하며, 여기서 입자는 유체가 컬럼을 통과하는 동안에 유지될 수도 있다. 카트리지에 대해 가해진 원심력의 방향을 적절히 변경시킴으로써, 고체상 입자와 반응하는 각종 반응물(예를 들면, 생체지표 및 추적 물질)을 함유하는 유체가 컬럼을 반복적으로 통과한다. 트랩의 설계는 입자 또는 비드의 컬럼을 얻기 위해서, 필터 또는 좁은 유체 경로의 사용을 피한다. 과잉 시약의 제거는 입자의 반복적인 세정에 의해 달성된다. 트랩 및 그 사용의 설명뿐만 아니라, 분석물을 포함하는 샘플, 및 각종 임의의 시약 및 용매가 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 유체 회로를 갖는 미세 유체칩의 개념이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
다른 어세이 시스템에 있어서, 강자성 입자가 고체상으로서 사용되어 세정 또는 분리 단계를 용이하게 한다. 그 후에 자석을 일시적으로 사용하여 반응 용기의 한 벽으로 입자를 끌어 당기고, 액체로부터 분리하는 동안에 그것들을 유지한다. 반응 용기가 자석으로부터 멀어지는 경우, 입자는 용액 중에 재현탁되는 것이 자유롭다. 그러나, 자성 입자는 그 강자성 재료의 함량때문에 광학적으로 밀도가 높고, 따라서 광학적 판독을 현저하게 해소한다. 이런 이유로, 강자성 입자는 어세이를 통해 입자에 결합되어 있는 추적 라벨과의 조합으로 사용하는데 적합하지 않다.
생체지표의 분석 등의 샘플 분석의 기술분야에서, 어세이에 있어서 고정상 및 이동상 고체상 양방의 사용이 알려져 있다. 특히, 본 발명은 분석물을 포함하는 샘플, 및 각종 임의의 시약 및 용매를 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 유체 회로를 갖는 미세 유체칩(즉, 처리 카트리지)에 있어서의 이러한 어세이의 사용에 관한 것이다. 이러한 미세 유체칩은, 예를 들면 Schultz et al. Clin. Chem. 1985, 31, 1457, 미국 특허 제 488763, 및 상술한 특허 출원 US 2009/0104077 A1 및 WO 2011/081530 A1에 개시되어 있다.
이종형 분석 어세이에 있어서, 신뢰성이 높은 분석 결과를 위해서 과잉의 비결합 추적 물질을, 고체상에 결합되어 있는 추적 물질로부터 효율적이고, 재현 가능한 분리(세정)하는 것이 필수이다. 효율적인 세정은 고감도 분석에 있어서 특히 중요하다.
다공질막 등의 다공질 구조를 갖는 고체상은 웰벽, 마이크로 필러 또는 구형 입자에서 사용 가능한 것과 같은 매끈한 표면을 갖는 고체상보다 효율적으로 세정하는 것이 보다 어렵다. 그러나, 컬럼에 빽빽이 충전된 구형 입자(예를 들면, 비드)를 포함하는 고체상은, 효율적이며 재현 가능한 세정에 관해 다공질막에서 직면하는 것과 같은 동일한 몇몇 어려움을 경험한다. 충전된 컬럼 중의 비드의 밀접한 상호작용은 비결합 추적 물질(즉, 고체상에 결합되지 않는 추적 물질)이 비특정 방법으로 용이하게 포획되는 일시적인 다공질 구조(즉, 비드 사이에 형성되는 공극에 기인함)를 제공한다. 종래 기술에 있어서, 이러한 컬럼은 세정액을 컬럼에 통과시킴으로써 세정된다. 그러나, 이러한 세정이 복수회 반복되어도(US 2009/0104077A1의 개시를 참조), 비결합 추적 물질의 적어도 일부는 다공질 구조 중에 포획된 채이며, 그 후에 어세이의 재현성 및 감도에 악영향을 미친다.
종래기술에 의거하여, 공지의 방법의 결점의 적어도 일부를 방지하는 샘플(예를 들면, 생물학적 샘플) 중의 분석물의 분석을 행하는 방법에 대한 요구가 있다. 이는 주로, 서로간의 효율적인 상호작용(결합)을 용이하게 하는 분석물, 고체상 비드 및 추적 물질의 배좌를 갖는 것과, 그 후에 과잉의 추적 물질(즉, 경쟁 어세이에서와 같이 분석물-추적 물질 착물을 포함하는, 비드에 결합되지 않는 추적 물질)의 효율적인 분리(세정)가 달성되는 다른 배좌를 작성하는 것 양방에 관련된 것이다.
본 발명은 분석물의 고체상으로의 결합(경쟁 어세이에 있어서와 같음)의 결합 또는 차단, 및 용이해진 세정 공정에 있어서의 비결합 추적 물질의 효율적인 분리를 포함하는 이종 분석 어세이를 위한 신규 방법에 관한 것이다.
본 발명은 종래기술의 결점의 적어도 일부를 방지하거나 완화하는 샘플 중의 분석물을 분석하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되며, 이하와 같다:
제 1 실시형태에 있어서, 본 발명은 정성적(qualitatively) 및/또는 정량적으로(quantitatively) 측정되는 분석물을 함유하는 샘플을 분석하는 방법을 제공하며; 상기 방법은 결합 단계 및 세정 단계를 포함하고, 상기 결합 단계는:
a) 밀도 m1의 비드와 분석물을 상호작용시키는 단계;
b) 밀도 m2의 정량 가능 비드 착물을 포함하는 충전된 비드의 구조를 얻는 단계를 포함하고;
세정 단계는:
c) 밀도 d > m2 및 m1의 액체 매체 중에 충전된 비드를 분산시키는 단계; 및
d) 액체 매체 및 정량 가능 비드 착물을 포함하는 비드를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 일실시형태에 있어서, 밀도 m1의 비드는 분석물에 결합할 수 있다. 선택적으로, 비드는 규정량의 분석물-추적 물질 단위를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 일실시형태에 있어서, 분석물은, 밀도 m1의 비드와의 상호작용 전, 동안 또는 후에 추적 물질과 상호작용한다.
본 발명에 따른 방법의 일실시형태에 있어서, 결합 단계의 단계 a)는 분석물을 결합할 수 있는 비드를 제공하는 제 1 단계를 구성하고, 비드는 선택적으로 규정량의 분석물-추적 물질 단위를 포함하고, 비드는 밀도 m1이고, 분석물은 비드와의 상호작용 전, 동안 또는 후에 추적 물질과 선택적으로 상호작용한다.
본 발명에 따른 방법의 일실시형태에 있어서, 분석물은 밀도 m1의 비드와 상호작용하여, 밀도 m2의 정량 가능 비드 착물이 형성된다.
단계 a)의 비드와 분석물의 상호작용은 단계 b)의 밀도 m2의 정량 가능 비드 착물을 제공한다. 정량 가능 비드 착물의 특정 성질은 행해지는 어세이의 유형에 의존한다. 그러나, 어세이의 유형에 상관없이, 정량 가능 비드 착물은 정량 가능하여, 이후에 비드 착물을 분석함으로써 분석물이 정량될 수도 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플, 및 분석물과 결합할 수 있는 비드를 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 포함하는 유체 칩 중에서 행해진다. 바람직하게는, 유체 회로에 대한 원심력의 방향은 적어도 2개의 독립된 방향으로 변화될 수도 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 충전된 비드의 구조는 유체 회로의 섹션에 배치된 비드를 가짐으로써 얻어지고, 섹션은 제 1 및 제 2 개구, 및 섹션 중에 비드 및 비드-분석물 착물을 유지할 수 있는 입자 유지 소자를 포함한다. 입자 유지 소자는 상기 개구 중 하나에 배치된 필터 소자 또는 벤드(bend)일 수도 있다. 바람직하게는, 섹션의 적어도 일부는 실질적으로 컬럼 형상이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 섹션은 비드 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 유체 회로가 유체 칩의 내부 유체 회로의 일부이다. 바람직하게는, 원심력은 원심분리기의 사용에 의해 가해지고, 섹션에 대한 원심력의 방향은 변화될 수도 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 유체 칩은 미세 유체칩이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 액체 매체 및 정량 가능 비드 착물을 포함하는 비드의 분리는 여과 또는 디캔팅(decanting)에 의해 달성된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 단계 a)는 밀도 d1 < m1의 제 1 액체 매체 중에서 행해진다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 결합 단계는 제 1 액체 매체와 비드를 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 단계 c)는 밀도 d2 > m2 및 m1의 제 2 액체 매체를 충전된 비드에 첨가함으로써 선행된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 비드는 폴리스티렌(PS) 및 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA) 비드 등의 합성 폴리머 비드이다. 비드는 바람직하게는 0.1 내지 50μm, 0.5 내지 50μm 및 2μm 내지 20μm의 범위의 직경을 가질 수도 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 비드 및/또는 추적 물질은 결합 단계 전에 건조 제형으로 제공된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 결합 단계는 섹션에 대한 제 1 방향으로 원심력을 가함으로써 비드를 충전하는 단계를 포함하여, 단계 b)에서 충전된 비드의 구조가 얻어질 수도 있다. 제 1 방향은 바람직하게는 비드가 입자 유지 소자를 향해 이동하는 것과 같다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 세정 단계는 단계 d) 동안에 실질적으로 제 1 방향으로 원심력을 가하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 정량 가능 비드 착물을 포함하는 비드는, 단계 d)의 제 1 방향과 상이한 제 2 방향을 갖는 원심력을 가함으로써 섹션으로부터 이송된다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 상기 방법은, 샘플의 분석물이 정성적 및/또는 정량적으로 측정되도록, 정량 가능 비드 착물을 분석하는 단계를 포함한다. 분석은 단계 a 내지 d와 동일한 유체 회로의 섹션, 또는 독립된 분석 섹션에서 행해질 수도 있다. 분석 수단은 정량 가능 비드 착물 중에 존재하는 추적 물질의 유형에 의존한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 추적 물질은 밀도 n > m2이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 비드 및 추적 물질은 표준화된 분석물과 반응하여 단계 a)의 규정량의 분석물-추적 물질을 포함하는 비드를 얻는다. 예를 들면, 유체 칩 중에서 상기 방법을 행하는 경우, 규정량의 분석물-추적 물질을 포함하는 비드는 일반적으로 미리 제조되고, 종종 유체 칩 중에 건조 제형으로 제공된다. 표준화된 분석물은 샘플의 분석물과 공통의 비드로의 결합에 요구되는 관련 구조 모티프만을 포함할 필요가 있다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 분석물은 생체지표이다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 추적 물질은 나노 입자이고, 및/또는 적어도 1.1, 적어도 1.5, 적어도 2.0, 및 더욱 바람직하게는 적어도 3.0g/cm3의 밀도를 갖는다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 추적 물질, 나아가서는 정량 가능 비드 착물은 바람직하게는 발광성이거나, 뚜렷한 측정 가능 흡광도 또는 광산란 특징을 가짐으로써, 광학적으로 검출 가능하다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시형태에 있어서, 비드는 1.5 미만, 1.3 미만, 1.2 미만, 또는 1.1g/cm3 미만의 밀도를 갖는다.
