NO176438B - Tris-maleimidoforbindelser og trivalent koblingsmiddel - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et trivalent koblingsmiddel. Den er spesielt rettet mot en tris-maleimidoforbind-else med tre linkerarmer med variabel lengde, ladning, labilitet og hydrofobisitet. Slike forbindelser er nyttige som mellomprodukter for fremstilling av bifunksjonelle og trifunksjonelle (dvs. tri-spesifikke) antistoff-1ignende forbindelser som er nyttige i medisinsk diagnostikk, legemidler og diagnostiske/terapeutiske kombinasjoner.

Antistoffer er komplekse proteinmolekyler dannet av et immunsystem til en organisme i respons til et antigen som av verten oppfattes som fremmed. Den ekstreme plastisiteten og diversiteten til et dyrs immunreportoar muliggjør dannelse av mange forskjellige antistoff-molekyler mot et like stort antall antigener. Individuelle antistoffer er derimot monospesifikke og derfor monofunksjonelle.

Landsdorp, et al. beskriver dannelsen av et bifunksjonelt antistoffkompleks dannet ved kryssbinding av to monoklonale antistoffer med forskjellige spesifisiteter, men av samme isotype. Landsdorp, et al. "Cyclic Tetramolecular Complexes of Monoclonal Antibodies: A New Type of Cross-linking Agent," Eur.J. Immunol., 16, s.679 - 83 (1986). Kryssbindingsmidlet til Landsdorp består av to anti-isotype antistoffmolekyler som kryssbandt de to monoklonale antistoffene for dannelsen av et cyklisk tetramolekylært kompleks som var bifunksjonelt. Implisitt, har de intakte antistoffene beskrevet av Landsdorp Fc regioner som kan binde komplement og/eller stimulere en immunrespons dersom tilstede in vivo.

En hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å unngå anvendelse av antistoffer eller linkere som har Fc regioner som kan binde, komplement og/eller stimulere en immunrespons av antistoff-målkomplekset.

U.S. patent nr. 4.714.681 beskriver dannelsen av bifunksjonelle antistoff-antistoff chimerer ved fusjon av to forskjellige hybridomceller som produserer monoklonale antistoffer med forskjellige spesifisiteter (kvadroma) og ved fusjon av en hybridom som produserer et spesifikt monoklonalt antistoff med en lymfocyt som produserer et annet antistoff. Vellykketheten av denne fremgangsmåte avhenger av evnen som de hybride cellene har til å produsere både tunge og lette kjeder av begge parentaltypene i like mengder for å maksimal-isere potensialet for tilfeldig oppstilling av tunge og lette kjeder for å tilveiebringe det hensiktsmessige bifunksjonelle komplekset. I beste fall kan denne tilfeldige oppstillingen av antistoff subenheter resultere i at bare ett av åtte molekyler ( 12. 5%) er av ønsket spesifisitet. Chimerene er hele antistoffer som har intakte Fc regioner. Når injisert inn i en fremmed art har chimerene beskrevet i U.S. patent nr. 4.714.681 dermed, som Landsdorps bifunksjonelle, potensiale for å påkalle en interaksjon mellom komponentene av immunsystemet som bærer Fc reseptorer (f.eks. makrofager, komplement osv.).

Blant de første beskrivelsene av anvendelse av kjemiske forbindelser for kovalent kryssbinding av antistoffer var Hamaguchi et al., J.Biochem, 85; 1289 - 1300 (1979). Hamaguchi beskriver syntese av en bifunksjonell-antistoff-p-galaktosidase-forbindelse som blir kryssbundet via N,N'-o-fenylendimaleimid. Forbindelsen til Hamaguchi ble rapportert å være nyttig i sandwich enzym immunoanalyser. Glennie et al., J.Immunol., 139, 2367 -2375 (1987) beskriver også kobling av to Fab' fragmenter ved anvendelse av forbindelsen beskrevet i Hamaguchi, dvs. o-fenylendimaleimid.

Til tross for deres karakterisering som bifunksjonelle, når anvendt som farmasøytiske midler, har de bifunksjonelle antistoffene og bifunksjonelle Fab'-forbindelsene ifølge tidligere type den iboende begrensningen av å være monofunksjonelle ved deres virkningssete. Denne begrensningen oppstår på grunn av at den første av de to spesifisitetene til det bifunksjonelle molekylet må være rettet mot virk-ningssetet, dvs. organet, vevet eller antigenet av interesse. Dette etterlater bare en enkelt spesifisitet for å oppnå mono-funksjon til molekylet når det er blitt immobilisert ved dets virkningssete. Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å utvikle en intermediaer forbindelse, dvs. et multifunksjonelt koblingsmiddel, som er egnet for å danne en ny serie farmasøytiske midler som kan være helhetlig trifunksjonelle, og dermed bifunksjonelt ved deres virkningssete.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en forbindelse som kan anvendes som et mellomprodukt for fremstilling av trifunksjonelle antistoff-lignende molekyler. Inter-mediærforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse virker som et trivalent middel som kan koble to eller tre Fab'-lignende fragmenter. Den intermediære forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse er følgelig et trivalent koblingsmiddel med formel:

kjenntegnet ved at

X er

der Z er der s = 1 eller 0; der n = 1 eller 0; der q = 1 eller 0; der Y er der Y' er

der p og m kan være like eller forskjellige og er tall varierende fra 0 til 20 forutsatt at når n = 0 er summen av m og p et tall varierende fra 1 til 20, mens når n = 1, er p og m hver et tall som er minst 1 og summen av p og m er et tall som varierer fra 2 til 20;

der R<1> er lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer; og

der R<**> er hydrogen, -C00H, eller lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 - 6 karbonatomer forutsatt at den lavere alkyldelen er monosubstituert med -NH2, eller -0H.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et trivalent koblingsmiddel for kovalent kobling av Fab'-lignende fragmenter, kjennetegnet ved at det omfatter en forbindelse med formel:

der X er der Z er der s = 1 eller 0; der n = 1 eller 0; der q = 1 eller 0; der Y er der Y' er

der p og m er like eller forskjellige og er tall varierende fra 1 til 20 forutsatt at når n = 0 er summen av m og p et tall varierende fra 1 til 20, mens når n = 1, er p og m hver et tall som er minst 1 og summen av m og p varierer fra 2 til 20;

der R<1> er lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer og

der R<2> er hydrogen, -C00H eller lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer forutsatt at lavere alkyldelen er enkel-substituert med -NH2-, eller -0H-.

Forbindelsen med formel I kan følgelig anvendes som et intermediat, dvs. et trivalent koblingsmiddel, for anvendelse i dannelsen av bifunksjonelle og trifunksjonelle antistoff-lignende forbindser. Med "bifunksjonell antistoff-lignende forbindelser" som anvendt heri menes forbindelser som har to Fab'-lignende fragmenter kovalent koblet dertil, fortrinnsvis med forskjellige spesifisiteter og der Fab<*->lignende fragmenter vesentlig har beholdt antigen-bindende aktivitet til de totale antistoffene som de er avledet fra. Med "trifunksjonell antistoff-lignende forbindelser" som anvendt heri menes forbindelser som har tre Fab'-lignende fragmenter kovalent bundet dertil, fortrinnsvis med forskjellige spesifisiteter, der Fab'-lignende fragmenter har vesentlig beholdt antigen-bindende aktivitet til de totale antistoffene som de er avledet fra. Bifunksjonelle og trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelser blir fortrinnsvis anvendt som in vivo farmasøytiske midler med diagnostiske, terapeutiske, eller en kombinasjon av diagnostiske/terapeutiske anvendelser .

Den intermediære forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse (nedenfor det "trivalente koblingsmiddel" ifølge foreliggende oppfinnelse), som er representert med Formel I, har strukturelt en sentral del "X" som tre linkerarmer går ut i fra. Den sentrale delen "X" kan være et enkelt atom, såsom karbon eller nitrogen, eller et cyklisk molekyl der tre linkerarmer kan gå ut fra. Egnede cykliske molekyler er en 6 leddet ring som er alifatisk eller en 6 leddet ring som er aromatisk. Foretrukne cykliske forbindelser er fenyl. Foretrukket plassering av linkerarmene på den aromatiske ringen er i 1, 3 og 5 posisjonene. Når derimot linkerarmene blir lenger er posisjonen av armene på den aromatiske ringen mindre kritisk på grunn av at sterisk hindring ved terminusen til linkerarmene, forårsaket av kobling til det første Fab'-lignende fragmentet, blir en mindre faktor.

Linkerarmene på det trivalente koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse kan være lineære eller forgrenet-kjedet alifatisk og omfatter fra 1-20 karbonatomer. Med hensyn på Formel I er armene lineært alifatiske når n=0, s=0ogm og p er hver et tall som er minst 1 og summen av p og m er et tall som varierer fra 2 til omtrent 20. Linkerarmene kan alternativt bli substituert på veien for å gi linkerarmene ønskede egenskaper. En eller flere av linkerarmene kan f.eks. inneholde en eller flere amider eller esterbindinger langs kjeden for å gi forbedret oppløselighet. Amid-bindingene kan bli tilveiebragt helt eller delvis av forskjellige alfa-aminosyrer.

Uttrykt med hensyn på Formel I er tilstedeværelse av et oppløselighetsforsterkende amid på hver linkerarm reflektert når i Formel I, n = 1 og Y = -CONH- eller -NH-C0-. Alternativt, oppstår tilstedeværelse av et oppløselighetsfremmende amid på hver linkerarm når Z ifølge Formel I er -CONH- eller -NH-C0-. Tilstedeværelse av to oppløselighetfremmende amidbindinger pr. linkerarm oppstår når Y i Formel I er-CONH- eller -NHCO- og når Z i Formel I er uavhengig -CONH-eller -NHC0-.

Anvendelse av aminosyrer, såsom serin, lysin, glutaminsyre og lignende som har polare substituenter, innfører enda høyere polaritet i linkerarmene til det trivalente koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse for derved å ytterligere forsterke dets oppløselighet i vann. Nødvendigheten av polarsubstituerte aminosyrer øker når hydrofobisiteten til linkerarmene øker, såsom med økende alifatisk kjedelengde.

På grunn av at stereokjemien blir beholdt iløpet av syntesen av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse (Eksempel 4-6), blir spesifik stereokjemi innført i linkerarmene ved anvendelse av D eller L aminosyrene.

