NO169981B

NO169981B - Analyseelement for bestemmelse av koagulasjonsparametere

Info

Publication number: NO169981B
Application number: NO872036A
Authority: NO
Inventors: Knut Bartl; Helmut Lill; Hans Wielinger
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1986-05-16
Filing date: 1987-05-15
Publication date: 1992-05-18
Also published as: KR870011473A; DK166884B1; JPS62274262A; EP0245802A3; ES2026479T3; DE3616496A1; NO872036L; DK240787D0; NO872036D0; KR960016336B1; CA1294857C; EP0245802B1; AU7290387A; EP0245802A2; NO169981C; US4861712A; ATE67602T1; DE3773046D1; DK240787A; JPH0650998B2

Description

Oppfinnelsen gjelder et analyseelement for bestemmelse av koagulasjonsparametere ifølge krav 1.

Et slikt analyseelement er beskrevet i den eldre

tyske patentsøknad P 35 16 579 som imidlertid ikke er forpu-blisert. Det taes hensyn til hele innholdet i den nevnte søk-nad. Der anvendes fortrinnsvis papir eller en pels i bærerma-terialet. I en annen utførelsesform av det analyseelement som er beskrevet der, befinner substratet og/eller kofaktoren seg i en vannløselig, filmdannende polymer. Den reagensholdige film påføres på en basisfolie.

Dersom man eksempelvis vil bestemme énfasekoagula-sjonstiden etter Quick med det analyseelement som er beskrevet i den nevnte patentsøknad, så inneholder det:thromboplastin som kofaktor (leilighetsvis også betegnet som aktivator), kalsium-ioner og et substrat for thrombin (en protease i blodkoagula-sjons systemet ) '. Dersom dette analyseelement bringes i kontakt med plasma, idet eksempelvis en dråpe plasma påføres, så star-tes koagulasjonskaskaden ved nærværet av thromboplastinet og kalsiumionene. Det thrombin som oppstår ved forløpet av koagulasjonskaskaden, spalter substratet. Substratet utvelges slik at det etter spaltning enten er umiddelbart påvisbart eller utløser en påvisningsreaksjon. I allmennet anvendes ?efi'". farvedannelse. Substratet er i dette tilfelle enten selv farvedannende eller spaltningsproduktet utløser indirekte en farvedannelse ved en etterfølgende reaksjon. Alternativt kan det eksempelvis også anvendes slike substrater for påvisnings-reaks jonen, som frembringer fluorescerende farvestoffer. Typen av påvisningsreaksjon er uvesentlig for foreliggende oppfinnelse.

Den fremgangsmåte som er beskrevet i den siterte patentsøknad, betyr et betydelig fremskritt, fordi for første gang stilles til forføyelse et analyseelement (som eventuelt også betegnes som tørrtest eller testbærer) for bestemmelse av parametere i blodkoagulasjonssystemet. Det lar imidlertid noe tilbake å ønske når det gjelder presisjonen for de oppnådde måleresultater. I rammen av foreliggende oppfinnelse ble det erkjent at de vanlige papirer eller pelser i analyseelementene i mange tilfeller innvirker på forløpet av koagulasjonskaskaden slik at måleresultatet ikke når den grad av nøyaktighet som er ønskelig fra medisinsk synspunkt.

Dersom reagensene innblandes i en vannløselig film, så unngås riktignok en påvirkning av koagulasjonskaskaden på foran nevnte måte ved egnet valg av filmdannere, men allikevel er målenøyaktigheten ikke så god som ønsket. Dette kan, slik det likeledes er erkjent i rammen av foreliggende oppfinnelse, tilbakeføres til at filmsjiktet forholdsvis langsomt frigjør reagensene. For koagulasjonstesten må imidlertid reagensene frigjøres så fort som mulig, fordi koagulasjonsegenskapene til prøven beregnes, ved hjelp av en tidsmåling. Startpunktet for dette tidsrom blir unøyaktig ved en forsinket frigjøring av reagensene.

Det er derfor en oppgave for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et analyseelement for koagulasjonstester som er like så lett å håndtere, som det som er beskrevet i den nevnte patentsøknad, men som oppviser en forbedret nøyaktighet.

Oppgaven løses ved hjelp av det analyseelement som er definert i patentkravene.

Som åpen, flat struktur bestående av tråder skal forståes enhver struktur som er flateformig i utstrekning, dvs. har en liten tykkelse (på fortrinnsvis mindre enn 0,5 mm, særlig foretrukket mindre enn 0,25 mm) i forhold til sin flateutstrekning. Flateutstrekningen er bestemt av testfeltflaten innenfor analyseelementet. Med "åpen" menes at strukturen skal være egnet til å muliggjøre en rask inntrengning av en vandig væske, eksempelvis en plasmaprøve, hvorved strukturen skal ha en størst mulig overflate som kan bringes i kontakt med prøven. Egnet ville eksempelvis en siktaktig struktur av et plastma-teriale være, dvs. med svært mange hull som er anordnet tett ved hverandre. Særlig foretrukket er imidlertid en vev, vevning eller et nett, som består av tråder. Særlig er monofile tråder egnet.

Som materiale for fremstilling av den flate

struktur er i prinsippet ethvert materiale som ikke har noen forstyrrende innvirkning på forløpet av koagulasjonskaskaden og av hvilket det fremstillingsteknisk lar seg frem-stille en struktur av den beskrevne art. Dessuten må materia-let være slik beskaffent, at den ikke-ionogene polymer hefter fast i reagensene på det. Særlig foretrukne materialer er

polyamid-, polyester- og blandingsvevning av disse fibre. Tråd-tallet ligger fortrinnsvis over 20 pr. cm.

Spørsmålet om det materiale som velges for strukturen, innvirker på forløpet av den eksogene koagulasjonskaskade, lar seg teste som følger: 40 mg av mate-rialet inkuberes med 300 ul citratplasma i 60 sekunder ved 37° C. Deretter frasentrifugeres plasmaet. Koagulerbarheten til plasmaet må ikke ha forandret seg statistisk signifikant.

Den ikke-ionogene polymer må ha den egenskap at den ved de temperaturer som er vanlige ved anvendelsen, løser seg tilstrekkelig raskt i det vandige medium. Det ble funnet at også materialer som ved større sjikttykkelse først løser seg tilstrekkelig raskt i vann ved temperaturer som ligger over romtemperaturen, fortsatt er egnet fordi de foreligger i tynt sjikt på strukturen ifølge oppfinnelsen.

Videre må den ikke-ionogene polymer ha den egenskap at den danner et vedhengende, tynt sjikt på den flate forbindelsesstruktur. I motsetning til en sjiktdannelse, slik det eksempelvis er vanlig ved fremstilling av regnawisende klær hvor et polymermateriale påføres på et vevsjikt på en slik måte at polymersjiktet i det vesentlige forblir på den ene side av vevstrukturen og spenner over dennes åpninger, impregneres strukturen ifølge oppfinnelsen med den ikke-ionogene polymer, dvs. polymeren omgir strukturen på alle sider.

Egnede polymerer er eksempelvis ikke-ionogene cellu-losederivater, polyvinylpyrrolidoner og polyxanthaner.

Polyethylenoxyder, polyakrylamider såvel som poly-vinylacetat som er delvis eller fullstendig forsåpet til polyvinylalkohol, har vist seg som særlig egnet. Innenfor den sistnevnte gruppe foretrekkes de delvis forsåpede polyacetater. Særlig foretrukket er polyvinylacetater med en forsåpningsgrad mellom 70 og 93 mol%. Alle disse polymerer har overraskende den tilleggsfordel at de stabiliserer thromboplastin. På

denne måte kan det fremstilles en Quick-test som utmerker seg ved et særlig godt lagringsforhold.

Eventuelt kan også blandinger av egnede, ikke-ionogene polymerer komme til anvendelse.

For fremstilling av reagensbærerne ifølge oppfinnelsen fremstilles først en løsning av faktoren og/eller kofaktoren og den ikke-ionogene, filmdannende polymer. Eventuelt kan også andre bestanddeler, eksempelvis myknere, tilsettes. Med denne løsning impregneres den flate struktur

fortrinnsvis ved . neddykking, men også eventuelt ved påsprøy-ting. Den egnede viskositet i impregneringsløsningen kan ikke generelt fastlegges, men må avstemmes for hver ikke-ionogen polymer henholdsvis polymerblanding fra produksjonstekniske synspunkter for den aktuelle vevning. Viskositeter mellom 50 og 250 mPasec har vist seg gunstig.

Det substrat som virker som indikator, kan sammen med faktoren og/eller kofaktoren på den ikke-ionogene, filmdannende polymer impregneres i den flate struktur.

Noen ganger kan det imidlertid være problematisk å forarbeide faktoren og/eller kofaktoren sammen med substratet. I dette tilfelle har det vist seg hensiktsmessig å anbringe substratet på et separat bærermateriale. For dette formål kommer forskjellige, kjente bærermaterialer i betraktning. Særlig foretrukket anvendes imidlertid også i dette tilfelle en åpen, flat struktur som bæremateriale, som analogt med den foran beskrevne fremgangsmåte impregneres med en løsning, som ved siden av substratet inneholder en ikke-ionogen, filmdannende polymer. Derved oppnås et særlig jevnt oppløsnings-forhold i begge bærermaterialsjikt, som på den ene side inneholder faktoren og/eller kofaktoren og på den annen side substratet som tjener som indikator.

Ifølge en ytterligere, foretrukken utførelsesform impregneres den åpne, flate struktur, henholdsvis even-

tuelt minst én derav dersom flere slike strukturer anvendes, samtidig med de kalsiumioner som vanligvis er nødvendigefor gjenkalsifisering av plasmaet i koagulasjonstesten.

Bufferstoffer kan likeledes impregneres sammen med faktoren og/eller kofaktoren, men de kan også være tilstede på et separat bærermateriale i analyseelementet.

Oppfinnelsen skal i det følgende forklares nærmere ved hjelp av figuren og av utførelseseksempler.

Fig. 1 viser skjematisk et analyseelement ifølge oppfinnelsen i tverrsnitt.

Den bærende bestanddel i analyseelementet som er generelt betegnet med 10, er en bærerfolie 1. I det viste utførelseseksempel har den en langaktig form som ved en test-strimmel. Ifølge oppfinnelsen er den imidlertid også egnet for andre former av analyseelementer, som eksempelvis har en kvad-ratisk form lik de fotografiske diapositiver.

På bærerfolien er det festet en erythrocyttavskil-lings- og plasmatransport-pels med en stripe smelteklebemiddel 2. Særlig egnet er en pels av et koagulasjonsnøytralt glass-fibermateriale, som er beskrevet i de tyske patentsøknader 35 23 969 og 36 10 429. Den i det følgende kort som transport-pelser betegnede pels 4 er delvis dekket med et dekkenett 3 som likeledes er festet med kleberen 2. Et nylonnett er egnet til dette.

Tre ytterligere, flateformige bestanddeler i analyseelementet 10 er festet med en stripe smelteklebemiddel på en slik måte på bærerfolien 1 at de delvis overlapper transport-pelsen 4. Da de bare er festet på én av sine kanter til hverandre og til bærerfolien 1, har de en avstand fra hverandre over sine gjenværende flater, så lenge de ikke trykkes på hverandre ved ytre trykk. Nærmere forklaring på denne type av testoppbygning kan eksempelvis uttas fra den europeiske patentsøknad med publikasjonsnummer 45 476.

Det underste sjikt 5 kan være en oxydasjonsmiddel-bærer, som i det følgende betegnes som oxydasjonsmatriks.

Over dette befinner reagensbæreren 6 ifølge oppfinnelsen seg

i form av den impregnerte, åpne forbindelsesstruktur. Som øverste sjikt er det anbragt en dekkfolie 7.

Fortrinnsvis anvendes en vev for sjiktet 6 som er impregnert med en løsning i hvilken filmdanneren, bufferen, thromboplastinet eller et annet startreagens for starten av den eksogene eller endogene koagulasjonskaskadenr såvel som et likeledes som indikator virkende substrat for én av de protea-sene som oppstår ved forløpet av blodkoagulasjonen, som f.eks. faktor II a, faktor X a osv, eventuelt i tillegg et koblingsmiddel, såvel som kalsium-ioner og eventuelt også en mykner for filmdanneren, er -løst i vann. Egnet som bufferstoffer er tris og forbindelser av rekken av"Good-buffere. Som substrater kan alle proteasesubstrater anvendes, som på grunnlag av sin aminosyresekvens er tilstrekkelig spesifikk, som f.eks. tos-gly-pro-arg-4-nitroanilid-acetat, eller tos-gly-pro-arg-p-fenylendiaminacetat og N-methylanthranilsyre som koblingsmiddel. Andre koblingsmidler, som N-(4-fluorfenyl)-N-methylamino-methanfosfonsyre osv., kan likeledes anvendes.

For indikatorer, som etter spalting med proteasen

gir en farve ved hjelp av en tilsluttet, oxydativ kobling, er det nødvendig å anbringe et oxydasjonsmiddel, som f.eks. K3[Fe(CN)g] i sjiktet 5. Likeledes kan det også anbringes kalsiumioner i sjiktet 5. Fortrinnsvis anvendes det likeledes et vev for sjiktet 5, som ble impregnert. Forsåvidt som det anvendes en indikator, ved hvilken det ikke er nødvendig med en forsterkningsreaksjon via en oxydativ kobling, bortfaller oxydasjonsmatriksen 5.

Sjiktet 5 kan ved den ovenfor nevnte, alternative utførelsesform med separat anbringelse av substratet også være en flat struktur, på hvilket substratet impregneres adskilt fra faktoren og/eller kofaktoren.

Nærmere enkeltheter om den kjemiske sammensetning av forskjellige koagulasjonstester som også er egnet for foreliggende oppfinnelse, kan tas fra den innledningsvis siterte, tyske patentsøknad 35 16 579.

I de følgende eksempler sammenlignes de resultater som oppnås ved reagensfilmer på folie ifølge den siterte,

tyske patentsøknad, med resultatene som oppnås med vev som er impregnert ifølge oppfinnelsen.

Fremstilling av et analyseelement for bestemmelse av énfase- koagulasjonstiden ifølge Quick.

Fremstilling av reagensfilmer ( reagensmatriks) på folie.

På polycarbonatfolier med tykkelse 200 um påføres med en våtfilmtykkelse på 100 um filmer med sammensetninger som opp-ført i Tabell 1, og disse tørkes ved 45° C. Etter tørkingen oppskjæres de sjiktede foliebaner til en bredde på 15 mm.

Fremstilling av impregnerte vev ( ifølge oppfinnelsen)_

Polyamidvev (type 75 HC fra firma Zuricher Beuteltuchfabrik, Sveits), impregneres med impregneringsløsnin-ger med de sammensetninger som er oppført i Tabell 1, og tør-kes ved 45° C. Etter tørkingen oppdeles de impregnerte vev-baner til en bredde på 15 mm.

Fremstilling av oxydasjonsmatriksen

Et nylonnett (type NY 20 HC Super fra firma Zuricher Beuteltuchfabrik, Sveits) impregneres med en vandig løsning av 50 mmol K^tFe(CN)g]/liter, 50 mmol kalsiumklorid/liter og 0,2 g/liter polyakrylamid (Rohagit 700 fra firma Rohm) og tørkes ved 45° C. Etter tørkingen oppdeles det impregnerte nett i 15 mm's brede baner.

Fremstilling av sjiktdannelses- hhv, impregnerings-masser

I 1 liter destillert vann oppløses Hepes 100 mmol, Tos-Gly-Pro-Arg-p-fenylendiamin 1 mmol, N-(4-fluorfenyl)-N-methylamino-methanfosfonsyre 15 mmol, 2,5 g thromboplastin og polymerene tilsvarende de angivelser som er gjort i Tabell 1. Disse løsninger innstilles på pH 7,5 med natronlut.

Fremstilling av analyseelementer

På en 100 mm bred polystyrenfolie (1 i tegning 1) legges en glassfiberpels (4 i tegning 1) ifølge den tyske patentsøknad 35 23 969 med en flatevekt på 30 - 40 g/m i en

bredde på 15 mm, dekkes delvis med et nylonnett (3 i tegning 1) og fikseres i den ene ende med en kleber (2 i tegning 1). Ved den frie ende av glassfiberpels legges oxydasjons- (5 i tegning 1) og reagensmatriksen (6 i tegning 1) på hverandre og dekkes med en 200 um tykk, gjennomskinnelig polycarbonatfolie (7 i tegning 1) med en bredde på 15 mm og fastklebes med en kleber 8 (2 i tegning 1). De således fremstilte bånd oppdeles til

6 mm brede strimler.

Oppbyggingen av analyseelementet med en reagensfilm på folie tilsvarende i det vesentlige den beskrevne oppbygging ifølge tegning 1. Den skiller seg imidlertid ved at det isteden for sjiktene 6 og 7 er anbragt et eneste sjikt. Dette består av en gjennomsiktig folie, som er besjiktet med filmen. Dette er slik anordnet at folien i figuren viser oppover.

Sammenligning av de nøyaktigheter som oppnås ved bestemmelse av énfasekoagulasjonstid etter Quick med filmsjikt på folien og med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

For å oppnå dette arbeides det som følger:

På de ovenfor beskrevne teststrimler pipetteres 32 ul Poolplasma med en Quick-verdi på 100 % og et plasma på 12,5 % som er fremstilt ved fortynning med fysiologisk koksaltløsning. De reagensbærere som er påført plasmaprøvene, måles i et remisjonsfotometer "Reflotron", Boehringer Mannheim. Den tid måles som går før det har funnet sted en remisjonsnedgang på 10 %, dvs. tiden til den exogene koagulasjonskaskade har for-løpet så langt at det er oppstått en bestemt mengde thrombin (faktor II a).

I måleseriene ble det hver gang gjennomført 25 be-stemmelser av hver testvariant og % Quick.

Måleresultatene fremgår av Tabell 2.

De fire kolonnene i Tabell 2 refererer til de fire forskjellige polymerer henholdsvis polymerblandingene i Tabell 1. I de to første spalter vises måleresultatene for den film på folien som er medtatt som sammenligning. De to siste spalter viser måleresultatene for utførelsesformen ifølge oppfinnelsen.

For hver utførelsesform er de målte tider for 100 %-plasmaet og for 12,5 %-plasma angitt. Vesentlig for bedømmel-sene av oppfinnelsen er særlig de likeledes angitte variasjonskoeffisienter (VK) i prosent.

De måleresultater som er gitt i tabellen viser tydelig at det med utførelsen ifølge oppfinnelsen oppnås statistisk signifikant bedre variasjonskoeffisienter. I området med lavere Quick-prosenter, i det viktige terapeutiske område, fremtrer den forbedrede nøyaktighet særlig tydelig.

Claims

1. Analyseelement for bestemmelse av koagulasjonsparametere i blod ved hjelp av et påvisbart substrat, eller et substrat som utløser en påvisningsreaksjon, en protease i blodkoagulasjonssystemet og minst én faktor og/eller kofaktor i blodkoagulasjonssystemet og et bufferstoff, karakterisert ved at faktoren og/eller kofaktoren sammen med en ikke-ionogen, filmdannende polymer som er oppløselig i vann ved temperaturer under 50°C, og som ikke innvirker forfalskende på forløpet av koagulasjonskaskaden, er impregnert på en åpen, flat struktur bestående av tråder, som for eksempel en vev, vevning eller et nett, som består av et materiale som for eksempel polyamid', polyester eller en,blanding derav, som ikke har noen forstyrrende innvirkning på forløpet av koagulasjonskaskaden, på en slik måte at polymeren omgir strukturen på alle sider.

2. Analyseelement ifølge krav 1, karakterisert ved at substratet sammen med faktoren og/eller kofaktoren og den vannløselige, ikke-ionogene polymer er impregnert på den åpne, flate struktur som består av tråder.

3. Analyseelement ifølge krav 1, karakterisert ved at substratet sammen med en vannløselig, ikke-ionogen polymer er impregnert på en andre, åpen, flat struktur som består av tråder og som er skilt fra den struktur som bærer faktoren og/eller kofaktoren.

4. Analyseelement ifølge ett av kravene 1-3, karakterisert ved at den flate, åpne struktur som består av tråder, i tillegg er impregnert med kalsiumioner.

5. Analyseelement ifølge krav 1, karakterisert ved at veven, vevningen eller nettet består av monofile tråder.

6. Analyseelement ifølge krav 1, karakterisert ved at den flate struktur som består av tråder, har en tykkelse på høyst 0,25 mm og oppviser minst 20 tråder pr. cm.

7. Analyseelement ifølge krav 1, ved hvilken det som kofaktor anvendes thromboplastin, karakterisert ved at den vannløselige, ikke-ionogene polymer er et polyethylenoxyd, et polyakrylamid eller en polyvinylalkohol.