추가적인 양태에 있어서, 본 발명은 또한 가해지는 원심력에 대한 유체 칩의 배향을 변화시킬 수 있는 원심분리 장치용 유체 칩에 있어서 본 발명에 따른 방법의 사용을 제공하고, 유체 칩은 비드, 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 상기 방법의 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 포함한다.
또한 추가 양태에 있어서, 본 발명은 선행하는 실시형태 중 어느 하나에 따른 방법에 사용하기 위한 유체 칩을 제공하고, 유체 칩은 가해지는 원심력에 대한 유체 칩의 배향을 변화시킬 수 있는 원심분리 장치에 적합하며, 비드 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는, 상기 방법의 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 포함한다.
모든 양태에 있어서, 본 발명의 방법에 사용되는 유체 칩은 유리하게는 미세 유체칩일 수도 있다. 그러나, 일부 경우에, ml 범위의 부피의 유체 칩이 바람직할 수도 있는 것이 상정된다.
도 1a 내지 1k는 본 발명에 따른 방법에 사용되는 단계를 나타내는 개략도이다.
도 1l 내지 1p는 미세 유체칩 중의 비드를 이동시키기 위한 본 발명의 개념을 나타내는 개략도이다. 상기 개념은 유리하게는 본 발명에 따른 방법과 조합될 수도 있다.
도 2a 내지 2b는 유체 회로 중의 상이한 밀도의 비드를 분리하기 위한 본 발명의 개념을 나타내는 개략도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합한 미세 유체 회로의 추가적인 세부사항을 나타내는 개략도이다.
용어의 정의
용어 《분석물》은 본 발명의 문맥에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서 정성적 또는 정량적으로 측정될 수도 있는 임의의 화합물을 포함하는 것으로 이해된다. 특히, 용어 "분석물"은 특정 질병 상태, 또는 생물체, 바람직하게는 인체의 다른 어떠한 생리학적 상태의 지표(즉, 생체지표)로서 사용될 수 있는 임의의 화합물을 포함하는 것으로 한다. 생체지표는, 예를 들면 빈혈용 생체지표, 예를 들어 에리스로포이에틴(EPO) 페리틴, 가용성 트랜스페린 수용체(sTrR), 엽산(폴레이트), 트랜스페린, 헤모글로빈, 비타민 B12, 골질환용 생체지표, 예를 들어 알칼리성 포스파타아제(ALP), 오스테오칼신, 부갑상선 호르몬(PTH), 골 특정 알칼리성 포스파타아제(BSAP), 비타민 D, 1,25 디히드록시, C-말단형 I 콜라겐 텔로펩티드(CTx), 비타민 D, 25 히드록시, N-말단형 I 콜라겐 텔로펩티드(NTx), 심장 질환용 생체지표, 예를 들어 아포지질단백질 E(Apo E), 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(BNP), LDH, CK, CKMB, 프로-B형 나트륨이뇨 펩티드(Pro-BNP), C-반응성 단백질(CRP), 트로포닌 I, 트로포닌 T, CRPhs(초고감도), 당뇨병용 생체지표, 예를 들어 C-펩티드, HbA1c, IA-2 항체, 인슐린, 프룩토사민, 인슐린 증식 인자(IGF-1), 글루카곤, 마이크로알부민, 글루코오스, 프로인슐린, 항체, 내분비과 관련 생체지표, 예를 들어 알파-태아단백질, 성장 호르몬, 부신 피질 자극 호르몬(ACTH), 성장 방출 인자(GRF), 코르티코스테론, 프로락틴, 코르티솔, 테스토스테론, 여포 자극 호르몬(FSH), 소화기내과 관련 생체지표, 예를 들어 가스트린, 리파아제, 감염 질환 관련 생체지표, 예를 들어 항보렐리아, 항풍진, 항HBs, 항HBc, 항HBe, 항HCV, 항HIV I/II 및 감염원뿐만 아니라, HIV-p24, HBsAg 등의 감염원의 일부가 되는 특정 항원에 대한 기타 항체, 염증/면역 관련 생체지표, 예를 들어 면역 글로불린(IgA, IgG, IgM, IgE, IgD 및 그 하위 집합), 클루스테린(아포지질 단백질 J), C-반응성 단백질(CRP), CRPhs(초고감도), 프로칼시토닌(PCT), 헤파린 결합 단백질(HPB), 칼프로텍틴, 인간 호중구 리포칼린/호중구 젤라티나아제 관련 리포칼린(HNL/NGAL), 엔도텔린-1, 피브리노겐, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(G-6-PDH), IFNγ에 의해 유도된 모노카인(MIG/CXCL9), IFN-알파, 네옵테린, IFNγ(IL-2, IL-4, IL-10)-4-플렉스, IL-10, IL-10(IL-2, IL-4, IFNγ)-4-플렉스, IL-1β, 란테스/CCL5, IL-2(IL-4, IL-10, IFNγ)-4-플렉스, IL-4(IL-2, IL-10, IFNγ)-4-플렉스, 종양 성장 인자(TGF-β1), IL-6, 종양 괴사 인자(TNFα), 지질 대사 관련 생체지표, 예를 들어 IL-8, 아포지질 단백질 AI(Apo AI), 콜레스테롤, 아포지질 단백질 AII(Apo AII), HDL-콜레스테롤, 아포지질 단백질 B-100(Apo B), LDL-콜레스테롤, 아포지질 단백질 B48(Apo B48), 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스페라아제(LCAT), 아포지질 단백질 CII(Apo CII), 파락소나아제(PON1), 아포지질 단백질 CIII(Apo CIII), 포스파티딜 이노시톨 글리칸 F(PIGF), 아포지질 단백질 E(Apo E), 트리글리세라이드, 신장내과 관련 생체지표, 예를 들어 알파-GST, 베타-2-마이크로글로불린(혈청), 마이크로알부민, 베타-2-마이크로글로불린(소변) 시스타틴 C, 크레아티닌, 혈액종양내과 관련 생체지표, 예를 들어 탄수화물 항원 19-9(CA19-9), 전립선 특이 항원(PSA), 발암성 태아 항원(CEA), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 섬유아세포 성장 인자(FGFb), 및 갑상선 상태 관련 생체지표, 예를 들어 항갑상선 페록시다아제 Ab(TPO), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 항티로글로불린 Ab, 토탈 티록신(T4), 프리 티록신(FT4), 토탈 트리요오도티로닌(T3), 프리 트리요오도티로닌(FT3), TSH 수용체 Ab, 및 티로글로불린일 수도 있다.
용어 "추적 물질"은 목적의 분석물(예를 들면, 생체지표) 또는 비드(용어 비드는 이하에 정의됨)에 결합할 수 있고, 분석 화학/생물학의 기술에서 일반적인 임의의 적합한 기술에 의해 정량 가능 또는 동정 가능하게 하는 성질을 나타내는(즉, 광학적, 자기적, 전기적으로, 또는 방사선에 의해 검출될 수도 있음) 임의의 물질을 포함하는 것으로 한다. 특정 목적의 성질은 광학적 검출을 가능하게 하는, 예를 들면 추적 물질이 발색단 등의 광을 흡수 및/또는 산란시키거나, 형광 또는 인광 등의 발광성을 나타내고, 또는 추적 물질이 직접적으로 광학적으로 검출 가능하지 않지만, 추가의 기질과 반응하여 광학적으로 검출 가능한 반응 생성물을 제공할 수도 있는 것이다. 목적의 분석물(예를 들면, 생체지표)로의 결합에 적합한 추적 물질 또는 비드의 결합부는, 예를 들면 단백질, 핵산, 탄수화물 및 킬레이트 화합물을 포함한다. 특정 결합부는 항체, 항원, 핵산 탐침 또는 기타 생체 특정 수용체 리간드 시스템을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 추적 물질의 예로는 나노 입자, 바람직하게는 금속 기반 나노 입자, 및 효소를 포함하는 것을 들 수 있다. 추적 물질의 나노 입자의 직경은 전형적으로는 3 내지 100nm이다. 바람직한 나노 입자로는 금(ρ=19.3g/cm3), 은(ρ=10.5g/cm3), 또는 철(ρ=7.9g/cm3) 콜로이드 등의 금속 기반 입자 및 업컨버전 나노 입자(UCNP; ρ는 전형적으로 4 내지 5g/cm3) 등의 무기 결정을 들 수 있다.
추적 물질로서의 금속 기반 나노 입자의 사용은 금 나노 입자의 검토를 위해 잘 알려져 있으며, 예를 들면 「S. Zeng et al .; "A review on functionalized gold nanoparticles for biosensing applications". Plasmonics 6 (3): 491-506」을 참조한다.
