CN117298291A - Fc结合肽偶联物、靶向TROP2的定点偶联ADC及其制备方法和应用 - Google Patents

Fc结合肽偶联物、靶向TROP2的定点偶联ADC及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Fc结合肽偶联物、靶向TROP2的定点偶联ADC及其制备方法和应用。所述的Fc结合肽偶联物如式(I)或式(II)所示。本发明采用Fc结合肽导向的定点偶联方法改善靶向TROP2‑ADC的均质性，提高靶向TROP2‑ADC候选药物的有效性、降低其毒性反应。

Description

Fc结合肽偶联物、靶向TROP2的定点偶联ADC及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种Fc结合肽偶联物、靶向TROP2的定点偶联ADC及其制备方法和应用。
背景技术
抗体偶联药物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)主要由连接片段偶联抗体和小分子细胞毒药物组成，以抗原靶向性的抗体将小分子细胞毒成分特异性地运输到肿瘤组织并释放，发挥杀伤癌细胞的作用。在ADC的设计中，抗体的选择决定靶向性，小分子细胞毒成分决定杀伤能力，连接片段的设计(亲水性)和偶联方法的优化影响ADC的均一性、稳定性。
TROP2(Tumor-associated calcium signal transducer 2)，又名TACSTD2(tumor-associated calcium signal transducer)、EGP-1(epithelial glycoprotein-1)、GA733-1(gastrointestinal tumor associated antigen)，是一类由TACSTD2基因编码的细胞表面单次跨膜糖蛋白。在64％肺腺癌(DOI:10.18632％2Foncotarget.15647)、78.1％三阴性乳腺癌(DOI:10.3892/or.2018.6496)中观察到高TROP2表达，与肿瘤生长、癌转移以及患者的不良预后相关。靶向TROP2的抗体偶联药物在抗肿瘤领域的应用已得到初步论证，目前有Immunomedics(已被Gilead收购)的Trodelvy(sacituzumab govitecan，研发代码为IMMU-132)上市，获批适应症为三阴性乳腺癌和尿路上皮癌。在研管线中，科伦博泰的SKB264采用了巯基与磺酰基嘧啶接头(sulfonyl pyrimidine-CL2A-carbonatelinker)，避免了retro-Michael反应并提高了ADC的血浆稳定性，目前处于三阴性乳腺癌适应症的临床III期，并在同适应症上获得FDA突破性疗法资格(DOI:10.3389/fonc.2022.951589)；第一三共株式会社的Datopotamab Deruxtecan(研发代码为DS-1062、Dato-DXd)采用了与恩曲妥珠单抗相同的GGFG四肽可裂解连接子以及DXd毒素，改善了ADC的均质性，提高了体内外血浆稳定性并有效延长了血浆半衰期(Dato-DXd at 6mg/kg vsIMMU-132 at 8mg/kg,45.12±13.92 vs 14.4±3.3)，目前处于肺癌适应症的临床III期(DOI:10.1158/1535-7163.MCT-21-0206)；恒瑞医药的SHR-A1921采用了四肽可裂解连接子以及自主研发的SHR9265毒素，目前处于临床I/II期(DOI:10.1158/1538-7445.AM2023-LB030；DOI:10.1158/1538-7445.AM2023-CT181)；君实生物/多禧生物的JS108(研发代码或为DAC-002)仅披露了使用微管蛋白抑制剂Tub196作为毒素，目前处于临床I期；启德医药的GQ1010采用了基于Sortase A转肽酶定点偶联的iLDC平台技术，改善了ADC的均质性，同时在偶联位点采取了自水解开环的马来酰亚胺结构(DOI:10.1038/nbt.2968)，减少了retro-Michael反应带来的血浆稳定性不足的问题，目前处于临床前研究(DOI:10.1158/1538-7445.AM2023-1549)。除JS108/DAC-002使用微管蛋白抑制剂Tub196作为毒素之外，已披露(部分)结构的Trodelvy、SKB264、Datopotamab Deruxtecan和SHR-A1921均采用了半胱氨酸偶联(cysteine-based coupling)的策略，将喜树碱类药物(SN38、T-030/KL610023、DXd、SHR9265)作为小分子毒素部分，DAR值(Drug-to-Antibody Ratio，药物抗体比)分别为7.6、7.2、4、4。除科伦博泰的SKB264之外，其他半胱氨酸偶联策略合成的抗体偶联药物，由于TCEP等还原剂无法区分还原位点、不同位点反应性不同等原因造成均质性不足、ADC产物聚集稳定性差，对ADC生产工艺要求较高；且在血液循环过程中存在不同程度的硫代琥珀酰亚胺(thiosuccinimide group)的retro-Michael反应断裂(DOI:10.1016/j.ddtec.2018.07.002)、导致细胞毒素在血浆中提前释放，临床试验中的药物治疗窗有限。
ADC药物的安全性、有效性有望通过均质性更高、稳定性更好的定点偶联技术得到进一步的提升。
在抗体Fc片段铰链区、CH2和CH3区域之间，抗体能够与至少4种天然蛋白骨架(Protein A、Protein G、类风湿因子、FcRn)发生蛋白-蛋白相互作用。利福尼亚大学旧金山分校的DeLano推测Fc上存在一保守区域能够与特定多肽结构高度亲和，在2000年利用噬菌体展示技术体外分筛多肽、辅助多肽-Fc片段结晶论证，探索得到包含13个氨基酸残基DCAWHLGELVWCT-NH2的多肽序列Fc-III(DOI:10.1126/science.287.5456.1279)。基于此项工作，日本鹿儿岛大学的伊藤教授开发了CCAP(Chemical Conjugation by AffinityPeptide)法、首先将Fc结合肽应用于抗体定点偶联物的合成，通过优化多肽序列筛选得到一段17个氨基酸残基的Fc结合环肽的序列(GPDCAYHKGELVWCTFH-NH2)，并在多肽的N端偶联biotin或毒素小分子DM1、用赖氨酸上修饰的NHS酯将Fc结合肽定点定量地偶联到抗体上(DOI:10.1021/acs.bioconjchem.8b00865)。这类多肽能够在pH 5.5-8.0的宽pH范围内实现曲妥珠单抗K248位点的定点偶联，但残留在ADC上的Fc结合肽可能影响部分抗体功能，导致抗体无法结合到FcRn上、难以纯化。日本的味之素公司在专利(JP2018017345/CA3061467A1)中进一步优化了环肽的序列(Ac-RGNCAYHRGKLVWCTYH-NH2)，2019年山田慧等人通过在linker中引入二硫键(DOI:10.1002/anie.201814215)、实现定点偶联后的Fc结合肽在TCEP的还原下脱除，而遗留的K248位巯基残基可以通过与马来酰亚胺的Micheal加成反应，实现毒素小分子与抗体的定点偶联。2022年，上海药物所的黄蔚课题组改良了Fc结合肽与抗体Fc片段的分子作用机制(DOI：10.1002/anie.202204132)，实现了一步无痕定点偶联，通过硫酯的转氨基反应，将毒性小分子或生物正交官能团偶联到曲妥珠单抗的K248位上，实现抗体的定点偶联。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种Fc结合肽偶联物，其可以实现对抗体K248位点的赖氨酸残基的定点偶联。
本发明提供的一种Fc结合肽偶联物，其结构如式(I)或式(II)所示：
其中，多肽链的序列为RGNCAYHRGKLVWCTYH，其中两个巯基之间形成二硫键；W1为硫酯；
R1选自以下基团：
W1选自以下基团：
n＝0-6；
W2选自以下基团：
n1＝0-36；
X或XL选自以下基团：
m、n2＝0-36；
Y1为-vc-、-va-、-GGFG-、-FK-等短肽，选自以下基团：
Y2选自以下基团：
L或L1为生物正交官能团，选自以下基团：
m1、n3＝0-36；
Z为药物活性成分；
以上，代表连接位点。
如式(I)结构的Fc结合肽偶联物为式(I')或式(I")所示：
如式(II)结构的Fc结合肽偶联物为式(II')或式(II")所示：
所述的Fc结合肽偶联物由Fc结合域配体(多肽链)、硫酯(W1)、功能性官能团(X)包含亲水官能团PEG链或/与生物正交官能团L1、可裂解片段(Y1、Y2)、药物活性成分Z等多部分组成。
优选的，所述的Fc结合肽偶联物选自以下化合物：
所述的药物活性成分为小分子毒素、PARP抑制剂、ATM抑制剂、免疫激动剂或荧光基团。
优选的，所述的Z选自美登素、一甲基澳瑞他汀E(MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(MMAF)、一甲基澳瑞他汀D(MMAD)、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷(VP-16)、喜树碱、DXd、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)、依喜替康(exatecan)、托泊替康(topotecan)、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)二聚体、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多订、艾榴塞洛素、奥拉帕尼(olaparib)衍生物、AZD5305衍生物、AZD1390衍生物、吡咯并嘧啶骨架的免疫激动剂、香豆素、BODIPY、Cy7、Biotin等。
进一步优选的，所述的Z选自：
其中，代表连接位点。
所述的Fc结合肽偶联物经多肽链合成、多肽链N端修饰、脱树脂、氧化成环得到环肽，再经酰胺缩合修饰linker-L1或linker-Z，构成具有偶联反应活性的Fc结合肽偶联物(式I、式II)。
本发明的另一技术目的是提供一种靶向TROP2的定点偶联ADC，如式(III)或式(IV)所示：
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、X、XL、Y1、Y2、L、Z的定义分别与上述相应定义相同。
其中，-NHW2X(L)Y1Y2Z为-NHW2XY1Y2Z或-NH(X)L为-NHL或-NH XL。
优选的，靶向TROP2的抗体(裸抗)选自自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A，或商业化的靶向TROP2的蛋白Sacituzumab、Datopotamab；
自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
靶向TROP2的蛋白Sac-A轻链质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，靶向TROP2的蛋白Sac-A重链质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
Sacituzumab和Datopotamab可通过商业化购买获得。
Sacituzumab轻链和重链的氨基酸序列参见：https://www.kegg.jp/entry/D10984；
Datopotamab轻链和重链的氨基酸序列参见：https://www.kegg.jp/entry/D12360。
优先的，所述的靶向TROP2的定点偶联ADC选自以下化合物：
/>
/>
/>
/>
所述的靶向TROP2的定点偶联ADC是基于Fc结合肽偶联物导向的K248位定点偶联的新型抗体-药物偶联物。本发明的另一技术目的是提供所述靶向TROP2的定点偶联ADC的制备方法，包括：将如式(I)或式(II)所示的Fc结合肽偶联物与靶向TROP2的裸抗进行反应，生成如式(III)或式(IV)所示的靶向TROP2的定点偶联ADC。
如式(I)所示的Fc结合肽偶联物与靶向TROP2的裸抗进行反应，生成如式(III)所示的靶向TROP2的定点偶联ADC，反应如下：
如式(III)所示的定点偶联ADC的制备流程如图1。包括如下步骤：
经多肽合成得到的肽链P1-resin，用R1-OH(羧酸)或R1 2O(酸酐)封闭肽链P1-resin的N端后得到肽链P2-resin，再脱树脂得到游离的肽链P2；将肽链P2经氧化形成二硫键得到环肽P3，所述的环肽P3具备与Fc结构域特定位点配位的能力；
药物活性成分Z(S1)经多步酰胺缩合得到药物连接子活性酯(S3)，再通过与W2-NHS反应将药物连接子活性酯末端NH2修饰转化为末端COOH(S4)并进一步修饰得到活性酯(S5)，活性酯与W1-COOH含硫linker经酯化反应得到硫酯(S6)，并进一步活化硫酯C端后得到含巯酯的活性酯(S7)；
环肽P3的赖氨酸残基与含巯酯的活性酯(S7)反应得到如式(I)所示的Fc结合肽偶联物(P6，即式I)，该Fc结合肽偶联物(P6，即式I)具备在抗体(Ab)的Fc结构域上引入毒素小分子或特殊反应性基团的功能；
如式(I)所示的Fc结合肽偶联物(P6)通过与抗体(Ab)Fc结构域的特定位点发生配位，在W1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体K248位点的赖氨酸残基，得到如式(III)所示的定点偶联ADC(ADC，即式III)。
如式(II)所示的Fc结合肽偶联物与靶向TROP2的裸抗进行反应，生成如式(IV)所示的靶向TROP2的定点偶联ADC，反应如下：
如式(IV)所示的定点偶联ADC的制备流程如图2。包括如下步骤：
经多肽合成得到的肽链P1-resin，用R1-OH(羧酸)或R1 2O(酸酐)封闭肽链P1-resin的N端后得到肽链P2-resin，再脱树脂得到游离的肽链P2；将肽链P2经氧化形成二硫键得到环肽P3，所述的环肽P3具备与Fc结构域特定位点配位的能力；
生物正交官能团L(S8)经NHS或sulfo-NHS修饰后得到含生物正交官能团的活性酯(S9)，活性酯(S9)与一端为巯基、另一端为COOH的W1-COOH含硫linker经酯化反应得到关键中间体(S10)，并进一步修饰得到含巯酯的活性酯(S11)；
