DK162395B

DK162395B - Vandoploeselige haemoglobinholdige forbindelser,fremgangsmaade til deres fremstilling samt farmaceutiske praeparater indeholdende forbindelserne

Info

Publication number: DK162395B
Application number: DK509884A
Authority: DK
Inventors: Jeffrey Tze-Fei Wong
Original assignee: Fisons Plc
Priority date: 1983-10-28
Filing date: 1984-10-25
Publication date: 1991-10-21
Also published as: US4710488A; DK509884A; AU567593B2; EP0140640B1; JPH06298802A; GB8328917D0; IL73334A0; CA1236014A; DK509884D0; JPH0714961B2; IL73334A; EP0140640A3; FI74979B; JPH0643444B2; DK162395C; JPS60123503A; FI74979C; NO165709B; EP0140640A2; US4650786A

Description

DK 162395 B

Opfindelsen angår en vandopløselig haemoglobinhol-dig forbindelse, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt et farmaceutisk præparat indeholdende forbindelsen.

US patentskrift nr. 4.064.118 beskriver et præpa-5 rat, der kan anvendes som et blod-substitut eller blod-strækkende middel, hvilket præparat indeholder det vandopløselige produkt fra covalent kobling af haemoglobin med dextran eller hydroxyethylstivelse med en molekylvægt fra ca. 5.000 til ca. 2.000.000. Dette US patent-10 skrift beskriver også en fremgangsmåde til fremstilling af et sådant produkt, hvilken fremgangsmåde omfatter kemisk kobling af haemoglobin med dextran eller hydroxyethylstivelse med en molekylvægt fra ca. 5.000 til ca. 2.000.000.

15 Det har imidlertid vist sig, at produkterne iføl ge US patentskrift nr. 4.064.118, sammenlignet med haemoglobin, har en tendens til at vise en noget større affinitet for oxygen, men bevarer haemoglobinets essentielle oxygen-transporterende og -frigørende evne. Målt ved 20 halvmætnings-oxygenspændingen viser det ved fremgangsmåde I ifølge US patentskrift nr. 4.064.118 fremstillede dextran-haemoglobin-kompleks omtrent 2,5 gange større affinitet for oxygen end tilfældet er for det frie haemoglobin.

25 EP patentskrift nr. 43.675 beskriver et blodsub stitut eller blodstrækkende middel indeholdende haemoglobin eller et haemoglobinderivat koblet til inulin. Når haemoglobinet er deriveret med pyridoxal-5'-phosphat, er oxygenaffiniteten imidlertid ikke synderlig formindsket 30 i forhold til produkter ifølge ovennævnte US patentskrift.

EP patentansøgning nr. 78.961 beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af lignende produkter, hvor haemoglobin er koblet til et dialdehyd samt til enten 35 pyridoxalphosphat, som ovenfor nævnt, eller inositol-hexaphosphat, altså en inositolring, hvori alle seks hydroxygrupper er phosphorylerede, og denne ring er bun- 2

DK 162395 B

det ikke covalent til haemoglobinet. Den ikke covalente binding medfører imidlertid, at inositolhexaphosphatet hurtigt udskilles fra legemet gennem nyrerne.

Pyridoxal-5-phosphat vides at binde til haemoglo-5 bin på reversibel måde, og det vides også, at denne binding kan gøres irreversibel ved reduktion, hvorhos både de reversibelt og de irreversibelt bundne produkter har mindre stærke oxygenbindings-karakteristika end haemoglobinet selv. Som ovenfor nævnt vil covalent derivat-10 dannelse med pyridoxal-5'-phosphat imidlertid ikke nedsætte oxygen-affiniteten af dextran-haemoglobin, således at den nærmer sig affiniteten af haemoglobin deriva-tiseret med pyridoxal-5'-phosphat (PLP-Hb). En oxygen-affinitet nær eller under affiniteten af PLP-Hb betragtes 15 som ønskelig for et tilfredsstillende haemoglobin-baseret blod-substitut.

Det har nu vist sig, at fysiologisk acceptable po-lysaccharid-haemoglobin-komplekser, for eksempel som beskrevet i US patentskrift 4.064.118, kan tilvejebringes 20 i modificeret form med en lavere oxygen-affinitet end hidtil.