본 방법에 사용하기에 적합한 UCNP의 검토를 위해, 예를 들면 「Cheng et al. Nanoscale, 2013, 5, 23」 및 「Ang et al. Nanomedicine, 2011, 6, 1273」을 참조한다.
추적 물질로서의 형광단의 사용은, 예를 들면 「The Molecular Probes® Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, by Life Technologies™」에 있어서 포괄적으로 참조된다.
그 자체로는 광학적으로 검출 가능하지 않은 다른 물질 또한 추적 물질로서 사용될 수도 있다. 예를 들면, ELISA형 어세이를 행하기 위해 본 방법을 사용할 경우, 얻어지는 비드-분석물-추적 물질 착물의 최종 분석은 추적 물질의 직접적인 광학적 검출에 의존하지 않지만, 추적 물질 상의 효소와 적합한 물질 사이의 반응으로부터의 반응 생성물(색상 또는 형광 또는 전기 화학적 신호를 제공함)에 의존한다.
적합한 추적 물질을 합성하기 위한 방법의 예는 종래기술에 포괄적으로 개시되어 있고, 본 발명의 방법에 적합한 추적 물질을 얻는 것은 합성 화학 또는 생화학의 당업자의 지식의 범위내이다.
용어 "비드"는 임의의 유형의 고체상 입자 또는 비드를 포함하고, 바람직하게는 0.1 내지 50μm, 0.5 내지 50μm의 직경, 바람직하게는 2μm 내지 20μm의 직경을 갖는 구형 마이크로 또는 서브마이크로 입자인 것으로 한다. 이들 입자는 다공질이거나 매끈한 고체 표면을 가질 수도 있다. 그것들은 소형화되거나 고체 재료, 액체 또는 기체일 수도 있는 비드 내의 하나 이상의 중심 핵 재료를 둘러 싸는 하나 이상의 쉘을 가질 수도 있다. 비드는 불투명하거나 투명할 수도 있다. 바람직하게는, 비드는 실질적으로 투명하며, 물의 밀도(ρ=1.0g/cm3)보다 약간 큰 부피 질량 밀도(volumetric mass density)(ρ)를 갖는 폴리머로부터 제조된다. 전형적으로, 비드는 폴리스티렌(ρ=1.05g/cm3), 폴리메틸메타크릴레이트(ρ=1.18g/cm3) 또는 중공 실리카(hollow silica) 비드 등의 다른 적합한 재로로 이루어진다. 또한, 본 발명에 따른 분석 방법에 사용되는 경우, 비드는 복수의 공유 결합된 분자 구조 또는 목적의 분석물 또는 추적 물질에 결합할 수 있는 개체를 포함한다. 이러한 분자 구조 또는 개체는, 예를 들면 항체 또는 그 단편, 핵산, 압타머, 킬레이트 구조, 분석물의 결합 모티프를 나타내는 합성 분자 구조 등일 수도 있다. 본 개시에서, 경쟁 어세이의 경우에 비드는 또한 규정량의 분석물-추적 물질 단위(즉, 추적 물질에 결합된 분석물로 이루어지는 단위)를 포함할 수도 있다. 용어 "규정량"은 이 점에 관해서, 공지의 분석 결과 또는 신호를 제공하기 위해서 비드가 표준화된 것을 나타내는 것을 의도한다. 샘플로부터 경쟁 분석물과의 상호작용 후에 규정량의 분석물-추적 물질 단위를 최초로 갖는 비드를 분석하고, 상기 공지의 분석 결과를 갖는 분석 결과를 비교함으로써, 분석물을 결정(determine)/측정(measure)할 수도 있다.
용어 "정량 가능 비드 착물"은 본 개시에 있어서는 비드와 분석물 사이, 또는 일부 어세이에서는 비드와 추적 물질 사이의 상호작용에 의해 형성되는 착물을 의미하는 것으로 한다. 후자는 경쟁 어세이 유형으로 형성되고, 여기서 비드와 분석물은 추적 물질로의 결합을 위해 경쟁한다. 일반적으로, 착물은 비드, 분석물 및 추적 물질을 포함한다. 어세이의 유형에 관계없이, 정량 가능 비드 착제의 정성적 및/또는 정량적 분석은 샘플로부터 측정될 분석물의 간접적인 정성적 및/또는 정량적 분석을 제공한다. 정량 가능 비드 착물의 특정 구조는 행해지는 어세이의 유형에 따라 상이하다. 예를 들면, 비경쟁 어세이에서, 착물은 이상적으로는 비드를 포함하고, 여기서 비드는 경쟁 어세이 동안에 적어도 하나의 분석물-추적 물질 단위에만 결합되고, 착물은 추적 물질 없이, 샘플로부터 유래하는 분석물-추적 물질 단위와 분석물 양방에 결합되는 비드를 포함할 수도 있다. 정량 가능 비드 착물의 추가적인 변형 또한 가능하며, 어세이의 유형에만 의존한다. 대부분의 어세이에 있어서, 정량 가능 비드 착물은 또한 정량 가능 비드-분석물 착물(즉, 착물은 분석물에 결합하는 비드를 포함함) 또는 정성적 및/또는 정량적 측정 가능 비드-분석물 착물로 칭해질 수도 있다.
용어 "샌드위치 착물"은 본 개시에서는 비드, 분석물 및 추적 물질을 포함하는 착물을 의미하는 것으로 한다. "샌드위치 착물"은 전형적으로는 정량 가능 비드 착물이지만, 경쟁 어세이와 관련될 수도 있는 용어는 또한 상술한 규정량의 분석물-추적 물질 단위를 포함하는 비드를 나타낸다.
용어 d, d1, d2 등은 g/cm3 단위의 특정 액체 매체의 부피 질량 밀도를 나타내는 것으로 한다.
용어 m, m1, m2 등은 g/cm3 단위의 특정 고체 재료의 부피 질량 밀도를 나타내는 것으로 한다.
용어 "액체 매체"는 행해지는 특정 어세이에 사용하기에 적합한 임의의 액체를 포함하는 것으로 한다. 특정 어세이에 있어서의 특정 액체 매체의 적합성은 당업자에 의해 용이하게 이해된다. 또한, 요구되는 부피 질량 밀도의 임의의 액체는 액체 중에 용해되거나 액체와 혼합되는 첨가제에 의해 변경될 수도 있다. 이는 각종 물질, 염, 액체 또는 기체와 같은, 관련된 임의의 유형의 재료에 대해서 사실이며, 단 그것들은 적절히 혼합 및 용해된다. 밀도의 변화는 관련된 물질의 농도 및 상대 밀도와 관련이 있다. 용매와 상이한 밀도를 갖는 용해성 화합물은 모두 용액/액체의 밀도에 영향을 미친다. 전형적으로는, 해수는 순수한 담수(1.00g/cm3)보다 높은 밀도(표면 1.025g/cm3)를 갖는다. 특히 밀도 구배 원심분리의 분야에서 수용액의 밀도를 변경하기 위해서 각종 물질이 사용된다. 이들로는 수크로오스, 수크로오스 폴리머, 각종 코팅 콜로이드 및 염화세슘과 같은 물질뿐만 아니라, 이오딕사놀, 이오헥솔, 메트리자마이드 및 고농도로 물에 용이하게 용해되는 다른 것 등의 요오드 함유 물질을 들 수 있다.
본 출원의 문맥에서 용어 "반응물"은 분석 방법에 있어서 존재하는 성분, 예를 들면 분석물, 추적 물질 또는 비드 상의 결합 분자체에 대한 일반적인 용어로 한다.
용어 "건조 제형"은 어세이를 행하는데 사용되는 장치로 포함될 수도 있는 비드 및 나노 입자의 제조물을 포함하는 시약을 나타낸다. 이들 건조 제형은 진공 건조 또는 동결 건조에 의해 제조될 수도 있다. 동결 건조 제형은 0.1μL 내지 200μL의 규정 크기를 갖는 균일한 구형 앨리쿼트로서 제조되었다. 이들은 대량으로 제조된 후에 분석 장치로 순차적으로 분배될 수도 있다.
본 발명의 일반적인 원리
본 발명은 제 1 용액 중의 반응물과 고체상 입자의 표면에 결합된 반응물 사이의 매우 효율적인 상호작용을, 제 2 용액을 사용하여 고체상 입자를 현탁액으로 가져옴에 의한 고체상 입자의 매우 효율적인 세정과 조합한 분석 방법을 기재한다.
고체상 입자는 마이크로 크기의 비드 또는 구형 입자이다.
용액 중의 반응물과 고체상 입자의 표면에 결합된 반응물은 모두 행해지는 어세이의 유형에 따라 다르다.
샌드위치형 비경쟁 면역 어세이에 있어서, 용액 중의 반응물은 분석물(예를 들면, 생물학적 샘플 중에 존재하는 어떠한 유형의 생체지표) 및 추적 물질(예를 들면, 특정 생체지표에 대해 선택적인 라벨링된 항체)이다. 상기 반응물은 고체상 입자와의 상호작용 전에 혼합될 수도 있고, 즉 동시에 적용되거나, 미리 형성된 분석물-추적 물질 단위로서 적용되거나, 연속적으로 적용될 수도 있다(즉, 추적 물질이 적용되기 전에 분석물이 고체상 입자에 결합됨). 고체상 입자의 표면 상의 반응물은 분석물 및/또는 분석물-추적 물질 단위에 결합할 수 있는 분자 구조(예를 들면, 항체)이다.
경쟁 면역 어세이에 있어서, 용액 중의 반응물은 샘플 중에 존재하는 분석물과 샘플 분석물에 의해 비드로부터 치환된 상당량의 분석물-추적 물질 단위의 혼합물일 수도 있다. 고체상 입자의 표면 상의 반응물(즉, 비드)은 샘플 중에 존재하는 분석물에 결합할 수 있는 분자체 또는 구조(예를 들면, 항체)를 포함하고, 여기서 분자 구조는 원래 분석물-추적 물질 단위에 결합된다.