环肽P3的赖氨酸残基与含巯酯的活性酯(S11)反应得到如式(II)所示的Fc结合肽偶联物(P7，即式II)，该Fc结合肽偶联物(P7，即式II)具备在抗体(Ab)的Fc结构域上引入毒素小分子或特殊反应性基团的功能；
如式(II)所示的Fc结合肽偶联物(P7)与抗体(Ab)Fc结构域的特定位点发生配位、在W1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体K248位点的赖氨酸残基，得到如式(IV)所示的靶向TROP2的定点偶联ADC(ADC，即式IV)。
上述多肽链(P)和药物连接子(S)的合成策略可进行适当调整。
本发明还提供了如式(III)所示的定点偶联ADC的另一种制备方法，包括如下步骤：
经多肽合成得到的肽链P1-resin，用R1-OH(羧酸)或R1 2O(酸酐)封闭肽链P1-resin的N端后得到肽链P2-resin，再脱树脂得到游离的肽链P2；将肽链P2经氧化形成二硫键得到环肽P3；环肽P3通过与Trt保护的巯基乙酸(或Trt保护的巯基丙酸等)发生酰胺缩合得到P4，再脱Trt基团得到环肽P5，环肽P3、P4、P5均具备与Fc结构域特定位点配位的能力；
环肽P5的末端巯基与活性酯(S5)直接反应得到如式(I)所示的Fc结合肽偶联物(P6，即式I)；
如式(I)所示的Fc结合肽偶联物(P6)通过与抗体(Ab)Fc结构域的特定位点发生配位、在W1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体K248位点的赖氨酸残基，得到如式(III)所示的的定点偶联ADC(ADC，即式III)。流程如图3。
本发明还提供了如式(IV)所示的定点偶联ADC的另一种制备方法，包括如下步骤：
经多肽合成得到的肽链P1-resin，用R1-OH(羧酸)或R1 2O(酸酐)封闭肽链P1-resin的N端后得到肽链P2-resin，再脱树脂得到游离的肽链P2；将肽链P2经氧化形成二硫键得到环肽P3；环肽P3通过与Trt保护的巯基乙酸(或Trt保护的巯基丙酸等)发生酰胺缩合得到P4，再脱Trt基团得到环肽P5，环肽P3、P4、P5均具备与Fc结构域特定位点配位的能力；
环肽P5的末端巯基与活性酯(S9)直接反应得到如式(II)所示的Fc结合肽偶联物(P6，即式II)；
如式(II)所示的Fc结合肽偶联物(P7)通过与抗体(Ab)Fc结构域的特定位点发生配位、在W1的硫酯键发生转酰基反应，定点修饰抗体K248位点的赖氨酸残基，得到如式(IV)所示的的定点偶联ADC(ADC，即式IV)。流程如图4。
本发明的另一技术目的是提供一种靶向TROP2的翻译后修饰定点偶联ADC，如式(V)或式(VI)所示：
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、Y1、Y2的定义分别与上述相应的定义相同；
Z、Z1、Z2独立地为药物活性成分；
L1和L2是一对生物正交官能团，当L1＝La时，L2＝Lb；当L1＝Lb时，L2＝La：
m1、n3＝0-36；
X、X1、X2选自以下基团：
/>其中m、n2＝0-36；
以上，代表连接位点。
当Z1＝Z2时，偶联后修饰的靶向TROP2的定点偶联ADC(式V)的DAR值从2增加为4，DAR值增加；Z1≠Z2时，偶联后修饰的靶向TROP2的定点偶联ADC(式V)为双药ADC。
优选的，所述的翻译后修饰的定点偶联ADC选自以下化合物：
/>
/>
式(III)或式(IV)所示化合物与偶联生物正交官能团L2的linker-drug(S14)反应引入毒素小分子，得到如式(V)或式(VI)所述的定点偶联毒素小分子的ADC。如式(V)或式(VI)所述的化合物的制备方法分别如图5、图6。
优选的，偶联生物正交官能团L2的linker-drug(S14)选自以下化合物：
/>
/>
/>
本发明的另一技术目的是提供一种切除不均一糖链的靶向TROP2的定点偶联ADC，如式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示：
式(VII)、式(VIII)、式(IX)和式(X)中，-R'为-W2XY1Y2Z、-(X)L、-W2X1(L1L2X2Y1Y2Z2)Y1Y2Z1和-L1L2XY1Y2Z；
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、X、X1、X2、Y1、Y2、L、L1、L2、Z、Z1、Z2的定义分别与上述相应定义相同。
-W2X1(L1L2X2Y1Y2Z2)Y1Y2Z1为-(X)L为-L或-XL。
如式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示的化合物分别是通过如式(III)、式(IV)、式(V)或式(VI)所示的化合物与糖苷内切酶Endo S或Endo S2反应切除不均一糖链而得到。反应过程如下：
本发明的另一技术目的是提供一种双偶联策略的抗体-药物偶联物，如式(XI)、式(XII)或式(XIII)所示：
/>
式(XI)、式(XII)或式(XIII)中，-R'为-W2XY1Y2Z、-(X)L、-W2X1(L1L2X2Y1Y2Z2)Y1Y2Z1或-L1L2XY1Y2Z；
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、X、X1、X2、Y1、Y2、L、L1、L2、Z、Z1、Z2的定义分别与上述相应定义相同，Z3为药物活性成分；
W3选自以下基团：
n1＝0-36。
如式(XI)所示化合物是通过如式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示的化合物以糖定点偶联的方式与linker-drug发生偶联反应得到；
如式(XII)所示化合物是通过如式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示的化合物以赖氨酸随机偶联的方式与linker-drug发生偶联反应得到；
如式(XIII)所示化合物是通过如式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)、式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示的化合物以半胱氨酸随机偶联的方式与linker-drug发生偶联反应得到。
本发明的另一技术目的是提供一种如式(III)-式(XIII)所示的化合物在制备抗肿瘤治疗的药物中的应用。
所述的用于抗肿瘤治疗的药物可以用于治疗乳腺癌、尿路上皮癌、肺癌或胰腺癌。
本发明的另一技术目的是提供一种如式(III)-式(XIII)所示的化合物在制备免疫治疗的药物中的应用。
所述的用于免疫治疗的药物可以为用于抗炎症、抗病毒、抗感染性疾病，或用于治疗上述多种癌症。
所述的药物可联合放疗或联合PD-L1/PD-1治疗上述多种癌症。
本发明的另一技术目的是提供一种如式(III)-式(XIII)所示的化合物在制备放射增敏剂、肿瘤靶标检测试剂或体内外诊断试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明基于Fc结合肽靶向抗体Fc结构域的Lys定点偶联技术，通过在linker中引入生物正交官能团(叠氮官能团、DBCO、BCN、TCO或Tz)作为二次偶联位点、实现多种作用机制的药物组合，以抗体偶联双药的形式实现多种不同作用机制的小分子药物联用。不同抗体具有保守的Fc结构域，Fc定点偶联策略的兼容性好、不影响产物ADC对抗原的靶向性，偶联工艺稳定、对自主表达的抗体和商业化的抗体均有良好的适用性。
本发明采用了Fc结合肽导向的定点偶联方法改善靶向TROP2-ADC的均质性，用DAR值为2-4的MMAE毒素联合PARP抑制剂提供抗肿瘤活性，期望提高靶向TROP2-ADC候选药物的有效性。通过在linker中修饰PEG等亲水官能团，降低linker-drug的疏水性、提高ADC的聚集稳定性，降低其毒性反应。
附图说明
图1显示如式(III)所示的定点偶联ADC的制备流程。
图2显示如式(IV)所示的定点偶联ADC的制备流程。
图3显示如式(III)所示的定点偶联ADC的另一种制备流程。
图4显示如式(IV)所示的定点偶联ADC的另一种制备流程。
图5显示如式(V)所示的化合物的制备流程。
图6显示如式(VI)所示的化合物的制备流程。
图7显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽Fc-S-PEG8-N3(式II)的结构示意图(a)和质谱数据图(b)(对应ADC-2，ADC-4)。
图8显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE(式I)的结构示意图(a)和质谱数据图(b)(对应ADC-6)。
图9显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽Ac-Fc-S-SG-PEG12-Lys(N3)-vc-PAB-MMAE(式I)的结构示意图(a)和质谱数据图(b)(对应ADC-7，ADC-8，ADC-9)。
图10显示根据本发明的一个实施方式的DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE的结构示意图(a)和质谱数据图(b)(对应ADC-4，ADC-8)。
图11显示根据本发明的一个实施方式的DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi的结构示意图(a)和质谱数据图(b)(对应ADC-9)。
图12为自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A的制备流程示意图。
图13为自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A的SDS-PAGE(a)与LC-MS(b)表征图。
图14显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-1(式IV)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图15显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-2(式V)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图16显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-3(式III)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图17显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-4(式III)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图18显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-5(式III)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图19显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-6(式III)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图20显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-7(式III)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图21显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-8(式VI)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图22显示根据本发明的一个实施方式的Fc结合肽导向的K248位定点偶联的抗体-药物偶联物ADC-9(式VI)的结构示意图(a)、质谱数据图(m/z)(b)和全长质谱数据图(c)。
图23显示抗体偶联药物实施例ADC-3(a)、ADC-5(b)的疏水相互作用色谱数据。
图24显示抗体偶联药物实施例ADC-3、ADC-5的尺寸排阻色谱(size exclusionchromatography,SEC)分析数据。
图25为显示抗体偶联药物实施例ADC-3、ADC-5的体外抗肿瘤活性(CCK8)的图；(a)-(f)分别为BXPC-3、NCI-N87、HCC-1806、HCI-441、FADU、Calu-6细胞模型。
图26为显示抗体偶联药物实施例ADC-4、ADC-6、ADC-7、ADC-8、ADC-9的体外抗肿瘤活性(CCK8)的图，(a)-(d)分别为DA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468、HCC-1806细胞株。
图27为显示抗体偶联药物实施例ADC-5(DAR＝2)对比半胱氨酸随机偶联ADC(DAR＝4)的体内抗肿瘤活性的图，(a)-(c)分别为NCI-N87、HCC-1806、FADU三种小鼠异种移植瘤模型。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
本发明中所使用的Fc结合肽由多肽合成仪(固相合成)制备得到，所使用的糖苷水解酶及其突变酶，均表达于大肠杆菌系统。本发明中所使用的氨基酸、点击化学连接子Fmoc-vc-PAB-PNP、BCN-PNP、DBCO-NHS、orlaparib片段以及带有荧光基团的化合物购买自毕得(上海)有限公司，CY7购买自多荧生物，LacNAc购买自保森生物；MMAE购买自上海芮珊医药科技有限公司；叠氮乙酸购买自探索平台；高纯氮购买自杭州与贝斯特气体有限公司。其他化合物、试剂和溶剂未做进一步揭示均购买自国药集团化学试剂有限公司。
本发明制备过程所使用的仪器、色谱柱包括：微波多肽合成仪(CEM LibertyLite/CEM Discover Bio)，分析性高校液相色谱仪(北京创新通恒LC3000)，制备型高校液相色谱仪(北京创新通恒LC3000)配用Waters C-18制备柱(5-10μm，19×250mm)，Flash过柱机(三泰科技SepaBean machine T)配用SepaFLASH SW080制备柱(Spherical C 18，40-60μm，120A)。
小分子及抗体分子量检测仪器：液相色谱质谱联用(LC-MS)，安捷伦6545LC/Q-TOF，配用Agilent C18 column(Eclipse Plus C18 RRHD，1.8um，2.1mm×50mm)at 35℃或Agilent C4 column(AdvanceBIO RP-mab C4，2.1mm×50mm)at 80℃。
flash设备或半制备HPLC的C18柱反相分离纯化流动相为水+0.1％三氟乙酸/乙腈+0.1％三氟乙酸，体积比从90:10到10:90。
一、多肽部分的合成，合成路线如下所示：
通用操作1
Fc结合肽树脂(P1-Resin，化合物1)的合成方法(多肽合成仪固相合成)
打开氮气钢瓶、调整氮气至合适流速，开启CEM Liberty Lite/CEM Discover Bio设备组。输入设置Fc结合肽序列RGNCAYHRGKLVWCTYH程序。单次称取0.1-0.5mM的Wang-Resin或2-氯三酰氯树脂(2-Chorotrityl Chloridie resin)或AM resin或MBHA resin于反应器中，并按照多肽合成仪提示配置0.2M的氨基酸溶液，称量足量氨基酸定容在DMF溶液中，具体用量如下：丙氨酸(Alanine)/A 0.69g/11ml，精氨酸(Arginine)/R 5.45g/42ml，天冬酰胺(Asparagine)/N 1.32g/11ml，半胱氨酸(Cysteine)/C 2.47g/21ml，甘氨酸(Glycine)/G 1.25g/21ml，组氨酸(Histidine)/H 7.81g/63ml，亮氨酸(Leucine)/L0.78g/11ml，赖氨酸(Lysine)/K 1.04g/11ml，苏氨酸(Threonine)/T 0.88g/11ml，色氨酸(Tryptophan)/W 2.22g/21ml，酪氨酸(Tyrosine)/Y 1.94g/21ml，缬氨酸(Valine)/V0.75g/11ml。准备足量的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、20％哌啶溶液、DIC溶液和Oxyma溶液，称取68-342mg Rink Amide-AM Resin(0.731mmol/g)，点击程序，开始合成。合成结束，将合成完成的树脂从反应器转移到多肽合成器中，用DMF涮洗反应器，用DCM润洗树脂多次并过滤液体抽干，收集固体为Fc结合肽树脂(P1-Resin，化合物1)，记录固体总重量备用。
R1-Fc结合肽肽链(P2，化合物2)的合成方法
按树脂投料比例取P1-Resin(对应约0.2mM树脂原料)于50ml多肽合成器中，加入1-20V N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，5-20倍当量的R1-OH、HATU和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，反应1-8小时。用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)涮洗反应器，用二氯甲烷(DCM)润洗树脂多次并过滤液体抽干，收集固体为P2-Resin，记录固体总重量备用。称取P2-Resin、按重量比例记录摩尔量，配置三氟乙酸：去离子水：三乙基硅烷(TFA:dd H2O:TIPES)＝95:2.5:2.5的混合溶液，以1-20V的比例加入反应器，反应1-8小时。过滤固体获取滤液，用旋转蒸发仪旋除过量溶剂，用乙醚沉淀得到白色固体。配置乙腈：去离子水(MeCN:dd H2O0＝7:2的混合溶液，用混合溶液溶解白色固体得到澄清溶液，经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到R1-RGNCAYHRGKLVWCTYH P2。
实施例1
Ac-Fc(P2-Ac)的合成方法
按树脂投料比例取P1-Resin(约1g，对应约0.2mM树脂原料)于50ml多肽合成器中，加入1-20V N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，5-20倍当量的乙酸酐(Ac2O)和吡啶，反应1-8小时。用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)涮洗反应器，用二氯甲烷)DCM润洗树脂多次并过滤液体抽干，收集固体为乙酰化的Fc结合肽树脂(P2-Ac-Resin)，记录固体总重量备用。称取部分乙酰化的Fc结合肽树脂、按重量比例记录摩尔量，配置三氟乙酸：去离子水：三乙基硅烷(TFA:dd H2O:TIPES)＝95:2.5:2.5的混合溶液，以1-20V的比例加入反应器，反应1-8小时。过滤固体获取滤液，用旋转蒸发仪旋除过量溶剂，用乙醚沉淀得到白色固体。配置乙腈：去离子水(MeCN:dd H2O)＝7:2的混合溶液，用混合溶液溶解白色固体得到澄清溶液，经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Ac-RGNCAYHRGKLVWCTYH P2-Ac(255mg，产率61％)。HRMS,计算值C93H137N31O22S2[M+H]+2106.0108，[M+2H]2+1053.5093,实测值1053.5098。
通用操作2
环化Fc结合肽(P3，化合物3，环化后的S2)的合成方法
取P2(11eq)溶解于二甲亚砜(DMSO)中配置成P2的1-10mM DMSO溶液，在溶液中分别滴加30％的过氧化氢水溶液(10mM)和氨水(100mM)并在室温下搅拌过夜。用flash设备C18柱反相分离纯化，得到白色粉末状固体P3。
实施例2
取Ac-RGNCAYHRGKLVWCTYH P2-Ac(20mg，1eq)溶解于1899ul的DMSO中配置成P2-Ac的5mM二甲亚砜(DMSO)溶液，在溶液中分别滴加30％的过氧化氢水溶液(2-4ul，10mM)和氨水(NH3-H2O 15.4ul,100mM)并在室温下搅拌过夜。用flash设备C18柱反相分离纯化，得到白色粉末状固体P3-Ac(17mg，产率85％)。HRMS,计算值C93H136N31O22S2[M+H]+2103.9951,[M+2H]2+1052.5015，实测值1052.9957。
通用操作3
R1-Fc-W1-S-Trt(P4，化合物4)的合成方法
在Trt-S-W1-COOH(4eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，加入HATU(2eq)，P3(1eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(3eq)并在室温下反应1小时。使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体P4。
实施例3
在Trt-S-OH(8.0mg,24mM，4eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，加入HATU(4.6mg,12mM，2eq)，P3-Ac(15mg，6mM，1eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(2.3mg，18mM，3eq)并在室温下反应1小时。使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-Trt P4-Ac(16mg，产率93％)。HRMS,计算值C114H151N31O23S3[M+H]+2420.0873，[M+2H]2+1210.5476，实测值1210.5498。
通用操作4
R1-Fc-SH(P5，化合物5)的合成方法-脱保护
在P4的二氯甲烷(DCM)溶液中加入三氟乙酸、三乙基硅烷(DCM:TFA:Et3SiH＝50:45:5)并在0摄氏度下搅拌1小时，浓缩得到P5粗品。使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体P5。
实施例4
在Ac-Fc-S-Trt P4-Ac(10mg)的二氯甲烷(DCM)溶液中加入三氟乙酸、三乙基硅烷(DCM:TFA:Et3SiH＝50:45:5)并在0摄氏度下搅拌1小时，浓缩得到Ac-Fc-SH P5-Ac粗品。使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-SH P5-Ac(9mg，产率90％)。HRMS,计算值C95H137N31O23S3[M+H]+2177.9778，[M+2H]2+1089.4928，实测值1089.4936。
二、毒素部分的合成，合成路线如下所示：
通用操作5
NH2-Y1-Y2-Z S2的合成方法(修饰可切割片段的药物活性物质)
称取1.0eq Fmoc-NH-Y1-Y2-PNP和1.2eq Z S1、0.22eq HOBt于离心管，加入2M N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后混匀至溶清，加入3M吡啶开始反应，室温搅拌过夜。用饱和食盐水和乙酸乙酯(20M×3)萃取反应液，收集有机相，加无水硫酸钠除水并放置30分钟，浓缩得到Fmoc-Y1-Y2-Z Fmoc-S2粗品。往粗品中加入5M含20％哌啶的乙腈溶液，振荡混匀后室温放置15分钟。用硅藻土拌匀，用flash设备C18柱反相分离纯化，收集目标组分并冻干，得到NH2-Y1-Y2-Z S2产物。
实施例5
NH2-vc-PAB-MMAE S2a的合成方法
称取100mg Fmoc-NH-vc-PAB-PNP和112mg单甲基澳瑞他汀E(MMAE)S1a、4mg HOBt于离心管，加入200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后混匀至溶清，加入300μL吡啶开始反应，室温搅拌过夜。用饱和食盐水和乙酸乙酯(50ml*3)萃取反应液，收集有机相，加无水硫酸钠除水并放置30分钟，浓缩得到Fmoc-vc-PAB-MMAE Fmoc-S2a粗品。往粗品中加入500μL 20％哌啶的乙腈溶液，振荡混匀后室温放置15分钟。用硅藻土拌匀，用flash设备C18柱反相分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NH2-vc-PAB-MMAE S2a(113.4mg，76％)。HRMS,计算值C58H94N10O12[M+H]+1123.7131,实测值1123.7150。
实施例6
NH2-vc-PAB-PARPi-F S2b的合成方法
称取100mg Fmoc-NH-vc-PAB-PNP和55mg PARPi-F S1b、4mg HOBt于离心管，加入200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后混匀至溶清，加入300μL吡啶开始反应，室温搅拌过夜。用饱和食盐水和乙酸乙酯(50ml×3)萃取反应液，收集有机相，加无水硫酸钠除水并放置30分钟，浓缩得到Fmoc-vc-PAB-PARPi-F Fmoc-S2b粗品。往粗品中加入500μL 20％哌啶的乙腈溶液，振荡混匀后室温放置15分钟。用硅藻土拌匀，用flash设备C18柱反相分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NH2-vc-PAB-PARPi-F S2b(80.2mg，69％)。HRMS,计算值C39H46FN9O7[M+H]+772.3582,实测值772.3563。
实施例7
NH2-vc-PAB-PARPi-2 S2c的合成方法
称取100mg Fmoc-NH-vc-PAB-PNP和66mg PARPi-2 S1c、4mg HOBt于离心管，加入200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后混匀至溶清，加入300μL吡啶开始反应，室温搅拌过夜。用饱和食盐水和乙酸乙酯(50ml×3)萃取反应液，收集有机相，加无水硫酸钠除水并放置30分钟，浓缩得到Fmoc-vc-PAB-PARPi-2 Fmoc-S2c粗品。往粗品中加入500μL 20％哌啶的乙腈溶液，振荡混匀后室温放置15分钟。用硅藻土拌匀，用flash设备C18柱反相分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NH2-vc-PAB-PARPi-2 S2c(32.1mg，25％)。HRMS,计算值C42H58N12O7[M+H]+843.4630,实测值843.4611。
实施例8
NH2-vc-PAB-exatecan S2d的合成方法
称取100mg Fmoc-NH-vc-PAB-PNP和65mg依喜替康(exatecan)S1d、4mg HOBt于离心管，加入200μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)后混匀至溶清，加入300μL吡啶开始反应，室温搅拌过夜。往反应液中加入500μL20％哌啶，室温振荡15分钟。用硅藻土拌匀，用flash设备C18柱反相分离纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NH2-vc-PAB-exatecan S2d(73.1mg，58％)。HRMS,计算值C43H49FN8O9[M+H]+841.3685,实测值841.3629,C43H48FN8O9Na[M+Na]+863.3504,实测值863.3476。
三、linker的延长：功能性侧链的合成，合成路线如下所示：
通用操作6
NH2-X-Y1-Y2-Z S3的合成方法(延长Linker酰胺缩合)
称取1.1eq Fmoc-NH-X-OH S16和2eq HATU并溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，加入1.0eq NH2-Y1-Y2-Z S2和2eq N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，室温反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。使用半制备HPLC纯化，收集目标产物、用LC-MS确证并冻干得到Fmoc-NH-X-Y1-Y2-Z Fmoc-S3。
往溶解Fmoc-NH-X-Y1-Y2-Z的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入20％的吡啶，室温振荡15min，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到NH2-X-Y1-Y2-Z S3。
实施例9
NH2-X(L1)-Y1-Y2-Z的合成方法，如下所示：
叠氮乙酸活性酯Az-NHS(S9a)的合成方法
称取叠氮乙酸S8a(250mg,1.0eq)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(288mg,1.0eq)于圆底烧瓶，0℃下加入四氢呋喃(2ml)后搅拌至溶清，缓慢滴加DCC(516mg,1.0eq)的四氢呋喃溶液(2ml)并继续搅拌4小时。过滤去除DCU沉淀，向滤液中加入无水乙醚(20～30ml)，4℃下静置过夜。离心去除上清液，收集白色沉淀，真空干燥后得到目标化合物Az-NHS S9a(352mg，72％)。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ4.71(s,2H),2.84(s,4H).13C NMR(151MHz,DMSO)δ169.91,165.51,47.50,25.50。
Fmoc-Lys(Az)-OH的合成方法
称取化合物Fmoc-Lys-OH S15(20mg,1.0eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(200μL)中，加入叠氮乙酸活性酯S9a(11.82mg,1.1eq)和三乙胺(15.0μL,2.0eq)，混合均匀后室温反应2h。LC-MS监测反应完全，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Fmoc-Lys(Az)-OHS16a(22.5mg，产率92％)。HRMS计算值C23H25N5O5[M+H]+452.1934，测量值452.1946。
NH2-Lys(Az)-vc-PAB-MMAE S3a的合成方法
称取Fmoc-Lys(Az)-OH S16a(2.4mg,1.0eq)和HATU(3.7mg,2.0eq)溶解在100μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入NH2-vc-PAB-MMAE S2a(5.8mg,1.0eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(2.8μL,2.0eq)，室温反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。LC-MS监测反应完全，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Fmoc-Lys(Az)-vc-PAB-MMAE Fmoc-S3a(7.5mg，产率93％)。HRMS计算值C81H117N15O16[M+H]+1556.8881，测量值1556.8895。
往溶解Fmoc-Lys(Az)-vc-PAB-MMAE Fmoc-S3a(30mg)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入20％的吡啶(40ul哌啶+160ul N,N-二甲基甲酰胺)，室温振荡15min，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到NH2-Lys(Az)-vc-PAB-MMAE S3a(6.1mg，产率95％)。HRMS计算值C66H107N15O14[M+H]+1334.8200，[M+2H]2+667.9139，测量值668.4528。
实施例10
NH2-X(mPEGn)-Y1-Y2-Z的合成方法，如下所示：
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Fmoc-Lys(mPEG24)-OH的合成方法
称取50mg CH3O-PEG24-COOH S17至25mL圆底烧瓶中，并用2mL无水二氯甲烷溶解，滴加两滴氯化亚砜，氮气保护下，50℃回流约2h.薄层色谱分析，展开剂比例甲醇:二氯甲烷＝1:8，显示反应完全，旋干反应体系，油泵抽真空30min，确保反应体系已除去过量的氯化亚砜，用400μL无水四氢呋喃重新溶解，得到溶液A S17-Cl。称取Fmoc-Lys-OH S15a 16mg和碳酸氢钠(NaHCO3)18mg，用900μL四氢呋喃和300μL纯水溶解使澄清，得到溶液B。冰浴搅拌下将溶液A缓慢滴加到溶液B中，室温反应1h，LC-MS监测反应体系，液相产率约65％，延长反应时间无改善。使用半制备HPLC纯化并冻干得到化合物S16b(47mg，产率71％)。HRMS，计算值C73H126N2O30[M+H]+1511.8468，测量值1511.8405，[M+2H]2+756.4275，测量值756.4223。
NH2-Lys(mPEG24)-vc-PAB-MMAE的合成方法
称取Fmoc-Lys(mPEG24)-OH S16b(7.8mg,1.0eq)和HATU(3.7mg,2.0eq)溶解在100μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入NH2-vc-PAB-MMAE S2a(5.8mg,1.0eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(2.8μL,2.0eq)，室温反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。LC-MS监测反应完全，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Fmoc-Lys(mPEG24)-vc-PAB-MMAE Fmoc-S3b(9.6mg，产率71％)。HRMS计算值C131H218N12O41[M+H]+2617.5454，[M+2H]2+1309.2766，测量值1309.7222,1326.7727。
往溶解Fmoc-Lys(mPEG24)-vc-PAB-MMAE的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入20％的吡啶，室温振荡15min，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到NH2-Lys(mPEG24)-vc-PAB-MMAE S3b(7.6mg，产率86％)。HRMS计算值C116H208N12O39[M+H]+2395.4773，测量值2395.4796，[M+3H]3+798.8299，测量值798.8272。
NH2-PEGn-Y1-Y2-Z的合成方法
实施例11
NH2-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
称取Fmoc-NH-PEG12-OH S16c(4.1mg,1.0eq)和HATU(3.7mg,2.0eq)溶解在100μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入NH2-vc-PAB-MMAE S2a(5.6mg,1.0eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(2.8μL,2.0eq)，室温反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。LC-MS监测反应完全，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Fmoc-NH-PEG12-vc-PAB-MMAE Fmoc-S3c(8.6mg，产率89％)。HRMS计算值C100H158N11O27[M+H]+1946.1362，[M+Na]+1968.1182，测量值1946.1381，1968.1198。
往溶解Fmoc-PEG12-vc-PAB-MMAE的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入20％的吡啶，室温振荡15min，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到NH2-PEG12-vc-PAB-MMAE S3c(6.7mg，产率88％)。HRMS计算值C85H147N11O25[M+H]+1723.0648，[M+Na]+1745.0467，测量值1723.0672，1745.0501。
实施例12
NH2-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE的合成方法
称取Fmoc-NH-PEG12-OH S16c(4.3mg,1.0eq)和HATU(3.7mg,2.0eq)溶解在100μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入NH2-LysN3-vc-PAB-MMAE S3a(6.7mg,1.0eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(2.8μL,2.0eq)，室温反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。LC-MS监测反应完全，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Fmoc-NH-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE Fmoc-S3d(8.2mg，产率76％)。HRMS计算值C107H169N16O29[M+H]+2143.2275，[M+Na]+2165.2094，测量值2143.2307，2165.2112。
往溶解Fmoc-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入20％的吡啶，室温振荡15min，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到NH2-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S3d(6.4mg，产率87％)。HRMS计算值C92H159N16O27[M+H]+1920.1561，[M+Na]+1942.1380，测量值1920.1588，1942.1402。
实施例13
NH2-PEG12-vc-PAB-PARPi-F的合成方法
称取Fmoc-NH-PEG12-OH S16c(4.2mg,1.0eq)和HATU(3.7mg,2.0eq)溶解在100μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入NH2-vc-PAB-PARPi-F(3.8mg,1.0eq)和N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)(2.8μL,2.0eq)，室温反应4h。LC-MS监测反应体系，显示反应几乎完全。LC-MS监测反应完全，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到Fmoc-NH-PEG12-vc-PAB-PARPi-F Fmoc-S3e(5.1mg，产率65％)。HRMS计算值C81H109FN10O22[M+H]+1593.7780，[M+Na]+1615.7594，测量值1593.7831，1615.7652。
往溶解Fmoc-PEG12-vc-PAB-MMAE的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入20％的吡啶，室温振荡15min，使用半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到NH2-PEG12-vc-PAB-MMAE S3e(3.6mg，产率82％)。HRMS计算值C66H99FN10O20[M+H]+1371.7099，[M+Na]+1393.6952，测量值1371.7374，1393.7021。
通用操作7
生物正交官能团(L1)的修饰、HOOC-W1-L1的合成方法
称取NHS-L1 S9(1-10eq)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，往上述反应体系中加入NH2-X-W1-COOH S11(1eq)和三乙胺(Et3N)(1-3eq)，室温反应1-4小时后，使用半制备HPLC纯化并冻干得到白色固体HOOC-W1-X-L1 S12。
实施例14
HOOC-PEG8-Az的合成方法
称取NH2-PEG8-COOH(15.1mg,1.0eq)和DMF(200uL)于离心管内，加入Az-NHS S9a(24.4mg,1.2eq)后混匀，继续加入NEt3(20uL，2.0eq)后室温下振荡30分钟-4小时，LC-MS监测反应体系，使用半制备HPLC纯化并冻干得到化合物HOOC-PEG8-Az S11a(6.3mg,35％)。HRMS,计算值C21H40N4O11[M+H]+525.2772,[M+H+H2O]+543.2872,实测值525.2783,542.2885。
通用操作8
生物正交官能团(L2)的修饰、L2-X-Y1-Y2-Z2的合成方法
称取NH2-Y1-Y2-Z2 S2或NH2-X-Y1-Y2-Z2 S3(1eq)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，往上述反应体系中加入L2-PNP或L2-NHS(1.2eq)和三乙胺(Et3N)(1-3eq)，室温反应1-4小时后，使用半制备HPLC纯化并冻干得到白色固体L2-X-Y1-Y2-Z2 S14。
实施例15
BCN-vc-PAB-MMAE的合成方法
称取NH2-vc-PAB-MMAE S2a(10mg,1eq)溶解在100μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入BCN-PNP S9b(3.4mg,1.2eq)和三乙胺(Et3N)(3.7uL,3eq)，室温反应1-4小时后，使用半制备HPLC纯化并冻干得到白色固体BCN-vc-PAB-MMAE S14a(9.6mg，83％)。HRMS,计算值C69H106N10O14[M+H]+1299.7968,实测值1299.8015。
实施例16
DBCO-vc-PAB-MMAE的合成方法
称取NH2-vc-PAB-MMAE S2a(10mg,1eq)溶解在100μL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,往上述反应体系中加入DBCO-NHS S9c(4.3mg,1.2eq)和三乙胺(Et3N)(3.7uL,3eq)，室温反应1-4小时后，使用半制备HPLC纯化并冻干得到白色固体DBCO-vc-PAB-MMAE S14b(10.3mg，82％)。HRMS,计算值C77H108N11O14[M+H]+1410.8072,实测值1410.8045。
实施例17
DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
称取NH2-PEG12-vc-PAB-MMAE S3c(10mg,1.0eq)溶解在100μL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，往上述反应体系中加入DBCO-NHS S9c(2.8mg,1.2eq)和三乙胺(Et3N)(2.5uL,3.0eq)，室温反应1-4小时后，使用半制备HPLC纯化并冻干得到化合物DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE S14c(8.6mg,74％)。HRMS,计算值C104H161N12O27[M+H]+2011.1628,[M+Na]+2033.1447,实测值2011.1620,2033.1480。其结构示意图和质谱数据图分别如图10中的(a)和(b)所示。
实施例18
DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F的合成方法
称取NH2-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S3e(8.0mg,1.0eq)溶解在100μL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，往上述反应体系中加入DBCO-NHS S9c(2.7mg,1.2eq)和的三乙胺(Et3N)(2.5uL,3.0eq)，室温反应1-4小时后，使用半制备HPLC纯化并冻干得到化合物DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S14d(6.3mg,65％)。HRMS,计算值C85H113FN11O22[M+H]+1658.8040,实测值1658.8082,1680.7891。
通用操作9
HOOC-W1-W2-X-Y1-Y2-Z的合成方法
称取NH2-X-Y1-Y2-Z S3(1eq)和NHS-W2-NHS(5eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并加入三乙胺(Et3N)(3eq)，室温下搅拌反应1-4小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NHS-W2-X-Y1-Y2-Z S5和副产物HOOC-W2-X-Y1-Y2-Z S4。
称取NHS-W2-X-Y1-Y2-Z S5(1eq)和HS-W1-COOH(10eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并加入三乙胺(Et3N)(3eq)，室温下搅拌反应1-4小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物HOOC-W1-W2-X-Y1-Y2-Z S6。
称取副产物HOOC-W2-X-Y1-Y2-Z S4(1eq)溶解于DMF溶液，随后加入NHS(1.2eq)和EDCI(1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-W2-X-Y1-Y2-Z S5(1.2eq)。加入HS-W1-COOH(10eq)和Et3N(3eq)，室温下搅拌反应1-4小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物HOOC-W1-W2-X-Y1-Y2-Z S6。
实施例19
NHS-SG-vc-PAB-MMAE S5a的合成方法
称取NH2-vc-PAB-MMAE S2a(11.2mg,1eq)和双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯(16.3mg,5eq)溶解于DMF溶液，并加入三乙胺(Et3N)(4.2uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NHS-SG-vc-PAB-MMAE S5a(11.2mg,84％)。HRMS,计算值C67H104N11O17[M+H]+1334.7612,实测值1334.7590。
实施例20
HOOC-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE S6b的合成方法
称取NH2-PEG12-vc-PAB-MMAE S3c(17.2mg,1eq)和双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯(16.3mg,5eq)溶解于DMF溶液，并加入三乙胺(Et3N)(4.2uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NHS-SG-PEG12-vc-PAB-MMAES5b(16.7mg,86％)。HRMS,计算值C94H157N12O30 +[M+H]+:1935.1162,实测值1935.1155。
称取NHS-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE S5b(9.7mg,1eq)和巯基乙酸(3.5uL,10eq)溶解于DMF溶液，并加入Et3N(2.1uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物HOOC-S-SG-vc-PAB-MMAE S6b(8.2mg,86％)。HRMS,计算值C92H156N11O29S[M+H]+1911.0791,实测值1911.0779。
实施例21
HOOC-S-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S6c的合成方法
称取NH2-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S3d(19.2mg,1eq)和双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯(16.3mg,5eq)溶解于DMF溶液，并加入三乙胺(Et3N)(4.2uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NHS-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S5c(17.9mg,83％)。计算值C102H170N17O32 +[M+H]+:2146.2231,实测值2146.2256。
称取NHS-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S5c(10.7mg,1eq)和巯基乙酸(3.5uL,10eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并加入三乙胺(Et3N)(2.1uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物HOOC-S-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S6c(8.8mg,83％)。HRMS,计算值C100H169N16O31S[M+H]+2122.1855,实测值2122.1902。
实施例22
HOOC-S-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S6d的合成方法
称取NH2-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S3e(13.7mg,1eq)和双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)戊二酸酯(16.3mg,5eq)溶解于DMF溶液，并加入三乙胺(Et3N)(4.2uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物NHS-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S5d(12.5mg,79％)。计算值C75H109FN11O25 +[M+H]+:1582.7580,实测值1582.7553。
称取NHS-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S5d(8.0mg,1eq)和巯基乙酸(3.5uL,10eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，并加入Et3N(2.1uL,3eq)，室温下搅拌反应2小时。通过半制备HPLC纯化，收集目标组分并冻干，得到化合物HOOC-S-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S6d(5.1mg,65％)。HRMS,计算值C73H108FN10O24S[M+H]+1559.7243,实测值1559.7211。
R1-Fc-W1-W2-X-Y1-Y2-Z(P6)或R1-Fc-W1-L(P7)的合成方法，如下所示：
通用操作10
R1-Fc-W1-W2-X-Y1-Y2-Z(P6，化合物6)或R1-Fc-W1-L(P7，化合物7)的合成方法一(route 1)
在HOOC-W1-W2-X-Y1-Y2-Z S6(1.2eq)或HOOC-W1-X-L S11(1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入NHS(1.2eq)和EDCI(1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-S-W1-W2-X-Y1-Y2-Z S7(1.2eq)或NHS-W1-X-L S13(1.2eq)。随后加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的P3(1eq)，加入pH＝7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体P6或P7。
实施例23
Ac-Fc-S-PEG8-Az的合成方法
在HOOC-S-PEG8-Az S10(3.3mg,1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.69mg,1.2eq)和EDCI(1.2mg,1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-S-PEG8-N3 S11。随后加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的P3-Ac(10.5mg,1eq)，加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-PEG8-Az P7a(9.3mg,69％)。HRMS,计算值C116H175N35O33S3[M+H]+2684.2365,[M+2H]2+1342.6222，实测值1342.6213。
实施例24
Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
在HOOC-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE S6b(6.8mg,1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.69mg,1.2eq)和EDCI(1.2mg,1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-S-PEG12-vc-PAB-MMAE S7b。随后加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的P3-Ac(10.5mg,1eq)，加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE P6b(13.1mg,66％)。HRMS,计算值C185H288N42O50S3[M+H]+3996.0558,[M+3H]3+1332.6905，实测值1333.0256。
实施例25
Ac-Fc-S-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE的合成方法
在HOOC-S-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S6c(12.7mg,1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.69mg,1.2eq)和EDCI(1.2mg,1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-S-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE S7c。随后加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的P3-Ac(10.5mg,1eq)，加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-SG-PEG12-LysN3-vc-PAB-MMAE P6c(15.4mg,73％)。HRMS，计算值C193H301N47O52S3[M+H]+4208.1661,[M+3H]3+1403.3939，实测值1403.3930。其结构示意图和质谱数据图分别如图9中的(a)和(b)所示。
实施例26
Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F的合成方法
在HOOC-S-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S6d(8.2mg,1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.69mg,1.2eq)和EDCI(1.2mg,1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-S-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S7d。随后加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的P3-Ac(10.5mg,1eq)，加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-PARPi-F P6d(12.6mg,69％)。HRMS,计算值C166H240FN41O45S3[M+H]+3643.6932,[M+3H]3+1215.5722，实测值1215.9030。
实施例27
Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-exatecan的合成方法
在HOOC-S-SG-PEG12-vc-PAB-exatecan S6e(9.7mg,1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.69mg,1.2eq)和EDCI(1.2mg,1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-S-SG-PEG12-vc-PAB-exatecan S7e。随后加入溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的P3-Ac(10.5mg,1eq)，加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-exatecan P6e(10.6mg,57％)。HRMS,计算值C170H244FN40O47S3[M+H]+3712.7073,[M+3H]3+1238.5756,实测值1238.6293。
通用操作11
R1-Fc-S-W1-W2-X-Y1-Y2-Z(P6，化合物6)或R1-Fc-W1-X-L1(P7，化合物7)的通用合成方法二(route 2)
在NHS-W2-X-Y1-Y2-Z S5(1.2eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入P5(1eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，加入0.2M PB(pH 7.4)溶液，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体R1-Fc-W1-W2-X-Y1-Y2-Z P6。
在HOOC-X-L1 S10(1.2eq)的DMF溶液中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.2eq)和EDCI(1.2eq)，室温下反应30分钟至4小时，原位生成NHS-X-L1 S11(1.2eq)。
在NHS-X-L1 S11(1.2eq)的溶液中加入P5(1eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，加入0.2M PB(pH 7.4)溶液，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体R1-Fc-W1-X-L1 P7。
实施例28
Ac-Fc-S-Az的合成方法
在Az-NHS(2.0mg，2eq)的DMF溶液中，加入P5-Ac(10.9mg，1eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，随后加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，收集目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-S-Az P6b(9.7mg,86％)。HRMS,计算值C97H139N34O24S3[M+H]+2260.9858，实测值2261.0347。
实施例29
Ac-Fc-S-SG-vc-PAB-MMAE的合成方法
将NHS-SG-vc-PAB-MMAE S5a(8.0mg，1.2eq)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，随后加入P5-Ac(10.9mg，1eq)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，随后加入pH 7.4的0.2M PB溶液、使DMF:PB溶液＝1:1，室温下搅拌30分钟-4小时。经半制备HPLC纯化，目标产物并冻干得到白色固体Ac-Fc-SG-vc-PAB-MMAE P7a(12.8mg,64％)。HRMS，计算值C158H235N41O37S3[M+H]+3996.0558，[M+3H]3+1132.5721，实测值1133.5587。
通用操作12
ADC的偶联方法
在50mM pH 7.2醋酸钠溶液或pH 7.4PB溶液或pH 5.5PIPES等其他缓冲体系)加入20％体积的DMF，随后加入靶向TROP2的Ab抗体(终浓度为5mg/mL)和Ac-Fc-S-linker-payload(1-20eq)，将反应体系置于37摄氏度下孵育2-4小时。取样经EndoS或EndoS2酶切除不均一糖型后，由ESI-TOF-MS监测反应终点。随后经Protein-A纯化、30kd或50kd超滤管浓缩和PBS溶液溶剂置换，获得预期的K248赖氨酸抗体偶联物ADC-1-9(式III或式IV)。
实施例30
Ab-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
取Fc结合肽连接子Ac-Fc-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE P7b(10.0mg)溶于250uL DMF，配成10mM母液。反应体系为含20％ DMF的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与抗体(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得目标ADC。
ADC的偶联后修饰
通用操作13
Click反应方法，如下所示：
取携带L2生物正交官能团的药物-连接子L2-X-Y1-Y2-Z2(10-20eq)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，配成10mM母液。在50mM PB，pH 7.5的PB溶液中，分别加入携带L2生物正交官能团的药物-连接子L2-X-Y1-Y2-Z2与携带L1生物正交官能团的抗体偶联物ADC-W2-X(L1)-Y1-Y2-Z1(式III，1eq)或ADC-W2-L1(式IV，1eq)，使药物-连接子终浓度为0.3-0.6mM、抗体偶联物的终浓度为5mg/mL，37℃下孵育2-4h。取样经MS分析显示约偶联2个药物-连接子。经protein A亲和柱纯化、30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得偶联后click反应修饰的抗体偶联物ADC-W2-X(L1-L2-X-Y1-Y2-Z2)-Y1-Y2-Z1(式V)或ADC-W2-L1 L2-X-Y1-Y2-Z2(式VI)。
实施例31
Ab-PEG8-Az-DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
将DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE溶于DMF配成10mM母液。在50mM PB，pH 7.5的PB溶液中分别加入药物-连接子DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE(0.334mM，10eq)与Ab-PEG8-Az的PBS溶液(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得目标Ab-SG-Lys(N3-DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE)-PEG12-vc-PAB-MMAE。
实施例32
Ab-SG-Lys(N3-DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE)-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
将DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE溶于DMF配成10mM母液。反应体系为含20％DMF的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与Ab-SG-Lys(N3)-PEG12-vc-PAB-MMAE的PBS溶液(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得目标Ab-SG-Lys(N3-DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE)-PEG12-vc-PAB-MMAE。
实施例33
Ab-SG-Lys(N3-DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F)-PEG12-vc-PAB-MMAE的合成方法
将DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F溶于DMF配成10mM母液。反应体系为含20％DMF的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与抗体(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得目标ADC化合物Ab-SG-Lys(N3-DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F)-PEG12-vc-PAB-MMAE。
通用操作14
抗体的去糖基化方法，如下所示：
取5mg/ml裸抗或经Fc结合肽偶联修饰的ADC(式III或式IV或式V或式VI)10ul，加入1ul浓度在的Endo S2酶，在37℃下孵10-15min，得到去糖基化的裸抗或ADC(式VII或式VIII或式IX或式X)。质谱检测抗体的Asn297的不均一糖型已脱除。
糖定点偶联的方法，如下所示：
/>
二糖衍生物溶于ddH2O:DMF＝1:1溶液配成20mM母液，加入2-氯-1,3-二甲基氯化咪唑啉(DMC)(终浓度为300mM)与三乙胺(Et3N)(终浓度为900mM)，混匀后置于冰上，反应2h，原位获得二糖噁唑啉中间体。在50mM、pH＝7.0的PB溶液中加入足量的二糖噁唑啉中间体(5eq)，用0.1-1M盐酸调节的pH为7.0左右，随后加入裸抗或经Fc结合肽偶联修饰的ADC(式III或式IV或式V或式VI)，使二糖噁唑啉中间体终浓度为1mM、抗体的终浓度为5mg/mL，37℃下孵育2h，经protein A亲和柱纯化、30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得糖定点偶联抗体。
赖氨酸随机偶联方法
在裸抗或经Fc结合肽偶联修饰的ADC(式III或式IV或式V或式VI)的PBS溶液中加入药物-连接子NHS-W2XY1Y2Z3的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液(2eq)，使药物-连接子的终浓度为0.4mM、抗体的终浓度为5mg/mL，25℃下孵育1-2h。加入Endo S或Endo S2酶去糖基化，通过LC-MS监测反应。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得赖氨酸随机偶联的ADC产物。
半胱氨酸随机偶联方法
W3选自以下基团：
n1＝0-36；在抗体(1.0eq)的PBS
溶液中加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)(2.5eq)，37℃反应2h，随后加入药物-连接子MC-VC-PAB-MMAE的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，使药物-连接子的终浓度为0.5mM、抗体的终浓度为5mg/mL，37℃继续反应2h。protein A亲和柱纯化、30kd或50kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得半胱氨酸随机偶联的ADC产物。
实施例34
自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A的制备：
参考Immunomedics公司anti-Trop2抗体专利序列(CN100360567C)，对抗体重链和抗体轻链序列分别进行密码子优化，原始质粒为pcDNA3.1(+)，质粒构建委托南京金斯瑞公司完成。将质粒瞬时转染入HEK293F表达体系，恒温培养箱中培养收获细胞，离心得上清液提取分泌蛋白。经过Protein A纯化、50kDa超滤浓缩等步骤(如图12所示)，获得自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A，并且通过SDS-PAGE与LC-MS对抗体初步确证(如图13)。SDS-PAGE胶图结果显示，在抗体加热变性后，产生大小为50kDa左右的重链和25kDa左右的轻链，且无杂带，说明抗体纯度良好，符合预期。使用EndoS2酶对Sac-A进行切糖后，经LC-MS检测解析得抗体具体分子量为146009.70，与预期分子量接近，可初步确定已经获得足够纯度的目标抗体。
制备自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A所用的材料和仪器如下：InvitrogenHEK293F细胞、FBS购自Gibco公司；OPM-293CD05 Medium培养基购自奥浦迈；anti-TROP2抗体Sac-A重链及轻链质粒购自南京金斯瑞公司；PEI转染试剂购自李记生物；细胞计数腔室载玻片购自Thermo Fisher Scientific。
全自动细胞计数仪(Invitrogen Countess 3，赛默飞)，二氧化碳培养箱(ZCZY-AN，上海知楚)，二氧化碳培养箱(371，赛默飞)，无菌超净台(ClassⅡ，LABGARD)，高速冷冻离心机(Sorvall ST 8R，赛默飞)，纯水仪(Pall Cascada 2.1，德国波尔)。
anti-TROP2抗体Sac-A轻链质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体序列为：
GGATCCgccaccATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCTACAGGCGTGCACAGCGATATCCAGCTGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGTCTATCACCTGTAAAGCCTCTCAGGACGTGTCCATCGCCGTCGCTTGGTATCAGCAAAAACCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCTCCTACCGGTACACCGGAGTGCCTGATAGATTCAGCGGCAGCGGATCTGGCACAGATTTCACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGCACTACATCACACCTCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCATCTGTTTTCATTTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTCAACAACTTCTACCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTCGACAACGCCCTGCAGTCTGGAAATAGCCAGGAGAGCGTGACAGAACAGGATAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCAAAGGCTGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAAGTGACCCATCAGGGCCTGAGCTCTCCAGTGACCAAATCTTTTAACAGAGGCGAGTGC tgaGCGGCCGC，
anti-TROP2抗体Sac-A重链质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体序列为：
GGATCCgccaccATGGGATGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACAGCTACAGGAGTGCATTCTGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCTCTGAGCTGAAGAAGCCCGGCGCTAGCGTGAAAGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGGTACACATTCACCAACTACGGCATGAACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGCCAGGGCCTTAAATGGATGGGCTGGATCAACACATACACCGGCGAGCCCACCTACACTGATGACTTCAAGGGCAGATTCGCCTTCTCTCTCGATACCTCTGTGTCCACCGCCTACCTGCAGATCAGCAGCCTGAAAGCTGATGATACCGCTGTGTACTTCTGCGCCAGAGGCGGATTCGGCAGCAGCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCTCCCTGGTTACCGTGTCTAGCGCCTCCACCAAGGGCCCTTCTGTCTTTCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCACCAGCGGAGGAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTGGTGGAACAGCGGCGCCCTGACATCTGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTGCAAAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCTTCCGTAGTGACAGTGCCTTCTAGCTCCCTGGGCACCCAAACATACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCCAGCAATACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACACACACCTGCCCCCCATGTCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAACCCAAGGACACCCTGATGATTAGCAGAACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAAGTGAAATTCAACTGGTATGTGGATGGCGTTGAGGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTATAGAGTGGTGTCTGTCCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTCCCAGCCCCTATCGAGAAGACCATCTCAAAGGCTAAGGGCCAGCCTCGGGAACCCCAGGTGTATACCCTGCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAAAACCAGGTCAGCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTTTACCCCTCTGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAACCTGAGAACAATTACAAGACCACACCTCCAATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGACCCTGAGCCTGAGCCCTG GAAAGtgaGCGGCCGC。
制备自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A的具体步骤如下：
(1)悬浮细胞复苏：预先将原始培养基预热至37℃。从液氮中取出HEK293F细胞冻存管，置37℃水浴中解冻，75％的酒精擦拭冻存管外壁。将冻存管中的细胞移至含6ml完全培养基的15ml离心管中，800rpm离心5min。弃上清，沉淀用完全培养基重悬，接种25ml无菌三角摇瓶，于37℃，120rpm，5％CO2细胞培养箱中培养。
(2)悬浮细胞传代:检测细胞活率，达到90％以上可进行细胞传代。直接将细胞悬液分到含培养基的摇瓶中，密度为0.5×106cells/mL左右。
(3)质粒转染：细胞密度为3～4×106cells/mL，活率≥95％。转染前一天，提前将细胞稀释密度至0.8～1.0×106cells/mL接种，细胞过夜生长。第二天，计数得细胞密度和活率。细胞密度为1.0×106cells/mL左右，细胞活率≥95％。
用293培养基稀释质粒，质粒总量：细胞总数＝1mg：106，质粒重链：质粒轻链质量比为1:3混合。翻转以充分混匀。同样用293培养基稀释PEI，PEI：质粒总量＝3ul：1ug。迅速将稀释后的PEI加到稀释后的质粒DNA中。颠倒试管混合。将混合物在室温下静置约15min。将混合物缓慢添加细胞液中，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。37℃，120rpm，5％CO2细胞培养箱中培养。在转染后16小时向摇瓶中添加5％(v/v)293-ProFeed。检测细胞活率，低于60％时收获细胞。
(4)抗体纯化：用洗杂缓冲液(0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH7.0)平衡层析柱。将样品加到平衡好的Protein A层析柱中。用洗杂缓冲液Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。用洗脱缓冲液清洗，分管收集洗脱液，并及时加入中和液(1M Tris-HCl，pH 8.5)调至中性。用Bradford蛋白浓度检测液先预测含有蛋白的洗脱液，SDS-PAGE检测。将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分)利用SDS-PAGE进行检测，判断纯化效果。
(5)超滤置换及浓缩：使用50kDa超滤管进行蛋白缓冲液置换以及浓缩，多次离心，离心条件为4000rpm，4℃，20min。获得蛋白保存于-20℃。
获得的自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体的，轻链氨基酸序列为：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC，
重链氨基酸序列为：
QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVWWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKTLSLSPGKG。
蛋白Sac-A的表征方法如下：
所用到的材料与仪器如下：
AdvanceBio RP-mAb C4 2.5x50mm,3.5micro购自安捷伦，考马斯亮蓝快速染色液购自碧云天，30％丙稀酰胺(W/V)、Tris-HCl、SDS、过硫酸铵、TEMED等购自泰坦。
LC-MS质谱仪(Agilent 6545 LC-TOF，Agilent)，电泳仪(Powerpac Basic，BIO-RAD)，全自动数码凝胶图像分析系统(Tanon 3500，上海天能)，
表征方法具体包括：
抗体质谱检测：所有样品均用Endo S2酶去糖基化。使用Agilent 6545 LC-TOF MS质谱仪测量大分子的数据。使用Agilent生物确认软件获得去卷积质量数。
SDS-PAGE：配10％分离胶，灌胶。凝固后，加入浓缩胶。待完全凝固，加电泳液后上样。加样完毕，电泳开始，电压控制在100V，20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压控制在200V，电泳过程保持电压稳定。电泳结束后，取出胶，染色10min，弃去染色液，水洗至蛋白质带清晰。在Tanon 3500拍照留存。
实施例35
ADC-1至ADC-9的制备
采用的实验材料与仪器如下：
自主合成的(Ac-Fc-S-Az P6b，Ac-Fc-S-SG-PEG8-N3 P7a，Ac-Fc-S-SG-vc-PAB-MMAE，Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE P7b，Ac-Fc-S-SG-PEG12-Lys(Az)-vc-PAB-MMAEP7c)，自主合成的linker-payload(BCN-vc-PAB-MMAE，DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE，DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F)，自主表达的抗体Sac-A和酶Endo S2。超滤管购自国药集团(50Kda，Millipore)。
电热恒温培养箱(HPX-9162MBE，上海博迅)，离心机(ST8R，Thermo)，离心机(Legend Micro 21R，Thermo)，超纯水系统(Milli-Q IQ 7005，Merck)。
具体制备方法如下：
基于Fc亲和肽的定点偶联：
取Fc结合肽连接子Ac-Fc-S-N3(5.6mg)、Ac-Fc-S-SG-PEG8-N3 P7a(6.7mg)、Ac-Fc-S-SG-vc-PAB-MMAE(8.5mg)、Ac-Fc-S-SG-PEG12-vc-PAB-MMAE P7b(10.0mg)、Ac-Fc-S-SG-PEG12-Lys(Az)-vc-PAB-MMAE P7c(10.5mg)分别溶于250uL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，配成10mM母液。反应体系为含20％ N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与抗体(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，30kd超滤管浓缩、置换PBS溶液进一步去除小分子残留后获得目标中间体ADC-1、中间体ADC-2、一步法产物ADC-5、一步法产物ADC-6与中间体ADC-7反应液。对反应液取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。对一步法产物ADC-5、一步法产物ADC-6反应液过protein-A亲和柱纯化，50Kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得浓度目标产物ADC-5和ADC-6，以及目标中间体ADC-1、ADC-2、ADC-7，保存于-20摄氏度。
偶联后修饰：
将BCN-vc-PAB-MMAE S14a溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配成10mM母液。反应体系为含20％N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与抗体中间体ADC-1(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，50Kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得目标ADC-3。
将DBCO-PEG12-vc-PAB-MMAE S14c溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配成10mM母液。反应体系为含20％N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与抗体中间体ADC-2或者中间体ADC-7(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入Endo S或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，50Kd超滤管浓缩和置换PBS溶液后获得目标ADC-4或ADC-9。
将DBCO-PEG12-vc-PAB-PARPi-F S14d溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配成10mM母液。反应体系为含20％N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的50mM醋酸钠(pH＝7.2)，分别加入药物-连接子(0.334mM，10eq)与抗体中间体ADC-7(5mg/mL，1eq)，37℃下反应2h。取样10uL、加入EndoS或Endo S2酶切除不均一糖型后，由LC-MS监测反应完成。反应混合物过protein-A亲和柱纯化，50Kd超滤管浓缩和换PBS溶液后获得目标ADC-8。
ADC-1至ADC-9的结构示意图和质谱数据图分别如图14-22所示。
ADC-1至ADC-9的性能分析
(1)疏水相互作用色谱(HIC，Hydrophobic interaction chromatography)检测DAR值
使用的实验材料与仪器如下：
K2HPO4，(NH4)2SO4，KH2PO4购自毕得医药；AdvanceBio HIC,4.6x 100mm,3.5μm购自安捷伦。高效液相色谱仪(LC-20ADXR，岛津)，超纯水系统(Milli-Q IQ 7005，Merck)。
具体实验方法如下：
流动相配制：取4.4g K2HPO4与198.2g(NH4)2SO4溶于1L H2O，加入5％(V/V)异丙醇，为A相；取2.5g K2HPO4与1.6g KH2PO4溶于1L H2O，加入20％(V/V)异丙醇，为B相。
检测条件：按表1设置流动相梯度；进样量20μg；检测UV为280nm。
表1流动相梯度设置
ADC-3、ADC-5的疏水相互作用色谱图分别如图23中的(a)、(b)所示。由图15可知，ADC-3DAR2的两步法定点偶联产物和ADC-5DAR2的一步法定点偶联产物具有相近的保留时间，说明两种偶联策略的ADC产物亲水性相近；比较峰型，ADC-3的有1个主峰和2个较大的次峰，ADC-5仅有1个主峰、2个小峰，说明ADC-5的均质性相较于ADC-3更好。可能受偶联位点位阻有关，当定点偶联的linker-payload较小时，ADC-3的位点特异性相较于ADC-5略有下降。
(2)尺寸排阻色谱(SEC，size exclusion chromatography)检测聚集稳定性使用的实验材料与仪器如下：
Agilent Bio SEC-5 7.8x300mm,5μm购自安捷伦，20×PBS溶液购自生工。PCR仪(T100 Thermal Cycler，BIO-RAD)，高效液相色谱仪(LC-20ADXR，岛津)，超纯水系统(Milli-Q IQ 7005，Merck)。
具体实验方法如下：
取待测ADC稀释浓度为1mg/mL，在PCR仪中60℃加热48小时。使用SEC柱分析，HPLC溶液体系为1×PBS，梯度不变，设置程序时间为20min，柱温设置为室温。
ADC-3、ADC-5的尺寸排阻色谱(size exclusion chromatography,SEC)分析数据如图24所示。在60℃加热48小时诱导聚集条件下，ADC-3和ADC-5均没有明显的降解或聚集，说明一步法或两步法的定点偶联策略的ADC产物聚集稳定性均良好。
(3)细胞活性检测
使用的实验材料与仪器如下：
NCI-N87、BXPC-3、Fadu、Calu-6购自普诺赛，Capan-1、SK-BR-3由上海实验室提供，HCI-441、HCC-1806购自浙江美森细胞技术。MEM培养基与青霉素-链霉素溶液(双抗)购自普诺赛，Fetal Bovine Serum购自Gibco。cck-8试剂盒购自YEASEN。
酶标仪(SpectraMax Plus 384，美谷分子)。
具体实验方法如下：
细胞铺板：将待测细胞按6000个细胞/孔接种到96孔板中，过夜培养。
药物稀释：按照实验需要，最高浓度100nM开始5倍稀释，稀释9个梯度。依次加药，样品设置3复孔。如图25所示。最外圈为PBS；B11,C11,D11为阴性对照，加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔；E11,F11,G11为空白对照，加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞和药物的孔。
药物作用144小时后，弃去原来培养液，每孔加入预先混合的含有10ul CCK-8的培养基溶液。在细胞培养箱内继续孵育3-4小时，在450nm测定吸光度。
ADC-3、ADC-5的体外抗肿瘤活性(CCK8)如图19所示。在TROP2阳性的BXPC-3、NCI-N87、HCC-1806、HCI-441、FADU五种细胞模型中，ADC-3DAR2的两步法定点偶联产物和ADC-5DAR2的一步法定点偶联产物具有相似的抗肿瘤活性，说明两种偶联策略的ADC经靶细胞内吞后，均能够有效释放载荷并发挥细胞毒的作用。在TROP2阴性的Calu-6细胞模型中，ADC-3、ADC-5不具有抗肿瘤活性，说明抗肿瘤活性的发挥依赖于抗体的靶向识别，定点偶联ADC均可有效区分TROP2阳性和TROP2阴性细胞，定点偶联策略不影响抗体部分的靶点识别。
ADC-3、ADC-5的IC50计算结果统计(nmol/L)如表2所示。
表2 ADC-3、ADC-5的IC50计算结果统计(nmol/L)
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ADC-4、ADC-6、ADC-7、ADC-8、ADC-9的体外抗肿瘤活性(CCK8)如图26所示。在TROP2阳性、BRCA突变的HCC-1806细胞株中，MMAE DAR4的ADC-9相较于不同策略合成MMAE DAR2的ADC-4、ADC-6、ADC-7和ADC-8，抗肿瘤活性显著增强，说明对提高DAR值对未知原因耐药的细胞株可增强抗肿瘤活性。在MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-468的三种BRCA突变的细胞株中，被测ADC的抗肿瘤活性无显著差异，但相较于图19中ADC的抗肿瘤活性下降，说明肿瘤细胞株BRCA突变是靶向TROP2的ADC耐药的潜在原因，有待进一步证实。
ADC-4、ADC-6、ADC-7、ADC-8、ADC-9的IC50计算结果统计(nmol/L)如表3所示。
表3 ADC-4、ADC-6、ADC-7、ADC-8、ADC-9的IC50计算结果统计(nmol/L)
ADC-5(DAR＝2)、半胱氨酸随机偶联ADC(DAR＝4)的体内抗肿瘤活性如图27所示。说明在TROP2阳性的NCI-N87、HCC-1806、FADU三种小鼠异种移植瘤模型中，ADC-5DAR2的定点偶联产物具有和Cys-ADC DAR4的随机偶联产物相当的体内抗肿瘤活性，同样给药剂量下肿瘤缓解时间更长。说明在定点偶联的前提下MMAE DAR2即能实现较好的抗肿瘤效果，有望减少高DAR值引起的ADC体内稳定性不佳问题、优化药代动力学性质，减少脱靶毒性。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种Fc结合肽偶联物，其特征在于，其结构如式(I)或式(II)所示：
R1选自以下基团：
W1选自以下基团：
W2选自以下基团：
X或XL选自以下基团：
Y1选自以下基团：
Y2选自以下基团：
L或L1为生物正交官能团，选自以下基团：
Z为药物活性成分；
以上，代表连接位点。
2.根据权利要求1所述的Fc结合肽偶联物，其特征在于，所述的Fc结合肽偶联物选自以下化合物：
3.根据权利要求1所述的Fc结合肽偶联物，其特征在于，所述的药物活性成分为小分子毒素、PARP抑制剂、ATM抑制剂、免疫激动剂或荧光基团。
4.根据权利要求1或3所述的Fc结合肽偶联物，其特征在于，所述的Z选自美登素、一甲基澳瑞他汀E、一甲基澳瑞他汀F、一甲基澳瑞他汀D、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷、喜树碱、DXd、7-乙基-10-羟基喜树碱、依喜替康、托泊替康、吡咯并苯并二氮杂卓二聚体、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多订、艾榴塞洛素、奥拉帕尼衍生物、AZD5305衍生物、AZD1390衍生物、吡咯并嘧啶骨架的免疫激动剂、香豆素、BODIPY、Cy7、Biotin。
5.一种靶向TROP2的定点偶联ADC，其特征在于，如式(III)或式(IV)所示：
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、X、XL、Y1、Y2、L、Z的定义分别与权利要求1-5任一项中相应定义相同。
6.根据权利要求5所述的靶向TROP2的定点偶联ADC，其特征在于，靶向TROP2的抗体选自自主表达的靶向TROP2的蛋白Sac-A，或商业化的靶向TROP2的蛋白Sacituzumab、Datopotamab；
自主表达靶向TROP2的蛋白Sac-A轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求5所述的靶向TROP2的定点偶联ADC，其特征在于，所述的靶向TROP2的定点偶联ADC选自以下化合物：
8.一种如权利要求5-7任一项所述靶向TROP2的定点偶联ADC的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1的如式(I)或式(II)所示的Fc结合肽偶联物与靶向TROP2的裸抗进行反应，生成如式(III)或式(IV)所示的靶向TROP2的定点偶联ADC。
9.一种靶向TROP2的翻译后修饰定点偶联ADC，其特征在于，如式(V)或式(VI)所示：
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、Y1、Y2的定义分别与权利要求1中相应的定义相同；
Z、Z1、Z2独立地为药物活性成分；
L1和L2是一对生物正交官能团，当L1＝La时，L2＝Lb；当L1＝Lb时，L2＝La：
m1、n3＝0-36；
X、X1、X2独立地选自以下基团：
/>
其中m、n2＝0-36；
以上，代表连接位点。
10.根据权利要求9所述的翻译后修饰定点偶联ADC，其特征在于，选自以下化合物：
/>
/>
11.一种切除不均一糖链的靶向TROP2的定点偶联ADC，其特征在于，如式(VII)、式(VIII)、式(IX)或式(X)所示：
VII、VIII、IX或X
式(VII)、式(VIII)、式(IX)和式(X)中，-R'分别为-W2XY1Y2Z、-(X)L、-W2X1(L1L2X2Y1Y2Z2)Y1Y2Z1和-L1L2 X Y1Y2Z；
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、X、X1、X2、Y1、Y2、L、L1、L2、Z、Z1、Z2的定义分别与权利要求9中的相应定义相同。
12.一种双偶联策略的抗体-药物偶联物，其特征在于，如式(XI)、式(XII)或式(XIII)所示：
式(XI)、式(XII)或式(XIII)中，-R'为-W2XY1Y2Z、-(X)L、-W2X1(L1L2 X 2Y1Y2Z2)Y1Y2Z1或-L1L2 X Y1Y2Z；
其中，抗体为靶向TROP2的抗体；
W2、X、X1、X2、Y1、Y2、L、L1、L2、Z、Z1、Z2的定义分别与权利要求9中的相应定义相同，Z3为药物活性成分；
W3选自以下基团：
13.一种如权利要求5、9、11、12任一项所述的式(III)-式(XIII)所示的化合物在制备用于抗肿瘤治疗的药物、免疫治疗的药物、放射增敏剂、肿瘤靶标检测试剂或体内外诊断试剂中的应用。
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