Ved eller nære den distale terminus til hver linkerarm er en maleimiddel for binding til en fri sulfhydrylgruppe (-SH) på et Fab'-lignende fragment. Maleimid-delen utviser selektiv reaktivitet med disse frie sulfhydrylgruppene ved pH 5 - 8, fortrinnsvis pH 5 - 7. Når pH øker mot 8 begynner maleimid-delen å reagere med frie aminogrupper i økende omfang, såsom E-aminogruppen til lysin. Ved pH >8, begynner selektiviteten for sulfhydryl å reduseres. Reaksjonen mellom maleimid-delen og aminene begynner videre å øke forårsaket av både det store antallet aminer og deres økende nukleofilisitet. På grunn av det større antallet lysinresidier, og dermed frie aminogrupper, på hvilke som helst Fab'-lignende fragmenter, oppstår kobling mellom en maleimid-del og hvilke som helst av de frie aminogruppene ved pH som er større enn 8 med redusert spesifisitet og behøver ikke å resultere i et enkelt repro-duserbart produkt. I kontrast, oppstår frie sulfhydrylgrupper på Fab'-lignende fragmenter ved 1-3 spesifikke belig-genheter og i hengselsregionen, dersom ikke de er kjemisk modifisert eller genetisk omkonstruert for spesifikt å oppstå andre steder. Ved pH 5 - 8, fortrinnsvis 5-7, muliggjør reaksjonen mellom maleimid-delen og sulfhydrylgruppene, som er unikt beliggende, for radiospesifikk og vesentlig reproduserbar binding av maleimid-delen ved hengselsregionen eller andre spesifikt tilsatte steder. Regiospesifikk binding ved eller nære ved hengselsregionen er viktig på grunn av den ikke bare muliggjør kobling av Fab'-lignende fragmenter på en reproduserbar måte, men muliggjør også at binding oppstår bort fra antigen-bindingsdelen av Fab'-lignende fragmenter, som minimaliserer de negative virkningene angående spesifisi-teten og/eller affiniteten til antistoffet.

"Fab'-lignende fragmenter" inneholdende frie sulfhydrylgrupper blir dannet ved enzymatisk spaltning av et helt antistoff ved dets hengselregion. Enzymatisk spaltning av et antistoff ved hengselsregionen blir vanligvis oppnådd enten av pepsin eller papain. Pepsinspaltning av et helt antistoff, såsom IgG, resulterer i et F(ab')2 fragment og et Fc'-fragment. Fra definisjonen innenfor dette fagområdet resulterer papainspaltning av et helt antistoff under reduserende betingelser til to Fab-fragmenter og et Fc-fragment. F(ab')£-fragmentet som ble oppnådd fra pepsinspaltningen kan bli reduktivt spaltet for å tilveiebringe to Fab'-fragmenter. Et Fab'-fragment er strukturelt likt et Fab-fragment idet begge fragmentene inneholder de intakte antigen-bindende regionene til antistoff-forløpet. Fab'-fragmentet er forskjellig fra Fab-fragmentet idet at Fab'-fragmentet er noe større med mer tung kjede. Fab'-fragmentet er videre forskjellig fra Fab-f ragmentet ved også å ha en eller flere ytterligere sulfhydrylgrupper på dets tunge kjede.

Avhengig av artene som er kilde for antistoffet kan antallet disulfidbroer mellom de to tunge kjedene ved hengselsregionen variere. Som et resultat kan antallet frie sulfhydryl (-SH)-grupper på Fab og Fab'-fragmenter også variere fra art til art. Pepsinspaltning og påfølgende reduksjon av muse IgG^, IgG2a og IgG2"b antistoff produsere muse Fab'-fragmenter som har tre frie -SH grupper. Pepsinspaltning og påfølgende reduksjon av humant IgG^ antistoff produserer i kontrast til dette to Fab'-fragmenter som hver bare har to frie -SH grupper. Papainspaltning av det samme humane IgG^ resulterer videre i to Fab-fragmenter som hver bare har en enkel fri -SH gruppe. Se U.S. patent 4.659.839 (Nicolotti et al.) i kol. 4 som beskriver denne sistnevnte spaltningen. Humant IgG^ er av interesse på grunn av at det er den predominante subklas-sen av monoklonale antistoffer anvendt i den konstante regionen av de chimeriske antistoffene.

Det trivalente koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse kobles til Fab'-fragmentene som har 1, 2 eller 3 frie sulfhydryl (-SH) grupper. Fab'-fragmentene som har to frie sulfhydrylgrupper er derimot spesielt foretrukne.

I foreliggende oppfinnelse er betegnelsen "Fab'-lignende fragmenter" kollektivt definert å innbefatte ikke bare de Fab og Fab'-fragmentene som har fra 1-3 frie sulfhydrylgruppene på deres tunge kjeder, enten oppstått naturlig, kjemisk modifikasjon eller genetisk omkonstruering, men også å innbefatte Fv fragmenter som er blitt genetisk omkonstruert å inneholde fra 1 - 3 sulfhydrylgrupper på enten deres tunge eller lette kjede eller på en kombinasjon av begge. "Fv fragment", som er et fragment avledet fra enten et antistoff, et Fab'-fragment eller et Fab-fragment, inneholder den variable ("v") regionen til antistoffet, og regionen tilveiebringer spesifisitet for antigenet av interesse. For at et genetisk omkonstruert Fv, Fab eller Fab'-fragment er nyttig i foreliggende oppfinnelse må sulfhydrylgruppen(e), som blir omkonstruert til fragmentet, være beliggende slik at det ikke vesentlig interfererer med antigen-bindingskapasiteten til Fv, Fab eller Fab'-fragmentet. Bestemmelse av antallet frie sulfhydrylgrupper i Fab'-fragmentene er velkjent innenfor fagområdet. U.S. patent 4.659.839 som ble utstedt 21. april 1987, beskriver en slik fremgangsmåte ved anvendelse av <3>H-(N-etylmaleimid) og er inkorporert heri som referanse.

Denne tris-maleimidforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse blir fortrinnsvis anvendt for å koble Fab'-lignende fragmenter som har to frie sulfhydryl (-SE) grupper. Som allerede beskrevet ovenfor blir slike Fab'-lignende fragmenter oppnådd ved pepsidspaltning og påfølgende reduksjon av humant IgG^. I tillegg er foretrukne Fab'-lignende fragmenter som har to frie sulfhydrylgrupper ved hengselregionen også oppnåelige fra hensiktsmessige humane, primate (f.eks. aper) og humane-muse chimeriske antistoffer. For eksempel, chimeriske antistoffer som har en human konstantregion tilveiebringer, ved pepsinspaltning og påfølgende reduksjon, Fab'-lignende fragmenter som har to sulfhydrylgrupper i hengselsregionen. Dette er tilfellet på grunn av at den humane konstantregionen innbefatter hengselsregionen som et segment innenfor denne. Disse chimeriske Fab'-lignende fragmentene med humane konstantregioner er foretrukket for anvendelse i mennesker i forhold til Fab'-lignende fragmenter fra ikke-humane kilder på grunn av at den humane konstantregionen reduserer sannsynligheten for å vekke en immunrespons vesentlig. Dette er av spesiell viktighet når det Fab'-lignende fragmentet skal bli administrert parenteralt til mennesker som et farmasøytisk middel.

Det trivalente koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse er egnet for kobling av to eller tre Fab'-lignende fragmenter for å fremstille en antistoff-lignende forbindelse for anvendelse i diagnostiske, terapeutiske og/eller diagnostiske/terapeutiske kombinasjoner. Med "diagnostiske" som anvendt heri menes undersøking som er relatert til enten in vitro eller in vivo diagnostikk av sykdomstilstander eller biologisk status (f.eks. graviditet, infertilitet osv.) i . pattedyr, fortrinnsvis mennesker. Med "terapeutisk" og "terapeutiske/diagnostiske kombinasjoner" som anvendt heri menes henhv. behandling eller diagnostikk og behandling av sykdomstilstander eller biologisk status via in vivo adminis-trasjon til pattedyr, fortrinnsvis mennesker, av bifunksjonelle eller trifunksjonelle antistoff-lignende molekyler som anvender det trivalente koblingsmidlet ifølge foreliggende oppfinnelse.

En spesielt foretrukket anvendelse av koblingsmidlet ifølge foreliggende oppfinnelse er å koble to eller tre Fab'-lignende fragmenter som har forskjellige spesifisiteter for å produsere en bi- eller trifunksjonell antistoff-lignende forbindelse. Den bifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen som har to forskjellige Fab'-lignende fragmenter kan bli anvendt som et in vivo diagnostisk eller terapeutisk middel. I denne anvendelsen har de første Fab'-lignende fragmenter spesifisitet for organet, vevet eller onkologiske antigener av interesse, mens det andre Fab'-1ignende fragmentet, avhengig av anvendelsen, har spesifisitet enten for et diagnostisk billed-dannende eller dosimetrisk isotop-kompleks (f.eks. ^Uln-etanolamintioureabenzyl-EDTA) eller for et terapeutisk middel (f.eks. et terapeutisk radioisotop kompleks eller et antigen, koblet til et kjemoterapeutisk middel).

De trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsene, som også blir fremstilt via det trivalente koblingsmidlet ifølge foreliggende oppfinnelse, har flere anvendelser. Disse anvendelsene innbefatter anvendelse som et diagnostisk middel, terapeutisk middel eller som en kombinasjon av diagnostisk/terapeutisk middel. En foretrukket anvendelse er en kombinasjon av diagnostisk/terapeutisk middel. I sistnevnte anvendelse har det første Fab'-lignende fragmentet spesifisitet for et organ, vev eller onkologisk antigen av interesse og bindes dertil. Det andre Fab'-lignende fragmentet har spesifisitet for et diagnostisk billed-dannende eller dosimetrisk/isotop kompleks (f.eks. et chelatert nuklid eller paramagnetisk middel) som muliggjør billed-danning av et organ eller vev av interesse og/eller diagnostikk av en tilstand (f.eks. kanser) assosiert med det organet eller vevet. Det tredje Fab'-lignende fragmentet har spesifisitet for et terapeutisk middel som eventuelt kan bli administrert til pasienten dersom den ventede tilstanden blir presentert for en lege ved billed-dannelse av organ, vev eller kanser via immobilisert andre Fab'-lignende fragment og antigenet derav. Det trivalente koblingsmidlet ifølge foreliggende oppfinnelse muliggjør dermed fremstilling av en trifunksjonell farmasøytisk sammensetning som er bifunksjonell (dvs. både diagnostisk og terapeutisk) på virkningsstedet.

Alternativt, ved anvendelse som et rent diagnostisk, middel har det andre og tredje Fab'-lignende fragmentet til den trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen spesifisitet for samme eller forskjellige diagnostisk billed-dannende eller dosimetriske kompleksene. Med anvendelse som et rent terapeutisk middel har både de andre og tredje Fab'-lignende fragmentene til den trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen spesifisitet for samme eller forskjellige terapeutiske midler.

Det er tilfeller når et trifunksjonelt antistoff-lignende forbindelse ("TFA") som har spesifisiteter for to forskjellige tumor-antigener kan være nyttige. Det er mye som tyder på at melanomet kan uttrykke p96.5 eller gp240 antigen eller begge. Dersom dette er tilfellet kan en TFA med bindings-spesifisiteter rettet mot disse to antigenene sammen med en anti-kjemoterapeutisk, anti/billed-dannende eller anti/terapeutisk isotop være nyttig. En lignende situasjon kan eksistere i lungekanser der noen tumorer uttrykker KSI/4 antigenet eller CEA eller begge. Ved anvendelse som enten et diagnostisk eller som et terapeutisk middel har første og andre Fab'-lignende fragmenter spesifisiteter for forskjellige antigener uttrykt på eller av samme tumor eller vev.

Et Fab'-lignende fragment kan ha spesifisitet for et terapeutisk middel enten direkte eller indirekte. Spesifisitet for et terapeutisk middel er "direkte" når Fab'-fragmentet er spesifikt for selve det terapeutiske midlet. Spesifisitet for et terapeutisk middel er "indirekte" når Fab'-fragmentet er spesifikt for et valgt antigen eller hapten som det terapeutiske midlet er koblet til. Når et Fab'-1ignende fragment har spesifisitet for et valgt antigen eller hapten kan man variere antallet og type terapeutisk middel koblet til det selekterte antigen eller haptenet, for derved å muliggjøre at den behandlende legen varierer behandlingen avhengig av faktorer såsom tilstedeværende tilstand, alvor-lighet til tilstanden, pasientens følsomhet overfor bestemte legemidler og tilstandens respons overfor visse legemidler. Man kan til og med koadministrere to terapeutiske midler bundet til det samme selekterte antigenet eller haptenet for å tilveiebringe en lokalisert synergistisk effekt på organet, vevet eller tumoren av interesse.

Eksempler på terapeutiske midler som kan bindes "direkte" til et Fab'-lignende fragment innbefatter chelatkomplekser som blir dannet mellom chelateringsmidler og chelaterbare radionuklider som er 3-utstrålere. Egnede chelateringsmidler for radionuklider (og/eller paramagnetiske metallioner anvendt i diagnostikk) er polysure organiske molekyler som ytterligere inneholder organisk nitrogen, fosfor, oksygen og svovel. Som eksempel, egnede chelateringsmidler inkluderer etylendiamintetraeddiksyre ("EDTA"), etanolamintioureabenzyl-EDTA ("EOTUBE"); dietylentriaminpenta eddiksyre ("DTPA" ); metyltioureabenzyl DTPA ("MeTUBD"), 1,4,7,10-tetrazacyklodo-dekan-N',N",N'",N""-tetra eddiksyre ("DOTA"); L-aminobenzyl-EDTA og lignende. Andre egnede organiske chelateringsmidler er beskrevet i U.S. patent 4.647.447 som er inkorporert heri som referanse. Egnede P-utstrålere er de chelaterbare ionene til 6<7>Cu, 1<86>Rh, 18<8>Rh, <189>Rh, 15<3>Sm, 9<0>Y og 11<1>In (Aiiger).

Eksempler på terapeutiske midler som kan bli "indirekte" bundet av et Fab'-lignende fragment er forbindelser med formel:

der "substratet" har minst en epitope som kan bli bundet av Fab'-lignende fragment og er substrat for et enzym eller et aktivt fragment derav, og der reaksjonen til enzymet med det bundne substrat-cytotoksiske midlet forårsaker frigjøring av det cytotoksiske midlet fra substratet.

Betegnelsen "cytotokslsk middel" som anvendt heri betyr forbindelser som er nyttige for behandling av neoplasmer, enten ondartede eller godartede. Slike medikamenter innbefatter generelt alkyleringsmidler, antiproliferative midler, tubulin-bindende midler, cytotoksiner generelt, og lignende. Foretrukne klasser av slike forbindelser er nitrogen sennepsmidler, vinka-alkaloider, daunomycinfamilien, mitomyciner, bleomyciner, cytotoksiske nukleosider, pteridin-familien av medikamenter, podofyophyllotoksiner, sulfonyl-ureaer som beskrevet i europeisk patentsøknad nr. 222,475, publisert 20. mai 1987), og lavmolekylvekt-toksiner som trikotesener og kolsisiner. Spesielt fortrukne medlemmer av de klassene inkluderer f.eks. doksorubisin, daunorubisin, aminopterin, metotreksat, metopterin, diklorometotreksat, mitomycin C, porfiromycin, 5-fluorourasil, 6-merkaptopurin, cytosin arabinosid, podofyllotoksin, etoposide, melfalan, vinblastin, vinkristin, leurosidin, vindesin, leurosin, trikotecen, desacetylcolchisin og lignende.

Som allerede nevnt er det trivalente koblingsmidlet ifølge foreliggende oppfinnelse egnet for kobling til Fab'-lignende fragmenter som har en, to eller tre frie sulfhydrylgrupper (-SH) dvs. sulfhydryldeler. Antall trivalente koblingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse som er nødvendig for å danne en trifunksjonell antistoff-lignende forbindelse vil variere fra 1-2 avhengig av antallet frie sulfhydrylgrupper på Fab'-fragmentene. For eksempel krever tre Fab'-fragmenter, som hver har en enkelt fri -SH gruppe, bare et trivalent koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse for å oppnå kobling for å danne et trifunksjonelt antistoff-lignende molekyl. I kontrast til dette vil tre Fab'-lignende fragmenter (betegnet heri F-^ab, F2ab, F3ab' ), hver med to frie sulfhydryler, vanligvis kreve to trivalente koblingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse for å gi opphav til en trifunksjonell antistoff-lignende forbindelse. Tre Fab'-lignende fragmenter som hver har tre frie sulfhydrylgrupper ville likeledes kreve to trivalente koblingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse. To eller tre Fab'-1ignende fragmenter med forskjellige antall frie sulfhydryler kan også bli kombinert for å danne henhv. et bifunksjonelt eller trifunksjonelt antistoff-lignende molekyl. Det er derimot mest foretrukket å anvende trivalente koblingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse for å koble to eller tre Fab'-lignende fragmenter hvori hvert fragment har to frie sulfhydrylgrupper .

Skjema I angår reaksjons-sekvensene for anvendelse av det trivalente koblingsmidlet, XI, ifølge foreliggende oppfinnelse, der XI er en skjematisk representasjon av forbindelsen ifølge Formel I, for å koble tre Fab'-lignende fragmenter som hver har to frie sulfhydrylgrupper. Det trivalente koblingsmidlet, XI, kan bli løst opp i et lite volum (< 1056 av reaksjonsvolumet) organisk oppløsningsmiddel hvor Fab'-lignende fragment er tilsatt for å bli derivatisert. I Skjema I er et molaert overskudd, fortrinnsvis minst 10 ganger, mer foretrukket er minst 20 ganger, fortrinnsvis minst 30 ganger, XI kombinert i en vandig buffer ved pH 5-8, fortrinnsvis pH 5 - 7, med et første Fab'-lignende fragment, F^ab'. I reaksjonen reagerer to av de tre terminale maleimidene på det trivalente koblingsmidlet, XI, med de to frie sulfhydrylgruppene (-SH) til det første Fab'-lignende fragmentet, F^ab', for å danne et koblet produkt XII som bare har en enkelt reaktiv maleimid-del gjenværende. Nærheten av de to sulfhydrylgruppene (-SH) på det Fab'-lignende fragmentet og den relative posisjonen til linkerarmene på koblingsmidlet muliggjør den andre maleimid-delen av koblingsmidlet til øyeblikkelig å bli koblet til den andre sulfhydryl (-SH) gruppen når den første koblingen har foregått. Det koblede produktet XII blir deretter separert ved gelfiltrering fra overskudd XI, mens XII blir omsatt i en vandig buffer ved pH 5 - 8, fortrinnsvis pH 5 - 7, med et annet Fab'-lignende fragment, betegnet Fgab', og med en andre spesifisitet. Det resulterende produktet XIV er en bifunksjonell Fab'-lignende del som har en enkelt fri sulfhydrylgruppe (-SH) for kobling med et andre trivalent koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse. I en separat reaksjon vist i Skjema I blir et tredje Fab'-lignende fragment, Fsab', som har en tredje spesifisitet, reagert som beskrevet ovenfor i vandig oppløs-ning ved pH 5 - 8, fortrinnsvis pH 5 - 7, med et molart overskudd av det trivalente koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse, XV, som kan være lik eller forskjellig fra XI. For eksempel kan XV, ulikt XI, ha labile linkerarmer som inneholder en disulfidbinding (-S-S-) innenfor hver av armene. Alternativt kan linkerarmene til XV variere fra linkerarmene til XI i lengde, polaritet eller forskjellige andre faktorer for å akkommodere Fab'-lignende fragmenter som blir koblet. Som tidligere beskrevet for XI, kan det trivalente koblingsmidlet, XV, bli løst opp i et lite volum (<10# av det vandige reaksjonsvolumet) til det organiske oppløsn-ingsmidlet hvor Fab'-lignende fragment er tilsatt for å bli derivatisert. I Skjema I produserer kobling av F3ab' til XV en forbindelse XVI som har en enkelt fri maleimid-del. Påfølgende reaksjon til produktene XIV og XVI i vandig oppløsning med pH 5 - 8 en trifunksjonell antistoff-lignende forbindelse XVII som inkorporerer det trifunksjonelle koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse. Generisk anvendelse av det trivalente koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse for å fremstille trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelser er mer fullstendig diskutert i Eksempel 12 heri. Spesifikke anvendelser er beskrevet i Eksemplene 13 og 14.

Som tidligere diskutert heri er Fab'-lignende fragmenter med minst to frie sulfhydryler avledet fra muse IgG^, IgG2a og IgG2fc; humant IgG; og primat (f.eks. sjimpanse)IgG.

Labiliteten til alle tre linkerarmene på det trivalente koblingsmidlet ifølge foreliggende oppfinnelse blir øket når en labil kjemisk funksjonell gruppe, såsom et disulfid (-S-S) blir symmetrisk innført i hver arm. Kjemiske reaksjoner som symmetrisk introduserer en -S-S- del inn i hver linkerarm er velkjente for fagfolk. For selektivt å øke labiliteten til en enkelt linkerarm må en labil binding, fortrinnsvis en -S-S-, bli selektivt inkorporert inn i den enkelte linkerarmen. Selektiv inkorporering blir best oppnådd etter en innledende kobling mellom et trivalent koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse og et Fab'-lignende fragment som har to frie sulfhydryler. Som et resultat av denne koblingen forblir det en enkelt terminal maleimid-del for ytterligere reaksjon. Den labile disulfid-bindingen (-S-S-) blir deretter inkorporert inn i den ukoblede linkerarmen via et alfa-omega-diamin eller mer foretrukket en alfa-omega ditiol-lignende forbindelse som inneholder en disulfid-del deri. Alfa-omega-ditioler som har en disulfid deri blir utøvet i forhold til tilsvarende diaminer forårsaket av minimalisering av uønskede sidereaksjoner med de frie aminene på Fab'-lignende fragmenter ved reaksjons-pH.

Som eksempel er disulfidinneholdende ditioler og diaminer forbindelser med respektive formler:

der g og j er tall fra 2 - 18 og f og h er tall fra 2-18 forutsatt at summen av g og f og/eller j og h ikke er større enn 20. Selektiv inkorporering av et disulfid inneholdende ditiol til en enkelt linkerarm ved pH 5 - 8, fortrinnsvis pH 5-7, blir fortrinnsvis oppnådd via reaksjonssekvensene som allerede er tilveiebragt i Skjema II.

Følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av N- metoksykarbonylmaleimid

Til en 100 ml 3-halset rundbundet flaske blir 400 ml etylacetat tilsatt. Flasken ble plassert i et isbad og temperaturen ble latt falle til omtrent 0°C. Til den avkjølte flasken ble det sekvensielt tilsatt med omrøring 7.76 g maleimid og 8.8 ml N-metlymorfolin. Gjennom en tllførselstrakt ble det tilsatt til den omrørende blandingen 6.26 ml metylklorformat i en hastighet slik at temperaturen ikke ble øket over 3°C. Gjennom tilsetningstrakten ble det tilsatt 5 ml etylacetat som vasking og vaskingen ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble rørt i 30 minutter ved mellom 0°-3°C. Deretter ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom en Buchner-trakt. Flasken ble vasket 2x med 10 ml etylacetat og vaskevannene ble også filtrert. Det resulterende presipita-tet ble vasket 2x med 10 ml etylacetat. Det kombinerte filtratet og vaskingene ble ekstrahert med 100 ml iskaldt vann, tørket (10 g NagSC^) og avdampet til tørrhet under redusert trykk. Resten ble på ny løst opp i 50 - 100 ml etylacetat:isopropyleter (40:60/v:v) ved anvendelse av et vannbad ved 60°C. Den resulterende oppløsningen ble filtrert, avkjølt helt til krystaller fremkom. Etter 30 minutter i et isbad ble den avkjølte oppløsningen og krystallene filtrert gjennom en sintret glasstrakt og krystallene ble vasket 2x med 20 ml isopropyleter. Krystallene ble vakuum-tørket over natten, smp. 61° - 63°C.

EKSEMPEL 2

Tris-( 2- N- maleimidoetyl) amin (" TMA" )

Til 15g NaHC03 i en 250 ml Erlenmeyer flaske ble 100 ml kaldt vann tilsatt og blandingen ble omrørt i et isbad helt til reaksjonsblandingen var ved 0°C. Til 80 ml av supernatant-opppløsniøngen i en 1000 ml rundbundet flaske ble 1.8 ml tris(2-aminoetyl)amin tilsatt og blandingen ble avkjølt til 0°C i et isbad. Til den avkjølte reaksjonsblandingen ble det tilsatt med omrøring 6.2 g finmalt N-metoksykarbonylmaleimid og blandingen ble rørt i ytterligere 10 minutter i isbad.

Deretter ble 240 ml vann tilsatt til blandingen og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble pH til oppløs-ningen justert til mellom pH 6 - 7 med konsentrert HC1 og volumet ble redusert til 100 ml ved avdampning under redusert trykk. pH til den resulterende oppløsningen ble justert til 10 med mettet Na2C03-oppløsning. Den resulterende oppløsn-ingen ble ekstrahert 3x med 200 ml etylacetat og kombinerte organiske faser ble vasket 2x med 100 ml ItøO. Den organiske fasen ble tørket (30 g Na2SC>4), filtrert og avdampet under redusert trykk til tørrhet. Resten ble løst opp i 40 ml varm metylacetat, filtrert (Buchner trakt) og avdampet under redusert trykk til tørrhet. Resten ble løst opp i et forhold på 5 ml/g (rest) i etylacetatrmetylenklorid (l:3/v:v). Til en 150 ml Lobar silikagel-kolonne som var blitt pre-ekvilibrert med to skikt volum etylacetatrmetylenklorid (l:3/v:v) ble en 5 ml alikot av den oppløste resten tilsatt. Kolonnen ble eluert med samme oppløsningsmiddel ved 4 ml/min. og TMA-fraksjonen, registrert ved A2so» ble samlet i en 500 ml rundbundet flaske. TMA-fraksjonen ble avdampet til tørrhet. Ytterligere 5 ml alikoter av den oppløste resten ble likeledes behandlet og tilsvarende TMA-fraksjoner ble avdampet til tørrhet. TMA restene ble løst opp i 10 ml elueringsopp-løsningsmiddel, slått sammen og avdampet under redusert trykk til tørrhet. Den kombinerte resten ble løst opp i 40 ml etylacetat:isopropyleter (3:l/v:v) ved anvendelse av et 60°C vannbad, filtrert og tilstrekkelig avkjølt helt til TMA presipiterte ut som krystallinske gule nåler. Resulterende TMA-krystaller ble samlet på en sintret glasstrakt, vasket 2x med 5 ml isopropyleter og tørket over natten under vakuum, smp. 132° - 133°C.

Analyse for C18<E>18<N>406 (MW = 386.36)

Beregnet: C, 55.95; H, 4.70; N, 14.50. Funnet: C, 55.54; H, 4.69; N, 14.45.

<*>H NMR Stms<CD>C13(300 MHz): 6.65(6E,s); 3.49(6E,t); og 2.68(6E,t).

I.R. (KBr): 1700cm_<1> (C=0).

U.V.(DMF): topp ved 272, molar ekstinksjonskoeffisient = 1920.

EKSEMPEL 3

Et mol cykloheksan-1,3,5-triol blir omsatt med 3 mol BrCEtøCOCPK"<1>" i tetrahydrofuran i nærvær av 3 ekv. kalium t-butoksid ved 22°C i 1 time. Den resulterende trikarboksyl-syren ble deretter omsatt med N-hydroksysuccinimid (NHS) og dicykloheksylkarbodiimid (DCC) i 1 time ved 0°C i tetrahydrofuran for å tilveiebringe tris-succinimidet. Denne forbindelsen blir deretter omsatt med et 10x overskudd etylendiamin i mettet natriumbikarbonat i 1 time ved 22°C. Den resulterende forbindelsen blir deretter omsatt med N-metoksykarbonylmaleimid (der syntesen er beskrevet i Eksempel 1) i mettet natriumbikarbonat ved 0°C i 10 minutter for å tilveiebringe et trismaleimid der X-komponenten til forbindelse I er en cykloheksyldel.

EKSEMPEL 4

Til 1 mol serin i vandig oppløsning i nærvær av NaHC03 ved 0°C blir det tilsatt 1.1 mol N-metoksykarbonylmaleimid. Reaksjonen blir latt forløpe ved 0°C i 10 minutter etterfulgt av en 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur. Det resulterende produktet, 2-(N-maleimido)-3-hydroksypropanoisk syre, blir deretter omsatt i diglym med et 10$ molart overskudd N-hydroksysuccinimid i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid ved 0°C i 1 time etterfulgt av inkubasjon i 3 timer ved romtemperatur for å tilveiebringe succinimidester-ene av den tidligere nevnte syren. Succinimidester-forbindelsen blir deretter omsatt med tris(2-aminoetyl)aminet i dimetylformamid (DMF) ved romtemperatur i 4 timer for å fremstille tris-maleimidoforbindelsen, som har strukturen vist ovenfor. I ovennevnte beskrevne reaksjoner blir den opprinnelige stereokjemien til aminosyreutgangsmaterialet opprettholdt rundt dets asymmetriske senter Ved valg av L-serin eller D-serin, L eller D stereokjemi blir respektivt opprettholdt rundt hvert asymmetriske senter.

EKSEMPEL 5

Til en vandig bikarbonatoppløsning som er blitt avkjølt til 0°C blir lysin tilsatt der den terminale aminogruppen er beskyttet av en t-butoksykarbonyl (BOC) gruppe. Til denne blir det deretter tilsatt omtrent ekvimolare mengder av N-metoksykarbonylmaleimid. Reaksjonen blir fortsatt i 10 min. ved 0°C etterfulgt av en ytterligere inkubasjon ved romtemperatur i 30 min. Den resulterende a-maleimidokarboksylsyren blir deretter omsatt i tetrahydrofuran med et 10% molart overskudd N-hydroksysuccinimid i nærvær av N,N-dicykloheksylkarbodiimid ved 0'C i 1 time etterfulgt av en inkubasjon ved romtemperatur i 3 timer for å tilveiebringe succinimidesteren av den ovennevnte syren. Succinimidesteren ble deretter omsatt med tris-(2-aminoetyl)amin i dimetylformamid (DMF) i 4 timer ved romtemperatur for å tilveiebringe en tris-maleimid-forbindelse der det terminale aminet enda bærer BOC-beskyt-telsesgruppen. Fjerning av BOC-gruppen blir oppnådd ved hydrolyse i 1 time med 3M HC1 i etylacetat ved romtemperatur. Som i eksempel 4 blir stereokjemien rundt det asymmetriske senteret (<*>) i lysin-utgangsmaterialet beholdt i sluttproduktet .

EKSEMPEL 6

Til en alfa aminosyre som lysin der den terminale aminogruppen er fri og alfaaminogruppen er beskyttet med en fenoksy-karbonyl (POC) gruppe, blir en trialdehydforbindelse med formel R(CH0)3 kondensert i nærvær av NaBB^CN. POC beskytt-ende grupper på det resulterende trikondensasjonsprodukt ble fjernet ved hydrogenering over Pd/C. De resulterende avbeskyttede alfaaminogruppene til det trikondensasjonsproduktet er nå egnet for reaksjon med N-metoksykarbonylmaleimid. Trikondensasjonsproduktet blir løst opp i vandig bikarbonat ved omtrent 0"C. Til dette blir N-metoksykarbonylmaleimid tilsatt og temperaturen blir opprettholdt ved 0"C i 10 minutter. Deretter blir reaksjonen fortsatt ved romtemperatur i 30 min. Resulterende maleimid blir deretter renset som beskrevet for TMA (Eksempel 2 heri). Når det gjelder Eksemplene 5 og 6 blir en hvilken som helst stereokjemi rundt det asymmetriske senteret (<*>) i lysinutgangs-materialet beholdt i sluttproduktet.

EKSEMPEL 7

Til 1,3,5-benzen trikarboksylsyre i tetrahydrofuran (TEF) ved 0°C blir et 10% ekvivalent overskudd av N-hydroksysuccinimid tilsatt i nærvær av dicykloheksylkarbodiimid. Reaksjonsblandingen blir opprettholdt ved 0°C i 1 time etterfulgt av en inkubasjon i 3 timer ved romtemperatur for å tilveiebringe tris-succinimidylesteren av triacid.

I en separat reaksjon blir etylendiamin omsatt ifølge fremgangsmåten i Eksempel 2 med en ekvimolar mengde eller mindre N-metoksykarbonylmaleimid, som blir fremstilt ifølge fremgangsmåten i Eksempel 1. Det resulterende produktet, 2-N-maleimidoetylendiamin, blir deretter omsatt med tris-succinimidylesteren fra ovenfor i en mettet natriumbikarbonatopp-løsning i omtrent 1 time ved 22° C for å fremstille tris-maleimidet som tilsvarer den kjemiske formlen vist ovenfor.

EKSEMPEL 8

Trisr2- N-( maleoylglycvl ) aminoetyl~ l amin ( " TMG" )

Glycin (1.5 g, 20 mmol) i mettet NaHC03 (100 ml) blir omfattende omrørt ved 0°C med finmalt N-metoksycarbonylmale-imid (3.1 g, 20 mmol). Etter 10 minutter blir oppløsningen fortynnet med 400 ml vann og omrørt ved romtemperatur i 40 minutter. pH til oppløsningen blir justert til ~7 med konsentrert HC1 og den nøytraliserte oppløsningen ble avdampet i vakuum til omtrent 50 ml. Deretter blir oppløs-ningen surgjort til pH ~2 med 3N HC1 og ekstrahert to ganger med 100 ml etylacetat. Kombinert etylacetatekstrakt ble vasket med vann, tørket over vannfri Na2S04 og avdampet til tørrhet. Råproduktet ble løst opp i 5 ml CH2C12:CH3C00H/95:5 og sendt igjennom en silikagel-flammekolonne (60 g) eluert med samme oppløsningsmiddel. Etter avdampning av det organiske oppløsningsmiddel ble produktet lyofilisert for å tilveiebringe 1.85 g lett, hvitt maleoylglycin.

