NO165709B - Fremgangsmaate for fremstilling av bloderstatningsmiddel. - Google Patents

Fremgangsmaate for fremstilling av bloderstatningsmiddel. Download PDF

Info

Publication number
NO165709B
NO165709B NO844282A NO844282A NO165709B NO 165709 B NO165709 B NO 165709B NO 844282 A NO844282 A NO 844282A NO 844282 A NO844282 A NO 844282A NO 165709 B NO165709 B NO 165709B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
hemoglobin
compound
formula
groups
molecular weight
Prior art date
Application number
NO844282A
Other languages
English (en)
Other versions
NO165709C (no
NO844282L (no
Inventor
Jeffrey Tze-Fei Wong
Original Assignee
Fisons Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fisons Plc filed Critical Fisons Plc
Publication of NO844282L publication Critical patent/NO844282L/no
Publication of NO165709B publication Critical patent/NO165709B/no
Publication of NO165709C publication Critical patent/NO165709C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/091—Esters of phosphoric acids with hydroxyalkyl compounds with further substituents on alkyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0009—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Glucans, e.g. polydextrose, alternan, glycogen; (alpha-1,4)(alpha-1,6)-D-Glucans; (alpha-1,3)(alpha-1,4)-D-Glucans, e.g. isolichenan or nigeran; (alpha-1,4)-D-Glucans; (alpha-1,3)-D-Glucans, e.g. pseudonigeran; Derivatives thereof
    • C08B37/0021—Dextran, i.e. (alpha-1,4)-D-glucan; Derivatives thereof, e.g. Sephadex, i.e. crosslinked dextran

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av bloderstatningsmidler.
US patent 4.064.118 beskriver et preparat som er egnet som et bloderstatningsmiddel eller blod-drøyemiddel, som om-fatter det vannoppløselige produkt oppnådd ved kovalent kobling av hemoglobin med dekstran eller hydroksyetylstivelse med en molekylvekt fra ca. 5000 til" ca. 2.000.000. Dette US patent beskriver også en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt preparat omfattende kjemisk kobling av hemoglobin og dekstran eller hydroksyetylstivelse med en molekylvekt fra ca. 5.000 til ca. 2.000.000.
Det er imidlertid funnet at, sammenlignet med hemoglobin, så har produktene i US patent 4.064.118 tendens til å vise en noe høyere affinitet for oksygen, men bibeholder den vesentlige oksygentransporterende og -frigjørende evne til hemoglobin. Som målt ved halvmetning-oksygenspenning viser dekstran-hemoglobinkomplekset fremstilt ved metode I i US patent 4.064.118 en affinitet for oksygen som er omtrent 2,5 ganger større enn tilfellet er for fritt hemoglobin.
Det er kjent at pyridoksal-5'-fosfat bindes til hemoglobin på en reversibel måte, og det er også kjent at denne binding kan gjøres irreversibel ved reduksjon, idet både det reversibelt og det irreversibelt bundede produkt har mindre sterke oksygenbindingsegenskaper enn selve hemoglobinet. Det er imidlertid funnet at kovalent derivatisering med pyridoksal-5'-fosfat ikke reduserer oksygenaffiniteten til dekstran-hemoglobin til å nærme seg den for hemoglobin derivatisert med pyridoksal-5'-fosfat (PLP-Hb). En oksygenaffinitet nær eller under den for PLP-Hb anses som ønsket for et tilfredsstillende hemoglobinbasert bloderstatningsmiddel .
Man har nå funnet at fysiologisk akseptable polysakkarid-hemoglobinkomplekser, f.eks. som beskrevet i US patent 4.064.118, kan fremstilles i modifisert form som har en lavere oksygenaffinitet enn hittil.
Bloderstatningsmiddelet som fremstilles ifølge oppfinnelsen, består av en vannoppløselig forbindelse som har en molekylvekt fra 70.000 til 2.000.000, og som har formelen:
hvor PS representerer et fysiologisk akseptabelt polysakkarid med molekylvekt fra 2.000 til 2.000.000, X representerer en kovalent bundet kjemisk brodannende gruppe, HB representerer en hemoglobinrest, og Z representerer en polyol hvori to eller flere av hydroksygruppene er forestret med fosforsyre.
Det er særlig foretrukket at Z inneholder 2-6, og helst 2-4 fosfatgrupper. Minst 2, og fortrinnsvis alle, hydroksygruppene er blitt forestret med fosforsyre. Det er også foretrukket at Z inneholder 4-8 karbonatomer og en rettkjedet gruppe. Videre er det foretrukket at hvert av karbonatomene i polyolen (andre enn minst ett av de terminale karbonatomene) har den eventuelt fosforsyreforestrede hydroksy-gruppen.
Z-gruppen kan være bundet til hemoglobinet på en rekke forskjellige måter som lett vil forstås av en fagmann.
Ifølge foreliggende oppfinnelsen fremstilles den ovenfor definerte forbindelse med formel I, ved at
(a) en forbindelse med formelen:
hvor PS, X og HB har de ovenfor angitte betydninger, bindes til en forbindelse som kan tilveiebringe en Z-ligand,
(b) en forbindelse med formelen:
hvor HB og Z har de ovenfor angitte betydninger, bindes til et polysakkarid PS, eller (c) en forbindelse med formel (I) inneholdende en reduserbar dobbeltbinding, reduseres.
Z-gruppen kan således f. eks. være bundet til en amino-gruppe på hemoglobinet ved hjelp av en amidbinding.
hvor X og PS har den ovenfor angitte betydning, (HBx)NH er en hemoglobinrest, og RCO er en Z-gruppe.