I overensstemmelse hermed er den vandopløselige hæmoglobinholdige forbindelse ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at den har en molekylvægt på fra ca. 70.000 25 til ca. 2.000.000 og har formlen I:

(PS)-X-(HB)-Z I

hvor: PS repræsenterer et fysiologisk acceptabelt polysaccha-30 rid med en molekylvægt på fra ca. 2.000 til ca.

2.000.000, X repræsenterer en covalent bundet kemisk brodannende gruppe, HB repræsenterer en haemoglobinrest, og 35 Z repræsenterer en oxygenaffinitets-reducerende ligand indeholdende 2 eller flere phosphatgrupper.

3

DK 162395 B

Det foretrækkes, at Z er en polyol, i hvilken to eller flere af hydroxygrupperne er esterificeret med phosphorsyre. Det foretrækkes navnlig, at Z indeholder fra 2 til 6 og især 2 til 4 phosphatgrupper. Når Z er en 5 phosphatester af en polyol, er mindst 2 og fortrinsvis alle hydroxygrupperne esterificeret med phosphorsyre.

Det foretrækkes også, at Z indeholder fra 4 til 8 car-bonatomer og er en ligekædet gruppe. Det foretrækkes endvidere, at Z omfatter en polyol, hvori hvert af car- 10 bonatomerne (forskellige fra i det mindste ét af de terminale carbonatomer) bærer en eventuelt phosphorsyre-esterificeret hydroxygruppe.

Z-Gruppen kan være forbundet til haemoglobinet på mange forskellige måder, der vil være nærliggende for 15 fagmanden.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes således også en fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen I, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at a) en forbindelse med formlen II:

20 (PS)-X-(HB) II

hvor PS, X og HB er som ovenfor defineret, forbindes med en forbindelse, der er i stand til at tilvejebringe en Z-ligand, b) en forbindelse med formlen III:

25 (HB)-Z III

hvor HB og Z er som ovenfor defineret, forbindes med et polysaccharid PS, eller c) der fremstilles en reduceret form af en forbindelse med formlen I ved reduktion af en tilsvarende for- 30 bindelse med formlen I indeholdende en reducerbar dobbeltbinding.

Således kan for eksempel Z-gruppen bindes til en aminogruppe på haemoglobinet ved hjælp af en amid-binding: 35 RCONH(HBx)-X-(PS) hvor X og PS er som ovenfor defineret, (HBx)NH er en hae-moglobinrest, og RCO er en Z-gruppe.

4

DK 162395 B

En sådan binding kan tilvejebringes ved konventionel acyleringsteknik, f.eks. ved at omdanne en forbindelse RCOOH til en aktiv ester deraf, f.eks. en N-hydro-xysuccinimidester, og omsætte den resulterende ester med 5 det forud fremstillede polysaccharid-haemoglobin-kom-pleks. Sådanne acyleringsreaktioner er imidlertid noget uspecifikke og kan føre til binding af Z-gruppen til mindre foretrukne stillinger på haemoglobinet.

Det foretrækkes derfor, at Z-gruppen forbindes 10· til haemoglobinet gennem en Schiff'sk base-binding og fortrinsvis en reduceret Schiff'sk base-binding: R-CH=N-(HBx)-X-(PS) eller R-CH2-NH-(HBx)-X-(PS) hvor: 15i X og PS er som ovenfor defineret, (HBx)-N= og (HBx)-NH- er haemoglobin-rester, og R-CH= eller R-CH2~ er en Z-gruppe.

Sådanne bindinger kan tilvejebringes ved konventionel teknik, f.eks. ved at omsætte et aldehyd RCHO med 20 det forud dannede polysaccharid-haemoglobin-kompleks efterfulgt, om nødvendigt, af selektiv reduktion af den resulterende Schiff'ske base. Egnede reduktionsmidler omfatter diethylaminboran eller natriumcyanoborhydrid eller fortrinsvis dimethylaminboran eller natriumbor-25 hydrid.

Bindingen af Z-gruppen til (PS)-X-(HB)-delen foregår ved metoder, der ikke påvirkes af størrelsen af (PS)-X-(HB)-delen. Produktmolekyler inden for et vidt størrelsesområde kan således laves med varierende områ-30 der af polysaccharid-til-haemoglobin-forhold.

Det foretrækkes, at Z-gruppen er afledt af et inositolphosphat.