1-H NMR (D20): S4.30(2H,s) og 6.95(2H, s).

IR (KBr) 1710 cm-<1> (C = 0)

Maleoylglycin (1.55 g, 10 mmol) i 50 ml diglym ble behandlet ved 0°C med N-hydroksysuccinimid (1.27 g, 11 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (2.23g, 11 mmol). Etter 1 time ved 0°C og 3 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen filtrert og avdampet til tørrhet for å tilveiebringe 1.9 g rå maleoylglycin N-succinimidylester.

Maleoylglycin N-succinimidylester (1.9 g, 7.5 mmol) ble oppløst i 35 ml DMF, og tris(2-aminoetyl )amin (329 mg, 2.25 mmol) i 10 ml dimetylformamid (DMF) ble dråpevis tilsatt med omrøring til oppløsningen. Reaksjonen ble registrert ved revers fase (C^g) høytrykks væskekromatografi (HPLC) eluert med en lineær gradient fra 80% 0.1 M ammoniumacetat (pH5)/- 205é CH30H til 50% 0.1 M ammoniumacetat (pH 5)/ 50% CH30H. Reaksjonsoppløsningen ble konsentrert og råproduktet ("TMG") ble delt inn i tre porsjoner og renset på en 150 ml Lobar revers fase C^g kolonne eluert med en trinngradient fra 20$ CH3OH/805é 0.1 M ammoniumacetat, pH 5 til 5056 CH3OH/50# 0.1 M ammoniumacetat.

<*>H NMR (DMF): S2.50(6H); 3.18(6H) og 7.05(6E).

EKSEMPEL 9

Trisr2- N-( maleo. vlglycvlglycyl ) aminoetvllamin ( " TMGG" )

Til 660 mg glycylglycin (5 mmol) i 25 ml mettet NaHC03 ved 0°C ble 775 mg N-metoksykarbonylmaleimid (5 mmol) tilsatt med omfattende omrøring. Etter 10 minutter ble oppløsningen fortynnet med 100 ml vann og omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. pH til oppløsningen ble justert fra 8 til 6.3 med 3N HC1 og oppløsningen ble avdampet med rotering under redusert trykk ("rotavaped") til omtrent 20 ml. Den konsentrerte oppløsningen ble surgjort til pH 2 med 3N HC1 og ekstrahert to ganger med 50 ml etylacetat. Kombinert etylacetat-ekstraktet ble tørket over vannfri NagSC^ og avdampet til tørrhet i vakuum.

Den resulterende resten ble løst opp i 18 ml diglym og behandlet ved 0°C med N-hydroksysuccinimid (460 mg, 4 mmol) og dicykloheksylkarbodiimid (824 mg, 4 mmol). Etter omrøring i 1 time ved 0°C og 2 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen filtrert og filtratet avdampet til tørrhet for å tilveiebringe 3.2 mmol maleoylglycylglycin N-succinimidylester .

Til 66 mg tris(2-aminoetyl)amin (0.45 mmol) i 2 ml dimetylformamid ("DMF") ble det dråpevis tilsatt med omrøring 8 ml 0.2 M maleoylglycylglycin N-succinimidylester i DMF. Etter omrøring ved romtemperatur i 1 time ble oppløsningen rotavaped til 3 ml og sendt gjennom en silikagel flammekolonne (60 g) eluert sekvensielt med (1) 150 ml EtOAc:MeOH/90:10; (2) 150 ml EtOAc:MeOH/75:25; (3) 150 ml EtOAc:MeOH/50:50; og (4) 150 ml MeOH. Etter avdampning av oppløsningsmidlet ble 0.22 g TMGG som en lysegul rest oppnådd fra fraksjon 3.

<*>H NMR (DMF): S2.55(6H); 3.25(6H); 3.95(6H); 4.35(6E); og 7.10(6H).

EKSEMPEL 10

Fremstilling av antistoffer.

(a) Anti-In-EDTA ("CHA")

Antistoffer heri betegnet "CHA" er et monoklonalt anti-hapten antistoff med spesifisitet for komplekset dannet mellom etylendiamintetraeddiksyre ("EDTA") og indium (III)ionet. For billed-dannelse blir ^^In isotopen av indium (III) anvendt. I foreliggende oppfinnelse ble EDTA derivatet, etanolaminetioureabenzyl EDTA ("EOTUBE") anvendt som chela-teringsmiddel. CHA 255 antistoffet ble fremstilt som følger. Miltceller fra BALB/c mus formeres immunisert med antigen ble koblet med en variant av P3.653 myelomcellelinjen. Se Gerhard, Monoclonal Antibodies, utgitt av Kenneth et. al., Plenum Press, New York (1980). De resulterende hybridomer ble skrinet ved en fast fase andre antistoff-radioimmuno-analyse for deres evne til å binde indium aminobenzyl-EDTA (Wang et. al., Journal of Immunological Methods, 18, 157

(1977)). Basert på deres høye titre og relativt høye affini-tet bestemt ved inhibisjon av bindingen ved umerket antigen, ble et monoklonalt antistoff betegnet CHA 255 valgt for ytterligere studie og injisert intraperitonealt i BALB/c mus for ascites produksjon. Monoklonale antistoffer ble renset fra muse ascites ved ione-byttekromatografi på DEAE-cellulose som beskrevet av Parham et.al., J. Immunol. Meth., 53, 133

(1982). Det monoklonale antistoffet CHA 255 er ytterligere beskrevet av Reardon, D.T., et. al., Nature, 316, s. 265-268 (1985) og Meares et. al., U.S. patent nr. 4.722.892, utstedt 2. februar 1988, heri inkorporert som referanse. CHA 255 antistoff blir nedenfor betegnet som "CHA".

(b) Anti-Y-DTPA ("CYA")

Antistoffet betegnet heri "CYA" er et monoklonalt anti-hapten antistoff som har spesifisitet for komplekset dannet mellom chelateringsmidlet, dietylentriaminpentaeddiksyre ("DTPA") og yttrium (III) ionet. For terapeutiske hensikter blir <90>Y isotopen av yttrium (III) anvendt. For å forsterke den farmasøytiske aksepterbarheten ble metyltioureabenzylderi-vatet av DTPA, som er kjent som metyltioureabenzyldietylen-triaminpenta eddiksyre ("MeTUBD") anvendt. CYA316 antistoffet (nedenfor betegnet "CYA") ble fremstilt ved anvendelse av de generelle teknikkene beskrevet i Reardon, et.al., "Antibodies Against Metal Chelates," Nature, 316: 265 - 267

(1985) og i Meares, et.al. (U.S. patent nr. 4.722.892), idet sistnevnte er inkorporert heri som referanse.

(c) Anti-CEA ("ZCE")

Antistoffet betegnet "ZCE" er et monoklonalt antistoff med spesifisitet for karsinoembryonisk antigen. "ZCE" antistoffet er kommersielt tilgjengelig fra Jean Pierre Mach, University of Lausanne, Lausanne, Sveits.

(d) Chimerisk Anti-CEA ("xCEM")

Antistoffet betegnet "xCEM" er et muse/humant chimerisk antistoff med spesifisitet for karsinoembryonisk antigen. "xCEM" antistoff ble klonet og uttrykt ifølge fremgangsmåten til Biedler et.al., J.Immunol., 141: s. 4053 - 4060 (1988).

(e) Chimerisk Anti-In-EDTA ("xCHA")

Antistoffet betegnet heri som "xCEA" er et muse-humant chimerisk antistoff med spesifisitet for In-EDTA chelat komplekset. "xCHA" antistoffet ble fremstilt ved vesentlig samme fremgangsmåte som anvendt for fremstilling av "xCEM" ovenfor (dvs. J.Immunol., 141: s. 4053 - 4060 (1988)) med unntagelse av at ved fremstilling av "xCHA" ble de variable regionene fra murinantistoff CHA 255 anvendt istedet for de variable regionene fra murinantistoff CEM-231.

EKSEMPEL 11

Fremstilling av den bifunksjonelle antistoff- lignende forbindelse xCEM-TMA-xCEM

(a) Fremstilling av xCEM-Fab'SH

Et chimerisk monoklonalt antistoff mot karsinoembryonisk antigen (CEA) og konstruert som "xCEM" ble spaltet med pepsin ved anvendelse av den konvensjonelle teknikken beskrevet i Eksempel 12(a) heri, med unntagelse av at spaltningen bare ble utført i 3 timer (se også f.eks. U.S. pat. 4.659.839, som beskriver pepsinspaltning og som er inkorporert heri som referanse). Spaltet xCEM ble deretter dialysert over natt mot boratbuffer, pH * 8 (ved papir). Absorbansen til dialysert pepsinspaltning ble målt ved 280nm ("Agso") soin angir 3.9 mg/ml protein. Til 900jj1 dialysert xCEM spaltning ble 2jj1 0.5M dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) tilsatt og blandingen ble inkubert ved 37°C i 15 minutter. Deretter ble 36>j1 0. 5M cystein (Cys) tilsatt til blandingen som ble inkubert i ytterligere 10 minutter ved 37°C. Den resulterende reaksjonsblandingen ble applisert på en biogel P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) og 2.0 ml av en proteinfraksjon ble samlet. Fraksjonens Agso indikerte 1.3 mg/ml eller 26jjM konsentrasjon av Fab'-lignende fragment betegnet xCEM-Fab'SH. Konsentrasjonen av sulfhydrylgruppene i fraksjonen ble bestemt ved anvendelse av standard-teknikken for tilsetning av et molart overskudd 5 ,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre) (dvs. DTNB) pluss boratbufret saltvann (50mM natriumborat, 50mM NaCl, pH 8.2) til en alikot av fraksjonen og måling av absorbansforskjellen ved 412nm mellom DTNB inneholdende alikot og en blank. Ved anvendelse av denne teknikken ble antallet sulfhydrylgrupper pr. Fab'-fragment beregnet å være 1.5 og tyder på omtrent 1.5 sulfhydrylgrupper pr. xCEM-Fab'SH. (b) Kobling av tris-(2-N-maleimidoetyl)amin med xCEM-Fab'SH Til 1.0 mg tris-(2-N-maleimidoetyl)amin (dvs. "TMA") løst opp i 80jj1 dimetylformamid ble 1 ml av eluatet inneholdende xCEM-Fab'SH tilsatt fra ovenfor. Reaksjonsblandingen ble latt stå ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter, for å separere TMA derivatisert Fab'-fragment fra TMA ble reaksjonsblandingen applisert på en biogel P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) og eluert i citratbufret saltvann (50 mM ammoniumci trat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3) og eluert inn i .1 ; NaCl ved 1 s DTPA, pH 6-3 50 mM ammoniumcitrat til .1 mol NaCl og 1 mM pH 6.3. 2.3 ml fraksjon av proteinet inneholdende eluatet ble samlet. A2go indikerte at konsentrasjonen til det ønskede produktet var 0.49 mg/ml eller 9.8jjM (ved å anta ingen TMA absorbans). Korresponderende maleimidkonsentrasjon i det koblede produktet ble bestemt å være 4.6jjM, resulterende i 0.47 TMA molekylet pr. Fab'-fragment. Det resulterende koblede produktet blir heri betegnet "xCEM-Fab'-TMA".