En slik binding kan oppnås ved hjelp av konvensjonelle acyleringsteknikker, f.eks. omdannelse av en forbindelse RCOOH til en aktiv ester derav, f.eks. en N-hydroksy-suksinimidester, og omsetning av den resulterende esteren med det fordannede polysakkarid-hemoglobinkompleks. Slike acyleringsreaksjoner er imidlertid noe uspesifikke og kan lede til binding av Z-gruppen til mindre foretrukne stil-linger på hemoglobinet.
Det er derfor foretrukket at Z-gruppen bindes til hemoglobinet gjennom en Schiff's base-binding, og fortrinnsvis en redusert Schiff's base-binding.
hvor X og PS har den ovenfor angitte betydning,
(HBx)-N= og (HBx)-NH- er hemoglobinrester, og
R-CH= eller R-CH2- er en Z-gruppe.
Slike bindinger kan oppnås ved konvensjonelle teknikker, f. eks. omsetning av et aldehyd RCHO med det fordannede polysakkarid-hemoglobinkompleks, fulgt, om nødvendig, av selektiv reduksjon av den resulterende Schiff<*>s base. Egnede reduksjonsmidler innbefatter dietylaminboran eller natriumcyanoborhydrid, eller mer foretrukket dimetylaminboran eller natriumborhydrid.
Bindingen av Z-gruppen til (PS)-X-(HB)-delen bevirkes ved hjelp av metoder som ikke påvirkes av størrelsen til (PS)-X-(HB)-delen. Således kan et bredt størrelsesområde for produktmolekyler fremstilles med varierende områder for forhold mellom polysakkarid og hemoglobin.
Det er foretrukket at Z-gruppen er avledet fra et inositolfosfat.
Inositolfosfater er kjente forbindelser og kan fremstilles og isoleres på i og for seg kjent måte. Det er spesielt foretrakket at Z-gruppen er avledet fra inositoltetrafosfat, f.eks. fra en blanding inneholdende en hovedandel inositoltetrafosfat og en mindre andel andre inositolfosfater.
Forbindelsen RCHO er således fortrinnsvis et inositol-fosfataldehyd, og mer foretrukket et inositolfosfat-dialdehyd med formelen:
hvor minst to, og fortrinnsvis fire, av gruppene Rx er fosfatgrupper, og resten er -OH-grupper. Forbindelsene med formel IV, hvori mindre enn fire grupper Rx er fosfatgrupper, eksisterer som strukturelle isomerer og også som en rekke stereoisomerer. Forbindelser med formel IV hvori alle fire gruppene Rx er fosfatgrupper, eksisterer som en rekke forskjellige stereoisomerer.
Forbindelsene med formel IV kan, om ønsket, separeres i deres forskjellige strukturelle og/eller optiske isomere former under anvendelse av konvensjonelle kjente teknikker. Alternativt og foretrukket kan forbindelsene med formel IV anvendes som en blanding for ytterligere omsetning med hemoglobinet eller hemoglobin-polysakkaridkomplekset.
Forbindelsene med formel IV kan fremstilles ved selektiv oksydasjon av et passende inositolfosfat som har to til-støtende, frie hydroksygrupper. Oksydasjonen kan hensiktsmessig utføres ved bruk av milde oksydasjonsbetingelser, f.eks. ved bruk av en perhalogensyre, slik som perjodsyre.
Reaksjonen kan hensiktsmessig utføres ved en lav pH-verdi eller en forhøyet temperatur, særlig når et inositoltetrafosfat benyttes som utgangsmateriale.
Polysakkarid-hemoglobinkomplekset kan avledes fra en rekke forskjellige polysakkarider, f.eks. en hydroksyalkyl-stivelse (slik som hydroksyetylstivelse), inulin eller fortrinnsvis dekstran. Mer spesielt er det foretrukket at komplekset er et som har blitt fremstilt ved omsetning av hemoglobin med N-bromacetylaminoetylaminodekstran som beskrevet av Tam, Blumenstein og Wong (1976) Proe. Nat. Acad. Sei. USA 73, 2128-2131 eller eksempel 1 i britisk patent 1.549.246. Det er foretrukket at polysakkaridet har en molekylvekt fra ca. 5000 til 2.000.000, f.eks. har en gjennomsnittlig molekylvekt på 10.000-100.000. Det er foretrukket at polysakkaridet er en dekstran med gjennomsnittlig molekylvekt på 70.000, 40.000 eller 20.000.
Et spesielt dekstran-hemoglobinkompleks som kan anvendes, er et 1:1-kompleks mellom humant hemoglobin og dekstran med en molekylvekt på ca. 20.000 (J.E. Chang og J.T. Wong, Canadian Journal of Biochemistry, Vol. 55, sidene 398-403, 1977).
Andelen av Z—grupper i polysakkaridkomplekset (eller i forbindelsen med formel III) er fortrinnsvis slik at forholdet fosfat til hemoglobin er i området fra 2 til 16:1, fortrinnsvis fra 4 til 16:1, bestemt ved metoden beskrevet i eksempel 1.
Når et dialdehyd benyttes for dannelse av Z-gruppen, kan det finne sted en viss kryssbinding mellom hemoglobin-delene, eller de to aldehydgruppene kan reagere med forskjellige aminogrupper på det samme hemoglobinmolekylet.