Inositolphosphater er kendte forbindelser og kan fremstilles og isoleres på i og for sig kendt måde. Det 35 foretrækkes navnlig, at Z-gruppen er afledt af inositol-tetraphosphat, f.eks. af en blanding indeholdende en 5

DK 162395 B

større del af. inositoltetraphosphat og en mindre del af andre inositolphosphater.

Forbindelsen RCHO er således fortrinsvis et ino-sitolphosphataldehyd og navnlig et inositolphosphatdial-5 dehyd med formlen IV: OHC-CHRx-CHRx-CHRx-CHRx-CHO IV hvor mindst 2 og fortrinsvis 4 af grupperne Rx er phos-phatgrupper, og de øvrige er gruppe -OH. Forbindelser med formlen IV, hvori mindre end fire grupper Rx er 10 phosphatgrupper, foreligger som strukturelle isomere og også som forskellige stereoisomere. Forbindelser med formlen IV, hvori alle fire grupper Rx er phosphatgrupper, foreligger som forskellige stereoisomere. Forbindelserne med formlen IV kan, om ønsket, opdeles i 15 deres forskellige strukturelle og/eller optiske isomere former ved anvendelse af i og for sig kendt konventionel teknik.

Alternativt og fortrinsvis kan forbindelserne med formlen IV anvendes som en blanding til videre om-20 sætning med haemoglobinet eller haemoglobin-polysac-charid-komplekset.

Forbindelserne med formlen IV kan fremstilles ved selektiv oxidation af et passende inositolphosphat med to nabostillede frie hydroxygrupper. Oxidationen kan 25 passende gennemføres under anvendelse af mildt oxiderende betingelser, f.eks. ved anvendelse af en perhalo-gensyre, såsom periodsyre.

Reaktionen kan hensigtsmæssigt gennemføres ved et lavt pH eller en forhøjet temperatur, navnlig når der 30 som udgangsmateriale anvendes et inositoltetraphosphat.

Polysaccharid-haemoglobin-komplekset kan være afledt af mange forskellige polysaccharider, f.eks. en hydroxyalkylstivelse (såsom hydroxyethylstivelse), inu-lin eller fortrinsvis dextran. Det foretrækkes navnlig, 35 at komplekset er et sådant, der er fremstillet ved omsætning af haemoglobin med N-bromacetylaminoethylamino-dextran, som beskrevet af Tam, Blumenstein og Wong 6

DK 162395 B

(1976) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73, 2128-2131, eller i Eksempel 1 i britisk patentskrift 1.549.246. Det foretrækkes, at polysaccharidet har en molekylvægt på fra ca. 5.000 til 2.000.000, f.eks. med en middel-5 molekylvægt på 10.000 til 100.000. Det foretrækkes, at polysaccharidet er en dextran med en middelmolekylvægt på 70.000, 40.000 eller 20.000.

Et specifikt dextran-haemoglobin-kompleks, der kan anvendes, er 1:1 komplekset mellem humant haemoglo-10 bin og dextran med en molekylvægt på ca. 20.000 (J. E. Chang og J. T. Wong, Canadian Journal of Biochemistry, bind 55, side 398-403, 1977).

Mængden af Z-grupper i polysaccharid-komplek-set (eller i forbindelsen med formlen III) er fortrins-15 vis en sådan, at phosphat-til-haemoglobin-forholdet ligger i området 2-16:1, fortrinsvis 4-16:1, bestemt ved metoden beskrevet i Eksempel 1.

Når der anvendes et dialdehyd til' dannelse af gruppen Z, kan der foreligge en vis grad af tværbin-20 ding mellem haemoglobin-dele, eller de to aldehydgrupper kan reagere med forskellige aminogrupper på samme hae-moglobinmolekyle.

Som et alternativ til binding af Z-gruppen til det forud fremstillede haemoglobin-polysaccharid-kompleks 25 (fremgangsmåde (a) ovenfor) kan Z-gruppen først bindes til haemoglobinet, f.eks. ved anvendelse af de oven for beskrevne former for teknik eller andre konventionelle former for bindingsteknik. Det modificerede haemoglobin kan derefter, om ønsket, forbindes yderligere til po-30 lysaccharidet (fremgangsmåde (b) ovenfor), f.eks. ved anvendelse af de i US patentskrift 4.064.118 beskrevne former for teknik.