효율적인 상호작용을 달성하기 위해서, 고체상 입자는 구조, 예를 들면 컬럼 중에 조밀하게 충전된다. 이는 바람직하게는 어세이 장치(예를 들면, 미세 유체칩) 중의 유체 회로의 섹션 또는 캐비티 내에 유지된 고체상 입자를 가짐으로써 달성된다. 섹션 또는 캐비티는 유리하게는 실질적으로 컬럼 형상일 수도 있지만, 다른 형상 또는 형태가 적합하다. 고체상 입자는 바람직하게는 입자 유지 소자, 예를 들면 섹션에 배치된 필터 소자에 의한 캐비티, 또는 유체 회로의 캐비티 중에 유지된다. WO 2011/081530 A1에 개시되어 있는 트랩은 필터 소자의 사용을 필요로 하지 않는 입자 유지 소자를 포함하는 캐비티를 제공하기 위한 대체 용액이다.
필터 소자는 고체상 입자가 통과되지 않도록 하는 구멍 크기 또는 슬릿 크기를 갖도록 설계 및 선택된다. 액체 용액은 필터 소자의 반대측의 컬럼측으로부터 상기 소자를 향해 작용하는 원심력을 가함으로써 고체상 입자 컬럼 또는 입자 현탁액으로부터 제거된다. 이와 같이 하여, 액체 용액은 고체상 입자 컬럼 및 필터 구조를 통해 압출된다.
적층된 비드를 통한 흐름은 컬럼에 대한 원심력의 각도를 변경함으로써, 또는 입자 유지 소자의 유동 저항을 변경함으로써 제어할 수도 있다.
필터를 통하는 액체의 흐름은 필터를 통과하는 액체의 출구를 제어하는 밸브를 사용하여 제어할 수도 있다. 그렇지 않으면, 이것은 고체상 입자를 함유하는 컬럼 형상 캐비티에 실질적으로 평행하게 침지되는 액체 컬럼과 같이 출구 액체에 가해지는 대항 압력을 제어함으로써 완료될 수 있다. 그 후에 원심력에 대한 어세이 장치(예를 들면, 미세 유체칩)의 배향을 변경함으로써 입자로부터 액체를 제거할 수도 있다.
고체상 입자의 효율적인 세정을 달성하기 위해서, 제 2 액체 용액을 첨가함으로써 입자가 현탁된다. 제 2 액체 용액은 고체상 입자의 부피 밀도보다 높은 밀도를 갖는다. 고체상 입자는 상기 액체 중에 존재하며, 원심력에 노출될 때에 그 컬럼 형상 구조로부터 꺼내지기(unpacking) 시작하고, 부유에 의해 원심분리축에 가장 가까운 고밀도 액체의 표면을 향해 이동한다. 이 방법에 의해, 고체상 입자는 용액 중에 분산된 표면을 향해 가고, 또한 임의의 비결합 추적 시약(예를 들면, 비결합 추적 물질 또는 비결합 분석물-추적 물질 단위), 및 고체상을 갖는 용액 중의 반응물의 상호작용 동안에 충전된 고체상 입자의 컬럼 형상 구조 중에 포획된 다른 가용성 또는 분산성 성분으로부터 분리된다. 여과에 의해 컬럼 형상 캐비티로부터 제 2 액체 용액이 배출되는 경우에, 부유에 의해 얻어진 제 2 액체 용액 중의 고체상 입자의 분산은 이들 입자의 효율적인 세정을 가능하게 한다.
"저밀도" 고체상 입자와 다른 분산성 재료 사이의 분리는, 이들 후자의 재료가 제 2 액체보다 높은 밀도를 갖는 입자를 포함하는 경우에, 더 용이해질 수도 있다. 이들 입자는 금속 콜로이드 등의 고밀도 나노 입자 또는 제 2 액체보다 높은 밀도를 갖는 폴리머 마이크로 입자일 수도 있다. 이 상황에서, 제 2 액체보다 높은 밀도를 갖는 입자는, 저밀도 입자가 회전축을 향해 이동하는 반면, 원심분리축으로부터 떨어진다. 분리의 정도는 포함되는 성분 및 액체의 밀도, 입자의 크기, 가해진 원심력 및 원심분리 시간의 차이에 의존한다.
따라서, 충전된 고체상 입자는 입자를 둘러싸는 용액의 밀도를 변경함으로써 현탁된다. 이 용액, 즉 제 2 액체 용액의 밀도가 입자 자체의 밀도보다 높은 경우에, 입자는 부유, 즉 가해진 중력 또는 원심력의 방향과 반대 방향으로 이동한다. 주위의 액체보다 낮은 밀도의 입자 상에 원심력이 작용하고 있는 경우에, 그것들은 원심 중심에 가장 가까운 용액의 표면으로 서서히 이동하는 반면, 액체보다 높은 밀도의 성분은 침전, 즉 원심 중심으로부터 가장 먼 용액의 부피로 이동하려는 경향이 있다. 어세이의 결합 단계를 행한 후에 고체상 입자를 현탁시킴으로써 달성되는 주요 이점은, 컬럼 중에 고체상 입자를 충전함으로써 얻어지는 다공질 구조에 의해 비특정 방법으로 포착 또는 포획되는 임의의 과잉 추적 물질이 방출되고, 따라서 보다 용이하게 제거되는 점이다.
이 방법에 의해, 예를 들면 액체보다 높은 밀도를 갖는 추적 물질을 액체보다 낮은 밀도의 성분으로부터 효율적으로 분리할 수 있다. 그 후, 액체 중에 분산된 보다 높은 밀도의 성분을 포함하는 액체는, 필터에 도달할 때에 고체상 입자가 정지되는 동안에, 필터를 통해 배출될 수도 있다. 반복된 재현탁 및 배출 단계에 의해 고체상 입자의 반복된 세정 단계를 행할 수도 있다.
고체상 입자보다 높은 밀도의 추적 물질을 갖는 것은 유리하지만, 컬럼에 충전된 고체상 입자의 재현탁은 또한 추적 물질이 고체상 입자보다 낮거나 동일한 부피 밀도를 갖는 경우에, 매우 개선된 세정 단계를 제공한다. 후자의 경우, 추적 물질은 여전히 상술한 바와 같이 다공질 구조로부터 방출되고, 따라서 필터 소자를 통해 제 2 액체 용액이 배출되는 경우에 고체상 입자로부터 보다 용이하게 제거된다.
이 용액은 과잉의 추적 물질을 세정 제거하기 위한 간단한 방법을 제공한다.
랩온어칩 장치(즉, 미세 유체칩, 처리 카트리지 등) 중의 고체상 입자 또는 비드를 사용하는 것의 추가적인 이점은 현탁액 중의 비드가, 어세이 동안에 장치 내의 상이한 위치/장소로 이송될 수도 있는 점이다. 이것은 이전에 추적 물질에 의해 오염되지 않은 유체 회로의 섹션 또는 캐비티 및/또는 각각의 단계의 최적화된 기능성을 위해 구체적으로 설계된 캐비티로의 입자의 미세 유체 이송을 포함할 수도 있다. 이것은, 예를 들면 우선 저장을 위해 최적화된 캐비티 중에 비드를 갖게 하고, 그 후에 빠른 상호작용을 위해 최적화된 캐비티(즉, 컬럼 형상 구조)로 비드를 이송하고, 그 후에 세정을 위해 최적화된 캐비티, 추가적으로는 판독을 위해 최적화된 캐비티로 비드를 이송하고, 최종적으로는 폐기물 저장용 캐비티로 이송한다.
설명한 바와 같이, 샘플을 분석하는데 사용되는 장치는, 특정 절차에 따른 샘플과 시약 양방의 미세 유체 처리를 위해 구체적으로 설계된 미세 유체칩 또는 카트리지일 수도 있다. 이들 카트리지는 일반적으로 펌프, 밸브, 원심력 또는 기타 물리적 수단에 의해 카트리지 내의 유체를 처리하는 기기에 의해 조작된다. 특히, 본 발명은 원심력 또는 중력에 의해 미세 유체칩 내에서 조작되는 어세이 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 개념에 있어서, 본 출원은 또한 상이한 밀도의 비드 또는 고체상 입자를 분리하기 위한 효율적인 방법을 개시한다. 이 개념은 동시에 복수의 분석물의 분석 후에, 얻어지는 상이한 정량 가능 비드 착물의 용이한 분리를 가능하게 한다. 제 1 개념은 하기에 더 설명한다.
상호작용 또는 결합 단계 및 그 후의 매우 효율적이며 간단한 세정 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 추가하여, 본 출원은 또한 액체의 상부에 부유하는 비드, 즉 다른 캐비티로 원심력을 생성하는 회전축을 향한 방향으로 이동된(부유된) 비드를 디캔팅하고 따라서 이송함으로써 비드보다 높은 밀도를 갖는 액체를 사용하여 비드가 한 캐비티로부터 다른 곳으로 효율적으로 이송될 수도 있는 본 발명의 제 2 개념을 개시한다. 제 2 개념은 하기에 더 설명한다.
본 발명의 제 1 개념과 제 2 개념 모두 유리하게는 본 출원의 발명과 조합될 수도 있지만, 이러한 사용으로 제한되는 임의의 방법은 아니다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명에 따른 방법의 개략도를 도 1a 내지 도 1k에 나타낸다. 상기 방법은 하나 이상의 목적의 분석물에 대해 샘플을 분석하는 것을 목적으로 한다. 상기 방법은 액체 중에 용해될 수도 있는 임의의 유형의 샘플에 적합하고, 또한 이러한 분석을 행하기 위한 어세이가 제공될 수도 있는 상기 샘플 중의 임의의 유형의 화합물 또는 물질을 검출/정량하는데 적합하다.
이하에서, 샘플은 생물학적 샘플인 것으로 가정되고, 표적 화합물 또는 물질은 바람직하게는 생체지표이며, 단백질(항원, 효소, 항체), 핵산, 약물, 호르몬, 영양소, 대사물질, 미생물, 세포 또는 하나 이상의 선택적 결합제를 포함하는 어세이에서 측정될 수 있는 임의의 이러한 분자 또는 분자의 집합체일 수도 있다. 상기 방법은 생체지표를 고체상 입자(즉, 마이크로 크기의 비드, 구형 입자 등)와 반응시키는 공지의 원리에 의거하고, 여기서 고체상 입자는 생체지표와 결합할 수 있는 분자 구조 또는 분자체를 포함한다. 생체지표가 항원인 경우에, 적합한 분자체는, 예를 들면 항체이다. 고체상 입자 및 생체지표에 추가하여, 추적 물질이 존재해야 한다. 추적 물질은 생체지표에 결합할 수 있는 분자체를 특징으로 한다.
고체상 입자 또는 비드는 상기에 정의된 바와 같다.
추적 물질은 상기에 정의된 바와 같다.
전형적인 이종 면역 어세이의 제 1 단계는 정량 또는 동정된 생체지표를 포함하는 생물학적 샘플을, 제 1 액체 매체 중의 비드 및/또는 추적 물질과 상호작용시키는 단계, 접촉시키는 단계, 배양하는 단계, 플러싱(flushing)하는 단계 또는 혼합하는 단계로 이루어지며, 도 1a 내지 도 1e를 참조한다. 표적 생체지표가 고체상 입자와 추적 물질 사이의 링커로서 기능할 경우에는 샌드위치형 배치가 설정된다. 이들 상호작용은 양방의 순서로, 또는 함께 적용된 모든 관련 반응물에 의해 연속적으로 행해질 수 있다. 바람직하게는, 이들 "샌드위치 착물" 중의 생체지표와 추적 물질의 이론 공연비가 1:1로 고정되어 있는 것이 확인된다. 비경쟁 어세이에서, 비드와 추적 물질 모두 생체지표에 결합할 수 있다. 추적 물질 및 고체상 입자는 몇몇 생체지표 특정 수용체를 담지할 수도 있고, 따라서 몇몇 생체지표 분자에 결합할 수도 있다. 그러나, 일반적으로 어세이는 생체지표에 대해 대과잉의 추적 물질을 함유하도록 설계된다. 그렇게 함으로써 통계학적으로, 각각의 생체지표 분자는 하나의 추적 물질에만 결합한다. 그러나, 각각의 미세 구형 비드는 매우 넓은 표면을 노출하고, 많은 표적 생체지표 및 그 후의 추적 물질에 결합할 수도 있다.
원리의 설명을 위해 나타내는 바와 같은 이 특정의 간략화된 실시형태에 있어서, 어세이는 W자 형상 캐비티, 유체 회로 또는 시험관 배치(1)에서 행해진다. 캐비티(1)는 제 1 출구(2)와 제 2 출구(3), 입구(4), 및 제 1 필터 소자(5)와 제 2 필터 소자(6)를 포함한다. 제 1 필터 소자(5)는 입구(4)와 제 1 출구(2) 사이에 배열된다. 입구와 제 1 필터 소자 사이에 배치되는 섹션은 컬럼 구조(7)를 형성한다. 화살표(G)는 캐비티 또는 시험관에 대해 가해진 원심력(또는 중력의 사용만이 현저히 느린 어세이를 제공하고, 실용적이지 않음에도 불구하고, 중력)의 방향을 나타낸다. 캐비티(1)는 유체 또는 미세 유체칩, 예를 들어 본 개시의 배경기술 섹션에 기재된 종래기술에 개시된 미세 유체칩 중의 유체 회로의 일부일 수도 있다. 이 경우, 캐비티는 미세 유체칩의 외부 회전축에 수직인 평면에 배치되어 있는 것으로 간주될 수도 있다. 따라서, 요구되는 원심력(G)은 상기 축 주변의 미세 유체칩의 회전에 의해 얻어지고, 미세 유체칩 중의 캐비티에 대한 원심력의 방향은 미세 유체칩이 스스로 회전함으로써 변경될 수도 있다.
도 1a 내지 도 1p에 있어서, W자 형상 캐비티(또는 유체 회로의 섹션)의 각종 부분은, 예를 들면 유체칩 내의 동일한 수평 레벨에 배치된 하나의 평면에 있는 것으로서 나타내어진다. 그러나, 많은 경우에 W자 형상 캐비티의 일부는 실질적으로 수직으로 배향된 채널에 의해 연결된 상이한 수평 레벨에서 유리하게 배치될 수도 있다. 도 3에 나타낸 바와 같이, W자 형상 캐비티 또는 유체 회로의 섹션은 L1 및 L2 내에 나타낸 측면 채널을 접속하는 횡단 채널(15, 16 및 17)을 갖는 2개 이상의 레벨에 배치될 수도 있다. 필터(5, 상세도 A) 및/또는 입자 트랩을 포함하는 다른 기능 소자는 바람직하게는 하나 이상의 이러한 횡단 채널(6, 상세도 B)의 내부 또는 그 위에 배치된다.
도 1a 내지 도 1e에 의해 나타내어지는 특정 어세이는 비경쟁 어세이이다. 이러한 어세이에서는, 비드(8) 및 추적 물질(9)(도 1d 참조)이 모두 대과잉으로 제공되어, 중간 생체지표의 존재 없이 서로 반응하지 않기 때문에, 어세이의 각종 성분이 상호작용, 접촉, 또는 혼합되는 배열이 임의로 선택될 수도 있다. 또한, 혼합하는 단계, 상호작용하는 단계 또는 접촉하는 단계(즉, 결합 단계)는 유리하게는 상술한 제 1 액체 매체가 비드(8)에 의해 형성된 플러그, 또는 컬럼을 통과하는 단계를 포함하여 비드, 추적 물질(9) 및 생체지표 사이의 반응이 가능한 신속히 완료되는 것을 보장할 수도 있다. 플러그 또는 컬럼은 컬럼 형상 캐비티(7)에 충전된 비드 또는 부피를 가짐으로써 얻어진다. 컬럼 형상 캐비티(7)는 바람직하게는 랩온어칩 장치의 유체 회로(즉, 미세 유체칩 또는 처리 카트리지의 유체 회로)의 일부일 수도 있다. 본 발명에 따른 분석 방법은 비경쟁 어세이의 사용에 의해 설명되지만, 상기 방법은 임의의 유형의 잉여 반응물 또는 오염 물질을 제거하기 위한, 적층/충전된 비드의 세정 단계를 요구하는 임의의 다른 어세이에 있어서 마찬가지로 유리하다.
도 1a 및 도 1b에 있어서, 액체 매체 중에 현탁된 비드는 입구(4)를 통해 도입된다. 액체 매체는 비드 밀도 미만의 밀도를 갖는다. 비드의 밀도는 m1 g/m3로 나타내어진다. 원심력(G)에 의해, 비드는 컬럼 형상 캐비티(7) 및 제 1 필터 소자(5)에 의해 구분된 컬럼 형상 구조에 충전되며, 도 1c를 참조한다. 비드는 상기 캐비티의 일단에 배치된 제 1 필터 소자(5)에 의해 컬럼 형상 캐비티 중에 유지된다. 필터 소자는 필터, 그리드, 체, 세격 등을 포함할 수도 있고, 그것을 통해 비드가 통과하는 것을 방지할 수 있다.
다음 단계에 있어서, 도 1d를 참조하자면, 생체지표를 포함하는 액체 매체 중에 현탁된 추적 물질(9)은 입구(4)를 통해 도입된다. 이 특정 실시형태에 있어서, 생체지표를 포함하는 샘플은 비드와의 상호작용 전에 추적 물질과 상호작용할 수 있으며, 따라서 샘플은 추적 물질이 현탁되는 액체 매체의 일부를 형성할 수도 있다. 비드를 현탁하는 액체 매체, 및 추적 물질을 현탁하는 액체 매체로부터 얻어지는 조합 액체 매체는 비드보다 낮은 밀도를 갖는다. 조합 액체 매체는 제 1 액체 매체로 나타내어지고, 상기 액체 매체의 밀도는 d1 g/cm3로 나타내어진다.
추적 물질 및 생체지표를 포함하는 제 1 액체 매체뿐만 아니라, 추적 물질과 생체지표의 상호작용에 의해 형성된 착물은 충전된 비드를 통해 통과된다. 충전된 비드를 통해 제 1 액체 매체가 통과하는 경우, 비드, 생체지표 및 추적 물질을 포함하는 "샌드위치 착물"이 형성된다. 필터 소자(5)는 추적 물질(9), 및 추적 물질과 생체지표의 상호작용에 의해 형성되는 착물이 통과할 수도 있는 것이며, 도 1d를 참조한다. 제 1 액체 매체는 컬럼을 통과하고, 가해진 원심력(G)의 방향을 변경함으로써 W자 형상 캐비티(1) 또는 시험관으로부터 도출되며, 도 1f 내지 도 1h를 참조한다. 대체 실시형태에 있어서, 제 1 액체 매체는, 예를 들면 제 1 필터 소자의 아래에 위치하는 밸브의 사용에 의해 캐비티로부터 도출될 수도 있다.
비드(8), 추적 물질(9) 및 생체지표 사이의 상호작용의 순서는 특정 경우에는 어느 용액이 가장 적절한지 또는 적합한지에 따른다. 따라서, 생체지표를 포함하는 샘플은 추적 물질(9)이 현탄되는 액체 매체의 일부, 또는 비드(8)가 현탁되는 액체 매체의 일부일 수도 있다.
비드, 추적 물질 및 생체지표 사이의 상호작용은 충전된 비드의 컬럼을 통해제 1 액체 매체를 1회 통과시킨 후에 완료되지 않을 수도 있다. 유리하게는, 미반응 추적 물질, 생체지표, 및 추적 물질과 생체지표의 상호작용에 의해 형성되는 착물(즉, 분석물-추적 물질 단위)을 포함할 수도 있는 제 1 액체 매체가 입구(4)로의 재도입에 의해 충전된 비드를 반복적으로 통과한다. 이러한 재도입은, 예를 들면 제 1 출구(2)를 입구(4)와 연결하는 루프 구조(예를 들면, 루프로서 형성되는 유체 회로)를 가짐으로써 달성될 수도 있다. 후자의 용액은 W자 형상 캐비티가 랩온어칩 장치 중의 유체 회로의 일부인 경우에 특히 유리하다. 재도입 후, 도 1e 내지 도 1h에 따른 단계를 반복할 수도 있다. 충전된 비드의 컬럼 또는 구조를 통한 복수회의 통과를 달성하기 위한 루프 구조를 사용하는 대신에, 제 1 액체 매체를 컬럼 또는 구조에 대한 원심력의 방향을 반복적으로 변경함으로써 충전된 비드를 통해 앞뒤로 이동시킬 수도 있다.
어세이 설계 및 샘플 중의 생체지표의 농도에 따라, 각각의 비드는 아무것도 없는 것으로부터 수천개의 생체지표-추적 물질 착물를 담지할 수도 있다. 바람직한 실시형태에 있어서의 각각의 비드의 부피는 생체지표-추적 물질 착물의 부피보다 실질적으로 크기 때문에, 비드당 다수의 생체지표-추적 물질 착물의 결합은 비드의 부피 질량 밀도에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 전형적인 실시예에 있어서, 구형 5μm(직경) 비드의 부피는 40nm 추적 물질의 부피의 2백만배에 가깝다.
비드, 추적 물질 및 생체지표 사이의 상호작용은 "샌드위치 착물"을 포함하는 충전된 비드(즉, 정량 가능 비드 착물) 및 미반응 추적 물질의 컬럼을 제공한다. "샌드위치 착물"의 밀도는 m2 g/cm3로 나타내어진다. 상호작용 동안에, 일부 미반응 추적 물질(9)은, 충전된 비드에 의해 형성되는 다공질 구조에 의해 비특정 방법으로 포착 또는 포획된다(즉, 비드 사이의 공동(void) 부피에 포착됨). 고감도이며 재현 가능한 분석 결과를 얻기 위해서, 가능한 많은 미반응 추적 물질이 비드 및 "샌드위치 착물"로부터 분리되어야 한다. 종래기술에 있어서, 미반응 추적 물질의 분리는 충전된 비드의 컬럼에 세정액을 통과시킴으로써 반복 세정에 의해 행해진다. 그러나, 상술한 바와 같이, 이러한 세정으로는 포착된 미반응 추적 물질을 모두 제거할 수 없고, 또는 시간을 소모하는 과잉 횟수의 반복 세정이 요구된다.
비드 및 "샌드위치 착물"로부터의 미반응 추적 물질의 분리를 개선하거나 또는 감안하기 위해서, 충전된 비드에 제 2 액체 매체를 첨가하며, 도 1i를 참조한다. 제 2 액체 매체는 d2 g/cm3의 밀도를 갖고, 여기서 d2 > m1 및 m2이다. 디캔팅에 의해 제 1 액체 매체가 제거되는 대체 분석 시스템에 사용되는 경우(즉, 제 1 액체 매체를 필터 소자에 통과시키는 것 대신), 제 1 액체 매체 및 제 2 액체 매체의 소부분의 조합의 밀도는 d2'로 나타내어질 수도 있는 것을 유의해야 한다. 그러나, 제 2 및 제 1 액체 매체의 부피 사이의 높은 비율때문에 d2'의 수치는 d2와 대략 동등하며, 즉 d2' > m1 및 m2이다.
본 방법의 근본적인 특징은 제 2 액체 매체가 비드 및 "샌드위치 착물"보다 높은 밀도를 갖는 것이다. 제 2 액체 매체의 첨가는 충전된 비드의 컬럼이 분해되어, 비드 사이의 밀접한 상호작용이 중단되는 것을 보장한다. 비드 사이의 밀접한 상호작용이 중단되는 경우, 포착/포획된 미반응 추적 물질이 제 2 액체 매체로 방출된다. 제 2 액체 매체의 밀도에 대해서 보다 낮은 밀도때문에, 비드 및 "샌드위치 착물"은 가해진 원심력(G)의 방향에 대하여, 제 1 필터 소자(5)로부터 멀어지게 이동하며, 도 1j를 참조한다. 충전된 비드 사이에 포착/포획되기 이전에 미반응 추적 물질을 제거하기 위해서, 제 2 액체 매체는 가해진 원심력(G)의 방향을 변경함으로써 제 1 출구(2)를 통해 W자 형상 캐비티 또는 시험관으로부터 도출되며, 도 1k를 참조한다. 대체 실시형태에 있어서, 제 2 액체 매체는, 예를 들면 제 1 필터 소자(5)의 아래에 위치한 밸브의 사용에 의해 캐비티로부터 도출될 수도 있다.
상이한 밀도의 제 1 및 제 2 액체 매체를 사용함으로써 얻어지는 가장 중요한 효과는 비드가, d1 < m1인 제 1 액체 매체 중에서 "침전"되는 반면, d2 > m1인 제 2 액체 매체 중에서는 "부유"한다는 것이다. 단어 "침전" 및 "부유"는 가해진 원심력(G)에 대해 액체 매체 중의 비드의 위치를 설명하기 위해 사용되며, 즉 비드가 "부유"하는 경우에, 그것들은 가해진 원심력의 방향과 반대 방향으로 이동했고, 용어 "침전"에 대한 역(逆) 또한 마찬가지이다.
제 2 액체 매체의 제거 후에 미반응 추적 물질의 잔존량이 너무 많은 경우, 도 1i 내지 도 1k에 따라 제 2 액체 매체를 첨가 및 제거하는 단계(즉, 세정 단계)는 제 2 액체 매체의 새로운(fresh) 앨리쿼트를 사용하여 요구되는 횟수로 반복될 수도 있다.
본 발명에 따른 방법의 이 특정 실시형태에 나타낸 바와 같이, 추적 물질은 유리하게는 n g/cm3의 부피 질량 밀도를 가질 수도 있으며, 여기서 n > m1, m2 및 d2이다. 이러한 밀도는, 비드에 제 2 액체 매체가 공급되는 경우, 과잉의 추적 물질이 "침전"되고, 비드 및 "샌드위치 착물"로부터 추적 물질의 분리를 더 용이하게 한다는 것을 보장할 수도 있다. 이것은 대체 실시형태에서 특히 유리할 수도 있으며, 여기서 비드는 상술한 바와 같이 디캔팅에 의해 컬럼 형상 캐비티로부터 이동된다.
그러나, 추적 물질은 특정 밀도를 가질 필요가 없다. 단, 충전된 비드의 컬럼이 분해되어, 비드 사이의 밀접한 상호작용이 중단되는 사실은, 제 2 액체 매체가 제거되는 경우에 과잉의 추적 물질의 개선된 제거가 달성되는 것을 보장한다. 부피 질량 밀도뿐만 아니라, 추적 물질의 다른 성질은 그것들이 제 2 액체 매체에서 어떻게 작용할지를 결정할 수도 있다. 예를 들면, 추적 물질이 나노 입자와 결합되거나, 나노 입자를 포함하는 경우, 그들의 부피 질량 밀도가 제 2 액체 매체의 밀도보다 높거나 낮은 경우에도 장기간에 걸쳐 액체 매체 중에 현탁된 상태를 유지하려는 경향이 있다. 추적 물질의 작용에 영향을 미치는 다른 성질 또는 특징으로는 포함되는 액체 매체에서의 용해성 또는 부유하는 비드로부터 분리된 상태를 유지할 수도 있는 임의의 가해지는 힘(즉, 자기적, 전기적)의 존재를 들 수 있다.
비드의 혼합물에 대해서 상술한 바와 같이, 제 2 액체 매체 중의 추적 물질 및 "샌드위치 착물"은 제 1 방향을 갖는 원심력을 받는다. "샌드위치 착물"을 포함하는 비드(즉, 정량 가능 비드 착물)는 제 2 액체의 밀도(d2)보다 작은 부피 질량 밀도(m1 및 m2)를 가지며, "부유"(즉, 원심 시스템의 회전축에 가장 가까운 제 2 액체 매체의 액체 표면을 향해 이동)하고, 반면 상술한 바와 같이 그 성질, 예를 들어 밀도 n, 크기, 용해성 등에 따른 과잉의 비결합 추적 물질은 "침전", 즉 원심력을 생성하는 회전축으로부터 멀어지거나, 적어도 비드 및 "샌드위치 착물"로부터 제 2 액체 매체, 따라서 현탁된 추적 물질을 분리하는데 충분한 시간 동안 현탁 상태를 유지한다.
미반응 추적 물질의 제거 후, 복수의 "샌드위치 착물"을 분석함으로써 생체지표를 그 위치에서(즉, 컬럼 형상 캐비티(7)에서) 정량 또는 동정할 수도 있다.
대체 실시형태에 있어서, 비드 및 "샌드위치 착물"은 분석을 위해서 상이한 위치 또는 캐비티로 이송된다. 비드, 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 갖는 유체 또는 미세 유체칩을 포함하는 랩온어칩 장치에 본 발명에 따른 방법이 사용되는 경우, "샌드위치 착물"을 포함하는 비드는, 예를 들면 이러한 비드의 분석을 위해 특별히 설계된 유체 회로 또는 캐비티로 이송될 수도 있다.
이 특정 실시형태에 있어서, "샌드위치 착물"을 포함하는 비드는 제 2 컬럼 형상 캐비티(10)로 이송된다. 제 2 액체 매체, 또는 제 2 액체 매체와 동일하거나 보다 높은 밀도를 갖는 상이한 액체 매체의 앨리쿼트를 비드에 더 첨가함으로써 이송이 달성되며, 도 1l 내지 도 1m을 참조한다. 앨리쿼트는 바람직하게는 도 1i 내지 도 1k의 세정 단계에서 사용되는 양보다 많아, 비드는 입구(4)에 보다 가까이 이동할 수도 있다. "샌드위치 착물"을 포함하는 모든 비드를 함유하는 원심분리축(또는 입구)에 가장 가까운 제 2 액체 매체의 부분은 디캔팅에 의해 제 2 컬럼 형상 캐비티(10)로 이송되며, 도 1o를 참조한다. 제 1 컬럼 형상 캐비티에 대한 원심력(G)의 방향을 약간 변경함으로써 디캔팅이 달성된다. 제 2 컬럼 형상 캐비티(10)는 어세이에서 그 다음 바람직한 작용을 위해서 최적으로 설계되며, 즉 제 2 캐비티는 보다 광범위한 세정 및/또는 "샌드위치 착물"의 정량을 위해서 설계될 수도 있다.
이 특정 실시형태에 있어서, 내부에 비드가 충전된 캐비티(7)는 컬럼 형상으로 나타내어져 설명된다. 그러나, 다른 실시형태에 있어서, 반응물 사이의 밀접한 상호작용, 그 후의 액체 매체 중에서 충전된 구조의 분산을 가능하게 하는 비드의 충전된 구조를 제공하는 한, 캐비티는 임의의 형상 또는 형태를 가질 수도 있다.
유체 회로 중의 상이한 밀도의 비드를 분리하기 위한 본 발명의 제 1 개념의 상세한 설명
도 1a 내지 도 1k에 의해 설명된 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법은 한 번에 하나의 분석물을 분석하는 것으로 나타내어진다. 그러나, 상기 방법은 한 번에 하나의 분석물만을 분석하는 것으로 제한되지는 않는다.
상이한 밀도의 복수 유형의 비드, 상이한 분석물에 대해 선택적인 각각의 유형, 및 복수 유형의 분석물을 함유하는 샘플과의 상호작용에서 각각 상호보완적인 추적 물질을 사용함으로써, 복수 유형의 분석물에 대응하는 복수 유형의 "샌드위치 착물"이 동시에 얻어질 수도 있다. 복수 유형의 "샌드위치 착물"은 동시에 또는 순차적으로 분석될 수도 있다. 상술한 바와 같은 결합 또는 상호작용 단계 후, 충전된 비드의 컬럼은 분석될 각종 분석물을 나타내는 복수 유형의 비드 및 대응하는 "샌드위치 착물"을 포함한다. 일부 경우에, 복수 유형의 "샌드위치 착물"은 서로 분리되는 일 없이 분석될 수도 있다. 그러나, 원하는 레벨의 감도 및 재현성을 얻기 위해서, 복수 유형의 "샌드위치 착물"의 분리가 요구될 수도 있다.
본 개시는 명세서 전체에 걸쳐 기재된 "샌드위치 착물"을 포함하는 복수 유형의 비드/고체상 재료의 분리를 달성하기 위한 본 발명의 제 1 개념을 제공한다. 제 1 개념은 본 발명에 따른 방법에 의존하지 않으며, 근본적인 부분도 아니다.
제 1 개념은 비드, 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 포함하는 유체 또는 미세 유체칩 등의 랩온어칩 장치에 사용하는데 특히 유리하다.
본 발명의 제 1 개념의 실시형태는 도 2a 및 도 2b에 나타내어진다. 상이한 밀도를 갖는 비드를 분리하는데 적합한 캐비티는 도 2a 및 도 2b에 나타내어진다. 캐비티는 입구(12), 제 1 출구(13) 및 제 2 출구(14)를 포함한다. 이 특정 경우에, 캐비티는 밀도 m1의 제 1 비드 세트(8a) 및 밀도 m2의 제 2 비드 세트(8b)가 구비되어 있다. 그 후에 밀도 d3, m1 < d3 < m2의 액체 매체(11)를 캐비티 중의 비드에 첨가한다. 원심력(G)은 제 1 비드 세트(8a)가 제 1 출구(13) 방향으로 이동(또는 부유)하는 반면, 제 2 비드 세트(8b)가 제 2 출구(14)를 향해 이동(또는 침전)하는 것을 야기한다. 원심력의 방향, 즉 원심력에 대한 캐비티의 배향을 변경함으로써, 제 1 비드 세트(8a) 및 액체 매체(11)의 일부가 제 1 출구(13)를 통해 이송되고, 반면 제 2 비드 세트(8b) 및 액체 매체(11)의 일부는 제 2 출구(14)를 통해 이송된다.
본 발명의 제 1 개념은 또한 도 1a에 이미 나타낸 것 등의 다른 캐비티 설계에 적용 가능하다. 도 1a에 나타낸 캐비티에 있어서, 우선 밀도 d3의 액체 매체(도 2a 및 도 2b에 대해 기재된 바와 같음)를 사용하여 2세트의 비드를 분리할 수도 있다(도 2a 중의 작용과 유사함). 2세트의 비드가 분리된 후, 가해진 원심력(G)의 방향을 변경함으로써, 제 1 비드 세트가 컬럼 형상 캐비티(7)로부터 디캔팅될 수도 있다(도 1o 중의 비드의 디캔팅과 유사함). 이렇게 하여 제 1 및 제 2 비드 세트가 분리될 수도 있다. 밀도 d4, d4 > m2의 액체 매체를 컬럼 형상 캐비티(7)에 더 첨가함으로써, 그 후에 제 1 비드 세트에 사용된 방법과 동일하게 제 2 비드 세트가 상기 캐비티로부터 디캔팅될 수도 있다.
상이한 밀도의 비드를 분리하는 본 발명의 제 1 개념은 상이한 밀도를 갖는 2세트의 비드로만 제한되는 것은 아니지만, 적합한 밀도의 액체 매체를 적용함으로써 분리를 가능하게 하는 상이한 농도를 갖는 한, 임의의 세트수의 비드를 분리하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 도 1a에 나타낸 캐비티의 경우, 각각 밀도 m1, m2, m3 및 m4의 4세트의 비드는, 우선 밀도 d3, m4 < d3 < m3, m2, m1의 액체 매체를 첨가하고, 밀도 m4의 비드를 디캔팅하고(도 1o 중의 비드와 유사함), 밀도 d3의 잔존하는 액체 매체를 여과 제거하고, 밀도 d4, m3 < d4 < m2, m1의 액체 매체를 더 첨가하고(그렇지 않으면, 밀도 d3의 잔존하는 액체 매체가 여과 제거되지 않지만, 추가의 고밀도 액체 등의 밀도 증가 첨가제의 첨가에 의해 그 밀도가 d4로 증가됨), 밀도 m3의 비드를 디캔팅하는 등에 의해 연속적으로 분리될 수도 있다.
추가의 선택사항은 비드를 2개의 조합 비드 세트로 분리하는 것이고, 여기서 제 1 조합 세트는 밀도 m1 및 m2의 비드를 포함하는 반면, 다른 조합 세트는 밀도 m3 및 m4의 비드를 포함한다. 이것은, 우선 밀도 d4, m4, m3 < d4 < m2, m1의 액체 매체를 첨가하고, 밀도 m4 및 m3의 비드를 디캔팅에 의해 얻어질 수도 있다. 그 후에 각각의 조합 비드 세트는, 예를 들어 추가 분리를 위해 도 2a에 나타낸 캐비티로 이송될 수도 있다. 분석 방법, 예를 들어 본 발명에 따른 방법에 제 1 개념을 사용할 경우, 비드 세트는 또한 분석될 "샌드위치 착물"을 포함할 수도 있다.
제 1 개념은 하기와 같이 정의될 수도 있다:
비드, 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 포함하는 유체칩 중의 비드를 분리하는 방법으로서, 상기 방법은:
- 유체 회로의 캐비티 중에 적어도 밀도 m1의 제 1 비드 세트 및 밀도 m2의 제 2 비드 세트를 제공하는 단계로서, 상기 캐비티는 적어도 제 1 출구를 포함하는, 단계;
- 제 1 액체 매체를 캐비티에 제공하는 단계로서, 상기 액체 매체는 m1 < d3 < m2이도록 밀도 d3을 갖는, 단계; 및
- 제 1 비드 세트 및 제 2 비드 세트가 캐비티 내에서 반대 방향으로 이동하도록 원심력을 가하는 단계를 포함한다.
유체칩 중의 비드를 분리하는 방법의 일실시형태에 있어서, 제 1 비드 세트는 제 1 출구를 향해 이동한다.
유체칩 중의 비드를 분리하는 방법의 일실시형태에 있어서, 상기 방법은:
- 바람직하게는 제 1 비드 세트가 제 1 출구를 통해 디캔팅되도록, 제 2 비드 세트가 상기 캐비티에 잔존하는 반면, 원심력의 방향을 변경함으로써 제 1 비드 세트를 캐비티의 외부로 이송하는 단계를 포함한다.
유체칩 중의 비드를 분리하는 방법의 일실시형태에 있어서, 캐비티는 제 2 출구를 포함하고, 상기 방법은:
- 제 1 출구를 통해 제 1 비드 세트가 이송되고, 제 2 출구를 통해 제 2 비드 세트가 이송되도록 원심력의 방향을 변경하는 단계를 포함한다.
유체칩 중의 비드를 분리하는 방법의 일실시형태에 있어서, 유체칩은 미세 유체칩이다.
유체칩 중의 비드를 이송하기 위한 본 발명의 제 2 개념의 상세한 설명
비드의 이송에 관하여, 본 개시는 또한 추가의 본 발명의 개념을 나타내며, 본 발명에 의존하지 않으며, 근본적인 부분도 아니다. 상기 개념의 실시형태는 도 1l 내지 도 1p에 개시되어 있다. 상기 개념은, 특히 유체 또는 미세 유체칩 등의 랩온어칩 장치에 관련된 문제를 해결하며, 여기서 비드는 원심력의 사용에 의해 유체 회로를 통해 이송된다. 종래기술에 있어서, 비드의 이송은 항상 원심력과 동일한 방향으로 행해지고, 이렇게 하여 유체 회로의 설계에 사용 가능한 선택사항이 제한된다. 추가의 본 발명의 개념은 밀도 d2의 액체 매체를 m1 이하의 밀도의 비드에 첨가함으로써, 가해진 원심력과 반대의 방향으로 비드를 이송시킬 수 있으며, 여기서 d2 > m1이다.
본 발명의 제 2 개념은 도 1l 내지 도 1p의 컬럼 형상 캐비티(7)를 참조하여 나타내지만, 상기 개념은 매우 다양한 형상 및 형태를 갖는 캐비티에 대해 동일하게 적합하다. 적합한 캐비티의 추가예는 도 2a 및 도 2b에 나타낸다. 상기 본 발명의 제 1 개념의 설명에 개시된 바와 같이, 제 1 비드 세트(8a)는 가해진 원심력(G)의 방향과 반대 방향인 제 1 출구(13)의 방향으로 이동(또는 부유)되는 것이 야기된다.
본 발명의 제 2 개념은 하기와 같이 정의될 수도 있다:
비드, 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수도 있는 내부 유체 회로를 포함하는 유체칩 중의 비드를 이송하는 방법으로서, 상기 방법은:
- 유체 회로의 캐비티 중에 m1 이하의 밀도의 비드를 제공하는 단계로서, 상기 캐비티는 적어도 제 1 출구를 포함하는, 단계;
- 캐비티에 제 1 액체 매체를 제공하는 단계로서, 상기 액체 매체는 d2 > m1이도록 밀도 d2를 갖는, 단계; 및
- 비드가 원심력의 반대 방향으로 이동하도록 원심력을 가하는 단계를 포함한다.
유체칩 중의 비드를 이송하는 방법의 일실시형태에 있어서, 비드는 제 1 출구를 향해 이동한다.
유체칩 중의 비드를 이송하는 방법의 일실시형태에 있어서, 상기 방법은:
- 바람직하게는 상기 비드가 제 1 출구를 통해 디캔팅되도록, 원심력의 방향을 변경함으로써 캐비티의 외부로 비드를 이송하는 단계를 포함한다.
유체칩 중의 비드를 이송하는 방법의 일실시형태에 있어서, 유체칩은 미세 유체칩이다.

Claims (15)

  1. 정성적(qualitatively) 및/또는 정량적으로(quantitatively) 측정될 분석물(analyte)을 함유하는 샘플의 분석 방법으로서,
    결합 단계 및 세정 단계를 포함하고, 상기 결합 단계는:
    a) 분석물을, 분석물에 결합 가능하고 밀도 m1을 갖는 비드(bead)와 상호작용시켜, 밀도 m2의 정량 가능 비드 착물을 제공하는 단계; 및
    b) 상기 정량 가능 비드 착물을 포함하는 충전된(packed) 비드의 구조를 얻는 단계를 포함하고;
    세정 단계는:
    c) 밀도 d > m2 및 m1의 액체 매체 중에, 충전된 비드를 분산시키는 단계; 및
    d) 액체 매체 및 정량 가능 비드 착물을 포함하는 비드를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 단계 a)의 비드는 규정량의 분석물-추적 물질 단위를 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 분석물은 단계 a) 전, 동안, 또는 후에 추적 물질과 상호작용되는, 방법.
  4. 삭제
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 충전된 비드의 구조는 유체 회로의 섹션에 배치된 비드를 가짐으로써 얻어지고, 섹션은 제 1 및 제 2 개구, 및 섹션 중의 비드를 유지할 수 있는 입자 유지 소자를 포함하는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 입자 유지 소자는 제 1 또는 제 2 개구에 배치된 벤드(bend) 또는 필터 소자인, 방법.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 섹션은 유체칩의 내부 유체 회로의 일부이며, 내부 유체 회로를 통해 비드 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수 있는, 방법.
  8. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 단계 a)는 밀도 d1 < m1의 제 1 액체 매체에서 행해지는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 결합 단계는 제 1 액체 매체와 비드를 분리하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  10. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 단계 c)는 충전된 비드에 밀도 d2 > m2 및 m1의 제 2 액체 매체를 첨가함으로써 선행되는, 방법.
  11. 청구항 5에 있어서,
    상기 결합 단계는 단계 b)의 충전된 비드의 구조가 얻어지도록, 섹션에 대한 제 1 방향으로 원심력을 가함으로써 비드를 충전하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 세정 단계는 단계 c) 동안에 섹션에 대한 제 1 방향으로 원심력을 가하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 정량 가능 비드 착물을 포함하는 비드는, 제 1 방향과 상이한 섹션에 대한 제 2 방향을 갖는 원심력을 가함으로써 섹션으로부터 이송되는, 방법.
  14. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    샘플의 분석물이 정성적 및/또는 정량적으로 측정되도록, 정량 가능 비드 착물을 분석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  15. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 방법은, 가해진 원심력에 대한 미세 유체칩의 배향을 변경할 수 있는 원심분리 장치용 미세 유체칩에서 사용하기 위한 것이고,
    미세 유체칩은 비드 및 적어도 하나의 분석물을 함유하는 샘플을 포함하는, 상기 방법의 각종 반응물이 원심력의 사용에 의해 이동될 수 있는 내부 유체 회로를 포함하는, 방법.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO337444B1 (no) * 2014-06-19 2016-04-11 Spinchip Diagnostics As Analysemetode
KR101888239B1 (ko) * 2016-05-06 2018-09-06 고려대학교 산학협력단 막힘 현상을 이용한 혈소판 검사 장치
US11162879B2 (en) * 2017-07-24 2021-11-02 Kanomax Fmt, Inc. Particle detection system and method
NO343863B1 (en) 2017-11-09 2019-06-24 Spinchip Diagnostics As Centrifuge apparatus
CN111610335B (zh) * 2020-05-29 2023-12-19 上海奥普生物医药股份有限公司 时间分辨荧光免疫层析试纸条、包含其的试剂盒及其应用
KR102629591B1 (ko) * 2021-07-27 2024-01-29 세종대학교산학협력단 앱타머를 구비한 다표적 컬럼 공정 시스템
JP2023160814A (ja) * 2022-04-22 2023-11-02 株式会社タウンズ 標的物質の検出方法および試薬

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1994987A2 (en) 2007-05-23 2008-11-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Microfluidic device using microfluidic chip and microfluidic device using biomolecule microarray chip
US20090104077A1 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Rohm Co., Ltd. Microchip
WO2011081530A1 (en) 2009-12-29 2011-07-07 Sintef Stiftelsen Sample processing cartridge and method of processing and/or analysing a sample under centrifugal force

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US488763A (en) 1892-12-27 William h
US4436631A (en) * 1981-08-05 1984-03-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Multiple particle washing system and method of use
CH666131A5 (fr) 1985-10-31 1988-06-30 Battelle Memorial Institute Support a phase solide muni d'un composant destine a participer a une reaction dans une phase liquide.
US5279936A (en) * 1989-12-22 1994-01-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Method of separation employing magnetic particles and second medium
CA2290731A1 (en) * 1999-11-26 2001-05-26 D. Jed Harrison Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis system
US7205157B2 (en) * 2001-01-08 2007-04-17 Becton, Dickinson And Company Method of separating cells from a sample
AU2002256202A1 (en) * 2001-04-11 2003-10-27 Burstein Technologies, Inc. Multi-parameter assays including analysis discs and methods relating thereto
US20030095897A1 (en) * 2001-08-31 2003-05-22 Grate Jay W. Flow-controlled magnetic particle manipulation
AU2002362013B2 (en) 2001-11-21 2008-04-24 Applied Biosystems, Llc. Digital assay
US20060003339A1 (en) 2004-06-30 2006-01-05 Fuernkranz Hans A Two-hybrid system
US8191715B2 (en) * 2007-04-02 2012-06-05 Samsung Electronics Co., Ltd. Centrifugal force-based microfluidic device and microfluidic system including the same
JP4869205B2 (ja) 2007-10-23 2012-02-08 シャープ株式会社 マイクロ流体デバイス及びマイクロ流体デバイス装置
JP5098650B2 (ja) * 2008-01-08 2012-12-12 ソニー株式会社 微小粒子の送流方法及び分析方法、並びに微小粒子分析用基板
US8962346B2 (en) * 2010-07-08 2015-02-24 Sandia Corporation Devices, systems, and methods for conducting assays with improved sensitivity using sedimentation
WO2012024690A1 (en) 2010-08-20 2012-02-23 President And Fellows Of Harvard College Multiphase systems having multiple phase properties
WO2014074737A1 (en) 2012-11-07 2014-05-15 Sandstone Diagnostics, Inc. Methods and devices for processing samples and counting cells
CN103018224B (zh) * 2012-12-14 2015-07-29 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 基于离心微流控技术的稀少细胞分离检测系统及方法
EP2810717B1 (en) * 2013-06-06 2018-10-17 F. Hoffmann-La Roche AG Acceleration sensitive indicator
WO2015019347A1 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Yeda Research And Development Company Ltd. Girk as a therapeutic target of immune disorders and a marker of b cell subtypes
NO337444B1 (no) 2014-06-19 2016-04-11 Spinchip Diagnostics As Analysemetode
CN107532333A (zh) 2015-02-22 2018-01-02 里兰斯坦福初级大学理事会 微筛选装置、方法和产品

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1994987A2 (en) 2007-05-23 2008-11-26 Samsung Electronics Co., Ltd. Microfluidic device using microfluidic chip and microfluidic device using biomolecule microarray chip
US20090104077A1 (en) 2007-10-18 2009-04-23 Rohm Co., Ltd. Microchip
WO2011081530A1 (en) 2009-12-29 2011-07-07 Sintef Stiftelsen Sample processing cartridge and method of processing and/or analysing a sample under centrifugal force

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nano Letters, vol. 14, no. 5, pp. 2365-2371
The Analyst, vol. 138, no. 9, p. 2558

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Publication number Publication date
JP2017518503A (ja) 2017-07-06
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