(c) Kobling av xCEM-Fab'-TMA med xCEM-Fab'SH

for dannelsen av xCEM-TMA-xCEM

Produktet fra (a) og (b) ovenfor ble kombinert i modellreak-sjonene i følgende forhold for å undersøke koblingsegenskap-ene til TMA derivatiserte Fab'-lignende fragmenter. Produktet til disse reaksjonene ble betegnet xCEM-TMA-xCEM ("Fab"' er blitt valgt for klargjøring):

Utbyttene av modell-forbindelsen xCEM-TMA-xCEM varierte som funksjon av forholdet til reaktantene.

De beste utbyttene av xCEM-TMA-xCEM ble oppnådd når Fab'-lignende fragmenter som bærer maleimid-delen var i overskudd i forhold til Fab'-lignende fragmenter inneholdende den frie sulfhydrylgruppen.

EKSEMPEL 12

Fremstilling av den bifunks. ionelle antistoff- lignende forbindelsen xCHA-TMA- xCEM. med spesifisitet for det billed-dannende midlet. In-EDTA og CEÅ (a) Fremstilling av F(ab')2 fragmenter fra intakt antistoff.

Dersom ikke annet er beskrevet heri ble de monoklonale antistoffene betegnet xCHA, CEM, ZCE og CYA spaltet med pepsin for å danne F(ab')2 fragmenter ifølge følgende prosedyre. Antistoff-oppløsninger med en antistoff-konsentrasjon på 5 - 15 mg/ml ble bestemt ved deres absorbans ved 280 nm ("Aggo")» ole dialysert i acetatbufret saltvann (0.1 M natriumacetat, 0.1 M NaCl, pH 4.1) over natt ved 4°C. Deretter ble en konsentrert pepsinoppløsning tilsatt til den dialyserte oppløsningen inneholdende omtrent 2$ antistoff i masse i pepsin. Reaksjonsblandingen ble deretter inkubert i 4-48 timer ved 37°C. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av NaHCOs helt til pH var =s8. F(ab')2 fragmentene ble renset ved forskjellige teknikker, inkludert gelfiltrering på Sephadex® G-150 kolonne (Pharmacia, Piscataway, NJ): høy-trykks væskekromatografi, ved anvendelse som en matrise enten Fast Flow S (Pharmacia) eller TSK-GEL SP-TOYOPEARL® 650S kationbytte-harpiks (Tosoh Corp., Japan) og 0.17M natriumacetat pH 4.5 med en NaCl gradient som elueringsbuf f er. Etter isolering ble F(ab')2 fragmentet dialysert i boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 50 mM NaCl, pH 8.2). De dialysérte oppløsningene inneholdende F(ab')2 fragmentene ble anvendt i påfølgende reduksjonstrinn.

(b) Reduksjon av xCHA-F(ab')2 til xCHA-Fab'SH

Til 4 ml av ovennevnte dialyserte oppløsning inneholdende 5.7 mg/ml xCHA-F(ab')2 ble 118 mg NaHC03 som justerte pH til 8 tilsatt. Deretter ble 8jj1 0. 5M dietylentriaminpentaeddiksyre ("DTPA") tilsatt og reaksjonen ble latt forløpe ved 37°C i 15 minutter. Ved ytterligere tilsetning av 160jj1 0. 5M cystein ble reaksjonsblandingen inkubert i 10 minutter ved 37° C. Reaksjonsblandingen ble applisert på en 50 ml P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) som var pre-ekvilibrert og eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). I løpet av elueringen ble en 7.84 ml proteinfraksjon samlet. Absorbansen til fraksjonen ved 280nm ("A2go") indikerte at proteinkonsentrasjonen til fraksjonen var 55jjM. Sulfhydryl innholdet til proteinfraksjonen ble bestemt å være IIOjjM ved tilsetning av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre) ("DTNB") og boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 50 mM NaCl, pE 8.2) til en alikot av reaksjonsblandingen og måling av absorbansforskjel-lene ved 412nm mellom alikoten inneholdende DTNB og en blank. Molforholdet mellom sulfhydrylgrupper og Fab'-fragmentet for xCHA-Fab'SH ble beregnet å være 2.0:1. Det resulterende reduserte fragmentet ble betegnet xCHA-Fab'SH.

(c) Fremstilling av et F(ab')2 fragment fra Anti-CEA

Et muse/humant chimerisk antistoff, med spesifisitet for CEA og betegnet "xCEM", ble klonet og uttrykt ifølge prosedyren til Beidler et.al., J. Immunol., 141, s. 4053 -4060 (1988). "xCEM" antistoffet ble spaltet med pepsin i 3 timer ifølge fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 11(a) heri for å fremstille det korresponderende F(ab')2 fragmentet, betegnet heri xCEM-F(ab' )2.

(d) Reduksjon av xCEM-F(ab')2 til xCEM-Fab'SH

Til 6.5 ml av den endelige dialyserte oppløsningen fra trinn (c) ovenfor, som inneholdt 8.46 mg/ml xCEM-F(ab' )2, ble 13jj1 0.5M dietylentriaminpentaeddiksyre ("DTPA") tilsatt. Reaksjonsblandingen ble inkubert i 15 minutter ved 37 "C etterfulgt av tilsetning av 260pl 0.5M cystein og ytterligere inkubasjon ved 37° C i 10 minutter. Deretter ble den resulterende blandingen applisert på en 50 ml biogel P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) som var pre-ekvilibrert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). Ved eluering av kolonnen med denne samme bufferen ble en 10.8 ml proteinfraksjon samlet. Absorbansen til eluatet ved 280 nm indikerte at proteinkonsentrasjonen var 104jjM. Sulfhydryl innholdet, bestemt ved fremgangsmåten i Eksempel ll(a) heri, ble beregnet å være 1.6 pr. fragment. Det resulterende reduserte fragmentet ble betegnet xCEM-Fab'SE.

(e) TMA derivatisering av xCEM-Fab'SE

Det reduserte fragmentet xCEM-Fab'SE ble koblet til tris(2-N-maleimidoetyl)amin ("TMA") ifølge følgende prosedyre. Til 12 mg TMA løst opp i 200jj1 dimetylformamid (DMF) i et reagensrør ble 10 ml citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pE 6.3) som var 104>jM xCEM-Fab 'SE, tilsatt. Blandingen ble sløret i begynnelsen, men ble oppklart når 10 ml xCEM-Fab'SE tilsetningen var fullført. Et hvitt presipi-tat var på bunnen og sidene av reagensrøret. Reaksjonen ble latt stå ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter ble reaksjonsblandingen applisert på en 200 ml P-6 kolonne (Biorad Laboratories) som var blitt pre-ekvilibrert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pE 6.3). Ved eluering av kolonnen med samme buffer ble en 23 ml fraksjon inneholdende xCEM-Fab'-TMA samlet. Absorbansen av fraksjonen ved 280 nm viste at dets proteinkonsentrasjon var 2.3 mg/ml eller 47jjM.

Ved anvendelse av maleimid tilbaketitrering ble maleimidkonsentrasjonen til proteinfraksjonen også bestemt. Til 200>j1 av 23 ml fraksjonen inneholdende xCEM-Fab'-TMA ble det tilsatt 20pl 1.0 mM cystein. Blandingen ble latt stå ved romtemperatur i 5 minutter. Deretter ble 10pl 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre) ("DTNB") og 770jj1 boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 50 mM NaCl, pE 8.2) tilsatt. Reaksjonsblandingen ble spektrofotometrisk analysert ved 412 nm og maleimidkonsentrasjonen i 23 ml fraksjonen ble bestemt å være 34jjM. Molforholdet mellom tilgjengelig maleimid pr. xCEM-TMA molekyl ble beregnet å være 0.72.

(f) Konjugasjon av xCHA-Fab'SE med xCEM-Fab'TMA

Til 7.2 ml (396 nmol) 55>jM xCEA-Fab 'SE oppløsning fra Eksempel 12(b) heri ble det tilsatt med omrøring 11.6 ml (545 nmol) 47jjM xCEM-Fab' -TMA oppløsning fra Eksempel 12(e) ovenfor. Forholdet mellom xCEA-Fab'/maleimid i denne reaksjonsblandingen ble beregnet å være 1.0:1. Reaksjonsblandingen ble latt stå ved romtemperatur i 4 timer hvorpå reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 20pl av en IM oppløsning av alkyleringsmidlet, N-etylmaleimid ("NEM"). Produktet, xCEA-TMA-xCEM ble renset fra reaksjonsblandingen ved forskjellige teknikker som innbefatter EPLC (høytrykks væskekromatografi) og anvendelse av Fast Flow S (Pharmacia, Piscataway, N.J.) eller TSK-GEL SP-TOYOPEARL® 650s (Tosoh Corp., Japan) matrise; og gelfiltrering på en Sephadex® G-150 kolonne (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Fagfolk er kjent med protein-separasjonsteknikker innbefattende EPLC og gelfiltrering.

EKSEMPEL 13

Fremstilling av den bifunks. lonelle antistoff- lignende forbindelsen. ZCE- BMP- CHA. med spesifisitet for CEA og In-EDTA

(a) Fremstilling av F(ab')2 fragmentet til anti In-EDTA

Antistoffet mot In-EDTA, betegnet heri som CEA, ble spaltet med pepsin ifølge fremgangsmåten i Eksempel 12(a) for å fremstille dets korresponderende F(ab')2 fragment, CEA-F(ab' )2.

(b) Reduksjon av CEA-F(ab')2 til CEA-Fab'SE

En 5 ml alikot av en final-dialysert oppløsning fra trinn (a) ovenfor, som inneholdt 10 mg/ml CEA-F(ab')2, ble redusert og renset på en P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) ifølge fremgangsmåten i Eksempel 12(b). Ved eluering av P-6 kolonnen (Biorad Laboratories), ble en 12 ml proteinfraksjon samlet. Basert på absorbansen av fraksjon 280 nm var konsentrasjonen av F(ab') fragmentet 86>jM. Sulfhydrylkonsentrasjonen til proteinfraksjonen ble bestemt å være 163pM ved anvendelse av 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre)

("DTNB"). Det molare forholdet mellom sylfhydrylgrupper og Fab' fragmenter for CHÅ-Fab'SH ble beregnet å være 1.9:1.

(c) BMP derivatisering av CHA-Fab'SH

Til 1 ml av en 50:50 oppløsning av DMF/H20 ble 13 mg N ,N' - bis(3-maleimidopropionyl)-2-hydroksy-l,3-propandiamin (nedenfor "BMP") tilsatt som er kommersielt tilgjengelig fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Etter oppløsning av BMP, ble 12 ml 86jjM proteinf raks j on fra trinn (b) ovenfor, som inneholdt CHA-Fab'SH, tilsatt til BMP oppløsningen. Reaksjonsblandingen ble latt stå i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter ble reaksjonsblandingen applisert på og eluert fra en 200 ml P-6 kolonne (Biorad Laboratories) med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). En 27 ml proteinfraksjon, som inneholdt CHA-Fab'BMP, ble samlet. & 28Q viste at CHA-Fab'BMP konsentrasjonen var 33pM.

Maleimidinnholdet av proteinfraksjonen ble bestemt på en 300jj1 alikot av fraksjonen ovenfor ved anvendelse av 20pl ImM cystein, IOjjI 5,5'-ditio-bis(nitrobenzosyre) ("DTNB") og 670jj1 boratbufret saltvann pH 8.2, som beskrevet i Eksempel 12(e) heri. Maleimidinnholdet av fraksjonen ble bestemt å være 33pM. Antallet maleimid-deler tilgjengelig pr. xCHA-Fab' ble beregnet til 1.0.

(d) Reduksjon av ZCE-F(ab')2 til ZCE-Fab'SH

Et kommerisielt tilgjengelig monoklonalt antistoff mot CEA, lisensiert fra Jean Pierre Mach, University of Lausanne, Lausanne, Sveits, og betegnet heri som ZCE, ble spaltet med pepsin ifølge fremgangsmåten i Eksempel 11 (a) for å fremstille dets tilsvarende F(ab')2 fragment, betegnet ZCE-F(ab')2. Dr. Mach refererer til ZCE antistoff som Mab35. Til en 4 ml alikot av final-dialysert oppløsning fra pepsinspaltningen ovenfor, som inneholdt 10 mg/ml ZCE-F(ab')2» hie IOjjI 0.5 M DTPA tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert i 10 minutter ved 37"C. Deretter ble 160pl 0.5M cystein tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37°C i ytterligere 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter applisert på en 40 ml P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA) som var pre-ekvilibrert og eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). En 11.3 ml proteinf raks j on ble samlet, som basert på dets absorbans ved 280 nm (Agso) var 79jjM i redusert protein. Sulfhydrylinnholdet til proteinfraksjonen ble bestemt å være 149pM ved anvendelse av DTNB som beskrevet i Eksempel 12(b). Forholdet av sulfhydrylgrupper pr. ZCE-Fab' fragment ble beregnet å være 1.9:1. Det resulterende fragmentet er betegnet ZCE-Fab'SH.

(e) Konjugasjon av CHA-Fab'BMP til ZCE-Fab'SH

Til 79uM oppløsningen av ZCE-Fab'SH fra Eksempel 13(d) ovenfor ble det dråpevis tilsatt en mengde av 33jjM oppløsn-ingen av CHA-Fab'BMP som er tilstrekkelig for å tilveiebringe et 1:1 forhold mellom ZCE-Fab'SH og reaktivt maleimid. Reaksjonsblandingen ble latt stå over natt ved 4"C. Deretter ble eventuelt ureagert sulfhydryl blokkert ved tilsetning av 16 mg DTNB til reaksjonsblandingen for derved å tilveiebringe en konsentrasjon på omtrent 1 mM DTNB.

Den resulterende bifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen, betegnet CHA-BMP-ZCE, ble renset fra reaksjonsblandingen ved hjelp av forskjellige teknikker inkludert høytrykks væskekromatografi (HPLC) ved anvendelse som matriser enten Fast Flow S (Pharmacia) eller TSK-GEL SP-T0Y0PEARL® 650s kationbytte-harpiks (Tosoh Corp., Japan); og ved gelfiltrering på en Sephadex® G-150 kolonne (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Fagfolk innenfor dette området er kjent med protein-rensning via teknikker som HPLC og gelfiltrering.

EKSEMPEL 14

Fremstilling av trifunksjonelle ant i stof f- 1 ignende forbindelser

Velg tre forskjellige intakte antistoffer betegnet heri Ab^, Ab2 og Ab3, som har ønskede spesifisiteter og aviditeter. Antistoffene blir individuelt spaltet med pepsin ifølge konvensjonell fremgangsmåte, beskrevet i Eksempel 12(a) heri, for tilveiebringing av F(ab')2 fragmenter betegnet som henhv. F1(ab')2, F2(ab')2 og F3(ab')2.

F(ab')2 fragmentene avledet fra hver av de tre antistoffene blir redusert med cystein (eller annet lignende reduksjonsmiddel) til deres respektive Fab' fragmenter, dvs. F^ab', F2ab' og F3ab', ved anvendelse av en konvensjonell prosedyre, som beskrevet i Eksempel 12(b) heri.

De tre reduserte Fab' fragmentene blir selektivt koblet sammen for å danne en trifunksjonell antistoff-lignende forbindelse via to trifunksjonelle koblingsmidler ifølge foreliggende oppfinnelse, f.eks. tris(2-maleoylglycylamino-etyl )amin ("TMG") fra Eksempel 8. Fiab^SH, som er blitt oppløst i en vandig buffer, pH 5 - 8, fortrinnsvis pH 5 - 7, blir tilsatt til et 30-ganger molart overskudd TMG løst opp i DMF. Reaksjonsblandingen blir inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter blir reaksjonsblandingen applisert på en P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA) som er blitt pre-ekvilibrert og som blir eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammonium[eller natrium]citrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pE 6.3). Proteinfraksjonen fra P-6 kolonnen (Biorad Laboratories) inneholder renset F^ab'-TMG som inneholder minst en maleimid-del som kan bli koblet til et annet redusert Fab'-fragment.

For å oppnå en andre kobling til TMG blir proteinfraksjonen inneholdende renset F^ab<*>TMG tilsatt dråpevis til det andre reduserte Fab'-fragmentet, F2ab'SH som er i samme citratbuf-fer som anvendt for å eluere P-6 kolonnen. Den andre koblingsreaksjonen blir "utført i 3 timer ved romtemperatur. Deretter blir de ekstra sulfhydrylene på FgaVSH delen av det koblede produktet, F^ab'-TMG-Fgab'SH, beskyttet av et reversibelt beskyttelsesmiddel, såsom DTNB (5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzosyre). Beskyttingen blir påbegynt ved tilsetning av tilstrekkelig DTNB for å oppnå en final-konsentrasjon på omtrent 1 mM i citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3) som inneholder Fj^ab'-TMG-F2ab'SH. Deretter blir reaksjonsblandingen inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Det resulterende beskyttede mellomproduktet F^ab'-TMG-Fgab'-S-blokkeringsmiddel, blir renset ved høytrykks væskekromatografi (HPLC), ved anvendelse av en matrise omfattende enten Fast Flow S (Pharmacia, Piscataway, N.J.) eller TSK-GEL SP-TOYOPEARL® 650s (Tosoh Corp., Japan); eller ved preparativ gelfiltrering, såsom på en kolonne inneholdende Sephadex® 650s G-150 superfin harpiks (Pharmacia, Piscataway, N.J.).

Når det er renset, blir det beskyttede mellomproduktet deblokkert i boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 50 mM NaCl, pH 8.2) hvorpå et molart overskudd av 1 mM cystein, DTT (ditiotreitol) eller et lignende reduksjonsmiddel blir tilsatt. Det deblokkerte og reduserte bifunksjonelle mellomproduktet blir ytterligere renset ved å la reaksjonsblandingen gå gjennom en P-6 kolonne (Biorad Laboratories) som er blitt pre-ekvilibrert med og som er eluert med det nettopp beskrevne citratbufrede saltvannet, pH 6.3. Det reduserte bifunksjonelle mellomproduktet, F-^ab ' -TMG-Fgab '-SH, er nå klar for kobling til et tredje maleimid-derivatisert Fab'-fragment.

Det tredje Fab'-fragmentet blir derivatisert ved å bli tilsatt til et 30-ganger molart overskudd av TMG (eller annet trivalent koblingsmiddel ifølge foreliggende oppfinnelse) som beskrevet for det første Fab'-lignende fragmentet nevnt i dette Eksempel. Reaksjonsblandingen blir inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter blir F3ab'-TMG i reaksjonsblandingen renset ved å utsette reaksjonsblandingen for en P-6 kolonne (Biorad Laboratories) som er blitt pre-ekvilibrert med og som er eluert med det beskrevne citratbufrede saltvannet, pH 6.3.

Den endelige koblingen for å produsere den trivalente antistoff-lignende forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse blir oppnådd ved å tilsette F3ab'-TMG til en oppløsning av ovennevnte citratbufrede saltvann (pH 6.3) inneholdende F^ab'-TMG-Fgab'SH og deretter muliggjøre at reaksjonen forløper i 3 timer ved romtemperatur. Deretter blir reaksjonen stoppet, såsom ved tilsetning av alkyleringsmidlet, N-etylmaleimid, til reaksjonsblandingen. Rensing av den trivalente antistoff-lignende forbindelsen (F^ab'-TMG-Fgab'-TMG-F3ab') blir oppnådd ved HPLC, eller preparativ gelfiltrering (f.eks. Pharmacia's Sephadex® kvalitet G-150 superfine harpiks), som er teknikker velkjente for fagfolk.

EKSEMPEL 15

Fremstilling av den trifunksjonelle antistoff- lignende forbindelsen;

CHA- BMP- CYA- BMP- ZCE

Tre forskjellige antistoffer, som er betegnet CHA, CYA og ZCE, var kilden for Fab'-fragmentene som ble koblet av to trivalente koblingsmidler for å danne den trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen CHA-BMP-CYA-BMP-ZCE. I dette eksemplet hadde det monoklonale antistoffet betegnet CHA spesifisitet for chelatkomplekset In-EDTA eller In-chelatert med derivater av EDTA, såsom EOTUBE.

Det monoklonale antistoffet betegnet "CYA" hadde spesifisitet for det chelaterte komplekset "Y-DTPA" og det monoklonale antistoffet betegnet "ZCE" hadde spesifisitet for karcino-embryonisk antigen ("CEA").

(a) Preparering av F(ab')2 fragmenter

F(ab')2 fragmentene til CHA, CYA og ZCE som er betegnet CHA-F(ab')2, CYA-F(ab')2 og ZCE-F(ab')2 ble preparert ved individuell spaltning av det respektive antistoffet med pepsin ifølge fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 12(a).

(b) Reduksjon av CYA-F(ab')2 til CYA-Fab *SH

Til 1.0 ml boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 50 mM NaCl, pH 8.2) inneholdende 8.1 mg/ml CYA-F(ab')2 ble 2jj1 0. 5M dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) og 40pl 0.5M cystein tilsatt. Reaksjonsblandingen ble latt gå i 10 minutter ved 37° C. Deretter ble reaksjonsblandingen applisert på en 15 ml P-6 kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) som var blitt pre-ekvilibrert og eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). En 3.0 ml protein-inneholdende fraksjon ble samlet fra kolonnen, som basert på dets absorbans ved 280 nm (A28q) hadde en protein (redusert Fab') konsentrasjon på 48jjM. Konsentrasjonen til frie sulfhydrylgrupper i proteinfraksjonen ble bestemt å være 118 uM ved anvendelse av fremgangsmåten i Eksempel 12(b) heri. Deretter ble forholdet mellom frie sulfhydrylgrupper pr. Fab' fragment beregnet å være 2.5:1.

(c) Preparering av CHA-BMP-ZCE-SH

Den bifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen CHA-BMP-ZCE med en blokkert sulfhydryl, ble fremstilt ifølge fremgangsmåten i Eksemplene 13(a) -(e). Deretter ble det til en 2.5 ml alikot inneholdende 3.9 g/ml renset blokkert CHA-BMP-ZCE i boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 50 mM NaCl, pH 8.2) tilsatt 5jj1 0. 5M dietylentriaminpentaeddiksyre ("DTPA"). Reaksjonsblandingen ble inkubert i 15 minutter ved tempeatur 370 C etterfulgt av påfølgende tilsetning av lOOjjl 0. 5M cystein. Reaksjonsblandingen ble ytterligere inkubert i 10 minutter ved 37"C som tilveiebragte deblokker-ing. Deretter ble reaksjonsblandingen applisert på en biogel P-6 kolonne (Biorad Laboratories) som var blitt pre-ekvilibrert og som var eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pE 6.3). En 5.8 ml proteinfraksjon ble samlet, som basert på dets absorbans ved 280 nm (Agso) hadde en 15>jM protein (redusert bifunksjonelt antistoff) konsentrasjon. Sulfhydrylkonsentrasjonen til proteinfraksjonen ble deretter bestemt ifølge fremgangsmåten i Eksempel 10(a).

(d) Kobling av CYA-BMP med CEA-BMP-ZCE-SE

for dannelsen av CEA-BMP-ZCE-BMP-CYA

Til 5.5 ml citratbufret saltvannsoppløsning som var 15jiM i CHA-BMP-ZCE-SE (fra trinn (c) ovenfor) ble det tilsatt en ekvimolar mengde CYA-BMP likeledes oppløst i citratbufret saltvann (50 mM natriumcitrat, 100 mM NaCl, pE 6.3). Reaksjonen ble fortsatt i 3 timer ved romtemperatur og deretter avsluttet ved tilsetning av N-etylmaleimid som beskrevet i Eksempel 14 heri. Den resulterende trifunksjonelle antistoff-lignende forbindelsen, betegnet CEA-BMP-ZCE-BMP-CYA ble renset ved gelfiltrering på Sephadex® G-150 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), eluerende med boratbufret saltvann (50 mM sodiumborat, 50 mM NaCl, pE 8.2). Fraksjonene 38 - 43 ble samlet og slått sammen for tilveiebringing av 3.2 ml av en oppløsning inneholdende 0.66 mg/ml renset produkt. En 2.0 ml alikot av de sammenslåtte fraksjonene ble deretter dialysert over natt i 0.17M natriumacetat, pE 4.5, for påfølgende EPLC rensing på en Mono S matrise (Pharmacia). Den uriktige bindingskapasiteten for In-E0TUBE komplekset av CEA-BMP-ZCE-BMP-CYA i 0.66 mg/ml sammenslått fraksjon ble bestemt å være 76$ av den teoretiske kapasiteten. Kontrollen for samme kjøring utviste en bindingskapasitet på 4$. Y-MeTUBD bindingsevnen var 82% av dets teoretiske verdi.

EKSEMPEL 16

Fremstilling av den trivalente antistoff- lignende forbindelsen xCEM- TMG- xCHA- TMG- xCEM

(a) Spaltning av "xCHA" og "xCEM"

til xCEM-F(ab')2 og xCEM-F(ab')2

Intakt chimerisk monoklonalt antistoff mot In-EDTA komplekset er betegnet heri "xCHA". Intakt chimerisk monoklonalt antistoff mot CEA er heri betegnet "xCEM". Preparering av disse antistoffene var som beskrevet i Eksemplene 11 og 12 heri. Intakt xCHA og xCEM antistoffer ble individuelt spaltet til deres respektive F(ab')2 fragmenter ved inkuber-ing av hver med 3% (pepsin: antistof f) ved 37 "C i 5 timer i acetatbufret saltvann (100 mM natriumacetat, 100 mM natriumklorid, pH 4.1). Spaltningene ble avsluttet ved nøytraliser-ing av pH. Deretter ble spaltningene dialysert i boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 100 mM natriumklorid, pH 8.2) for å tilveiebringe tilsvarende F(ab')2 fragmenter betegnet xCHA-F(ab')2 og xCEM-F(ab')2.

(b) Reduksjon av xCEM-F(ab')2 til xCEM-Fab'SH

Til 6 ml xCEM-F(ab')2 (17 mg/ml) oppnådd fra trinn (a) ovenfor ble 2.0 ml boratbufret saltvann (50 mM natriumborat, 100 mM natriumklorid, pH 8.2) og 16jj1 0. 5M dietylentriaminpentaeddiksyre ("DTPA") tilsatt for å oppnå en final DTPA konsentrasjon på 1 mM. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37° C i 10 minutter, etterfulgt av tilsetning av 360>il 0. 5M cystein og en ytterligere inkubasjon i 10 minutter ved 37°C. Cystein ble fjernet ved gelfiltrering på en 2.5 x 19 cm P-6 DG kolonne (Biorad Laboratories, Richmond, CA 94804) som var blitt pre-ekvilibrert med og som ble eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). Ved eluering ble en 19.6 ml proteinf raksjon samlet, som basert på dets absorbans ved 280 nm (A2§q) var 90jjM i redusert Fab' fragment- xCEM-Fab'SH. Den frie sulfhydrylkonsentrasjonen til proteinfraksjonen ble bestemt ved omsetning med DTNB (ifølge Eksempel 10(a)) å være 159pM. Forholdet mellom fri sulfhydryl pr. redusert Fab' fragment ble beregnet å være 1.8:1.

(c) Derivatisering av xCEM-Fab'SH med TMG

Det reduserte Fab' fragmentet, xCEM-Fab'SH, ble derivatisert med et 30 ganger molart overskudd av tris[2-N-(maleoyl-glycyl )aminoetyl]amin ("TMG"). 19.5 ml xCEM-Fab 'SH (1.8jjmol) i citratbufret saltvann fra trinn (b) ovenfor ble tilsatt med røring til 176>j1 314 mM TMG (53>jmol) i DMF. Etter 10 minutter ved 23°C ble overskudd TMG fjernet på en 2.5 x 45 cm P-6 DG kolonne (Biorad Laboratories) som var pre-ekvilibrert og eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). En 26.8 ml proteinfraksjon ble samlet, som basert på dets absorbans ved 280 nm (A23q) inneholdt 3.3 mg/ml eller var 67jjM i det derivatiserte fragmentet - xCEM-Fab'-TMG. Bestemmelse av aktive maleimider ved cystein tilbaketitrering (pr. Eksempel 12(e)) indikerte 1.16 aktive maleimider pr. Fab' fragment.

(d) Reduksjon av xCHA-F(ab')2 til xCHA-Fab'SH

En 2.7 ml alikot av xCHA-F(ab')2 (9.2 mg/ml) ble inkubert med 1 mM DTPA i 10 minutter ved 37°C. Til denne reaksjonsblandingen ble det tilsatt 6jj1 0. 5M ditiotreitol ("DTT") og reaksjonsblandingen ble ytterligere inkubert ved 37°C i ytterligere 10 minutter. DTT ble fjernet ved gelfiltrering på en 1.5 x 25 cm P-6 DG kolonne (Biorad Laboratories) som var pre-ekvilibrert og eluert med citratbufret saltvann (50 mM ammoniumcitrat, 100 mM NaCl, 1 mM DTPA, pH 6.3). En 7.6 ml proteinfraksjon ble samlet som basert på absorbansen ved 280nm (A2g0) var 59>jM i den ønskede xCHA-Fab 'SH. Den frie sulfhydrylkonsentrasjonen til fraksjonen ble bestemt å være 236pM. Forholdet til frie sulfhydrylgrupper pr. reduserte Fab' fragment ble beregnet å være 4.7:1.

(e) Kobling av xCHA-Fab'SH og xCEM-Fab'TMG

Til 7.5 ml xCHA-Fab'SH fra trinn (d) ovenfor ble tilsatt 26.2 ml xCEM-Fab'-TMG fra trinn 15(c) ovenfor og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 23° C i 100 minutter. Reaksjonen ble terminert ved tilsetning av 34jj1 IM N-etylmaleimid, et alkyleringsmiddel. Reaksjonsblandingen ble deretter konsentrert til 12 ml ved ultrafiltrering. Den konsentrerte reaksjonsblandingen ble renset ved gelfiltrering på en 2.6 x 96 cm G-150 superfin kolonne (Pharmacia, Piscataway, N.J.) som har et skiktvolum på 500 ml. Strømningshastigheten var omtrent 0.2 ml/min. og 5 ml fraksjoner ble samlet. ^ 280 sporet til elueringsmønsteret viste tre hovedprodukter. Den ønskede trivalente antistoff-lignende forbindelse, betegnet heri xCEM-TMG-xCHA-TMG-xCEM ble funnet som middelprodukt, dvs. i fraksjonene 38 - 41. Identiteten til xCEM-TMG-xCHA-TMG-xCEM ble bekreftet ved høytrykks væskekromatografi (HPLC) gelfiltrering og ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ved anvendelse av en 7.5$ akrylamidgel.

Claims (1)

1. Forbindelse med formel karakterisert ved at X er der Z er der s = 1 eller 0; der n = 1 eller 0; der q = 1 eller 0; der Y er der Y' er der p og m kan være like eller forskjellige og er tall varierende fra 0 til 20 forutsatt at når n = 0 er summen av m og p et tall varierende fra 1 til 20, mens når n = 1, er p og m hver et tall som er minst 1 og summen av p og m er et tall som varierer fra 2 til 20; der Ri er lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer; og der R<2> er hydrogen, -C00H, eller lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1-6 karbonatomer forutsatt at den lavere alkyldelen er monosubstituert med -NHg, eller -0H.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er

3. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er

4 . Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er

5 . Trivalent koblingsmiddel for kovalent kobling av Fab'-lignende fragmenter, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse med formel: der X er der Z er der s = 1 eller 0; der n = 1 eller 0; der q = 1 eller 0; der Y er der Y' er der p og m er like eller forskjellige og er tall varierende fra 1 til 20 forutsatt at når n = 0 er summen av m og p et tall varierende fra 1 til 20, mens når n = 1, er p og m hver et tall som er minst 1 og summen av m og p varierer fra 2 til 20; der R<*> er lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 til omtrent 6 karbonatomer og der R<2> er hydrogen, -C00H eller lineær eller forgrenet lavere alkyl med fra 1 til 6 karbonatomer forutsatt at lavere alkyldelen er enkel-substituert med -NHg-f eller -0H-.

6. Trivalent koblingsmiddel ifølge krav 5, karakterisert ved at det er n Trl■ valiepn„t t kkoobblli ingg smiddel iføl^ ge ^krav c 5, karakterisert vea

8. Trivalent koblingsmiddel ifølge krav 5, karakterisert ved at det er