Det i den foreliggende beskrivelse omtalte haemoglobin kan stamme fra ethvert egnet dyr, f.eks. en okse

DK 162395B

7 men er fortrinsvis humant haemoglobin.

Forbindelserne ifølge opfindelsen, d.v.s. forbindelser med formlen I, er nyttige ved, at de har oxygen-transporte-rende evne. Forbindelserne er således anvendelige som im-5 mobiliserede oxygen-ekstraktanter, f.eks. i systemet beskrevet i US patentskrift 4.343.715. Forbindelserne er også beregnet til anvendelse i blodsubstitut- eller blodstrækkende kompositioner. Forbindelserne kan således anvendes til at tilvejebringe forøget oxygenering af dår-10 ligt perfuseret væv. Sådanne dårligt perfuserede væv kan foreligge i cancervækster, i tilfælde af myocardial in-farkt eller i tilfælde af hjerneblødning. Forbindelserne kan også anvendes som blodsubstitutter, f.eks. til ofre fra ulykker eller vold, eller hvor blodtypebestem-15 melse og -tilpasning ikke er mulig, ihvertfald ikke inden for den til rådighed stående tid, eller hvor patienter er i fare ved eller nægter normal blodtransfusion, eller med det formål at levere oxygen til væv eller organer, der skal præserveres, eller til forsyning af 20 ekstracorporale cirkulationssystemer eller til andre situationer, hvor erythrocyter normalt er involveret.

Præparatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det indeholder en forbindelse ifølge opfindelsen i blanding med et farmaceutisk acceptabelt excipiens, 25 fortyndingsstof eller bræestof.

Det farmaceutisk acceptabelt excipiens, fortyndingsmiddel eller bærestof. kan for eksempel være en vandig opløsning, der kan være en pufret afbalanceret saltopløsning. I almindelighed vil forbindelserne blive 30 anvendt under brug af sådanne typer af præparater, emballager og anvendelsesformer, som er konventionelle ved anvendelse af blodplasma-strækkende midler. Forbindelserne kan også frysetørres, eventuelt med et cryo-beskyttende middel, og senere rekonstitueres med henblik 35 på anvendelse.

8

DK 162395 B

Den mængde af forbindelsen, der anvendes, vil variere med patientens størrelse og tilstand og den ønskede behandling. I visse alvorlige tilfælde kan imidlertid i det væsentlige alt patientens blod erstattes 5 med et præparat . indeholdende en forbindelse ifølge opfindelsen.

Forbindelserne med formlen I er fordelagtige ved, at de har mere ønskelige oxygen-absorptions- og -frigørings-egen-skaber end lignende kendte forbindelser. Visse forbin-10 delser ifølge opfindelsen har således oxygendissocia- tions-kurver (jfr. Eksempel 3), der er mere højreforskudte end tilfældet er for phosphopyridoxyleret haemoglobin. Forbindelserne ifølge opfindelsen er også fordelagtige ved, at de kan fremstilles let og i relativt højt 15 udbytte.

Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler, under henvisning til tegningen, hvori:

Fig. 1 er en kurve over optisk tæthed målt ved 576 nm, der illustrerer den chromatografiske adskillelse 20 af FPA-Dx-Hb fra ikke koblet FPA-Hb;

Fig. 2 er en tilsvarende kurve, der illustrerer den chro- matografiske rensning af poly-FPA-Hb;

Fig. 3 viser oxygendissociationskurver for produktet fra Eksempel 1g før den chromatografiske adskil-25 lelse; og

Fig. 4 viser tilsvarende kurver 1 for dextran-haemoglo-binudgangsmaterialet for Eksempel 1c, 2 for produktet fra Eksempel 1d, 3 for produktet fra Eksempel 1c, og 4 for produktet fra Eksempel 1e under 30 anvendelse af DMAB.

Eksempel 1 (a) Fremstilling af inositoltetrakisphosphat.

Natriumphytat (inositolhexaphosphat) blev de-35 phosphoryleret med opløselig hvedephytase, som beskrevet af R. V. Tomlinson og C. E. Ballou, Biochemistry 1_, 9

DK 162395 B

166-171 (1962). Alternativt kunne hvedeklid vasket to gange med 50% ethanol og én gang med 95% ethanol anvendes som phytase-kilde. Dephosphoryleringen fik lov at forløbe, indtil der i opløsningen ikke længere forelå 5 signifikante mængder af inositolhexaphosphat eller ino-sitolpentaphosphat. Den anvendte phytasemængde valgtes således, at denne operation krævede ca. 72 timer. Reaktionsblandingen blev klaret ved filtrering efterfulgt af centrifugering. Til den resulterende opløsning blev 10 der sat 1M FeClg til opnåelse af et molært forhold på 3:1 for FeClg:oprindeligt phytat. Det gule bundfald blev fracentrifugeret og gensuspenderet i destilleret vand.

Fast NaOH blev sat til .suspensionen indtil pH 12, og blandingen blev omrørt og holdt ved pH 12 i 3 timer. Efter 15 filtrering blev filtratet neutraliseret med eddikesyre til pH 5,2. Filtratet fra 5 liter forgæring (indeholdende oprindeligt 50mM inositolhexaphosphat) blev overført til en 1 liters søjle af Dowex-l-harpiks ækvilibre-ret med destilleret vand. Over overføring blev søjlen 20 vasket med 1 liter destilleret vand og elueret med 7 liter 0,3N HC1 og derefter 4 liter IN HC1. Fraktioner indeholdende inositoltetraphosphatet blev fældet med 3 voluminer 95% ethanol. Efter henstand natten over ved 4°C blev overstanden hældt fra efterladende et viskost 25 bundfald. Absolut ethanol blev tilsat, indtil bundfaldet blev til et hvidt pulver. Pulveret blev vasket med absolut ethanol, 1:1 ethanol:ether og til slut med ether, hvorved vandtes det Ønskede produkt.

30 (b) Oxidation af inositoltetrakisphosphat.

En opløsning af 11 g inositoltetrakisphosphat (fremstillet som i trin (a)) i 322 ml 0,6M HI04,2H20, blev inkuberet i mørke ved 22°C i 8 timer. Reaktionsblandingen blev neutraliseret til pH 5,2 med 5N KOH, holdt 35 ved 0°C i 10 minutter og derefter centrifugeret for at fjerne KIO^. Ascorbinsyre (56,7 g) blev sat til overstanden. Efter 10 minutter blev der tilsat 3 voluminer

DK 162395 B

10 ethanol, og blandingen holdtes ved 4°C i 1 time. Ved centrifugering blev der opsamlet et klart viskost bundfald. Bundfaldet blev sat til 100 ml absolut ethanol.

Ved triturering blev bundfaldet mere fast og blev til 5 slut opbrudt i et pulver, da den ethanoliske overstand blev udskiftet med 4 portioner absolut ethanol, hver på 50 ml. Det resulterende hvide'pulver blev vasket successivt med ethanol, 1:1 ethanol:ether og ether og lufttørret. Udbyttet var 7,7 g af dialdehyd-derivatet af inosi-10 toltetrakisphosphat· (FPA) .

(c) Covalent binding af FPA til dextran-haemoglobin med dimethylamin-boran (DMAB).

Til 0,25 ml 6 vægt% (målt på haemoglobinet alene) 15 dextran-haemoglobin (Dx-Hb), fremstillet ved fremgangsmåden fra Eksempel 1 af britisk patentskrift 1.549.246, bortset fra at der anvendtes dextran med en molekylvægt på 20.000, i 0,05M (bis-[2-hydroxyethyl]-amino-tris-[hydroxymethyl]Jmethan (bis-tris), pH 7,4 blev der sat 20 1,25 mg FPA i 0,17 ml 0,05M natriumacetat-puffer, pH 5,2 (ca. 7,3 FPA:1 Dx-Hb). Blandingens pH blev indstillet på 7,4 med fortyndet NaOH, der blev tilsat 0,025 ml 0,5M dimethylaminboran (DMAB), og opløsningen blev inkuberet 2 timer ved 0°C. Den resulterende blanding overfør-25 tes til en 30 ml Sephadex G25-søjle ækvilibreret i 0,1M 2-amino-2- (hydroxymethyl) -Γ,3-propandio1 (tris)/IN NaCl-puffer, pH 8,5, og opereret ved 4°C. De første totredjedele af spidsen blev opsamlet, dialyseret mod bis-tris-puffer, 0,05M, pH 7,4, natten over og derefter 30 anvendt til oxygendissociations-bestemmelse. Anvendelsen af Sephadex-søjlen kan, om ønsket, udelades.

(d) Covalent binding af FPA til Dx-Hb med NaBH^.

Til 0,25 ml 6% Dx-Hb (som anvendt i (c) ovenfor) 35 i o,05M bis-tris, pH 7,4, blev der sat 3,41 mg FPA i

en 20 mg/ml opløsning (20FPA:lDx-Hb). Opløsningens endelige pH var 7,0. Efter 20 minutters inkubation ved 0°C

DK 162395 B

1 1 blev der tilsat 0,025 ml 0,8M NaBH^. Opløsningen blev inkuberet i yderligere 2 timer ved 0°C. Reaktionsblandingen blev derefter overført til en 30 ml Sephadex G25-søjle ækvilibreret i 0,1M tris/ΙΝ NaCl, pH 8,5, og ope-5 reret ved 4°C. De første to-trediedele af spidsen blev opsamlet, dialyseret som under (c) ovenfor og anvendt til oxygendissociations-bestemmelse. Igen kunne anvendelsen af Sephadex-søjlen, om ønsket, udelades.

Ved en alternativ fremgangsmåde blev der til 0,2 10 ml 6% Dx-Hb (som anvendt under (c) ovenfor) i 0,05M bistris, pH 7,4, sat 0,68 mg FPA i en 5 mg/ml opløsning (5FPA:lDx-Hb). Blandingen blev inkuberet ved 0°C i 20 minutter, og der blev ved 0°C tilsat 0,02 ml 0,5M NaBH^ i løbet af 2 timer med konstant omrøring.

15 (e) Covalent binding af FPA til Hb med dimethylamin-boran eller NaBH^.

Til 0,25 ml 6 vægt% haemoglobin opløst i 0,05M bis-tris ved pH 7,4, blev der sat 1,25 mg FPA i 0,17 ml 2o 0,05M natriumacetat-puffer, pH 5,2. Blandingens pH blev indstillet på 7,4 med fortyndet NaOH, der blev tilsat 0,025 ml 0,5M dimethylamin-boran, og opløsningen blev inkuberet i 2 timer ved 0°C. Reaktionsblandingen blev overført til en 30 ml Sephadex G25-søjle ækvilibreret 25 i 0,lM tris-puffer, pH 8,5, indeholdende IN NaCl, og opereret ved 4°C. De første to-trediedele af spidsen blev opsamlet, dialyseret mod bis-tris-puffer, 0,Q5M, pH 7,4, natten over og derefter anvendt til oxygen-bestemmelse. (Anvendelse af Sephadex-søjlen kunne, om øn-30 sket, udelades). Det således vundne FPA-Hb havde en oxygendissociations-kurve, der er højreforskudt sammenlignet med frit Hb, og kan derfor anvendes som oxygenbærer, hvor en lav affinitet for oxygen er af betydning, enten med henblik på blodsubstitution eller til in-35 korporering i en immobiliseret oxygen-ekstraktant. NaBH^ kan anvendes i stedet for DMAB. Det således fremstillede FPA-Hb kan også anvendes i nedenstående dele (f) og (g) · 12

DK 162395 B

(f) Covalent binding af cyanogenbromid-aktiveret dex-tran til FBA-Hb.

2 g Dextran med en molekylvægt på 70.000 blev opløst i en blanding af 80% formamid'-20% vand vol,/vol., og 5 opløsningen blev afkølet til -15°C. Derefter blev der under omrøring tilsat 1,6 g CNBr i 3,2 ml 80% formamid/20% vand vol./vol. ved 4°C. Yderligere tilsætning af 15,1 ml 1,5M triethylamin i dimethylformamid ved -15°C foregik dråbevis under omrøring. Efter inkubation i 10 minutter 10 ved -15°C blev der til blandingen sat ét volumen acetone (ved -20°C) for at udfælde det aktiverede dextran. Bundfaldet blev vasket to gange med acetone (-20°C) ved centrifugering, én gang med ether og lufttørret, hvorved vandtes et aktiveret dextran. Af det aktiverede dextran 15 blev 35 mg sat til 1 ml FPA-Hb (3% med hensyn til Hb) i 0,05M bis-tris, pH 7,4, og opløsningen holdtes ved 0°C i 16 timer.

0,15 ml FPA-Dx-Hb vundet ved denne fremgangsmåde (8% med hensyn til Hb) blev skilt fra det ikke-koblede 20 FPA-Hb ved chromatografi på en 118 ml Sephadex G150-søjle til frembringelse af den optiske tæthedskurve ved 576 nm vist i Fig. 1. Pilen viser positionen for ikke-koblet FPA-Hb.

25 (g) Fremstilling af poly-FPA-Hb ved anvendelse af glu-taraldehyd som polymerisationsmiddel.

Til 6,5 ml FPA-Hb (6% med hensyn til Hb) i 0,1M natriumphosphat-puffer, pH 7,5, ved 4°C blev der sat 0,195 ml 5% glutaraldehyd i samme puffer. Blandingen hold-30 tes ved 4°C i 16 timer, og 0,15 ml af blandingen blev fraskilt ved chromatografi på 118 ml af en Sephadex G150-søjle til frembringelse af den optiske tæthedskurve ved 576 nm vist i Fig. 2. Pilen viser positionen for frit Hb.

35 13

DK 162395 B

Phosphat-bestemmelse

Portioner på op til 0,5 ml af FPA-Dx-Hb- eller FPA-Hb-opløsningerne blev digereret ved tilsætning af 1,2 ml 70% HC104 efterfulgt af kogning indtil klarhed.

5 Der blev derefter tilsat 8 ml I^O, 0,05 ml 5% ammonium-molybdat og 0,05 ml 0,25% l-amino-2-naphthol-4-sulfon-syre. De resulterende opløsninger blev kogt i 10 minutter, og absorptionsevnen eller den optiske tæthed ved 820 nm blev aflæst for at bestemme phosphatkoncentratio-10 nen.

Haemoglobin-koncentrationen bestemtes ved metoden ifølge D. L. Drabkin og J. H. Austin, J. Biological Chemistry, bind 112, side 51-65 (1935).

^ . , ^ Reduktions- Phosphat/

Produkt metode Hb4 FPA-Dx-Hb fremstillet ud fra DMAB 8,4:1 bromdextran mol.vægt 20.000 og humant Hb 20 FPA-Dx-Hb fremstillet ud fra NaBH. 4,8:1 bromdextran mol.vægt 20.000 og humant Hb FPA-Dx-Hb fremstillet ud fra DMAB 10,9:1 bromdextran mol.vægt 20.000 og okse-Hb FPA-Hb fremstillet ud fra DMAB 10,4:1 humant Hb FPA-Hb fremstillet ud fra DMAB 7,6:1 okse-Hb (Bern.: FPA-Dx-Hb vundet ved at binde dextran til FPA-Hb og polyFPA-Hb udgår begge fra FPA-Hb, og deres phos-30 phat/Hb^-forhold vil derfor være identiske med forholdet for det anvendte stam-FPA-Hb).

Eksempel 2 a) 0,5 mmol 2,3-Diphosphoglycerat blev opløst i 10 ml 35 vand og ledt gennem pyridin-form af Dowex (aller AG)-50-søjle. Effluenten blev opsamlet og koncentreret ved reduceret tryk. Vand blev fjernet ved tilsætning af vandfrit pyridin og koncentrering. Tilbageværende vand og py-

DK 162395B

14 ridin blev fjernet ved vask med vandfrit dimethylforma-mid (to gange), indtil der ikke længere var nogen lugt af pyridin. 6 mmol Aminoacetaldehyd-diethylacetat blev tilsat under anvendelse af vandfrit dimethylsulfoxid 5 som opløsningsmiddel og sammenblandet ved rystning.

6 mmol Dicyclohexylcarbodiimid blev tilsat, og blandingen blev omrørt 3-4 timer ved stuetemperatur. En lille mængde vand blev derefter tilsat, og bundfaldet blev frafiltreret. Filtratet blev ekstraheret (3 gange) med vand-10 fri ether for at fjerne resterende reaktanter, og opløsningen blev inddampet til tørhed, hvorved vandtes et hvidt pulverprodukt.

b) Råproduktet fra trin a) (ækvivalent med ca. 0,5 mmol af oprindeligt 2,3-diphosphoglycerat) blev opløst i en 15 lille mængde vand. Opløsningen blev ledt gennem Dowex-50 H+-form for at fjerne fri amin. Den sure effluentdel blev opsamlet, koncentreret til ca. 2 ml, og. der blev tilsat 0,5 ml IN HC1. Den resulterende opløsning blev henstillet ved 4°C i 30-60 minutter, og der blev tilsat en 20 ækvivalent mængde NH^HCO^ for at indstille pH på ca. 7.

c) 3 ymol 6% Dextran-haemoglobin (enten oxygeneret eller deoxygeneret), fremstillet ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1 i britisk patentskrift 1.549.246, blev opløst i 0,05M tris ved pH 7,4. Produktet fra trin b) (15 ymol) 25 og natriumcyanoborhydrid (60 ymol) blev tilsat, og réak-tionsblandingen holdtes ved stuetemperatur i 2 timer. Overskudsprodukt fra trin b) blev derefter fjernet enten (i) ved dialyse mod 1M NaCl/0,05M tris ved pH 8,5, eller (ii) ved passage gennem Sephadex C25 ækvilibreret med 30 1M NaCl/0,05M tris ved pH 8,5, og opsamling af spidsens forreste ende.

Eksempel 3

Oxygendissociations-kurverne for produkterne fra 35 Eksempel 1 og for udgangs-haemoglobindextranet blev bestemt ved anvendelse af metoden ifølge Benesch, MacDuff og Benesch (1965) Anal. Biochem. 11, 81-87 (1965), men

DK 162395 B

15 ved anvendelse af en temperatur på 24°C og bis-tris-puf-fer, 0,05M, ved pH 7,4.

Resultaterne er vist i Fig. 3 og 4.

Fig. 3 viser resultatet for produktet fra Eksem-5 pel Ig) før separation på Sephadex-søjlen.

Fig. 4 viser ved 1 resultatet for dextran-haemo-globin-udgangsmaterialet for Eksempel lc), ved 2 resultatet for produktet fra Eksempel ld), ved 3 resultatet for produktet fra Eksempel lc), og ved 4 resultatet for pro-^0 duktet fra Eksempel 1e) under anvendelse af DMAB.

Claims

1. Vandopløselig haemoglobinholdig forbindelse, kendetegnet ved, at den har en molekylvægt på fra ca. 70.000 til ca. 2.000.000 og har formlen I: 5 (PS)“X-(HB)—Z I hvor: PS repræsenterer et fysiologisk acceptabelt polysaccha-rid med en molekylvægt på fra ca. 2.000 til ca. 2.000.000, 10 X repræsenterer en covalent bundet kemisk, brodannende gruppe, HB repræsenterer en haemoglobinrest, og Z repræsenterer en oxygenaffinitets-reducerende ligand indeholdende 2 eller flere phosphatgrupper. 15

2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Z er en polyol, i hvilken to eller flere af hydroxygrupperne er esterificeret med phosphor-syre.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, kende- 20 tegnet ved, at Z indeholder fra 2 til 6 phosphat-grupper.

4. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at Z er afledt af en forbindelse med formlen IV: 25 OHC-CHRx-CHRx-CHRx-CHRx-CHO IV hvor mindst 2 af grupperne Rx er phosphatgrupper, og de øvrige er grupper -OH.

5. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at polysaccha-30 ' ridet er et dextran med en middelmolekylvægt pa fra 10.000 til 100.000.

6. Forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at phosphat-til-haemoqlobin-forholdet ligger i området 2-16:1. DK 162395 B

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen I som defineret i krav 1, kendetegnet ved, at a) en forbindelse med formlen II: 5 (PS)-X-(HB) II hvor PS, X og HB er som ovenfor defineret, forbindes med en forbindelse, der er i stand til at tilvejebringe en Z-ligand, b) en forbindelse med formlen III: 10 (HB)-Z III hvor HB og Z er som ovenfor defineret, forbindes med et polysaccharid PS, eller c) der fremstilles en reduceret form af en forbindelse med formlen I ved reduktion af en tilsvarende 15 forbindelse med formlen I indeholdende en reducerbar dobbeltbinding.

8· Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at den indeholder en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6 i blanding med et far- 20 maceutisk acceptabelt excipiens, fortyndingsstof eller bærestof.