De modifiserte hemoglobinene med formel (HB)-Za hvor Za er en gruppe avledet fra et inositolfosfat, og spesielt hvor Z er avledet, som beskrevet ovenfor, fra et inositol-fosfataldehyd, er nye forbindelser og utgjør et trekk ved foreliggende oppfinnelse. Disse nye modifiserte hemoglobinene har oksygentransporterende evne og er, i tillegg til deres nyttevirkning for binding til et polysakkarid, nyttige i seg selv, eller i polymerisert form, som oksygentransporterende midler.
Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således polymerisert (HB)-Za og en fremgangsmåte for fremstilling av polymerisert (HB)-Za, som innbefatter polymerisasjon av (HB)-Za.
Polymerisasjonen av (HB)-Za kan utføres ved anvendelse av i og for seg kjente fremgangsmåter for polymerisasjon av hemoglobin, f.eks. ved omsetning av hemoglobinet med glutaraldehyd, f.eks. ved en temperatur på 0-10°C i en vandig oppløsning. Reaksjonen kan utføres i en buffer for opprettholdelse av en omtrent nøytral pH-verdi. (HB)-Za behøver ikke deoksygeneres før polymerisasjon. Det polymeriserte produktet er fordelaktig idet dens oksygendissosiasjonskurve forskyves mot høyre sammenlignet med kjente polymeriserte hemoglobiner eller modifiserte polymeriserte hemoglobiner. Graden av polymerisasjon kan variere med det spesielle formål for hvilket produktet er ønsket. Generelt vil imidlertid en for høy polymerisasjonsgrad gjøre oppløsningene av polymeren for viskøse mens en for lav polymerisasjonsgrad vil bevirke mange frie hemo-globinmolekyler som kan forårsake skade på nyrene.
Som et alternativ til binding av Z-gruppen til det fordannede hemoglobin-polysakkaridkompleks (metode a) ovenfor), kan Z-gruppen først festes til hemoglobinet, f.eks. ved bruk av ovenfor beskrevne teknikker eller andre konvensjonelle bindingsteknikker. Det modifiserte hemoglobinet kan deretter, om ønsket, ytterligere bindes til polysakkaridet (metode b) ovenfor), f. eks. ved bruk av de teknikker som er beskrevet i US patent 4.064.118.
Det hemoglobin som er omtalt i foreliggende oppfinnelse, kan avledes fra et hvilket som helst hensiktsmessig dyr, f.eks. storfe, men er fortrinnsvis humant hemoglobin. Forbindelsene x foreliggende oppfinnelse, dvs. forbindelser med formel I, forbindelser Hb-Za og polymerisert HB-Za, er nyttige idet de har oksygentransporterende evne. Forbindelsene er således nyttige som immobiliserte oksygen—ekstraksjonsmidler, f.eks. i det system som beskrives i US patent 4.343.715. Forbindelsene angis også for bruk i bloderstatnings- eller blodekspanderings-preparater. Forbindelsene kan således benyttes for å tilveiebringe forøket oksygenering av dårlig perfuserte vev. Slike dårlig perfuserte vev kan forekomme i kreftbefengt vev, i tilfeller av myokardialt infarkt eller i tilfeller av hjerneblødning. Forbindelsene kan også benyttes som bloderstatningsmidler, f.eks. for offere ved ulykker eller voldshandlinger; når blodtyping og -tilpasning ikke er mulig eller ikke er mulig i løpet av den tid som er til-gjengelig; når pasienter er i fare i forbindelse med, eller avviser, normal blodoverføring; for det formål å levere okygen til vev eller organer som skal oppbevares; for preparering av sirkulasjonssystemer utenfor kroppen; eller for andre situasjoner hvor erytrocytter normalt er indikert.
Forbindelsene kan administreres til de aktuelle pasienter i blanding med en farmasøytisk akseptabel eksipiens, fortynningsmiddel eller bærer, f.eks. som en vandig oppløsning, som kan være i en bufret, balansert salt-oppløsning. Generelt vil forbindelsene bli administrert ved benyttelse av typer av formuleringer, pakninger og former for administrasjon som er konvensjonelle for administrasjon av blodplasma-ekspansjonsmidler. Forbindelsene kan også frysetørkes, eventuelt med et kryobeskyt-tende middel, og deretter rekonstitueres for bruk.
Mengden av forbindelse som administreres, vil variere med pasientens størrelse og tilstand og den behandling som er ønsket. I visse alvorlige tilfeller kan imidlertid vesent-lig alt blod til pasienten erstattes med en formulering som inneholder en forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen.
Forbindelsene med formel I og de andre forbindelsene ifølge oppfinnelsen, er fordelaktige idet de er i besit-telse av mer ønskede oksygenabsorpsjons- og -frigjørings-egenskaper enn lignende kjente forbindelser, således har visse forbindelser i foreliggende oppfinnelse oksygen-dissosiasjonskurver (kfr. eksempel 3) som er mer for-skjøvet mot høyre enn fosfopyridoksylert hemoglobin. Forbindelsene i foreliggende oppfinnelse er også fordelaktige idet de lett kan fremstilles og i relativt høyt utbytte.
Molekylvekter i foreliggende oppfinnelse er uttrykt som Mw i stedet for Mn.
Oppfinnelsen illustreres ved følgende eksempler.
Eksempel 1
( a) Fremstilling av inositoltetrakisfosfat
Natriumfytat (inositolheksafosfat) ble defosforylert med oppløselig hvetefytase som beskrevet av R. V. Tormlinson og C. E. Ballou, Biochemistry 1, 166-171(1962). Alterntivt kan hvetekli vasket to ganger med 50% etanol og en gang med 95% etanol benyttes som kilde for fytase. Defosfory-lering fikk forløpe inntil ingen betydelige mengder av inositolheksafosfat eller inositolpentafosfat var tilbake i oppløsning. Mengden av benyttet fytase ble valgt slik at denne fremgangsmåte tok omkring 72 timer. Reaksjonsblandingen ble klaret ved filtrering fulgt av sentrifugering. IM FeCl3 ble tilsatt til den resulterende oppløsning for oppnåelse av et 3:1 molarforhold for FeCl3 opprinnelig fytat. Det gule bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering og resuspendert i destillert vann. Fast NaOH ble tilsatt til suspensjonen for oppnåelse av en pH-verdi på 12, og blandingen ved omrørt og holdt ved pH 12 i tre timer. Etter filtrering ble filtratet nøytralisert med eddiksyre til pH 5,2. Filtratet oppnådd fra 5 1 behandlingsmateriale (inneholdende opprinnelig 50 mM inositolheksafosfat) ble anbragt på en 1 liters kolonne av "Dowex-1"-harpiks likevektsinnstilt med destillert vann. Etter påføring ble kolonnen vasket med 1 liter destillert vann og eluert med 7 liter 0,3 N HC1 og deretter 4 liter 1 N HC1. Fraksjoner inneholdende inositoltetrafosfat ble utfelt med 3 volumdeler 95% etanol. Etter henstand over natten ved 4°C ble supernatanten avbeit, og dette ga et viskøst bunnfall. Absolutt etanol ble tilsatt inntil bunnfallet ble omdannet til et hvitt pulver. Pulveret ble vasket med absolutt etanol, 1:1 etanol:eter og til slutt med eter for oppnåelse av det ønskede produkt.
( b) Oksydasjon av inositoltetrakisfosfat
En oppløsning av 11 g inositoltetrakisfosfat (fremstilt som i trinn a)) i 322 ml 0,6 M HI04.2H20, ble inkubert i mørke ved 22°Ci 8 timer. Reaksjonsblandingen ble nøytrali-sert til pH 5,2 med 5 N KOH, holdt ved 0°C i 10 minutter og deretter sentrifugert for å fjerne KIO4. Askorbinsyre (56,7 g) ble tilsatt til supernatanten. Etter 10 minutter ble 5 volumdeler etanol tilsatt, og blandingen ble holdt ved 4°C i en time. Et klart, viskøst bunnfall ble oppsamlet ved sentrifugering. Bunnfallet ble tilsatt til 100 ml absolutt etanol. Ved triturering ble bunnfallet mer fast og delte seg til slutt opp i et pulver når den etanoliske supernatanten ble erstattet ved fire tilførsler, hver på 50 ml, av absolutt etanol. Det resulterende, hvite pulveret ble vasket med etanol, 1:1 etanol:eter og eter, suk-sessivt, og lufttørket. Utbyttet var 7,7 g av dialdehyd-derivatet av inositoltetrakisfosfat (FPA).
( c) Kovalent binding av FPA til dekstranhemoglobin med dimetylaminboran ( DMAB)
Til 0,25 ml 6% vekt/vekt (målt på hemoglobinet alene) dekstranhemoglobin (Dx-Hb) fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 1 i britisk patent 1.549.246, med den unntagelse at dekstran i molekylvekt 20.000 ble benyttet-., i 0,05 M (bis-(2-hydroksyetyl)amino-tris-(hydroksyinetyl))metan(bis-tris) pH 7,4, ble det tilsatt 1,25 mg FPAS i 0,17 ml 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,2 (ca. 7,3 FPA.-l Dx-Hb). Blandingens pH-verdi ble justert til 7,4 med fortynnet NaOH, 0,025 ml 0,5 M dimetylaminboran (DMAB) ble tilsatt, og oppløsningen ble inkubert i to timer ved 0°c. Den resulterende blanding ble påført på en 30 ml "Sephadex. G25"-kolonne likevektsinnstilt i 0,1 M 2-amino-2-(hydroksymetyl)-l,3-propandiol(tris) 1 N NaCL pH 0,5 buffer, og operert ved 4°C. De første to tredjedeler av toppen ble oppsamlet, dialysert mot bis-tris-buffer, 0,05 M, pH 7,4 natten over, og deretter benyttet for oksygendissosiasjonsbestemmelse. Bruken av "Sephadex"-kolonnen kan, om ønket, sløyfes.
(d) Kovalent binding av FPA til Dx-Hb med NaBH4
Til 0,25 ml 6% Dx-Hb (som benyttet i c) ovenfor) i 0,05 M bis-tris pH7,4, ble det tilsatt 3,41 mg FPA i 20 mg/ml oppløsning (20 FPA:1 D-Hb). Oppløsningens sluttlige pH-verdi var 7,0. Etter en 20 minutters inkubering ved 0°C ble 0,025 ml 0,8 M NaBH4 tilsatt. Oppløsningen ble inkubert i ytterligere to timer ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble deretter påført på en 30 ml "Sephadex G25"-kolonne likevektsinnstilt i 0,1 M tris 1 N NaCl pH 8,5 og operert ved 4°C. De første to tredjedeler av toppen ble oppsamlet, dialysert som i avsnitt c) ovenfor, og benyttet for oksygendissosiasjonsbestemmelse. Igjen kan bruken av "Sphadex"-kolonnen, om ønsket, sløyfes.
I en alternativ metode ble 0,2 ml 6% Dx-Hb (som benyttet i
c) ovenfor) i 0,05 M bis-tri pH 7,4 tilsatt 0,68 mg FPA i en 5 mg/ml oppløsning (5 FPA:1 Dx-Hb). Blandingen ble
inkubert ved 0°C i 20 minutter, og 0,02 ml 0,5 M NaBH4 ble tilsatt ved 0°C i løpet av to timer under konstant om-røring.
( e) Kovalent binding av FPA til Hb med dimetylaminboran eller HaBH4
Til 0,25 ml 6% vekt/vekt hemoglobin oppløst i 0,05 M bis-tris ved pH 7,4, ble det tilsatt 1,25 mg FPA i 0,17 ml 0,05 M natriumacetatbuffer, pH 5,2. Blandingens pH-verdi ble justert til 7,4 med fortynnet NaOH, 0,025 ml 0,5 M dimetylaminboran ble tilsatt, og oppløsningen ble inkubert i to timer ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble påført på en 30 ml "Sephadex G25"-kolonne, likevektsinnstilt i 0,1 M tris-buffer, pH 8,5, inneholdende 1 N NaCl, og operert ved 4°C. De første to tredjedeler av toppen ble oppsamlet, dialysert mot bis-tris-buffer, 0,05 M, pH 7,4, natten over og deretter benyttet for oksygenbestemmelse. (Bruken av "Sephadex"-kolonnen kan, om ønsket, sløyfes). Det således oppnådde FPA-Hb har en oksygendissosiasjonskurve som er forskjøvet mot høyre sammenlignet med fritt Hb, og kan derfor benyttes som oksygenbærer der lav affinitet for oksygen er av viktighet, enten for bloderstatningsformål eller for inkorporering i et immobilisert oksygen-ekstraksjonsmiddel. NaBH4 kan benyttes i stedet for DMAB. Det således fremstilte FPA-Hb er også nyttig i (f) og (g) nedenfor.
( f) Kovalent binginq av cyanoqenbromid- aktivert dekstran til FPA- Hb 2 g dekstran med molekylvekt 70.000 ble oppløst . i en blanding av 80% formamid-20% vann, vol/vol, og oppløs-ningen ble avkjølt til -15°C. 1,6 g CNBr i 3,2 ml 80% formamid-20% vann vol/vol ved 4°C ble deretter tilsatt under omrøring. Ytterligere tilsetning av 15,1 ml 1,5 M trietylamin i dimetylformamid ved -15°C ble foretatt dråpevis under omrøring. Etter inkubering i 10 minutter ved -15°C ble en volumdel aceton (ved -20°C) tilsatt til blandingen for å utfelle det aktiverte dekstran. Bunnfallet ble vasket to ganger med aceton (—20°C) ved sentrifugering, en gang med eter, og lufttørket for oppnåelse av et aktivert dekstran. 35 mg av det aktivertte dekstran ble tilsatt til 1 ml FPA-Hb (3% med hensyn til Hb) i 0,05 M bis-tris, pH' 7,4, og oppløsningen ble holdt ved 0°C i 16 timer.
0,15 ml FPA-Dz-Hb oppnådd ved denne metoden (8% med hensyn til Hb) ble separert fra ukoblet FPA-Hb ved kromatografi på en 188 ml "Sephadex G150"-kolonne for oppnåelse av det optiske densitetsspor ved 576 nm vist på fig. 1. Pilen indikerer posisjonen til ukoblet FPA-Hb.
( g) Fremstilling av poly- FPA- Hb ved bruk av qlutar-aldehyd som polymerisasjonsmiddel
Til 6,5 ml FPA-Hb (6% med hensyn til Hb) i 0,1 M natrium-fosfatbuffer, pH 7,5, ved 4°C, ble det tilsatt 0,195 ml 5% glutaraldehyd i den samme bufferen. Blandingen ble holdt ved 4°C i 16 timer, og 0,15 ml av blandingen ble separert ved kromatografi på 118 ml av en "Sephadex G150"-kolonne for oppnåelse av det optiske densitetsspor ved 576 nm vist på fig. 2. Pilen indikerer posisjonen til fritt HB.
Fosfatbestemmelse
Opp til 0,5 ml aliquoter av FPA-Dx-Hb- eller FPA-Hb-opp-løsningene ble behandlet ved tilsetning av 1,2 ml 70% HCIO4, og deretter koking inntil oppløsningene var klare. 8 ml H20, 0,05 ml 5% ammoniummolybdat og 0,05 ml 0,25% l-amino-2-natol-4-sulfonsyre ble deretter tilsatt. De resulterende oppløsninger ble kokt i 10 minutter og ab-sorpsjonsevnen eller den optiske densitet ved 820 nm ble avlest for å bestemme fosfatkonsentrasjonen.
Hemoglobinkonsentrasjonen ble bestemt ved metoden ifølge D.L. Drabkin og J.H. Austin, J. Biological Chemistry, Vol. 112, side 51-65 (1935).
(Merk: FPA-Dx-Hb oppnådd ved binding av dekstran til FPA-Hb og polyPFA-Hb starter begge fra FPA-Hb, og derfor vil deres fosfat/Hb^-forhold være identisk til det for FPA-Hb-stammaterialet.)
Eksempel 2
a) 0,5 Mmol 2,3-difosfoglycerat ble oppløst i 10 ml vann og ført gjennom en pyridinform av "Dowex (eller
AG)-50"-kolonne. Utløpet ble oppsamlet og konsentrert under redusert trykk. Vann ble fjernet ved hjelp av tilsetning av vannfritt pyridin og konsentrasjon. Resterende vann og pyridin ble fjernet ved vasking med vannfritt dimetylformamid (to ganger) inntil det ikke var noen lukt av pyridin. 6 Mmol aminoacetaldehyd-dietylacetal ble tilsatt ved bruk av vannfritt dimetylsulfoksyd som opp-løsningsmiddel, og blandet ved rysting. 6 Mmol dicyklo-heksylkarbodiimid ble tilsatt, og blandingen omrørt i 3-4 timer ved romtemperatur. En liten mengde vann ble deretter tilsatt, og bunnfallet ble frafiltrert. Filtratet ble ekstrahert (tre ganger) med vannfri eter for å fjerne resterende reaktanter og oppløsningen konsentrert til tørrhet for oppnåelse av et hvitt pulverformig produkt;
b) Råproduktet fra trinn a) (ekvivalent med ca. 0,5 Mmol opprinnelig 2,3-difosfoglycerat) ble oppløst i en
liten mengde vann. Oppløsningen ble ført gjennom "Dowex-50" H+<->form for å fjerne fritt amin. Den sure delen av utløpet ble oppsamlet, konsentrert til ca. 2 ml, og 0,5 ml IN HC1 ble tilsatt. Den resulterende oppløsning ble hensatt i 4°C i 30-60 minutter, og en ekvivalent mengde NH4HCO3 ble tilsatt for å justere pH-verdien til ca. 7. c) 3 my mol 6% dekstran-hemoglobin (enten oksyge-nert eller deoksygenert), fremstilt ved metoden i eksempel 1 britisk patent 1.549.246, ble oppløst i 0,05 M tris ved pH 7,4. Produktet fra trinn b) (15 my mol) og natriura-cyanoborhydrid (60 my mol) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen holdt ved romtempertur i to timer. Overskudd av produkt fra trinn b) ble deretter fjernet enten (i) ved dialyse mot 1 M NaCl/0,05 M tris ved pH 8,5, eller (ii) ved føring gjennom "Sephadex G25" likevektsinnstilt med 1 M NaCl/0,05 M tris ved pH 8,5, og oppsamling av front-endetoppen.
Eksempel 3
Oksygendissosiasjonskurvene for produktene i eksempel 1, og for hemoglobin-dekstran-utgangsmaterialet ble bestemt ved bruk av metoden ifølge Benesh, MacDuff og Benesch
(1965), Anal. Biochem. 11 81-87 (1965), men ved bruk av en temperatur på 24°C og bis-tris-buf f ér, 0,05 M, ved en pH på 7,4.
Resultatene er vist med følgende figurer 3 og 4.
Fig. 3 viser resultatet for produktet i eksempel lg) før separering på "Sephadex"-kolonnen. Fig. 4 viser ved 1 resultatet for dekstran-hemoglobin-utgangsmaterialet for eksempel lc), ved 2 resultatet for produktet i eksempel.Id), ved 3 resultatet for produktet i eksempel lc) og ved 4 resultatet for produktet i eksempel e) ved bruk av DMAB.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et bloderstatningsmiddel bestående av en vannoppløselig forbindelse som har en molekylvekt fra 70.000 til 2.000.000, og som har formelen: hvor PS representerer et fysiologisk akseptabelt polysakkarid med molekylvekt fra 2000 til 2.000.000, X representerer en kovalent bundet kjemisk brodannende gruppe, HB representerer en hemoglobinrest, og Z representerer en polyol hvori to eller flere av hydroksygruppene er forestret med fosforsyre, karakterisert ved at (a) en forbindelse med formelen: hvor PS, X og HB har de ovenfor an gitte betydninger, bindes til en forbindelse som kan tilveiebringe en Z-ligand, (b) en forbindelse med formelen: hvor HB og Z har de ovenfor angitte betydninger, bindes til et polysakkarid PS, eller (c) en forbindelse med formel (I) inneholdende en reduserbar dobbeltbinding, reduseres.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den anvendes en forbindelse hvor Z inneholder 2-6 fosfatgrupper.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes en forbindelse hvor Z er avledet fra en forbindelse med formelen: hvor minst to av gruppene Rx er f os f atgrupper, og resten er —OH-grupper.
4. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de fore-gående krav, karakterisert ved at det anvendes en forbindelse hvor polysakkaridet er en dekstran med en gjennomsnittlig molekylvekt fra 10.000 til 100.000.
5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av de fore-gående krav, karakterisert ved at det — benyttes et forhold mellom fosfat og hemiglobin som er i området fra 2 til 16:1.
NO844282A 1983-10-28 1984-10-26 Fremgangsmaate for fremstilling av bloderstatningsmiddel. NO165709C (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB838328917A GB8328917D0 (en) 1983-10-28 1983-10-28 Blood substitute

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO844282L NO844282L (no) 1985-04-29
NO165709B true NO165709B (no) 1990-12-17
NO165709C NO165709C (no) 1991-04-03

Family

ID=10550912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO844282A NO165709C (no) 1983-10-28 1984-10-26 Fremgangsmaate for fremstilling av bloderstatningsmiddel.

Country Status (12)

Country Link
US (2) US4650786A (no)
EP (1) EP0140640B1 (no)
JP (2) JPH0643444B2 (no)
AT (1) ATE51629T1 (no)
AU (1) AU567593B2 (no)
CA (1) CA1236014A (no)
DE (1) DE3481844D1 (no)
DK (1) DK162395C (no)
FI (1) FI74979C (no)
GB (1) GB8328917D0 (no)
IL (1) IL73334A (no)
NO (1) NO165709C (no)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4831012A (en) * 1984-03-23 1989-05-16 Baxter International Inc. Purified hemoglobin solutions and method for making same
US5464814A (en) * 1986-06-20 1995-11-07 Northfield Laboratories, Inc. Acellular red blood cell substitute
FR2600894B1 (fr) * 1986-07-02 1989-01-13 Centre Nat Rech Scient Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
DE3636590A1 (de) * 1986-10-28 1988-05-26 Braun Melsungen Ag Blutersatzmittel
US5449759A (en) * 1987-05-16 1995-09-12 Somatogen, Inc. Hemoglobins with intersubunit desulfide bonds
GB8712240D0 (en) * 1987-05-23 1987-07-01 Fisons Plc Pharmaceutical formulation
DK110188D0 (da) * 1988-03-02 1988-03-02 Claus Selch Larsen High molecular weight prodrug derivatives of antiinflammatory drugs
FR2630329B1 (fr) * 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
US4900780A (en) * 1988-05-25 1990-02-13 Masonic Medical Research Laboratory Acellular resuscitative fluid
DE69117054T2 (de) * 1990-03-14 1996-06-27 Univ Toronto Acylphosphatester und modifikation von proteinen damit
US6172039B1 (en) 1990-04-16 2001-01-09 Apex Bioscience, Inc. Expression of recombinant hemoglobin and hemoglobin variants in yeast
US5334705A (en) * 1991-08-15 1994-08-02 Duke University Benzenetricarboxylate derivative-crosslinked low oxygen affinity hemoglobin
JP3426599B2 (ja) * 1991-11-08 2003-07-14 ヘモゾル インコーポレイテッド 薬物担体としてのヘモグロビン
US5900477A (en) * 1992-01-30 1999-05-04 Baxter International, Inc. Use of hemoglobin in the treatment of hemorrhagic shock
US5334706A (en) * 1992-01-30 1994-08-02 Baxter International Administration of low dose hemoglobin to increase perfusion
US5612310A (en) * 1993-05-24 1997-03-18 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5554638A (en) * 1993-05-24 1996-09-10 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
US5840851A (en) * 1993-07-23 1998-11-24 Plomer; J. Jeffrey Purification of hemoglobin
US5578564A (en) * 1993-07-23 1996-11-26 Somatogen, Inc. Nickel-free hemoglobin and methods for producing such hemoglobin
US6242417B1 (en) 1994-03-08 2001-06-05 Somatogen, Inc. Stabilized compositions containing hemoglobin
US5631219A (en) * 1994-03-08 1997-05-20 Somatogen, Inc. Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin
US6458762B1 (en) 1994-03-28 2002-10-01 Baxter International, Inc. Therapeutic use of hemoglobin for preserving tissue viability and reducing restenosis
AU693354B2 (en) * 1995-04-10 1998-06-25 Baxter International Inc. The use of cross-linked hemoglobin in treating subarachnoid hemorrhage
US5733869A (en) * 1995-10-06 1998-03-31 Baxter International, Inc. Therapeutic administration of hemoglobin in cardiac arrest
WO1998017289A1 (en) * 1996-10-21 1998-04-30 Baxter International Inc. Therapeutic use of hemoglobin to treat head injury
JP4583510B2 (ja) * 1997-02-28 2010-11-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 無細胞系による酸素輸送の最適化のための方法と組成物
US5814601A (en) * 1997-02-28 1998-09-29 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for optimization of oxygen transport by cell-free systems
US6894150B1 (en) * 1999-10-01 2005-05-17 Ross Walden Tye Non-pyrogenic, endotoxin-free, stroma-free tetrameric hemoglobin
CA2319966A1 (en) * 2000-09-19 2002-03-19 Dextro-Sang Corporation Improved dextran-hemoglobin conjugate as potential blood substitute
FR2828206B1 (fr) * 2001-08-03 2004-09-24 Centre Nat Rech Scient Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases pour la culture cellulaire et le genie tissulaire
US20030153491A1 (en) * 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US20050164915A1 (en) 2002-04-01 2005-07-28 Sangart, Inc. Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
CA2488230C (en) * 2002-04-29 2013-04-09 Yves Claude Nicolau Inositol pyrophosphates, and methods of use thereof
JP3912206B2 (ja) * 2002-07-05 2007-05-09 株式会社日立製作所 筒内直接燃料噴射装置用燃料ポンプ
RU2337705C2 (ru) * 2003-01-29 2008-11-10 Нортфилд Лэборэтериз, Инк. Растворы полимеризованного гемоглобина с пониженным количеством тетрамера и способ их получения
US7745423B2 (en) * 2004-07-06 2010-06-29 NormOxys, Inc Calcium/sodium salt of inositol tripyrophosphate as an allosteric effector of hemoglobin
US20060106000A1 (en) * 2004-07-06 2006-05-18 Claude Nicolau Use of inositol-tripyrophosphate in treating tumors and diseases
US20060258626A1 (en) * 2004-07-06 2006-11-16 Claude Nicolau Use of inositol-tripyrophosphate in treating tumors and diseases
US20070135389A1 (en) * 2004-07-06 2007-06-14 Claude Nicolau Tumor eradication by inositol-tripyrophosphate
JP2009524436A (ja) * 2006-01-24 2009-07-02 ノースフィールド ラボラトリーズ、インコーポレイテッド 重合したヘモグロビンの培地、並びに島細胞の単離及び移植におけるその使用
US20090004159A1 (en) * 2006-01-24 2009-01-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells
US7504377B2 (en) * 2006-10-23 2009-03-17 Ikor, Inc. Nitric oxide-blocked cross-linked tetrameric hemoglobin
US7494974B2 (en) * 2006-10-24 2009-02-24 Ikor, Inc. Carboxymethylated cross-linked tetrameric hemoglobin
CN101784193A (zh) * 2007-05-01 2010-07-21 诺尔姆奥克西斯公司 促红细胞生成素互补或替代
WO2014124278A1 (en) * 2013-02-07 2014-08-14 OPK Biotech, LLC Perfusion of prospective donor hearts with polymerized hemoglobin

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2449885C3 (de) * 1974-10-21 1980-04-30 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat
US4053590A (en) * 1975-02-27 1977-10-11 Alza Corporation Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin
CA1055932A (en) * 1975-10-22 1979-06-05 Hematech Inc. Blood substitute based on hemoglobin
DE2616086C2 (de) * 1976-04-13 1986-04-03 Dr. Eduard Fresenius, Chemisch-pharmazeutische Industrie KG, 6380 Bad Homburg Substanz zur Verwendung in einem kolloidalen Blutvolumenersatzmittel aus Hydroxyethylstärke und Hämoglobin
US4136093A (en) * 1976-04-23 1979-01-23 Biotest-Serum-Institut Gmbh Hemoglobin preparation with increased oxygen release
DE2740053A1 (de) * 1977-09-06 1979-05-03 Klaus Prof Dr Med Gersonde Verwendung von allosterischen effektoren mit hilfe von lipidvesikeln ueber eine irreversible inkorporierung zwecks verbesserter o tief 2 -entladung des haemoglobins in erythrozyten
JPS5716815A (en) * 1980-07-02 1982-01-28 Ajinomoto Co Inc Oxygen transporting agent for artificial blood
US4343715A (en) * 1980-10-10 1982-08-10 Duke University Immobilized hemoglobin, and processes for extracting oxygen from fluids using the same
US4401652A (en) * 1980-12-31 1983-08-30 Allied Corporation Process for the preparation of stroma-free hemoglobin solutions
JPS57206622A (en) * 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
IN158551B (no) * 1981-08-12 1986-12-06 Gen Electric Co Plc
US4473496A (en) * 1981-09-14 1984-09-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Intramolecularly crosslinked hemoglobin
DE3144705C2 (de) * 1981-11-11 1983-12-08 Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, vernetzten Hämoglobinpräparates mit hoher Sauerstoff-Transportkapazität, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte Hämoglobinpräparat
US4529719A (en) * 1983-05-04 1985-07-16 Tye Ross W Modified crosslinked stroma-free tetrameric hemoglobin
FR2551660B1 (fr) * 1983-09-13 1986-11-14 Centre Nat Rech Scient Hemoglobine modifiee chimiquement, sa preparation, solutions aqueuses en contenant et leur utilisation
US4600531A (en) * 1984-06-27 1986-07-15 University Of Iowa Research Foundation Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield

Also Published As

Publication number Publication date
DK162395B (da) 1991-10-21
US4710488A (en) 1987-12-01
DK509884A (da) 1985-04-29
AU567593B2 (en) 1987-11-26
EP0140640B1 (en) 1990-04-04
JPH06298802A (ja) 1994-10-25
GB8328917D0 (en) 1983-11-30
IL73334A0 (en) 1985-01-31
CA1236014A (en) 1988-05-03
DK509884D0 (da) 1984-10-25
JPH0714961B2 (ja) 1995-02-22
IL73334A (en) 1989-03-31
EP0140640A3 (en) 1986-05-28
FI74979B (fi) 1987-12-31
JPH0643444B2 (ja) 1994-06-08
DK162395C (da) 1992-03-09
JPS60123503A (ja) 1985-07-02
FI74979C (fi) 1988-04-11
EP0140640A2 (en) 1985-05-08
US4650786A (en) 1987-03-17
FI844204L (fi) 1985-04-29
NO165709C (no) 1991-04-03
ATE51629T1 (de) 1990-04-15
NO844282L (no) 1985-04-29
AU3475384A (en) 1985-05-09
DE3481844D1 (de) 1990-05-10
FI844204A0 (fi) 1984-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO165709B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av bloderstatningsmiddel.
EP0043675B1 (en) Modified hemoglobins suitable for use as oxygen carriers for blood substitutes
US4371673A (en) Water soluble forms of retinoids
US5079337A (en) Macromolecular conjugates of hemoglobin, a procedure for their preparation and their uses
EP0912197B1 (de) Hämoglobin-hydroxyethylstärke-konjugate als sauerstoff-transport-mittel
US4920194A (en) Blood substitute
EP1066057B1 (en) Hemoglobin-polysaccharide conjugates
US5110909A (en) Macromolecular conjugates of hemoglobin, a procedure for their preparation and their uses
Wong Conjugated Hemoglobin: Rightshifted Dextran-Hemoglobin as Blood Substitute
EP0314749B1 (en) Haemoglobin complexes
Bonneaux et al. Hemoglobin-dialdehyde dextran conjugates: Improvement of their oxygen-binding properties with anionic groups
JPH1160499A (ja) 抗腫瘍剤
Dellacherie Polysaccharides in oxygen-carrier blood substitutes
US7307150B2 (en) Dextran-hemoglobin conjugates as blood substitutes
Xue et al. [20] Preparation of conjugated hemoglobins
JPH04288304A (ja) 高分子マイトマイシンｃ誘導体及びその製造方法
JPS60139702A (ja) 化学修飾多糖及びその製造法
IL87706A (en) Hemoglobin-based non-pyridoxylated blood substitute and method for the preparation thereof
JPH029564B2 (no)

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees