NO171458B - 3alfa-hydroksysteroid-oksydase, kvantitativ analyse av 3alfa-hydroksysteroid ved bruk derav, og et reagens for denne kvantitative analyse - Google Patents
3alfa-hydroksysteroid-oksydase, kvantitativ analyse av 3alfa-hydroksysteroid ved bruk derav, og et reagens for denne kvantitative analyse Download PDFInfo
- Publication number
- NO171458B NO171458B NO872823A NO872823A NO171458B NO 171458 B NO171458 B NO 171458B NO 872823 A NO872823 A NO 872823A NO 872823 A NO872823 A NO 872823A NO 171458 B NO171458 B NO 171458B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hydroxysteroid
- reagent
- quantitative analysis
- hydrogen peroxide
- oxidase
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 40
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 title claims abstract description 21
- KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthrene-3,16-diol Chemical compound C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CC(O)CC1(C)CC2 KVUXYQHEESDGIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 58
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 42
- VMNRNUNYBVFVQI-UHFFFAOYSA-N 10,13-dimethyl-1,2,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydrocyclopenta[a]phenanthren-3-one Chemical compound C1CC2CC(=O)CCC2(C)C2C1C1CCCC1(C)CC2 VMNRNUNYBVFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 claims abstract description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 13
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 13
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- -1 aniline compound Chemical class 0.000 claims description 5
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Natural products NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QTWZICCBKBYHDM-UHFFFAOYSA-N leucomethylene blue Chemical compound C1=C(N(C)C)C=C2SC3=CC(N(C)C)=CC=C3NC2=C1 QTWZICCBKBYHDM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 1-naphthol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=CC2=C1 KJCVRFUGPWSIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 15
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N (2s,4r)-4-[(3r,5s,6r,7r,8s,9s,10s,13r,14s,17r)-6-ethyl-3,7-dihydroxy-10,13-dimethyl-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2-methylpentanoic acid Chemical compound C([C@@]12C)C[C@@H](O)C[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H](O)[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)C[C@H](C)C(O)=O)CC[C@H]21 HSINOMROUCMIEA-FGVHQWLLSA-N 0.000 description 10
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 5
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000017283 Bile Duct disease Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 101710172561 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102100024089 Aldo-keto reductase family 1 member C2 Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 2
- 235000019646 color tone Nutrition 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N (e)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazine Chemical compound C1=CC=C2S\C(=N\N)N(C)C2=C1 PHOLIFLKGONSGY-CSKARUKUSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KOVSBUJXECYKBH-UHFFFAOYSA-N 3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].OS(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 KOVSBUJXECYKBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010015031 Glycochenodeoxycholic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010007979 Glycocholic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010035713 Glycodeoxycholic Acid Proteins 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N Glycodeoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 description 1
- RFDAIACWWDREDC-UHFFFAOYSA-N Na salt-Glycocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 RFDAIACWWDREDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- BHTRKEVKTKCXOH-UHFFFAOYSA-N Taurochenodesoxycholsaeure Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)CC2 BHTRKEVKTKCXOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- QLRGSUBBRSJVLL-UHFFFAOYSA-N benzene;chloroform;methanol Chemical compound OC.ClC(Cl)Cl.C1=CC=CC=C1 QLRGSUBBRSJVLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTEXIPZMMDUXMR-UHFFFAOYSA-N benzene;ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O.C1=CC=CC=C1 RTEXIPZMMDUXMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000009614 chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- GHCZAUBVMUEKKP-GYPHWSFCSA-N glycochenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 GHCZAUBVMUEKKP-GYPHWSFCSA-N 0.000 description 1
- RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N glycocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N 0.000 description 1
- 229940099347 glycocholic acid Drugs 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N glycodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003222 pyridines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- BHTRKEVKTKCXOH-AYSJQVDDSA-N taurochenodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)C1C2C2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)CC1 BHTRKEVKTKCXOH-AYSJQVDDSA-N 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N taurodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 AWDRATDZQPNJFN-VAYUFCLWSA-N 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L tetrazolium blue Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- GHCZAUBVMUEKKP-UHFFFAOYSA-N ursodeoxycholic acid glycine-conjugate Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)CC2 GHCZAUBVMUEKKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Denne oppfinnelse vedrører en 3a-hydroksysteroid-oksydase og også en kvantitativ analyse av et 3a-hydroksysteroid ved å gjøre bruk av 3a-hydroksysteroid-oksydase, og et reagens for den kvantitative analyse.
Blant 3a-hydroksysteroider i en organisme, er det steroid-hormoner slik som adrosteron, i tillegg gallesyre og lignende. Av disse har gallesyre en spesielt viktig betydning for kliniske diagnoser. Gallesyre er prinsippielt sammensatt av glykocholsyre, taurocholsyre, glykochenodeoksycholsyre. taurochenodeoksycholsyre. glykodeoksycholsyre, taurodeoksychol-syre og lignende. Etter å ha blitt syntetisert fra kolesterol i en lever, blir den sirkulert gjennom en ekstremt lukket syklus kalt "enterohepatisk sirkulasjonssystem". Gallesyre foreligger derfor bare i en spormengde i perifert blod hos friske mennesker. Denne syklus blir imidlertid utsatt for avbrudd ved en lever- eller gallekanalsykdom, hvilket resulterer i et økt blodnivå av gallesyre. Ved å gjøre bruk av en økning i blodnivået av gallesyre som indeks, er det derfor mulig å diagnos-tisere en slik lever- eller gallekanalsykdom og på samme tid bestemme dens alvorlighetsgrad i en viss utstrekning. Av disse grunner er det blitt viktig å analysere gallesyre, som er en av 3a-hydroksysteroidene, i en organisme, kvantitativt, spesielt serum, for diagnose av lever- og/eller gallekanalsykdommer.
Som kvantitative analyser av 3a-hydroksysteroider som er kjent til denne dato, finnes kromatografering, enzym assay, immunoassay etc. På området rutinekliniske tester blir enzym assay primært anvendt på grunn av dens lettvinthet. 3a-hydroksysteroid-dehydrogenase (heretter forkortet som 3a-HSD) forårsaker nemlig å virke på gallesyre (et 3a-hydroksysteroid) i nærvær av nikotinamid adenin dinukleotid (heretter forkortet som "NAD"), og omdanner derved NAD til redusert nikotinamid-adenin-dinukleotid (heretter forkortet som "NADH"). Deretter blir kvantitativ analyse av denne utført ved en hvilken som helst av de følgende metoder:
(1) fluorescens av den resulterende NADH måles,
(2) den resulterende NADH blir omdannet tilbake til NAD med diaphorase og samtidig blir koeksisterende reazurin omdannet til resorufin. Fluorescensen av resorufin blir så målt.
(3) den resulterende NADH blir omdannet tilbake til NAD
under påvirkning av diaforase, og samtidig blir sameksi-sterende nitroblå tetrazolium omdannet til diformazan.
i Fluorescensen i diformazan blir så underkastet kolorimetri.
Metodene ovenfor (1) og (2) er imidlertid fluorometriske metoder, og prosedyrene i disse er komplekse og videre krever de dyrt utstyr. Under disse omstendigheter blir de sjeldent satt sin lit til i rutinetester. På den annen side har metoden (3) dårlig følsomhet. Videre krever den at hver prøve har et stort volum, siden blodnivået i gallesyren er ekstremt lavt. Den har også tendens til interferens med andre komponenter i prøven. Metoden (3) er defor ikke fullt ut tilfredsstillende. Videre er den resulterende diformazan et stoff som har lav vannløselighet, og er således full av ulemper, slik at den blir adsorbert og forårsakes å presipitere på instrumenter anvendt under målingen, f.eks. celler.
Det har derfor vært ønsket å utvikle enn fordelaktig metode for analyse av et 3a-hydroksysteroid som er uten ulemper, slik som de som er beskrevet ovenfor og som bruker et enzym.
De foreliggende oppfinnere utførte et forsøk på reaksjons-systemer, andvendbare til analyser av 3a-hydroksysteroider. En rekke undersøkelser ble også utført på enzymer som er andvendbare i slike systemer. Som resulat er det blitt funet at enzymer (heretter kalt "3a-hydroksysteroid-oksydase") som er istand til å oksydere et 3a-hydroksysteroid til det tilsvarende 3-okso-steroid og hydrogenperoksyd, eksisterer i viss<_ mikroorganismer.
I tillegg er det også blitt funnet at 3-oksosteroidet og hydrogenperoksyd forekommer stoichiometrisk, forutsatt at 3 a-hydroksysteroid-oksydase forårsakes å virke på 3a-hydroksysteroidet og oksygen.
Den foreliggende oppfinnelse bygger på disse funn.
Et aspekt av denne oppfinnelse er således en 3a-hydroksysteriod-oksydase, karakterisert ved følgende kjemiske egenskaper:
Et annet aspekt av denne oppfinnelse er en kvantitativ analyse av et 3a-hydroksysteroid som omfatter inkubering av en testprøve sammen med en 3a-hydroksysteroid-oksydase eller et enzympreparat som inneholder 3a-hydroksysteroid-oksydasen, og så måling av mengden av den resulterende hydrogenperoksyd eller 3-oksosteroidet.
Et videre aspekt av denne oppfinnelse er et reagens som er anvendbart i den kvantitative analysen av et 3a-hydrosteroid, som omfatter en 3a-hydroksysteroid-oksydase og et reagens som er anvendbart til måling av hydrogenperoksyd.
Enda et aspekt av denne oppfinnelse er et reagens som er anvendbart til kvantitativ analyse av et 3a-hydroksysteroid, som omfatter en 3a-hydroksysteriod-oksydase og et reagens som er anvendbart til måling av et 3-oksosteroid som tilsvarer 3a-hydroksysteroidet.
Den foreliggende oppfinnelse baserer seg på at et 3a-hydroksysteroid kan oksyderes stoichiometrisk til dets tilsvarende 3-oksosteroid og hydrogenperoksyd, og mengden av 3a-hydroksysteroidet kan bestemmes fra hydrogenperoksyd eller 3-oksosteroider som ble dannet under påvirkning av enzymet.
Analysen i denne oppfinnelse er avhengig av måling av hydrogenperoksyd, eller at 3-oksosteroid blir dannet under påvirkning av en 3a-hydroksysteroid-oksydase. Analysen i denne oppfinnelse krever derfor ikke handlinger slik som varmebehandling av en prøve, fjerning av proteiner og ekstra-hering kan forhindre adsorpsjon av diformazan på en beholder, forskjellig fra de konvensjonelle fremgangsmåter, og sikrer god følsomhet.
Videre er kolorimetri mulig på den høyere frekvensside i målingssystemet av hydrogenperoksyd ved å foreta et egnet valg av farvereagens, hvilket fører til den videre fordel at inn-flytelsen av interfererende stoffer (hemoglobin, bilirubin, etc.) i serum eller plasma kan reduseres.
Målene ovenfor og andre mål, egenskaper og fordeler ved den foreliggende oppfinnelse vil fremkomme fra den følgende beskrivelse og de vedlagte krav, tatt sammen med de medfølgende tegninger, hvor: Fig 1. til fig. 3 er tegninger som viser kalibreringskurvene, oppnådd i henholdsvis eksempel 3 - eksempel 5. I hver av tegningene er absorbansnivåer plottet langs aksen av ordinatene, mens GC-konsentasjoner er plottet langs aksen av abscissene. Fig. 4 og 5 er tegninger som viser det optimale pH-nivå og pH-stabilitet av enzymet i henhold til denne oppfinnelse. Relative aktivitetsnivåer er plottet langs aksen av ordinatene, mens pH-verdier er plottet langs aksen av abscissene.
Mange mikroorganismer er allerede blitt kjent for å metabolisere 3a-hydroksysteroider. Spesielt de som krever pyridin nukleotid som koenzym ble funnet av Talalay, et al. (Nature, 170, 620 (1952)). En 3a-hydroksysteroid-dehydrogenase, som oksyderer et 3a-hydroksysteroid til dets tilsvarende 3-oksosteroid i nærvær av NAD som koenzym, ble videre isolert fra mikroorganismer av Pseudomonas. Referanse kan bli gjort til f.eks. Talalay, et al. (Nature, 173, 1189, (1954)), Boyer, J. et al. (Biochemistry, 4, 1825 (1965), Delin, et al. (Acta, 67, 197,
(1963)), Marcus, et al. (J. Biol. Chem. 218,661 (1956)) og Talalay, et al. (J. Biol. Chem., 218, 675 (1956)).
Den ovenfor nevnte 3a-hydroksysteroid-dehydrogenase er blitt isolert og produsert fra forskjellige typer mikroorganismer i senere år. F.eks. er det blitt rapportert at stammer slik som Pseudomonas putida NRRL-B-11064 (Agric. Biol. Chem 43, 1521 (1979)), Bacillus sphaericus (japansk patent lagt-åpen nr. 157894/1979) og Escherichia freundii (J. Bact. 79. 145
(1960)) inneholder det.
Det er imidlertid ikke blitt utgitt noen rapport om meta-boliseringsveien hvor 3a-hydroksysteroid blir oksydert til dets tilsvarende 3-oksrsteroid og hydrogenperoksyd.
Imidlertid er det av de foreliggende oppfinnere for første gang blitt funnet at stammer av Pseudomonas og noen stammer av andre slekter metaboliserer 3a-hydroksysteroider til de tilsvarende 3-oksosteroider med samtidig produksjon av hydrogenperoksyd. De foreliggende oppfinnere har således klart å oppnå en 3a-hydroksysteroid-oksydase fra stammene ovenfor.
Den enzymatiske prosess for enzymet av denne oppfinnelse kan uttrykkes ved følgende formel. Enzymer som har slike virkninger, har ikke vært kjent. Enzymet i denne oppfinnelse er derfor nytt.
Enzymet i denne oppfinnelse, 3a-hydroksysteroid-oksydase, kan fremstilles ved en standardprosess for produksjon av enzymer ved å behandle en mikroorganisme som er istand til å metabolisere et 3a-hydroksysteroid slik at det tilsvarende 3-oksosteroid og hydrogenperoksyd dannes, med mikroorganismer som tilhører slekten Pseudomonas, Nocardia, Pimerobacter og
lignende.
Som eksempel på mikroorganismer som er anvendbare i oppnåelsen av enzymene av denne oppfinnelse, kan nevnes Pseudomonas testosteroni ATCC 11996, og den som er tilgjengelig
i handelen fra SIGMA Corporation som en lyofilisert mikroorganisme og som inneholder en hydroskysteroid-dehydrogenase.
For oppnåelse av enzymet i denne oppfinnelse fra en mikroorganisme er det bare nødvendig å lysere cellevegger med en buffer som inneholder et ikke-ionisk overflateaktivt middel, for å frigjøre enzymet og så å ekstrahere enzymet. Disse fremgangsmåter er konvensjonelt kjente, og modifikasjoner av disse kan anvendes.
Nærmere bestemt blir celler ødelagt ved supersoniske
bølger, høytrykkshomogenisator, fransk trykk, mekanisk ødeleggelse eller lignende i nærvær av et ikke-ionisk overflateaktivt middel for å frigjøre enzymet ut av cellene, fulgt av løseliggjøring av dette. Etter fjerning av cellefragmenter og lignende fra den resulterende løseliggjorte væskeblanding og 3a-hydroksysteroid-oksydase ved filtrering, sentrifugering eller lignende, blir nukleinsyre, som foreligger i en relativt stor mengde, utfelt og fjernet med protaminsulfat. Den således oppnådde rå-enzymløsning blir renset ved på en passende måte å anvende, enten enkeltvis eller i kombinasjon, vanlige rensnings-teknikker for enzymer, slik som kromatografering, ved å gjøre bruk av "Butyl Toyopearl" ®, "Sephacryl" ®, "Ionebytter-sefarose"®, hydroksyapatit, "ULTROGEL"®, eller lignende, og utsalting med ammoniumsulfat. Det resulterende rensede enzym blir konsentrert ved ultrafiltrering eller lignende. For å
lagre det således oppnådde enzym, anbefales det å omdanne det til en fast form, fortrinnsvis til en lyfilisert form, ved å anvende et polysaccharid, en flerverdig alkohol, en aminosyre,
et buffrende stoff eller lignende som eksipient.
Typiske karakteristika for 3a-hydroksysteroid-oksydase i denne oppfinnelsen, oppnådd på denne måte, er forut beskrevet i forbindelse med 3a-hydroksysteroid-oksydasen som stammer fra Pseudomonas testosteroni ATCC 11996.
Der. kvantitative analyse av et 3a-hydroksysteroid, som
også tilhører denne oppfinnelse, kan utføres på følgende måte, ved å bruke 3a-hydroksysteroid-oksydase, oppnådd som beskrevet ovenfor. Dvs., en prøve som inneholder 3a-hydroksysteroidet, blir inkubert sammen med 3a-hydroksysteroid-oksydasen eller et enzympreparat som inneholder det samme i nærvær av oksygen,
slik at det tilsvarende 3-oksosteroid og hydrogenperoksyd blir dannet. 3a-Kydroksysteroidet blir så kvantitativt analysert fra mengden av det således dannede hydrogenperoksyd eller 3-oksosteroid. I noen tilfeller blir oksygen som er inneholdt i en form som er oppløst i reaksjonsblandingen under vanlige betingelser, anvendt som oksygenet i reaksjonen ovenfor. Det er således unødvendig å tilføre oksygen utenfra.
Som en fremgangsmåte for den kvantitative analyse av hydrogenperoksyd, er det ofte praktisert å måle det resulterende hydrogenperoksyd, f.eks. ved et system som inneholder et eller flere farvereagenser som er istand til å gjennomgå forandringer i farvetoner i nærvær av hydrogenperoksyd. Denne fremgangsmåte er nemlig å bestemme mengden av eksisterende hydrogenperoksyd ved å måle forandringer i farvetone i et eller flere farvereagenser i henhold til den kolorimetriske teknikk.
Som en foretrukket eksempelvis metode, kan det nevnes måling av mengden av hydrogenperoksyd ved å støtte seg til en reaksjon som finner sted mellom hydrogenperoksyd og 4-aminoantipyrin i nærvær av en overskuddsmengde av fenol og en peroksydase, og så å bestemme mengden av 3ot-hydroksysteroider fra mengden av hydrogenperoksydet. Mengden av det resulterende hydrogenperoksyd kan også måles ved andre egnede reaksjonsreagenssystemer,
f.eks. en kombinasjon av en peroksydase, 4-amino-antipyrin, og en fenol-, naftol- eller anilinforbindelse; en kombinasjon av en peroksydase, 3-benzotiazolinon-hydrazon (MBTH) og en anilinforbindelse; en kombinasjon av en peroksydase og 2,2'-amidinobis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS); og en kombinasjon av en peroksydase og et leucometylenblått-derivat. Fra den således målte mengde av det resulterende hydrogenperoksyd, kan mengden av 3oc-hydroksysteroid bestemmes.
På den annen side kan mengden av 3-oksosteroid måles, f.eks. på følgende måte. Etter ekstraktering av 3-oksosteroidet fra reaks jordblandingen ir. ed et egnet organisk løsningsmiddel (etylacetat, etyleter eller lignende) og konsentrering av ekstraktet blir det resulterende konsentrat fremkalt ved hjelp av et passende fremkallingsmiddel (f.eks. et benzen-kloroform-metanol-system eller et etylacetat-benzen-system), et mobilt punkt blir bekreftet og isolert ved en kjemisk analysemetode slik som UV-absorpsjon eller jodsprøyting og blir så kvantitativt analysert ved en fremgangsmåte som er kjent innen fagområdet. En annen fremgangsmåte kan også anvendes som et alternativ, hvor det resulterende 3-oksosteroid blir tilført til og målt med et redoks kolorimetrisk system ved å gjøre bruk av det faktum at 3-oksosteroider blir oksydert, og dets medfølgende elektronreseptor blir redusert samtidig når en 3-oksosteroid-A<4->dehydrogenase (E.C. 1, 3, 99,6) forårsakes å virke på 3-oksosteroidet (japansk patentsøknad nr. 64547/1985). Som redoks f arvereagenser a., /endbare i utførelsen av den sistnevnte fremgangsmåten, kan nevnes nitrogenblå-tetrazolium, indonitro-tetrazolium, 3-(4,5-dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyl-2H-tetra-zoliumbromid (MTT), 1,1'-(3,3'-dimetoksy-4,4'-bifenylen)-bis(5-(4-nitrofenyl)-3-[4-(2-hydroksy-3-2-hydroksyetyl-dietyl-aminopropoksy)fenyl]1-2H-tetrazoliumklorid (MTB), etc.
Disse kvantitative analyser av et 3a-hydroksysteroid kan hver utføres på en automatisk måte, hvor de kvantitative analyser av mange prøver utføres kontinuerlig, eller på en ikke-automatisk måte hvor de kvantitative analyser av et lite antall prøver utføres individuelt.
For de kvantitative analyser av et 3oc-hydroksysteroid er det egnet å anvende kvantitative analysereagenser i følgende former: (1) et reagens som er anvendbart til den kvantitative analyse av 3a-hydroksysteroidet, som inneholder en 3<x-hydroksysteroid-oksydase og et reagens som er anvendbart til måling av hydrogenperoksyd; og (2) et reagens som er anvendbart til den kvantitative analyse av 3a-hydroksysteroidet, som inneholder en 3a-hydroksysteroid-oksydase og et reagens som er anvendbart til måling av dets tilsvarende 3-oksosteroider.
Som eksempel viser reagenser, som er anvendbare til måling av hydrogenperoksyd, kan nevnes en kombinasjon av en peroksydase, 4-aminoantipyrin og fenol, såvel som de forskjellige ovenfor beskrevne reagenser. På den annen side, som det reagens som er anvendbart til måling av 3-oksosteroidet, kan den ovenfor beskrevne 3-oksosteroid-A<4->dehydrogenase eller et redoks reagens nevnes som eksempel.
Reagenset fra denne oppfinnelse som er anvendbart til kvantitativ analyse av et 3ot-hydroksysteroid, kan fortrinnsvis inneholde en 3a-hydroksysteroid-oksydase ved en sluttkonsentrasjon på 100-1000 enheter/ml. I disse tilfeller betyr en enhet av 3a-hydroksysteroid-oksydase en enzymatisk mengde som kan produsere 1 umol hydrogenperoksyd pr. minutt ved pH 9,0 og 37» C.
Hver av disse kvantitative analysereagenser kan utformes til et preparat som omfatter alle nødvendige komponenter. Alternativt kan det også være mulig å utforme enzymene til 3a-hydroksysteroid-oksydase og peroksydase eller 3a-hydroksysteroid-oksydase og 3-oksosteroid-A<4->dehydrogenase og de gjenværende reagenser til adskilte preparater. Spesielt er det foretrukket å danne enzymene til et lyofilisert pulver eller i en konsentrert væskeform slik at en bruker kan fortynne og bruke det samme ved måling.
Idet vi har beskrevet oppfinnelsen generelt, kan en mere fullstendig forståelse oppnås ved referanse til visse spesifikke eksempler, som er gitt her bare for illustrative formål, og ikke er ment å være begrensende med mindre annet er spesifisert.
Eksempler:
Den foreliggende oppfinnelse vil heretter beskrives spesifikt ved hjelp av de følgende eksempler.
Eksempel 1: Fremstilling av 3a-hydroksysteroid-oksydase
Til 20 1 av et vekstmedium som var blitt sterilisert på forhånd, ble 500 ml av en utsedskultur-buljong av Pseudomonas testosteroni ATCC 11996 inokulert. pH i vekstmediet var 7,00, og dets hovedkomponenter var som følger:
Etter at kulturmediet var blitt inkubert ved 20°C i 24 timer for å la mikroorganismene vokse, ble en acetonløsning av testosteron tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 50-500 ml/l i mediet, slik at produksjon av en 3a-hydroksysteroid-oksydase ble indusert. Deretter ble mikroorganismen dyrket ved samme temperatur i 10-24 timer. Etter fullførelse av kulturen, ble den resulterende kulturbuljong sentrifugert for å separere og oppsamle celler. De således oppsamlede celler ble suspendert ved 5°C i 5 volumer av en 0,02 M fosfatbuffer med pH 7,0 som inneholdt 1% (v/v) av "Triton X-100" (BDH Ltd), til et totalt voum på 1 1. Ved hjelp av en celleødelegger, DINI-MILL®, ble cellene ødelagt for å frigjøre enzymet. Den resulterende blanding ble sentrifugert, og et ekstrakt som inneholdt 3a-hydroksysteroid-oksydase ble oppnådd fra supernatanten. Ekstraktet ble så tilsatt med 430g ammoniumsulfat til en slutt-konsenetrasjon med 65% metning, den presipiterte fraksjon ble oppsamlet ved sentrifugering. Presipitatet ble oppløst i en 0,1 M fosfatbuffer (pH 7) som inneholdt 0,1% "Triton X-100", og den resulterende blanding ble dialysert i 24 timer mot den samme buffer for å fjerne alt gjenværende ammoniumsulfat. Dialysatet ble så forårsaket å passere gjennom en kolonne (kapasitet: 200 ml) , pakket med "DEAE-Sepharose CL-6B"® som på forhånd var blitt ekvilibrert med den samme buffer (pH 7,0) som inneholdt 0,1% av "Triton X-100". Den tilsiktede 3a-hydroksysteroid-oksydase ble eluert med den samme buffer som inneholdt 0,1% av "Triton X-100" i henhold til den lineære gradient teknikk, hvor den molare konsentrasjon av natriumklorid ble gradvis øket. Eluatfraksjonen, som inneholdt 3a-hydroksysteroid-oksydase, ble konsentrert ved 5°C gjennom en ultrafiltreringsmembran. Den konsentererte enzymløsning (20 ml) hadde aktivitet, hvorigjennom et 3a-hydroksysteroid ble oksydert ved 37°C. Det totale ut-vinningsforhold var 10%, mens den spesifikke aktivitet var 0,5 enheter/mg.
Et azid ble tilsatt som konserveringsmiddel til enzym-løsningen. Den resulterende løsning var lagringsdyktig i 2-3 måneder ved 5°C. I løpet av lagringsperioden ble aktiviteten bevart fullt ut. Relative aktiviteter av den således oppnådde 3a-hydroksystyreoid-oksydase for forskjellige stoffer er oppsummert i tabell 1.
Eksempel 2: Kvantitativ analyse av etiocholan-3ot-ol-17-on: Først av alt ble det dannet et målingsreagens av en 0,1M fosfatbuffer (pH 7) som inneholdt 20 enheter/l av 3a-hydroksysteroid-oksydase (som inneholdt 1% "Triton X-100"), 60 mmol 4-a::.inoa-tipyri- ,. 20 ir.mol fenol og 10.000 enheter/ml av en peroksydase.
Til 0,5 n:l av rr.ålingsreagenset ovenfor ble det tilsatt
200 pl av en .T.etanolløsning av etiocholan-3a-ol-17-on, fulgt av en reaksjon ved 37°C i 10 minutter. Absorbanten ble så målt ved en bølgelengde på 500 nm. Med et målingsreagens som lignet det som ble anvendt i prosedyren ovenfor, med unntak av utelatelse av 3a-hydroksysteroid-oksydase, ble en lignende operasjon også utført, med henblikk på den samme prøve. Resultater ble anvendt som blindprøve. Som testprøver ble det anvendt de som ble oppnådd ved fortynning av etiocholan-3a-ol-17-on til forskjellige konsentrasjoner.
Resultater er vist i tabell 2.
Eksempel 3: Kvantitativ analyse av gallesyre i serum:
Etter tilsetning av 200 pl serum eller en standard løsning til 0,5 ml av det samme målingsreagens som det,som ble anvendt i eksempel 2 og etter å ha latt dem reagere ved 37°C i 10 minutter, ble en måling utført ved 500 nm. Ved et målingsreagens som lignet det som ble anvendt i prosedyren ovenfor, med unntak av utelatelse av 3oc-hydroksysteroid-oksydase, ble en lignende operasjon også utført med henblikk på samme prøve. Resultatene ble anvendt som blindprøve. Som testprøve ble det anvendt de som ble oppnådd ved fortynning til forskjellige serumkonsen-trasjoner, som var blitt tilsatt med glykolcholsyre (heretter forkortet som "GC") på forhånd. Resultater er vist i tabell 3.
I tillegg er en kalibreringskurve som er fremstilt på grunnlag av resultatene, vist i fig. 1.
Eksempel 4:
Ved å bruke det samme målingsreagens som det som ble anvendt i eksempel 2, med unntak av anvendelsen av 30 mM av natrium N-etyl-N- (2-hydroksy-3-sulf opropyl) -3 , 5-dimetoksyanilin (heretter forkortet som "DAOS") i stedet for fenol, ble det bestemt en kalibreringskurve ved hjelp av samme metode som målingsmetoden i eksempel 2 med unntak av at målingsbølgelengden ble forandret til 600 nm. Resultatene er vist i tabell 4. Kalibreringskurven som ble fremstilt på grunnlag av resultatene, er vist i fig. 2.
Eksempel 5:
En kalibreringskurve ble bestemt ved hjelp av samme fremgangsmåte som målingsmetoden i eksempel 3, med unntak av at 10 mmol/1 av leucometylenblått ble anvendt i stedet for DAOS i eksempel 4, idet mengden av serum eller en testprøve var 50 pm, og målingsbølgelengden var 670 nm. Resultatene er oppsummert i tabell 5. Videre er kalibreringskurven som ble fremstilt på grunnlag av resultatene, vist i fig. 3.
Eksempel 6:
Idet man separat anvendte ti serumpulver i en mengde på 100/xl hver, ble det utført operasjoner lik den i eksempel 4, for å bestemme absorbansnivåene i de henholdsvise serumprøver. Fra kalibreringskurvene ble mengdene av 3 a-hydroksy steroid i henholdsvise serumprøver beregnet. Videre ble de samme prøver også målt ved "ENZABILE"® som var et sett for måling av 3a-hydroksysteroid med en 3a-hydroksysteroid-dehydrogenase. I tabell 6 er det gitt resultater sammen med beregnings-resultatene ovenfor.
Eksempel 7:
Et målingsreagens ble fremstilt ved å anvende 5 mmol NTB
og 100 enheter av 3-okso-53-steroidA 4-dehydrogenase istedet for 4-aminoantipyrin, fenol og peroksydase i eksempel 2.
En kalibreringskurve ble bestemt ved samme metode som målingsmetoden i eksempel 2, med unntak av at målingsbølgelengden ble forandret til 540 nm.
Resultatene er vist i tabell 7.
Idet vi nå har beskrevet oppfinnelsen fullt ut, vil det være åpenbart for en vanlig fagmann på området at mange forandringer og modifikasjoner kan gjøres ved denne, uten å fjerne seg fra idéen eller rekkevidden av oppfinnelsen som fremsatt her.
Claims (6)
1. 3a-hydroksysteroid-oksydase,
karakterisert ved følgende fysiokjemiske egenskaper :
2. 3a-hydroksysteroid-oksydase i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte oksydase er oppnådd fra en kulturbuljong av Pseudomonas testosteroni (ATCC 11996).
3. Kvantitativ analyse av et 3a-hydroksysteroid, karakterisert ved at den omfatter inkubering av en testprøve sammen med en 3a-hydroksysteroid-oksydase i henhold til krav 1, eller et enzympreparat som innenolder 3a-hydroksysteroid-oksydase i henhold til krav 1, og så måling av mengden av det resulterende hydrogenperoksyd eller 3-oksosteroid.
4. Reagens som er anvendbart til kvantitativ analyse av et 3a-hydroksysteroid,
karakterisert ved at det omfatter en 3a-hydroksysteroid-oksydase i henhold til krav 1 og et reagens som er anvendbart til måling av hydrogenperoksyd.
5. Reagenser i henhold til krav 4, karakterisert ved at reagenset for måling av hydrogenperoksyd er valgt fra en kombinasjon av en peroksydase, 4-aminoantipyrin, og en fenol-^, naftol- eller anilinforbindelse; en kombinasjon av en peroksydase, 3-benzotiazolinon-hydrazon og en anilinforbindelse; en kombinasjon av en peroKsydase og 2,2 ' -amidinobis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre; og en kombinasjon av en peroksydase og et leucometylenblått-derivat.
6. Reagens som er anvendbart til kvantitativ analyse av et 3 a-hydroksystero id,
karakterisert ved at det omfatter en 3a-hydroksysteroid-oksydase i henhold til krav 1, og et reagens som er anvendbart til måling av et 3-oksosteroid som tilsvarer 3a-hydroksysteroidet.
/. Reagens i henhold til krav 6,
karakterisert ved at reagenset som er anvendbart til måling av 3a-oksosteroid, omfatter en kombinasjon av en 3-oksosteriod-A<4->dehydrogenase og et redoks-farvereagens.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61160325A JPH0687777B2 (ja) | 1986-07-08 | 1986-07-08 | ３α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる３α―ヒドロキシステロイドの定量法 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO872823D0 NO872823D0 (no) | 1987-07-07 |
| NO872823L NO872823L (no) | 1988-01-11 |
| NO171458B true NO171458B (no) | 1992-12-07 |
| NO171458C NO171458C (no) | 1993-03-17 |
Family
ID=15712520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO872823A NO171458C (no) | 1986-07-08 | 1987-07-07 | 3alfa-hydroksysteroid-oksydase, kvantitativ analyse av 3alfa-hydroksysteroid ved bruk derav, og et reagens for denne kvantitative analyse |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4889801A (no) |
| EP (1) | EP0252490B1 (no) |
| JP (1) | JPH0687777B2 (no) |
| AT (1) | ATE84821T1 (no) |
| DE (1) | DE3783671T2 (no) |
| ES (1) | ES2053475T3 (no) |
| GR (1) | GR3006941T3 (no) |
| NO (1) | NO171458C (no) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2719709B2 (ja) * | 1988-11-28 | 1998-02-25 | 丸金醤油株式会社 | 胆汁酸硫酸サルファターゼ、その製造法及び胆汁酸の定量法 |
| JP2811319B2 (ja) * | 1989-04-18 | 1998-10-15 | 旭化成工業株式会社 | 胆汁酸の高感度測定法および測定用組成物 |
| CH686445A5 (de) * | 1992-10-06 | 1996-03-29 | Balzers Hochvakuum | Kammer und Kammerkombination fuer eine Vakuumanlage und Verfahren zum Durchreichen mindestens eines Werkstueckes. |
| CN113151207B (zh) * | 2021-04-21 | 2023-03-31 | 重庆第二师范学院 | NAD(H)依赖型3α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1397406A (en) * | 1971-06-22 | 1975-06-11 | Nyegaard & Co As | Enzymic reagent |
| JPS6131097A (ja) * | 1984-07-23 | 1986-02-13 | Toyo Jozo Co Ltd | 新規な高感度酵素的測定法 |
| US4680259A (en) * | 1984-09-26 | 1987-07-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for colorimetric determination of total cholesterol |
| US4737457A (en) * | 1986-02-26 | 1988-04-12 | Eastman Kodak Company | Analytical composition, element and method for the determination of hydrogen peroxide |
-
1986
- 1986-07-08 JP JP61160325A patent/JPH0687777B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-06-19 US US07/063,912 patent/US4889801A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-07 EP EP87109789A patent/EP0252490B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-07 AT AT87109789T patent/ATE84821T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-07 ES ES87109789T patent/ES2053475T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-07 DE DE8787109789T patent/DE3783671T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-07 NO NO872823A patent/NO171458C/no not_active IP Right Cessation
-
1993
- 1993-01-29 GR GR920402541T patent/GR3006941T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0252490A3 (en) | 1990-01-17 |
| NO171458C (no) | 1993-03-17 |
| DE3783671D1 (de) | 1993-03-04 |
| JPH0687777B2 (ja) | 1994-11-09 |
| EP0252490B1 (en) | 1993-01-20 |
| GR3006941T3 (no) | 1993-06-30 |
| ES2053475T3 (es) | 1994-08-01 |
| NO872823D0 (no) | 1987-07-07 |
| JPS6314692A (ja) | 1988-01-21 |
| US4889801A (en) | 1989-12-26 |
| NO872823L (no) | 1988-01-11 |
| ATE84821T1 (de) | 1993-02-15 |
| DE3783671T2 (de) | 1993-05-06 |
| EP0252490A2 (en) | 1988-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Taniguchi et al. | The oxidase system of heterotrophically-grown Rhodospirillum rubrum | |
| US8445246B2 (en) | Flavin-binding glucose dehydrogenases | |
| KR880000753B1 (ko) | 신규의 빌리루빈 산화효소를 포함하는 시약조성물 및 그의 사용방법 | |
| EP0012446B1 (en) | Acidic uricase, its production and its use for the determination of uric acid | |
| EP0049078B1 (en) | Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide | |
| JPH047199B2 (no) | ||
| NO171458B (no) | 3alfa-hydroksysteroid-oksydase, kvantitativ analyse av 3alfa-hydroksysteroid ved bruk derav, og et reagens for denne kvantitative analyse | |
| Hylemon et al. | 7 α-Dehydroxylation of cholic acid by cell extracts of Eubacterium species VPI 12708 | |
| JP3041840B2 (ja) | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 | |
| JPH0284178A (ja) | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット | |
| US5091305A (en) | Bile acid sulfate sulfatase, process for its preparation and method for assaying bile acid | |
| JP5470906B2 (ja) | カタラーゼ | |
| EP0123511A2 (en) | Method and composition for determination of glycerol | |
| JP2017158441A (ja) | カタラーゼ | |
| JP3819094B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、その製造法及びこれを用いる１，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JP3852991B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、その製造法および用途 | |
| JP3586485B2 (ja) | ピルビン酸の定量方法およびその定量用試薬 | |
| US5264347A (en) | Method for the determination of α-ketoisocaproate in biological samples using D-α-hydroxyisocaproic dehydrogenase from lactobacillus casei | |
| JP2886846B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 | |
| JPS6342519B2 (no) | ||
| JP3031517B2 (ja) | 新規アスコルビン酸オキシダーゼ、その製法およびその用途 | |
| JP3597909B2 (ja) | 塩素イオンの定量方法および定量試薬 | |
| JPS5935592B2 (ja) | Ｄ−フルクト−スの定量法 | |
| JP3778603B2 (ja) | ソルビトールオキシダーゼ、その製造法およびその用途 | |
| JP3862034B2 (ja) | グルコースの測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |