NO175622B

NO175622B -

Info

Publication number: NO175622B
Application number: NO903144A
Authority: NO
Priority date: 1988-01-15
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1994-08-01
Also published as: NO903144L; NO903144D0; EP0401232B1; AU2944789A; DE68907718D1; EP0401232A1; NO175622C; DE68907718T2; FI93796B; FI903575A0; WO1989006547A1; DK18288D0; FI93796C

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for pasteurisering av vandige oppløsninger av koagulasjonsfaktor VIII, spesielt human faktor VIII. Formålet med oppfinnelsen er å fjerne eller inaktivere infeksiøst virus som kan forekomme i preparater inneholdende koagulasjonsfaktor VIII. Et spesielt formål med oppfinnelsen er å foreta varmebehandling av vandige oppløsninger av faktor VIII under betingelser hvor eventuelt forekommende virus med sikkerhet er inaktivert, mens det oppnås høy gjenvinning av det terapeutiske protein human koagulasjonsfaktor VIII.

Den humane koagulasjonsfaktor VIII (heretter kalt faktor VIII), også kalt antihemofilifaktor (AHF), utgjør en del av blodets koagulasjonssystem. Faktor VIII må foreligge for at koagulering skal inntre. Mennesker som helt eller delvis har mistet evnen til å syntetisere faktor VIII lider av sykdommen hemofili A som er en medfødt sykdom. Sykdommen kjennetegnes ved hyppige blødninger, spesielt i leddene og i muskulaturen.

Det er derfor nødvendig å tilføre personer som har faktor VIII mangel preparater som inneholder faktor VIII. En slik substitusjonsbehandling av hemofili A pasienter ble startet i Europa i 1965. Denne substitusjonsbehandling har resultert i en betydelig økning av den gjennomsnittlige livslengde for hemofili A pasienter. Den gjennomsnittlige livslengde for hemofili A pasienter har således i Sverige øket fra 16 år i 1948 til ca. 56 år i 1978. Substitusjonsbehandling har dessuten forårsaket en reduksjon i antallet invalidiserende blødninger hos hemofili A pasienter og således forbedret pasientenes evne til å forsørge seg selv og forbedret deres livsbetingelser.

Preparater som inneholder faktor VIII fremstilles fra humant blod eller blodplasma. Forskjellige fremgangsmåter for denne produksjon er kjent. For samtlige er den første del av prosessen den samme. Blod fra doner kan tappes på et posesystem som inneholder antikoagulant. Antikoagulanten kan være citrat-fosfat-dekstrose (CPD), sur citratdekstrose (ACD) eller heparin. Blodplasmaet adskilles fra de øvrige komponenter ved sentrifugering. Denne separasjon kan også skje under den aktuelle tapping av donoren ved såkalt plasmaferese. Blodplasmaet lagres i dypfryst tilstand. Det dypfryste blodplasma tines, og det foretas en såkalt kryopresipitasjon. Det resulterende kryopresipitat inneholder faktor VIII og danner utgangspunktet for den videre produksjon.

Denne kan foretas på kjent måte ved å benytte utfellingsteknikk for å fjerne uønsket proteinmateriale. Utfelling av dette proteinmaterialet kan for eksempel skje ved tilsetning av etanol (Mattock et al., Europeisk patentsøknad nr. 0 062 456, 1982), av polyetylenglykol (Sarno et al., Europeisk patentsøknad nr. 0 221 556, 1987) eller glycin (Mitra et al., Europeisk patentsøknad nr. 0 126 789, 1984). Andre kjente fremgangsmåter for å fjerne uønsket proteinmateriale fra oppløsninger inneholdende faktor VIII omfatter bruk av kromatografisk teknikk (for eksempel som beskrevet av Chavin et al., Europeisk patentsøknad nr.

0 104 356, 1984).

Det er dessuten kjent at bruk av blodplasma produsert med heparin som antikoagulant, såkalt heparinisert blodplasma, kan øke gjenvinningen av faktor VIII i kryopresipitatet (Rock et al., Europeisk patentsøknad nr. 0 053 046, 1982). Heparin utgjør en gruppe av sulfaterte polysakkarider som har en molekylvekt på 5000 til 40.000, typisk fra 15.000 til 25.000, og har en antikoagulerende effekt i blodplasma. Selv om heparin kan øke gjenvinningen av faktor VIII, har ikke heparin utstrakt anvendelse som antikoagulant fordi dette hindrer bruk av en rekke av de øvrige komponenter i blodet til terapeutiske formål.

Heparin har en antikoagulerende effekt i blod eller blodplasma. Heparin som sådant hemmer delvis trombin og tjener tildels som katalysator ved dannelse av et trombin-antitrombin III-kompleks. Trombin er ett av de proteinene som kan spalte faktor VIII molekylet i fragmenter. Faktor VIII er en viktig koagulasjonsfaktor i blodets koagulasjonssystem. Aktivering av faktor VIII forårsaker spaltning av faktor VIII molekylet i fragmenter. Denne aktivering forårsakes enten av aktivert faktor X, aktivert protein C eller trombin, hvorav sistnevnte er den viktigste. Tilsetning av heparin påvirker således det naturlige koagulasjonssystem og stabiliserer følgelig faktor

VIII.

Heparin påvirker ikke innholdet av frie kalsiumioner i blod eller blodplasma som inneholder faktor VIII. Dette i motsetning til citrat eller citrat-holdige antikoagulanter, så som citrat-fosfat-dekstrose (CPD), hvor det forekommende citrat tjener som en chelatdanner og danner et kompleks med kalsium. Siden nærvær av kalsium har betydning for stabiliteten av faktor VIII, kan heparin som antikoagulant bidra til å forbedre stabiliteten av faktor VIII.

Stabilisering av faktor VIII med heparin i heparinisert blodplasma skjer delvis ved å hemme trombin, som nedbryter faktor VIII, og delvis ved å ikke endre nærværet av kaliumioner.

Faktor VIII preparater kan fremstilles fra heparinisert plasma med høyere gjenvinning av faktor VIII aktivitet i kryopresipitatet (Smit-Sibinga et al., Lancet, ii, 449, 1981). Grunnen til dette er delvis at heparin stabiliserer faktor VIII i plasmaet, delvis at heparin øker utfellingen av faktor VIII ved kryopresipitasjonen.

For å oppnå høyere gjenvinning av faktor VIII i kryopresipitatet, er det viktig at plasmaet hepariniseres under blodgivningen. Senere tilsetning av heparin til blodplasmaet fremstillet med citratholdig antikoagulant, fører ikke til en øket gjenvinning av faktor VIII i kryopresipitatet (Mikaelson et al., Blood, Vol. 62, No. 5, 1983, s. 1006). Tilsetning av heparin under fremstillingen av preparater som inneholder faktor VIII etter eller under gjenoppløsning av kryopresipitatet, forbedrer heller ikke gjenvinningen av faktor VIII. Effekten av heparin avhenger således av heparintilsetning i forbindelse med blodgivningen. På den annen side kan tilsetning av både heparin og kalsium til citratholdig blodplasma eller fraksjoner, resultere i en øket gjenvinning av faktor VIII.

Et alvorlig problem ved den terapeutiske anvendelse av preparater eller fraksjoner fremstillet fra humant blod eller blodplasma, er at blodet eller blodplasmaet kan inneholde infeksiøst virus. Eksempler på slikt infeksiøst virus er hepatitt B-virus, hepatitt ikké-A-ikke-B-virus og human immunodefisient-virus. Overføring av infeksiøst virus er kjent ikke bare fra bruk av preparater som inneholder faktor VIII, men generelt fra bruk av preparater fremstillet fra humant blod eller blodplasma. Eksempler på slike preparater er koagulasjonsfaktor IX, koagulasjonsfaktor XIII, immunoglobulin, antitrombin III. Forskjellige fremgangsmåter for å fjerne infeksiøst virus fra terapeutiske preparater eller oppløsninger som inneholder disse fra humant blod eller blod er kjent. Slike kjente fremgangsmåter består i oppvarming av vandige oppløsninger som inneholder terapeutisk protein i 10 timer ved 60°C, hvilket gir sikkerhet mot overføring av infeksiøst virus når preparater som inneholder disse plasmaproteiner benyttes. For å unngå denaturering eller annen skade på det terapeutisk aktive protein i den vandige oppløsning, er det imidlertid nødvendig å tilsette stabilisatorer under varmebehandlingen.

Salter av fettsyrer eller aminosyrer tilsettes derfor gjerne som stabilisatorer ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C av oppløsninger som inneholder humant albumin eller proteinkonsentrat (Gellis at el., J. Clin. Invest., 27, 239,

(1948)). Bruken av denne fremgangsmåte for behandling av humant albumin eller proteinkonsentrat har medført at infeksiøst virus ikke er blitt overført ved bruk av disse preparater siden prosessen ble innført i 1948. Ved disse prosesser forekommer intet eller kun ubetydelig tap av det terapeutiske plasmaprotein albumin.

Oppløsninger som inneholder plasminogen kan stabiliseres med aminosyren lysin under varmebehandling til 60°C i 10 timer (Baumgarten et al., USA-patent nr. 3 227 626, 1966). Ifølge dette patent ødelegger denne prosessen forekommende hepatitt-virus.

Oppløsninger som inneholder koagulasjonsfaktor XIII kan oppvarmes til 60°C i 10 timer i nærvær av aminosyre, monosakkarid eller sukkeralkohol (Fukushima, patent No. Sho 51-134878, 1976). Et tap av faktor XIII aktivitet på ca. 50% har vært angitt for denne prosess.

Dessuten kan oppløsninger som inneholder

proteinasehemmeren antitrombin III, stabiliseres med salter av sitronsyre før oppvarming i 10 timer ved 60°C (Holleman et al., Thromb. & Haemo., 38, 201, (1977)). Tapet av det terapeutiske protein antitrombin III utgjør opp til ca. 30% i denne prosess.

Forskjellige fremgangsmåter for stabilisering av faktor VIII ved varmebehandling i vandige oppløsninger er kjent.

En fremgangsmåte for stabilisering av faktor VIII ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C med en polyol har vært beskrevet (US-patent 4 440 697, 1984). Denne prosess består i tilsetning av for eksempel sakkarose, eventuelt sammen med aminosyren glycin, i en mengde som bevirker at oppløsningen etter tilsetningen inneholder 62 vektprosent sakkarose eller er mettet med sakkarose.

En lignende fremgangsmåte for stabilisering av faktor VIII som likeledes foretas ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C ved bruk av sukkeralkohol eller disakkarid er beskrevet (Europeisk patentsøknad nr. 0 117 064, 1984). Fremgangsmåten består i tilsetning av for eksempel 66 vektprosent sakkarose eller sorbitol som stabilisator under varmebehandlingen.

En fremgangsmåte som benytter en kombinasjon av en nøytral aminosyre, et sakkarid eller en sukkeralkohol og saltet av en karboksylsyre som har fra 3 til 10 karbonatomer, for stabilisering av faktor VIII ved varmebehandling ved 60°C i 10 timer, er kjent (Europeisk patentsøknad nr. 0 077 879, 1983). Humant albumin kan tilsettes som en ytterligere stabilisator. Denne fremgangsmåte består i å tilsette for eksempel 25% vekt/volum glycin og 20% vekt/volum natriumkaprylat som stabilisator.

Dessuten er det kjent en fremgangsmåte for varmebehandling av faktor VIII i 10 timer ved 60°C med samtidig reduksjon av et forurensende fibrinogeninnhold (Tysk offentliggjørelsesskrift nr. 29 16 711, 1980). Stabilisatoren er et sakkarid eller en sukkeralkohol i kombinasjon med en høy konsentrasjon av aminosyre. Aminosyren får fibrinogenet i faktor VIII oppløsningen til å felles ut. Fremgangsmåten består i tilsetning av for eksempel 50 vektprosent sakkarose og 2M glycin til faktor VIII oppløsningen under varmebehandlingen.

Endelig, er det fra GB 2 172 000 kjent å foreta varmebehandling i 10 timer ved 60°C av en oppløsning som i tillegg til faktor VIII, inneholder restmengder av heparin eller andre sulfaterte polysakkarider som ikke er blitt fullstendig fjernet i forutgående rensetrinn. I de foregående undersøkelser viste det seg at nærværet av slike restmengder av heparin ikke hadde noen innflytelse på utbyttet eller gjenvinningen av faktor VIII etter varmebehandlingen (se side 4, linje 6-7 i beskrivelsen av GB 2 172 000).

Det er karakteristisk for tidligere kjente fremgangsmåter for stabilisering av faktor VIII i vandige oppløsninger ved varmebehandling ved 60°C i 10 timer, at gjenvinningen av faktor VIII etter varmebehandlingen er lav. Eksemplene i de ovenfor omtalte patentbeskrivelser angir således følgende gjenvinninger av faktor VIII etter varmebehandling i 10 timer ved 60°C:

Den lave gjenvinning av faktor VIII i tidligere kjente forsøk utgjør en alvorlig svakhet ved disse. Siden preparater av fraksjoner som inneholder faktor VIII fremstilles fra humant blod eller blodplasma fra blodgivere, er dette materialet i høy grad et begrenset råmateriale.

I Danmark benyttes således 20 millioner IU av faktor VIII

(1987) per år, hvilket tilsvarer ca. 400.000 blodgivere. 1 IE (internasjonale enheter) av faktor VIII tilsvarer faktor VIII-aktiviteten av 1 ml normalt plasma. Dessuten er omkostningene ved fremstilling av disse preparatene meget høy og gjenvinningen av faktor VIII aktivitet lav, hvilket gjør at faktor VIII er et meget kostbart protein. Prisen på 1 IE av faktor VIII i et høyt renset faktor VIII preparat er således ca. Dkr. 4 i Danmark. Det årlige forbruk av faktor VIII tilsvarer i Danmark ca. Dkr. 80 millioner. Det er derfor av stor betydning at gjenvinningen av faktor VIII er høy.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på den oppdagelse, at man kan oppnå en vesentlig forøket gjenvinning av faktor VIII, hvis pasteuriseringen gjennomføres på en renset citratholdig oppløsning av faktor VIII, som inneholder heparin som stabilisator i kombinasjon med et sakkarid eller sukkeralkohol. Det er således viktig for oppnåelse av høyt utbytte, det vil si høy gjenvinnelsesgrad, at man som utgangsmateriale anvender en renset citratholdig oppløsning av faktor VIII.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte av den type som er definert i ingressen i krav 1, og er karakterisert ved det innhold som fremgår av definisjonen i den karakteriserende del av kravet. Denne fremgangsmåte hindrer overføring av infeksiøst virus gjennom bruk av preparatet og gir også en høy gjenvinning av faktor VIII.

Fremgangsmåten består i å tilsette oppløsningen av faktor VIII heparin som stabilisator i kombinasjon med et sakkarid eller en sukkeralkohol, og varmebehandlingen foretas på i og for seg kjent måte, fortrinnsvis i 10 timer ved 60°C. Dette fører til en bemerkelsesverdig forbedret gjenvinning av faktor

VIII.

Ved tilsetning av heparin som stabilisator i kombinasjon med et sakkarid eller en sukkeralkohol ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C av en vandig oppløsning inneholdende citrat og faktor VIII, er det kun den hemmende effekt av trombin som er viktig. Denne effekt kan forsterkes ved å binde heparin til von Willebrand-faktor. På grunn av det forekommende citrat, inntrer ingen økning i kalsiumnivået med følgende stabilisering av faktor VIII.

Effekten av tilsetning av heparin ved varmebehandling, kan derved tilskrives et angrep på det naturlige koagulasjonssystem med følgende stabilisering av faktor VIII.

Dette står i kontrast til tidligere kjente tilsetninger ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C av en vandig oppløsning inneholdende faktor VIII. Sakkarider, sukkeralkohol, aminosyrer eller salter av organiske syrer har en stabiliserende effekt ved at disse stabilisatorene påvirker hydratasjonsgraden eller ladningsforskjeller i proteinet.

Fremgangsmåten ved varmebehandlingen i 10 timer ved 60°C av en vandig oppløsning inneholdende faktor VIII med heparin som stabilisator, i kombinasjon med et sakkarid eller en sukkeralkohol, kan foretas på en hvilken som helst fraksjon eller preparat som inneholder faktor VIII.

Et sakkarid eller en sukkeralkohol tilsettes til citrat-oppløsninger inneholdende faktor VIII. Tilsetning av sakkarose utgjør en foretrukket utførelsesform. Stabilisering av faktor VIII øker med økende tilsetning av sakkarid eller sukkeralkohol. Det kan således tilsettes fra 20 vektprosent og opp til metning. I henhold til den foretrukne utførelsesform tilsettes sakkarose tilsvarende 60 vektprosent. Metning av en oppløsning inneholdende faktor VIII med sakkarid eller sukkeralkohol forårsaker dels håndteringsproblemer som følge av den høye viskositet og dels stabilisering av det infeksiøse virus.

Heparin kan tilsettes før eller etter tilsetningen av sakkarid eller sukkeralkohol i mengder tilsvarende fra 1,0 til 4,0 IE heparin per g oppløsning etter tilsetning av sakkarid eller sukkeralkohol. Tilsetning tilsvarende fra 1,5 til 2,5 IE heparin per g oppløsning er foretrukket.

Tilsetning av for store mengder heparin forårsaker utfelling av faktor VIII. Denne utfelling kan påvises ved å måle blakkingen av oppløsningen. Det har herunder vist seg at en økning i blakkingen av oppløsningen kan påvises ved tilsetning av 4,0 IE heparin per g oppløsning. For utfelling av proteiner gjelder det at kjemiske og fysikalske betingelser i oppløsningen, som for eksempel proteinkonsentrasjon, proteinsammensetning, ledningsevne, pH eller saltkonsentrasjon, påvirker utfellingsgraden. Forandringer av for eksempel proteinkonsentrasjon eller proteinsammensetning kan således forårsake forandringer i den heparinkonsentrasjon som gir den høyeste gjenvinning av faktor VIII uten at utfelling i proteinoppløsningen begynner.

For å oppnå maksimalt utbytte, må pH i oppløsningen justeres til et fysiologisk nivå. pH-verdien bør være mellom 6,0 og 7,0, fortrinnsvis 6,2 til 7,0.

Tilsetning av begrensede mengder CaCl2 kan forårsake stabilisering av faktor VIII under varmebehandlingen. Ved foreliggende fremgangsmåte benyttes fra 0 til 150 mM CaCl2 per g ferdig oppløsning.

Fjerning av sakkarid eller sukkeralkohol fra den faktor Vlll-holdige oppløsning etter varmebehandling, kan foretas ved dialyse eller utfelling av faktor VIII fra oppløsningen.

Bestemmelse av faktor VIII aktiviteten kan foretas enten ved en 2-trinns metode eller en 1-trinns metode. Det er kjent at 1- og 2-trinns metodene kan resultere i ulike bestemmelser av faktor VIII aktiviteten i en gitt prøve. Det er dessuten kjent at gjentatte målinger med samme metode på den samme prøve, kan forårsake store variasjoner i bestemmelsen av faktor VIII aktiviteten. Det er også kjent at resultatene av bestemmelsen av faktor VIII aktiviteten kan avhenge av andre proteiner eller andre komponenter som forekommer i den aktuelle prøve.

Bestemmelse av faktor VIII aktiviteten ved en 2-trinns metode foretas ved hjelp av en metode basert på et kromogent substrat (KABI Coatest Factor VIII), hvor den opprinnelige metode i reagensrør ved 37°C er modifisert for utførelse på en mikrotiter-plate med redusert reagensforbruk ved romtemperatur. Det benyttes 50 mikroliter prøve eller standard som etter blanding med 50 mikroliter fosfolipid, faktor IXA og faktor X, oppvarmes i 10 minutter. Etter tilsetning av 25 mikroliter 25 mM CaCl2, foretas inkubering i 15 minutter, hvoretter 50 mikroliter substrat tilsettes.

Etter ytterligere 20 minutters inkubering avbrytes reaksjonen ved tilsetning av 50 mikroliter IM sitronsyre. Farveutviklingen avleses ved 405 nm med 492 nm som referanse.

Bestemmelse av faktor VIII aktiviteten ved 1-trinns

metode foretas ved hjelp av APTT-metoden (Activated Partial Thromboplastin Time). 100 mikroliter prøve eller standard pipetteres over i kyvettene, og deretter tilsettes 100 mikroliter deficient plasma (faktor VIII deficient plasma, General Diagnostic). 100 mikroliter APTT-reagens (General Diagnostic) tilsettes og oppløsningen termostateres ved 37°C i 5 minutter. Etter tilsetning av 100 mikroliter 0,03 M CaCl2, måles tiden inntil koagulering av oppløsningen.

For kvantitative bestemmelser fremstilles

kalibreringskurver basert på fortynningsserier av en intern standard kalibrert mot WHO-standard (3rd Int. Standard of F VIII, human plasma, 3,9 IE/ml). 2-trinns metoden som her er angitt har en lavere påvisningsgrense (ca. 10 ganger) enn 1-trinns metoden. I forbindelse med tilsetning av heparin er det en fordel å benytte 2-trinns metoden i og med at eventuell effekt av heparin lettere kan unngås ved fortynning.

Bestemmelse av blakking foretas ved måling av ekstinksjon ved 400 nm.

Forsøk har således vist at tilsetning av heparin tilsvarende konsentrasjoner fra 1,0 til 4,0 IE heparin per g oppløsning inneholdende faktor VIII, stabilisert med et sakkarid eller en sukkeralkohol under varmebehandlingen, resulterer i en økning i gjenvinningen av faktor VIII.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er illustrert gjennom de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

14 ml citratoppløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) inneholdende 1680 IE faktor VIII) ble fordelt på 7 rør slik at hvert rør inneholdt 2 ml oppløsning. Til hvert rør ble det tilsatt 3 g sakkarose som ble bragt i oppløsning. Heparin-oppløsning (500 IE/ml) ble deretter tilsatt til hvert rør slik at hvert rør inneholdt den heparinmengde som er angitt i

tabellen nedenfor, og ca. 48 IE av faktor VIII ferdig oppløsning. Rørene ble forseglet og varmebehandlet i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII ble bestemt ved 1-trinns metoden og blakkingen av oppløsningen bestemt som ekstinksjonen ved 400 nm.

Eksempel 2

20 ml citratoppløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) inneholdende 6000 IE faktor VIII ble fordelt på 10 rør slik at hvert rør inneholdt 2 ml oppløsning. Hvert rør ble tilsatt 3 g sakkarose som ble bragt i oppløsning. Heparinoppløsningen (500 IE/ml) ble deretter tilsatt til hvert rør slik at hvert enkelt rør inneholdt den heparinmengde som er angitt i

tabellen nedenfor og ca. 120 IE av faktor VIII per g ferdig oppløsning. Rørene ble forseglet og varmebehandlet i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII ble bestemt ved 2-trinns metoden.

Eksempel 3

8 ml citratoppløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) inneholdende ca. 5000 IE av faktor VIII ble fordelt på 4 rør slik at hvert rør inneholdt 2 ml oppløsning. Hvert rør ble tilsatt 3 g sakkarose som ble bragt i oppløsning. Heparinoppløsningen (500 IE/ml) ble deretter tilsatt til 2 rør slik at hvert rør inneholdt en heparinmengde på 2,0 IE per g oppløsning. Rørene ble forseglet og varmebehandlet i 10 timer ved 60°C. Forsøket ble gjentatt på annet prøvemateriale, i alt 5 ganger. Faktor VIII innholdet varierte i disse prøvene fra 220 til 260 IE per g ferdig oppløsning. Faktor VIII ble bestemt ved 2-trinns metoden.

Gjennomsnittlig forbedring for samtlige undersøkelser var 50%.

Eksempel 4

2 ml citratoppløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) inneholdende 600 IE av faktor VIII ble blandet med 3 g sakkarose som ble bragt i oppløsning. Heparinoppløsningen (500 IE/ml) og kalsiumklorid (10"<2>M) ble deretter tilsatt slik at røret inneholdt en heparinmengde på 2,0 IE, 100 mM kalsiumklorid og 120 IE faktor VIII per g oppløsning. Rørene ble forseglet og varmebehandlet i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII ble bestemt ved 2-trinns metoden. Gjenvinningen av faktor VIII var 88%.

Claims

1. Fremgangsmåte for pasteurisering av vandige oppløsninger av faktor VIII ved oppvarming til en temperatur på 55-65°C i et tidsrom på 5-15 timer i nærvær av et sakkarid eller en sukkeralkohol, karakterisert ved at en renset citrat-holdig oppløsning av faktor VIII tilsettes 1-4 IE heparin per g ferdig oppløsning og deretter underkastes varmebehandlingen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den tilsatte heparinmengde utgjør 1,5-2,5 IE per g ferdig oppløsning.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at pH-verdien holdes ved 6,2-7,0 under varmebehandlingen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at faktor VIII innholdet holdes mellom 10 og 300 IE per g ferdig oppløsning.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at mengden av sakkarid eller sukkeralkohol utgjør 50-65 vektprosent beregnet på basis av ferdig oppløsning.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at sakkaridet er sakkarose.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6, karakterisert ved at varmebehandlingen foretas i nærvær av CaCl2 i en mengde som ikke overskrider 150 mM per g ferdig oppløsning.