NO155547B - Optisk aktive cefalosporin-analoge og salter derav samt fremgangsmaate for deres fremstilling. - Google Patents

Optisk aktive cefalosporin-analoge og salter derav samt fremgangsmaate for deres fremstilling. Download PDF

Info

Publication number
NO155547B
NO155547B NO800314A NO800314A NO155547B NO 155547 B NO155547 B NO 155547B NO 800314 A NO800314 A NO 800314A NO 800314 A NO800314 A NO 800314A NO 155547 B NO155547 B NO 155547B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
solution
compound
preparation
cis
oct
Prior art date
Application number
NO800314A
Other languages
English (en)
Other versions
NO155547C (no
NO800314L (no
Inventor
Tadashi Hirata
Yukio Hashimoto
Takehiro Ogasa
Shigeru Kobayashi
Shigeo Yoshiie
Ikuo Matsukuma
Kazuo Kimura
Seigo Takasawa
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP1453379A external-priority patent/JPS55108872A/ja
Priority claimed from JP10707079A external-priority patent/JPS5630976A/ja
Priority claimed from JP14648879A external-priority patent/JPS5671092A/ja
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Kk filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Kk
Publication of NO800314L publication Critical patent/NO800314L/no
Publication of NO155547B publication Critical patent/NO155547B/no
Publication of NO155547C publication Critical patent/NO155547C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C12P17/184—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing a beta-lactam ring, e.g. thienamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D463/00—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring
    • C07D463/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D463/14—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [4.2.0] octane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbacephalosporins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulfur-containing hetero ring with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hetero atoms directly attached in position 7
    • C07D463/16—Nitrogen atoms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører optisk aktive cefalosporin-analoger og fremgangsmåte for deres fremstilling.
De optisk aktive cefalosporin-analogene er kjenne-tegnet ved at de har den generelle formel:
med (6R, 7S)-konfigurasjon, hvor R betyr hydrogen eller alkyl med 1-5 karbonatomer, og R <2>betyr hydrogen eller halogen, samt salter derav.
I den ovenfor angitte formel I er den laverealkylgruppe R"*" en rett eller forgrenet alkylgruppe med 1-5 karbonatomer, slik som metyl, etyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, sek.-butyl, tert.-butyl eller lignende. Som eksempel på
2
halogenatomet for R kan angis klor, brom eller ;jod.
I "J. Am. Chem. Soc." 96, 7584 (1974) er det om-
talt en karbacefem-forbindelse som er beskrevet i overensstemmelse med den nomenklatur som er benyttet i nevnte referanse, og hvor svovelatomet i cefalosporin er substituert med et karbonatom, og som har en substituert metyl-gruppe i 3-stillingen, og denne forbindelse er likeledes omtalt i "J. Med. Chem." 20, 551 (1977). Man har imidlertid ikke omtalt noen forbindelse av denne type med spesielt sterk antibakteriell virkning.
Man har nå lykkes i å fremstille karbacefem-forbindelser som har forskjellige substituenter i 4-, 5- og 3-stillingene (systemet for nummerering er i overensstemmelse med den ovenfor angitte generelle formel I). Forbindelsene er omtalt i japansk patentsøknad nr. 34 96/78 (Japanese Published Unexamined Patent Application nr. 128591/79),
DE-OS nr. 2911786, 122403/78, 133072/78, 162005/78 og 8408/79.
Man har likeledes lykkes i å fremstille hittil ukjente, acylerte karbacefem-forbindelser som utgjør hittil ukjente antibiotika med sterk antibakteriell virkning. Slike forbindelser er omtalt i japansk patentsøknad nr. 3496/78 (Japanese Published Unexamined Patent Application nr. 128591/79),122402/78, 127027/78, 133071/78, 162006/78, 162007/78, 162008/78, 8409/79 og DE-OS 2911787.
De ovenfor omtalte cefalosporin-analoger er imidlertid fremstilt ved syntetiske fremgangsmåter under anvendelse av optisk inaktive utgangsforbindelser, og de er optisk inaktive dl-forbindelser ( angitt ved (-)), med mindre de er i besittelse av optiske aktive acylgrupper.
De forbindelser som er beskrevet med den generelle formel
I, hvor hydrogenatomet i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjonen, er tilstede som en blanding av like store mengder av de speilvendte forbindelser, representert ved formlene (I-l) og (1-2):
1 2
og hvor R og R har den ovenfor angitte betydning. Det er imidlertid ikke blitt omtalt noen fremgangsmåte til å isolere en av disse enantiomere forbindelser.
Til dette formål har man nå funnet at en av de optisk aktive speilvendte forbindelser kan fremstilles og isoleres.
Ved foreliggende fremgangsmåte fremstiller man optisk aktive forbindelser av cefalosporin-analoger med den ovenfor angitte formel I samt salter derav. Disse optisk aktive forbindelser av cefalosporin-analoger, dvs.
en av de enantiomere forbindelser, fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved en optisk selektiv deacylerings-omsetning under anvendelse av et enzym, og med en inaktiv del-forbindelse inneholdende en acylgruppe som utgangsforbindelse.. Den ønskede forbindelse oppnås med et bemerkelsesverdig høyt utbytte ved denne fremgangsmåte.
En forbindelse hvori en optisk aktiv acylgruppe innføres for dannelse av en dl-form av en forbindelse med formel (I), og som i det etterfølgende betegnes som forbindelse (I), dvs. en forbindelse som kan representeres ved den generelle formel (A):
adskilles til diastereoisomere forbindelser (japansk patentsøknad nr. 127027/78) DE-OS 2911787.
De ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilte optisk aktive forbindelser antas å ha den absolutte struktur som er representert ved den generelle formel (I-l), dvs. (6R, 7S) ut fra forskjellige egenskaper, sterk anti-mikrobiell virkning av acylforbindelsene sammenlignet med de tilsvarende optisk inaktive dl-forbindelser, samt sammenhengen mellom den absolutte kjemiske struktur tilsvarende cefalosporinene og disses virkninger. Disse forbindelser er særlig nyttige som syntese-mellomprodukter ved fremstilling av optisk aktive acylerte forbindelser som er sterkt virkende antibakterielle midler.
I det etterfølgende er de optisk aktive forbindelser beskrevet under henvisning til den generelle formel (I-l). Forbindelsene i de etterfølgende eksempler og i referanseeksemplene er dessuten betegnet i overensstemmelse med den tilskrevne, absolutte struktur.
Optisk aktive forbindelser av de cefalosporin-analoger som er representert med den generelle formel (I), eller forbindelser som er representert med den tilskrevne absolutte strukturformel (I-l), fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved optisk selektiv deacylering hvor-ved man omsetter en forbindelse med den generelle formel:
hvor R' betyr en fenylgruppe som eventuelt er substituert med en eller flere hydroksygrupper; X' betyr hydrogen
1 2
eller amino; R og R har den ovenfor angitte betydning;
og hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon med et enzym som er i stand til optisk selektiv deacylering, og som er oppnådd fra en mikroorganisme til-hørende en av slektene Aeromonas, Achromobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Xanthomonas, Kluyvera, Gluconobacter, Clostridium, Comamonas, Coryne-bacterisum, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus Pseudomonas, Flavobacterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Proteus, Beneckea, Mricrococcus, Mycoplana og Phodopseudomonas, og er i form av en renset enzymoppløsning, cellelegemer utvunnet fra en dyrkningsbuljong, en cellesuspensjon, en suspensjon av sprengte celler, et ekstrakt befridd for celler eller en dyrkningsvæske av mikroorganismen, hvoretter man utvinner den dannede optisk aktive forbindelse, eventuelt i form av et salt.
De etterfølgende stammer er eksempler på mikro-organismene .
For utførelse av den optisk selektive deacylerings-omsetning kan enzymet tilveiebringes i en hvilken som helst av de etterfølgende former: 1. I form av mikroorganismens dyrkningsvæske eller behand-lede deler derfra; 2. Som cellelegemer som er innvunnet fra dyrkningsvæsken ved sentrifugering, og som kan være vasket med saltoppløs-ning (vanligvis ca. 1%), med bufferoppløsning eller lignende, eller som suspensjon av celler; 3. Som en suspensjon av sprengte celler, dvs. en suspensjon av cellelegemer som er mekanisk eller kjemisk ned-brutte; 4. som et ekstrakt som er befridd for celler, dvs. en væske som er fremstilt ved fjerning av de ødelagte celle- • legemer fra suspensjonen av ødelagte celler; eller 5. som en renset enzymoppløsning som er fremstilt ved at man innvinner enzymproteinet med amoniumsulfat fra ekstraktet som er befridd for celler, og underkaster enzymproteinet gelfiltrering, søylekromatografi på ioneveksler-cellulose, kromatografi på ioneveksler "Sephadex"-søyler eller lignende .
Man kan anvende celler eller renset enzym som er immobilisert ved konvensjonelle metoder.
Omsetningen utføres ved en temperatur på 0-40°C, fortrinnsvis 15-35°C, og ved en pH-verdi på 5-8 i et inak-tivt oppløsningsmiddel som ikke influerer på omsetningen.
Som.oppløsningsmiddel benyttes fortrinnsvis vann. For å oppløse cefalosporin-erstatningsmidlet eller den cefalosporin-analoge kan man anvende organiske oppløsnings-midler slik som aceton, metanol, etanol, 1,1-dimetylforma-mid, dimetylsulfoksyd eller lignende. Det er effektivt å tilsette fosfatbuffer, veronal-buffer eller sitronsyre-buffer for regulering av pH-verdien under omsetningen. Om-setningstiden som influeres av arten og konsentrasjonen av enzymene, arten av og konsentrasjonen av mediene, reaksjons-temperaturen og reaksjonens pH-verdi, har i alminnelighet mellom 30 min. og 24 timer. Man foretrekker å avslutte omsetningen når omsetningsforholdet har nådd sin maksimale verdi.
Cellekonsentrasjonen er fortrinnsvis 1-50 mg tørr-stoff pr. 1 ml av reaksjonsvæsken. Når man benytter et renset enzym er det passende å anvende den mengde enzym som har samme aktivitet som den tørre celle har. Utgangs-materiale (III) benyttes i en mengde på 0,5-50 mg pr. 1 ml av omsetningsvæsken.
Dersom den benyttede mikroorganisme også produserer et enzym slik som 3-laktamase, esterase eller lignende, som har en tilbøyelighet til å forhindre den ønskede omsetning, kan man mutere slike mikroorganismer ved kjente fremgangsmåter for dannelse av en mutant som har en redusert produk-tivitet med hensyn til det uønskede enzym. Alternativt kan man tilsette inhibitorer for slike enzymer til reaksjons-systemet for å forsterke omsetningsforholdet.
Etter avslutningen av omsetningen utføres isole-
ring av den ønskede forbindelse ved hjelp av en konvensjo-nell metode, som benyttes ved isolering og rensing av organiske forbindelser fra dyrkningsvæsker, slik som absorbsjon under anvendelse av forskjellige bærestoffer, ionevekslings-kromatografering, gelfiltrering, væske-væske-ekstråksjon og lignende.
Acylforbindelsene av de optisk aktive forbindelser
(I) (forbindelsen I-l)) har meget sterkere antimikrobielle virkninger enn acylforbindelsene av de tilsvarende optisk inaktive forbindelser (I).
Eksempler på slike forbindelser og disses antimikrobielle virkninger er i det følgende omtalt som referanse-eksempler.
I det følgende angis en re e eksempler for belys-ning av oppfinnelsen.
Eksempel 1
Fremstilling av (+)-cis-7-amino-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre [(+)-cis-7-amino-2-karboksy-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on] (cis refe-
rerer seg til stereokjemien knyttet til 6- og 7-stillingene og dette gjelder for de etterfølgende eksempler):
1-1. Fremstilling av suspensjon av sprengte celler. 1) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv deacylering.
Som podingsmateriale anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 (biologiske egenskaper er beskrevet i "J. General Applied Microbiology" 3, 28-31 (1957)).
Som podingssubstrat anvendes en vandig oppløsning inneholdende 1% polytekton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjøtt-ekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,9 5% natriumklorid, og som er justert til en pH-verdi på 7,0 med 5n NaOH. Man poder en løkkefull av podingsmaterialet i 10 ml av podingssubstratet i et stort reagensglass på 50 ml, og dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C i 24 timer. Den samlede mengde podingsvæske podes videre i 300 ml av dyrkingssub-stratet i en 2 liter Erlenmeyerkolbe, og dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C under rysting. Dyrkingssubstra-tet har samme sammensetning som podingssubstratet. 2) Fremstilling av en suspensjon av sprengte celler. Etter dyrking i 24 timer underkastes dyrkingsvæsken sentrifugering for oppsamling av cellelegemene. Cellene vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltoppløsning og bringes til suspensjon i en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet på tørr-stoff i 1/30 molar fosfatbuffer-oppløsning. Deretter anbringes 10 ml av cellesuspensjonen i et 50 ml reagensglass hvori det underkastes ultrasonisk disintegrasjon ved 200 W i 2 min. for fremstilling av suspensjonen av sprengte celler. Ved denne behandling ble det benyttet en ultrasonisk disintegrator av modell UR200P.
1-2. Fremstilling av en substratoppløsning.
200 mg (-)-cis-7-fenylacetamido-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt ifølge DE-OS 2911787, tilsettes til 9 ml 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5). Etter som forbindelsen ikke oppløses, tilsettes 2n NaOH i små mengder og blandingen justeres
igjen til en pH-verdi på 6,5 til oppløsning av forbindel- • sen. Til slutt tilsettes ionevekslet vann for dannelse av 10 ml oppløsning.
1-3. Enzymomsetning
10 ml av den ovenfor beskrevne suspensjon av sprengte celler tilsettes til 10 ml av substratoppløsnin-gen, og enzymomsetningen utføres ved en temperatur på 30°C i løpet av 80 min. Reaksjonens forløp avhengig av tiden er angitt i Tabell 1.
Som det fremgår av tabell 1 er omsetning og utbytte stasjonært etter at omdannelsesgraden for blandingen av optisk aktive isomere har nådd 50% (molforhold).
1-4. Isolering og rensing av den ønskede forbindelse
Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering fra reaksjonsoppløsningen. Det overlig-gende lag justeres til pH 3,0 med 2n saltsyre og påføres på en søyle (2,6 cm bred, 51 cm høy), som var pakket med 270 ml "Diaion HP-10". Elueringen utføres med ionevekslet vann og eluatet oppsamles i 5 ml fraksjoner. Den ønskede forbindelse elueres fra fraksjonene 280 ml til 315 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum, lyofiliseres og opp-løses i en liten mengde av en blanding av vann og metanol (50:50 etter volum, hvilket vil gjelde i det følgende). Oppløsningen påføres på en søyle (1,6 cm bred, 64,5 cm høy), som er pakket med 130 ml "Sephadex R LG-20". Elu-ering utføres med en blanding av vann og metanol (50:50). Eluatet oppsamles i 5 ml fraksjoner. Fraksjonene fra 65 ml til 8 5 ml ble kombinert og inndampet under vakuum for fjerning av metanolen. Inndampingsresten lyofiliseres for dannelse av 48 mg av et hvitt pulver. Egenskapene for dette produkt er som følger: IR(KBr)v : 1800, 1790, 1775, 1640, 1620
IliaX
NMR (100M D20-DSS)<$: 6,46 (1H, dd, J=3,5, 4,7 Hz),
J=5,2 Hz), 4,06 (lH,m), 2,5-1,5 (4H,m)
Det avsløres at forbindelsen har et mol saltsyre
og vann. Forbindelsens egenskaper stemmer godt overens med de til den tilsvarende dl-forbindelse. Verdien for optisk rotasjon er [o]p = +48° (c = 0,5, i 1 molar fosfatbuffer-oppløsning (pH 0,7)), hvilket stemmer godt overens med verdien i nedenfor angitte eksempel 2, [o]D 15° = 48,5o (c =0,5, i en molar fosfatbufferoppløsning (pH 7,0)).
Forbindelsen viser en enkelt flekk som er ninhydrin-positiv ved en Rf-verdi på 0,22 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (tynnsjiktsplate "Merck Art 5721"), til utvikling benyttet oppløsningsmiddel isopropanol:eddiksyre:vann lik 4:1:1. Rf-verdien stemmer overens med den til den optisk aktive dl-forbindelse.
Eksempel 2
Fremstilling av (+)-cis-7-amino-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (alternativ fremgangsmåte). 2-1. Fremstilling av suspensjon av sprengte celler.
Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 1-1.
2-2. Fremstilling av en substratoppløsning.
100 mg (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-1- aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre fremstilt ifølge DE-OS 2911787 oppløses i 5 ml 1/30 molar fosfat-bufferoppløsning (pH 6,5).
2- 3. Enzymomdannelsen.
5 ml av den ovenfor omtalte suspensjon av sprengte celler tilsettes til 5 ml av substratoppløsningen, og enzymomsetningen utføres ved 30°C i 24 timer.
2-4. Isolering og rensing.
Man oppnår 46 mg av et hvitt pulver ved en metode analog med den i eksempel 1-4. Egenskapene for denne forbindelse faller godt sammen med egenskapene for den forbindelse som ble fremstilt i eksempel 1.
j- o j 15° = 48,5° (c = 0,5, i 1 molar fosfatbuf feroppløsning _
(pHD7,0) ) .
Eksempel 3
Fremstilling av (-)-cis-73-amino-4ø-metyl-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre.
3-1. Fremstilling av suspensjon av sprengte celler.
Man gjentar fremgangsmåten som i eksempel 1-1.
3-2. Fremstilling av en substratoppløsning.
Man anvender samme fremgangsmåte som i eksempel 1-2 med unntagelse av at man benytter (-)-cis-73-fenylacetamido-4<7-metyl-l-azabicyklo- [4,2, 0 ]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt ifølge DE-OS 2911787.
3-3. Enzymomsetning
Man gjentar fremgangsmåten i eksempel 1-3 med unntagelse av at man.benytter suspensjonen av sprengte celler og substratoppløsningen, slik som fremstilt ifølge 3-1 og 3-2. Omsetningsforholdet blir stasjonært på 1 time. Omsetningen fortsettes i 120 min. Utbyttet er 50% (molforhold)
av (-)-substratet.
3-4. Isolering og rensing av den ønskede forbindelse.
Man gjentar nesten samme fremgangsmåte som i eksempel 1-4. Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering fra reaksjonsoppløsningen. Det overlig-gende lag påføres på en søyle (2,5 cm bred, 46 cm høy),
som er pakket med 220 ml "Diaion HP-10". Elueringen utføres med ionevekslet vann og eluatet oppsamles i fraksjoner på
5 ml. Den ønskede forbindelse elueres i fraksjonene mellom 200 ml og 270 ml. Fraksjonene inndampes under vakuum, lyofiliseres og oppløses i en liten mengde vann og metanol (50:50). Oppløsningen påføres på en søyle (1,6 cm bred, 64,5 cm høy), som er pakket med 130 ml "Sephadex LH-20" og elueringen utføres med en blanding av vann og metanol (50:50). Eluatet oppsamles i fraksjoner på 5 ml. Fraksjonene fra 65 ml til 80 ml forenes og inndampes for fjerning av metanolen. Deretter lyofiliseres inndampingsresten til dannelse av 30,5 mg av et hvitt pulver. Forbindelsens egenskaper er som følger: IR(KBr)v™ : 1800, 1770 (sh), 1760 (sh), 1740, 1680, 1630
ms. x
NMR(100M D20-DSS)6: 6,16 (1H,d,J=5,1 Hz), 4,52 (lH,d,
J=4,9Hz), 3,86 (lH,m), 2,64 (lH,m), 1,9-1,4 (2H,m), 1,10 (3H,d,J=7,3 Hz)
Det avsløres at forbindelsen er et kaliumsalt med 2 molekyler vann. De ovenfor beskrevne egenskaper stemmer godt overens med de til tilsvarende dl-forbindelser. Forbindelsen viser en positiv enkel flekk med ninhydrin ved Rf=0,33 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi
(man benytter samme silisiumdioksydgel som i eksempel 1-4). Rf-verdien stemmer overens med den til den optisk inaktive d,1-forbindelse.
15° o
Optisk rotasjon [o]D = -30 (c=0,5, i 1 molar fosfatbufferoppløsning). Denne verdi stemmer godt overens med den som ble funnet i eksempel 4 -30,8° (c=0,5 i 1 molar fosfatbufferoppløsning) (pH 7,0).
Eksempel 4
Fremstilling av (-)-cis-7P-amino-4o-metyl-l-azabicyklo-'
[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (alternativ fremgangsmåte) .
4-1. Fremstilling av suspensjon av sprengte celler.
Man gjentar samme fremgangsmåte som i eksempel 3-1. 4-2. Fremstilling av substratoppløsning.
100 mg (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-4a-metyl-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre som er fremstilt ifølge DE-OS 2.911.787 oppløses i 5 ml av en 1/30M fosfatbufferoppløsning (pH 6,5).
4-3. Enzymomsetning
Analogt med eksempel 1-3 tilsettes 5 ml av den ovenfor beskrevne suspensjon av sprengte celler til 5 ml av substratoppløsningen, og enzymomsetningen utføres ved en temperatur på 30°C i 24 timer.
4-4. Isolering og rensing av den ønskede forbindelse.
Man gjentar fremgangsmåten i eksempel 3-4 for dannelse av 55 mg av et hvitt pulver. Denne forbindelses egenskaper passer godt sammen med de som er funnet i eksempel 3.
Optisk rotasjon [a]^ = -30,8 (c=0,5 i 1 molar fosfatbufferoppløsning (pH 7,0)).
Eksempel 5 Fremstilling av (+)-cis-73-amino-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (alternativ fremgangsmåte): 5-1. Dyrking av mikroorganismer
Som podings-mikroorganismer anvendes følgende
Som substrat anvendes en vandig oppløsning inneholdende 1% kjøttekstrakt, 1% pepton, 0,3% natriumklorid og 0,5% gjærekstrakt, og som er justert til en pH-verdi på 7,2 med 5n NaOH. Man tilsetter en løkkefull podningsmateriale til 30 ml av podningssubstratet i en 300 ml Erlenmeyerkolbe og dyrkingen utføres ved en temperatur
på 30°C i løpet av 24 timer. Man vasker de tørrlegemer som er fremstilt ved sentrifugering fra dyrkingsvæsken,
med 5 ml 0,9% saltoppløsning og innvinner dem igjen ved sentrifugering derfra. Cellene bringes til suspensjon i en 1/30 molar fosfatbuffer (pH 7,0) i en konsentrasjon på 20 mg/ml beregnet på tørrstoff.
5-2... Fremstilling av en s ub stra topp løsning.
150 mg (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-1- aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt ifølge DE-OS 2.911.787, oppløses i 15 ml av en 1/30 molar fosfatbuffer (pH 7,0).
5-3. Enzymomsetning
0,5 ml av suspensjonen av celler fremstilt i overensstemmelse med eksempel 5-1 og 0,5 ml av substrat-oppløsningen blandes, og blandingen får omsettes ved en temperatur på 30°C i løpet av 20 timer.
5-4. Identifikasjon av reaksjonsproduktet.
Det er mulig å bestemme innholdet av diastereoisomere av (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido3-1-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre ved hjelp av hurtig væskekromatografering, slik som omtalt i DE-OS 2.911.787. I foreliggende eksempel bestemmes de diastereoisomere ved en slik metode. Kvantitativ bestemmelse av 7-amino-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre som er fremstilt ved ovennevnte enzymomsetning 5-3, kan også gjennomføres på samme måte.
Som det fremgår av tabell 2 forblir i reaksjons-oppløsningen en mer polar diastereoisomer, f.eks. (-)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2- en-8-on-2-karboksylsyre uomdannet, og en mindre polar isomer, f.eks. (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-1-aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre forminskes: Svarende til denne forminskelse dannes det en topp av (+)-cis-7-amino-1-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-kårboksylsyre. Den eksisterende ubalanse mellom forminskel-sen av (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-1-aza-bicyklo- [4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre og dannelsen av (+)-cis-7-amino-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2- • karboksylsyre er begrunnet ved tilstedeværelsen av 3-laktamase i omsetningssystemet.
Enzymer fra alle de i tabell 2 angitte mikroorganismer er i besittelse av en evne til å danne optisk aktive forbindelser med den absolutte konfigurasjon (6R,7S) ved selektiv deacylering av cefalosporin-analoger. Eksempel 6 Fremstilling av ( + )-cis-7-amino-l-azabicyklo-[4, 2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (alternativ fremgangsmåte): Clostridium acetobutylicum IFO 3346 podes i 100 ml potetdekstrose-buljong. Luften i fermenteringsbeholderen erstattes med sterilisert nitrogengass og fermenteringsbeholderen forsegles. Dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C i 48 timer.
Etter dyrkingen, fjernes cellene, vaskes med fysio-logisk saltoppløsning og bringes til suspensjon i 2 ml 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 7,0). 0,5 ml av den sub-stratoppløsning som er fremstilt analogt med eksempel 5-2 og suspensjonen av celler forenes, og får omsettes med hverandre ved en temperatur på 30°C i 20 timer. Omsetningen overvåkes som beskrevet i eksempel 5-4. (-)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre forblir uomdannet og kun (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-aminoacetamido]-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre forminskes. Mengden av forminskelse er på 1,0 mg og fører til fremstillingen av 0,2 mg av (+)-7-amino-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre.
Eksempel 7
Fremstilling av (-)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:
7-1. Fremstilling av suspensjon av sprengte celler.
1) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv deacylering.
Som podningsstamme anvendes Kluyvera citrophila ATCC 21285 (biologiske egenskaper er beskrevet i
"J. General Applied Microbiology" 3, 28-31 (1957)).
Som podningssubstrat anvendes en vandig oppløsning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjøtt-ekstrakt, 0,5% natriumglutamat og 0,25% natriumklorid, og som er regulert til en pH-verdi på 7,0 med 5n NaOH. En løkkefull podningsmateriale podes i 10 ml av podningssubstratet i et 50 ml stort reagensglass og dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C i løpet av 24 timer. Den samlede mengde podningsvæske podes ut i 300 ml dyrkningssubstrat i en 2 liter Erlenmeyerkolbe og dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C under rysting. Sammensetningen av hovedporsjonen av dyrkningssubstrat er den samme som i podningssubstratet. 2) Fremstilling av suspensjonen av sprengte celler.
Etter dyrkingen i 24 timer utsettes dyrkingsvæsken for sentrifugering til oppsamling av cellelegemene. Cellene vaskes to ganger med 50 ml 0,9% saltoppløsning og bringes til suspensjon i en konsentrasjon på 40 mg/ml beregnet på tørrstoff i en 1/30 molar fosfatbufferoppløsning (pH 8,0).
7-2. Fremstilling av en substratoppløsning.
200 mg (+)-cis-7-fenylacetamido-3-klor-l-aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre som er fremstilt analogt med etterfølgende referanseeksempel 7, tilsettes til 9 ml 1/30 molar fosfatbuffer (pH 8,0). Ettersom forbindelsene ikke oppløses tilsettes 2n NaOH i små mengder og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 8,0 for oppløsning av forbindelsen. Til slutt tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml oppløsning.
7-3. Enzymomsetning
10 ml av den ovenfor nevnte suspensjon av sprengte celler tilsettes til 10 ml av substratoppløsningen og enzymomsetningen utføres ved en temperatur på 40°C i løpet av 80 min. Det tidsmessige forløp av omsetningen er illu-strert i tabell 3.
7-4. Isolering og rensing av den ønskede forbindelse.
Etter avslutning av omsetningen fjernes cellene ved sentrifugering fra reaksjonsoppløsningen. Det øverste væskelag inndampes under vakuum til dannelse av 5 ml opp- • løsning. Oppløsningen påføres en søyle (1,75 cm bred, 42 cm høy) som er pakket med "Diaion HP-10" . Elueringen utføres med ionevekslet vann. Den ønskede forbindelse elueres fra fraksjonene mellom 90 ml og 120 ml. Disse fraksjoner inndampes under vakuum til dannelse av 2 ml oppløsning og opp-løsningen justeres til pH 3,5 med ln saltsyre for bunn-felling av krystaller. Krystallene fjernes ved filtrering, vaskes med en liten mengde metanol og tørkes til dannelse av 38 mg av et hvitt pulver. Reaksjonsproduktets egenskaper er som følger.
-1
IR(KBr) Cm„ : 3200, 1800, 1790 (sh), 1640 (sh), 1630, 1555
NMRdOOM D20-DSS) : 4, 47 (1H, d, J=5,1 Hz) , 3,88(lH,m),
2,64(2H,m), l,93(2H,m)
Optisk rotasjon = 2,7° (c=0,24, 1 molar fosfatbuffer
pH 7,0)
Referanseeksempel 1
Fremstilling av (+)-cis-7-[2-amino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoacetamido]-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:
131,3 mg (0,30 mmol) 2- (2-tritylamino-4-tiazolyl) -» 2-syn-metoksyiminoeddiksyre oppløses i 1 ml vannfritt diklormetan, og 4,1 yl trietylamin tilsettes ved en temperatur på -20°C. Etter tilsetning av 61,7 mg fosforpenta-klorid får blandingen omsettes ved en temperatur på -20°C
i løpet av 30 min., hvoretter den inndampes under vakuum. Inndampingsresten oppløses i 1 ml vannfritt tetrahydrofuran for dannelse av en syrekloridoppløsning.
Uavhengig herav oppløses 40,2 mg (0,17 mmol) av monohydratet av hydrogenkloridsaltet av (+)-cis-7-amino-1-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt analogt med eksempel 1, i en blanding av 1 ml tetrahydrofuran og 1 ml vann, og det tilsettes 116,2 yl trietylamin. Den ovenfor fremstilte syrekloridoppløsning tilsettes dråpevis til denne oppløsning under omrøring og underisavkjøling, og blandingen får omsettes i 1 time. Deretter justeres blandingen til en pH-verdi på 2,0 med
5% saltsyre og den ekstraheres tre ganger med 10 ml etylacetat. Etylacetatlaget vaskes med 10 ml mettet saltopp-løsning, tørkes med mettet natriumsulfat (og vann)/ og inndampes under vakuum til dannelse av 9 3 mg av den rå, acylerte forbindelse. Reaksjonsproduktet oppløses i 50% eddiksyre og holdes under omrøring ved en temperatur på 50°C i halvannen time. Oppløsningen avkjøles til romtemperatur og det utfelte hvite bunnfall fjernes ved filtrering. Filtratet inndampes og inndampingsresten oppløses i en liten mengde dimetylsulfoksyd. Oppløsningen tilsettes til en søyle som er pakket med 10 ml "HP-10", og elueringen utføres med vann skiftende til en blanding av vann og metanol (1:2). Slike fraksjoner som viser en Rf-verdi på 0,3 med silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (plate: "Merck Art. 5719", oppløsningsmiddel: butanol:eddiksyre: vann lik 4:1:1) forenes og inndampes under vakuum til dannelse av 13,5 mg (utbytte 22,4%) i form av hvite krystaller. Reaksjonsproduktets egenskaper er som følger: Smp.: 172°C (dékomp.)
[o]p 1 rO = 32,6° (DMSO, c=0,5)
CItl ^~
IR(KBr)vmax: 1765, 1660, 1630, 1545
PMR(DMSO-d6) <S: 9,26(lH,d), 7,19(2H,s), 6,75(lH,s),
6,28(lH,t), 5,50(lH,d-d, J=8,9, 4,7 Hz), 3,83(3H,s), 2,5-l,0(4H,m)
Disse verdier stemmer godt overens med de til tilsvarende d,1-forbindelse. Ut fra den kraftige antimikrobielle virkning antas det at denne forbindelses absolutte konfigurasjon er (6R,7S).
Referanseeksempel 2
Fremstilling av (-)-cis-73-[2-(2-amino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoacetamido]-4ø-metyl-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:
76 mg (0,17 mmol) 2-(2-tritylamino-4-tiazolyl)-2-syn-metoksyiminoeddiksyre oppløses i 1,52 ml vannfritt diklormetan, og 17,3 mg (0,17 mmol) trietylamin tilsettes ved en temperatur på -15°C. Etter tilsetting av 35,7 mg (0,17 mmol) fos forpentaklorid får blandingen omsettes under omrøring ved en temperatur på -15°C i løpet av 30 min. Reaksjonsblandingen inndampes under vakuum og inndampingsresten oppløses i 2 ml vannfritt tetrahydrofuran til dannelse av syrekloridoppløsning.
Uavhengig herav oppløses 28 mg (0,10 mmol) av dihydratet av kaliumsaltet av (-)-cis-73-amino-4<7-metyl-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt analogt med eksempel 3, i 1,5 ml av en blanding av tetrahydrofuran og vann (1:1), og det tilsettes 36,6 mg (0,36 mmol) trietylamin til dannelse av en homogen oppløs-ning. Til denne oppløsning tilsettes dråpevis syreklorid-oppløsningen under omrøring og isavkjøling, og blandingen får reagere i 45 minutter. Deretter ekstraheres reaksjonsblandingen fire ganger med 3 ml etylacetat. Etylacetatlaget vaskes med 5 ml mettet saltoppløsning, tørkes med mettet natriumsulfat og inndampes under vakuum til dannelse av 107,1 mg av den rå, acylerte forbindelse, som er betegnet med formel (VII). Reaksjonsproduktet oppløses i 4,5 ml 50% eddiksyre og oppløsningen omrøres ved en temperatur på 50-55°C i 45 min. Etter avkjøling til romtemperatur, underkastes reaksjonsoppløsningen en filtrering til fjerning av et utskilt hvitt bunnfall og filterkaken vaskes med 2 ml 50% eddiksyre. Vaskevæsken og filtratet forenes og inndampes under vakuum. Inndampingsresten oppløses i en liten mengde dimetylsulfoksyd og føres på en kolonne som er pakket med 10 ml "HP-10". Elueringen utføres med vann og metanol (5:0 til 2:1). De fraksjoner som viser en Rf-verdi på 0,54 ved silisiumdioksydgel-tynnsjiktskromatografi (under anvendelse av tidligere angitte beting-elser) forenes og inndampes under vakuum til dannelse av 12,9 mg (utbytte 23,8%) av det ønskede produkt i form av et hvitt pulver. Reaksjonsproduktegenskapene er som føl-ger: [o]^<5>° = -27° (DMSO, c=0,5) - Smp.: (dekomp.) ca. 180°C
-1
cm
IR(KBr)v'r" : 1770, 1672, 1633, 1540
ula. X
PMR(DMSO-dg) <S: 9 , 26 (1H, d, J=8, 3 Hz) , 7,18(2H,s), 6,75(lH,s),
6,31(lH,d,J=5,l Hz), 5,51(lH,d-d), J=8,3, 5,0 Hz), 3,83(3H,s), l,67(2H,m), 1,07
(3H,d,J=7,3 Hz)
Verdiene stemmer godt overens med de til den tilsvarende d,1-forbindelsen. Ut fra den kraftige antimikrobielle aktivitet antas den absolutte konfigurasjon for denne forbindelse å være (4S,6R,7S).
Referanseeksempel 3
De antimikrobielle virkninger av forbindelsene fremstilt i referanseeksemplene 1 og 2 er som følger: Man anvender hjerteinfusjonsagar-fortynningsmetoden (pH 7,2). Den cefalosporinforbindelse som har den samme acyl-sidekjede tilsvarende d,1-forbindelsen anvendes som referanse.
A: Den i referanseeksempel 1 fremstilte forbindelse.
A<1>: Den d,1-forbindelse som tilsvarer den i referanseeksempel
1 fremstilte forbindelse.
B: Den i referanseeksempel 2 fremstilte forbindelse.
B<1>; Den d,1-forbindelse som tilsvarer den i referanseeksempel
2 fremstilte forbindelse.
C: Den cefalosporinforbindelse som er betegnet med følgende formel:
Referanseeksempel 4 Fremstilling av (+)-cis-7-azido-3-klor-2-tert-butyl-oksy-karbonyl-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on:
Foreliggende forbindelse fremstilles ifølge nedenstående fremgangsmåter a), b), c) og d) .
a) Fremstilling av ( + )-cis-7-azido-3-fenyltio-1-azabicyklo-[4,2,0]-oktan-8-on-2-karboksylsyre, t-butyl
ester:
528 mg (2 mmol) (+)-cis-7-azido-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester som er fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i DE-OS 2.911.786, oppløses i 15 ml vannfri benzen og 0,2 ml (2 mmol) tiofenol og 0,2 ml (2mmol) piperidin tilsettes. Blandingen omrøres ved romtemperatur i 2 timer. Etter avslutning av omsetningen vaskes reaksjonsoppløsningen med 10% sitronsyre og mettet saltoppløsning og den tørkes med vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum og den således fremstilte oljeaktige inndampingsrest renses ved silisiumdioksydgel-søylekromatografi under anvendelse av 30 g silisiumdioksydgel, og et oppløsningsmiddel bestående av etylacetat og n-heksan (1:4) for dannelse av 720 mg (96,3%) av den ønskede forbindelse.
Smp.: 77,5-78,0°C.
IRv<KBr> (CM -1) : 2110, 1765, 1745
max
NMR (CDC13)6: 7,27-7,60(5H,m), 4,78(1H,d,J=5 Hz),
4,33(lH,s), 3,78-3,98(lH,m), 3,81(lH,s),
1,50-2,34(4H,m), l,42(9H,s)
b) Fremstilling av (+)-cis-7-azido-3-fenylsulfinyl-1-azabicyklo-[4,2,0]-oktan-8-on-2-karboksylsyre-tert.-butylester:
480 mg (1,28 mmol) av den i referanseeksem-
pel 4-a) fremstilte 3-fenyltioforbindelse oppløses i 50 ml vannfri kloroform og 24 0 mg (1,41 mmol) m-klorperbenzo-syre under isavkjøling. Blandingen får reagere under om-røring og isavkjøling. Reaksjonsblandingen vaskes med mettet natriumhydrogenkarbonat og mettet natriumklorid og tørkes over vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum til dannelse av 500 mg (99,9%) av den ønskede forbindelse.
Smp.: 95,5-96,5°C
IRv^(cm 2120, 2100, 1780, 1735, 1035
Illa. X
NMR (CDC13)6: 7,55-7,91(5H,m), 4,87(1H,d,J=4,6Hz),
4,05(lH,s), 3,90-4,10(lH,m), 3,10(lH,s),
1,70-2,84(4H,m), l,30(9H,s)
c) Fremstilling av (+)-cis-7-azido-3-klor-3-fenyl-sulfinyl-l-azabicyklo-[4,2,0]-oktan-8-on-2-karboksylsyre-tert.-butylester:
109 mg av den i referanseeksempel 4-b)
fremstilte sulfoksydforbindelse oppløses i 1 ml vannfritt metylenklorid og 23,5 mg (0,42 mmol) kalsiumoksyd tilsettes. Etter tilsetting av 27 yl (0,34 mmol) sulfinyl-klorid får reaksjonsblandingen reagere under omrøring og isavkjøling i 1 time. Reaksjonsblandingen vaskes med 10% sitronsyre, mettet natriumhydrogenkarbonat og mettet natriumkloridoppløsning, og det tørkes med vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet fjernes ved destillasjon og den således fremstilte oljeaktige inndampingsrest underkastes silisiumdioksydgel-kromatografi under anvendelse av 5 g silisiumdioksydgel og et oppløsningsmiddel bestående av etylacetat og n-heksan (1:5) for dannelse av 66,5 mg (56,1%) av den rensede, ønskede oljeaktige forbindelse.
IRvSoSl3(cm-1): 2120, 1770, 1735, 1055
ITla X
NMR (CDC13)6: 7,53-8,00(5H,m), 4,90(1H,d,J=5Hz),
4,43(lH,s), 4,15-4,35(lH,m), 1,83-2,85
(4H,m), l,38(9H,s)
d) Fremstilling av (+)-cis-7-azido-3-klor-l-aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester:
1,3 g (3,06 mmol) 3-klor-3-fenylsulfinylforbindelse som er fremstilt i referanseeksempel 4-c), oppvarmes under tilbakeløp med 100 ml karbontetraklorid i 6 timer. Etter avslutning av omsetningen underkastes reaksjonsopp-løsningen destillasjon under vakuum for fjerning av opp-løsningsmidlet. Den således fremstilte inndampingsrest underkastes rensing ved silisiumdioksydgelkromatografi under anvendelse av 100 g silisiumdioksydgel, og et opp-løsningsmiddel bestående av etylacetat og n-heksan (1:5) for dannelse av 596 mg (65,2%) av den ønskede forbindelse. Smp.: 9 6-97°C
IRv<KBr> (cm<-1>): 2120, 1765, 1735, 1630
max
PMR (CDC£3)6: 4,93(1H,d,J=5Hz), 3,72-3,92(1H,m), 2,56-2,70(2H,m), 1,86-2,32(2H,m), l,55(9H,s), CMR (CDCÅ3)6: 127,7, 125,0
Referanseeksempel 5
Fremstilling av (+)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester:
350 mg (1,17 mmol) av den i ref eranseeksem-
pel 4 fremstilte azidoforbindelse oppløses i 20 ml etanol og 1,2 ml ln saltsyre og 70 mg 10% palladium-på-karbon. Gassformig hydrogen ledes gjennom blandingen ved romtemperatur og atmosfæretrykk i løpet av 3 timer og palladium-på-karbon fjernes ved filtrering. Filtratet inndampes under vakuum for dannelse av et fast stoff. Det faste stoff oppløses i vann og vaskes med eter. Mettet tilsetning av natriumhydrogenkarbonat for å gjøre oppløsningen svakt alkalisk ekstraheres vannlaget med etylacetat. Etylacetatlaget vaskes med mettet saltoppløsning og tørkes med vannfritt natriumsulfat. Oppløsningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum for dannelse av 218,4 mg (68,4%) av et pulver bestående av den ønskede forbindelse.
Smp.: 102,5-104,5°C
lRVKBr(cm-1) : 1770, 1720, 1620
max
NMR (CDC£3)6: 4,43(1H,d,J=5Hz), 3,52-3,90(1H,m),
2,52-2,72(2H,m), 2,22(2H,br), 1,87-2,17
(2H,m), l,55(9H,s)
Referanseeksempel 6
Fremstilling av trifluoracetatet av (+)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:
102/2 mg (0,31 mmol) av den i referanseeksempel 5 fremstilte aminoesterforbindelse og 1 ml trifluoreddiksyre blandes under isavkjøling. Blandingen omrø-res ved romtemperatur i 30 min. Oppløsningen fjernes ved destillasjon under vakuum for dannelse av en oljeaktig inndampingsrest. Til inndampingsresten tilsettes eter og det således oppnådde pulver innvinnes ved filtrering. Pulveret lyofiliseres for dannelse av 75,5 mg (60,9%) av den ønskede forbindelse.
Smp.: 208-220°C (dekomp.)
IR KBr (cm-1): 1795, 1630
max
Referanseeksempel 7
Fremstilling av (+)-cis-7-fenylacetamido-3-klor-l-azabi-cyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:
150 mg (0,45 mmol) av trifluoracetatet av (+)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, som er fremstilt som angitt i referanseeksem-
pel 6, oppløses i en blanding av 2 ml vann og 2 ml aceton og 134 mg (1,5 mmol) natriumhydrogenkarbonat tilsettes til oppløsningen for å gjøre denne homogen. Blandingen tilsettes 0,5 ml fenylacetylklorid under avkjøling i 1 time, og blandingen omrøres i 3 timer. Reaksjonsblandingen justeres til en pH-verdi på 2 med ln saltsyre og ekstraheres fem
ganger med 2 ml etylacetat. Ekstraktet inndampes under vakuum og tørkes til dannelse av 80 mg (55,0%) av den ønskede forbindelse.
IRvKB^ (cm-1): 1790, 1705, 1630, 1560
irtcix
NMR (CD3OD)6: 7,29(5H,s), 5,36(lH,d,J=5Hz), 3,79-3,99
(lH,m), 2,56-2,75(2H,m), 1,17-2,02(2H,m) Referanseeksempel 8
Fremstilling av (+)-cis-7-[(R)-2-fenyl-2-tert.-butyloksy-karbonylamino]-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester:
150 mg (0,55 mmol) av (+)-cis-7-amino-3-klor-l-aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester, som er fremstilt som i referanseeksempel 5, oppløses i 3 ml vannfritt metylenklorid. Uavhengig herav oppløses 166 mg (0,66 mmol) av N-tert-butyloksykarbo-nyl-(R)-fenylglycin i 5 ml vannfritt tetrahydrofuran og oppløsningen avkjøles til en temperatur på -15 til -10°C. Deretter tilsettes 0,66 ml ln n-metylmorfolin i tetra-hydrof uran og 0,66 ml ln isobutylklorformeat i tetrahydrofuran dråpevis til oppløsningen og oppløsningen omrøres ved en temperatur på -15 til -10°C i 20 min. Ved samme temperatur tildryppes den ovenfor fremstilte aminoppløs-ning til oppløsningen og temperaturen heves gradvis til romtemperatur. Blandingen omrøres ved romtemperatur natten over. Etter tilsetning av 10 ml metylenklorid vaskes reaksjonsblandingen med 10% sitronsyreoppløsning, mettet natriumhydrogenkarbonat og mettet saltoppløsning, det tørkes med vannfritt natriumsulfat og inndampes under vakuum. Den oppkonsentrerte oppløsning underkastes silisiumdioksydgel-kromatografi under anvendelse av 20 g silisiumdioksydgel ("Wako-gel C 200") og et oppløsningsmiddel av etylacetat og n-heksan (1:5 etter volum, idet dette også
gjelder i det følgende) til dannelse av 124 mg (utbytte 44,6%) av en blanding av diastereoisomere forbindelser av den ønskede forbindelse.
Reaksjonsproduktets egenskaper er som følger: IRv<KBr>(cm<-1>): 1780, 1730, 1680, 1655, 1550
max
NMR (CDC£3)6: 7,34 (5/2H,s) , 7,31(5/2H,s), 6,93(lH,m),
5,63(lH,m), 5,30(l/2H,dd,J=5,4, 6,8Hz), 5,11-5,22(3/2H,m), 3,76-3,91(lH,m), 2,33-2,66(2H,m), l,52(9H,s), l,41(9H,s),
0,92-l,97(2H,m)
Referanseeksempel 9
Fremstilling av (6R,7S) 7-(R)-fenylglycinamido-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (A) og (6S,7R), 7-(R)-fenylglycinamido-3-klor-l-aza-bicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre:
Til 128,4 mg (0,25 mmol) (+)-cis-7-(2-feny1-2-tert.-butyloksykarbonylaminoacetamido)-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre, tert.-butylester, som er fremstilt som i referanseeksempel 8, tilsettes 1 ml metylenklorid og 1 ml trifluoreddiksyre under isavkjø-ling, og blandingen omrøres under isavkjøling i halvannen time. Oppløsningsmidlet fjernes ved destillasjon under vakuum og det således dannede oljeaktige reaksjonsprodukt underkastes hurtiggående væskekromatografi under anvendelse av "Micro-Bondapack C-18" og med et oppløsningsmiddel på 7% metanol og 0,2n Kf^PO^ for adskillelse av de diastereoisomere. Hver av de eluerte fraksjoner inndampes under vakuum og de konsentrerte oppløsninger underkastes avsalting med
"Diaion HP-10" og et oppløsningsmiddel bestående av metanol og vann (1:1) for dannelse av 9,4 mg av den mer polare isomer (B) og 7,6 mg av den mindre polare isomer (A).
Totalt utbytte 19,1%. Mer polare isomer (B)
[ø]£<10>: -75,8° (c-0 4, H20)
Smp.: over 300°C (brunfarget)
IRv<KBr> (cm"<1>): 1765, 1700, 1550
ms x
NMR (D20)6: 7,49(5H,s), 5,16(lH,d,J=4,7Hz), 5,05(lH,s),
3,78-4,03(lH,m), 2,53-2,67(2H,m), 1,26-2,09
(2H,m)
Mindre polare isomer (A)
: +34,0° (c=0 35, H20)
Smp.: over 300°C (brunfarget)
IRv^(cm-1): 1770, 1700, 1620
in cl x
NMR (D20)6: 7,51(5H,s), 5,36(1H,d,J=4 6Hz), 5,19(lH,s),
3,83-4,00(lH,m), 2,41-2,56(2H,m), 1,49-1,76 (lH,m), l,14-l,45(lH,m)
Den absolutte struktur av isomeren (A) er bestemt til (6R,7S) basert på den sterke antibakterielle aktivitet for den mindre polare isomer (A), som angitt i det følgende. Ref eranseeksempel 10 '.
Fremstilling av (6R,7S) 7-(R)-fenylglycinamido-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (alternativ fremgangsmåte):
10-1) Fremstilling av cellesuspensjon.
a) Dyrking av en mikroorganisme som har evne til optisk selektiv acylering.
Som podningsstamme anvendes Pseudomonas melanogeum ATCC 17808 (de biologiske egenskaper er beskrevet i "Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan" 37, 71
(1963)).
Som podningssubstrat anvendes en vandig oppløsning inneholdende 1% polypepton, 1% gjærekstrakt, 0,5% kjøtteks-trakt, 0,5% natriumglutamat og 0,25% natriumklorid, som justeres til en pH-verdi på 7,0 med 5n NaOH. En løkkefull podningsmateriale podes i 10 ml av podningssubstratet i et 50 ml stort reagensglass og dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C i 24 timer. Den samlede mengde av podningssubstratet anbringes i 300 ml av dyrkningssubstra-tet i en 2 liter Erlenmeyerkolbe og dyrkingen utføres ved en temperatur på 30°C. Sammensetningen av dyrkingssubstra-tet er den samme som sammensetningen av podningssubstratet.
b) Fremstilling av cellesuspensjon.
Etter dyrking i 24 timer fjernes cellelegemene fra
dyrkingsvæsken og vasking foretas to ganger med 50 ml 0,9% saltoppløsning. Cellene bringes til suspensjon i en konsentrasjon på 20 mg/ml beregnet på tørrstoff i 1/30 molar fosfatbuffer (pH 6,5).
10-2) Fremstilling av en substratoppløsning.
200 mg av trifluoracetatet av (+)-cis-7-amino-3-klor-l-azabicyklo-[4,2,0]-okt-2-en-8-on-2-karboksylsyre (utgangsforbindelse a), som er fremstilt som i sammenlig-ningseksempel 6, og 800 mg av hydrogenkloridsaltet av d-fenylglycinmetylester (utgangsforbindelse b) tilsettes 9 ml 1/30 molar kaliumfosfatbuffer (pH 6,5). 5n KOH tilsettes i små mengder, og blandingen reguleres igjen til en pH-verdi på 6,5 for oppløsning av de to utgangs forbindelser. Til slutt tilsettes ionevekslet vann til dannelse av 10 ml oppløsning.
10-3) Enzymomsetning.
10 ml av cellesuspensjonen tilsettes til 10 ml av substratoppløsningen og enzymomsetningen utføres ved en temperatur på 30°C i halvannen time. Omsetningen overvåkes ved hurtiggående væskekromatografi under anvendelse av "Tri rotar" samt "Prepack column Nucleosil 10C18" . Elueringen utføres med 7% metanol-0,2 molar KH2PO^-oppløsning. Omsetningen når sitt maksimum ved et utbytte på 9 0% i for-hold til utgangsforbindelsen a) i løpet av halvannen time. 10-4) Isomering og rensing av den ønskede forbindelse: Etter avslutning av omsetningen fjernes cellelegemene fra reaksjonsoppløsningen ved sentrifugering.
Det øvre lag inndampes under vakuum og tilsettes på en søyle (1,6 cm bred, 50 cm høy) som er pakket med "Diaion HP-10". Etter tilsetning av 200 ml ionevekslet vann, utføres elueringen ved 2 5% vandig metanoloppløsning. Deretter inndampes de fraksjoner som inneholder den ønskede forbindelse under vakuum til dannelse av et 5 ml konsentrat. Dette konsentrat påføres på en søyle (1,6 cm bred, 64,5 cm høy), som er pakket med 130 ml "Sephadex-LH20" og elueringen utføres med et oppløsningsmiddel bestående av vann og metanol (50:50). Den ønskede forbindelse elueres i fraksjonene fra 55 ml til 75 ml. Disse fraksjoner inndampes under vakuum og lyofiliseres til dannelse av 78 mg hvitt pulver. Dette reaksjonsprodukts egenskaper faller sammen med den mindre polare isomer (A) beskrevet i referanseeksempel 9.
De antibakterielle aktiviteter av forbindelsene fremstilt i referanseeksemplene 9 og 10 er anført i nedenstående tabell. Man benyttet hjerteinfusjonsagar fortynningsmetoden (pH 7,2). Stoffet Cefazolin ble benyttet som referansemateriale.

Claims (2)

1. Cefalosporin-analoger, karakterisert ved at de har den generelle formel: med (6R,7S)-konfigurasjon hvor R<1> betyr hydrogen eller alkyl med 1-5 karbonatomer, og R betyr hydrogen eller halogen, samt salter derav.
2. Fremgangsmåte for fremstilling av cefalosporin-analoger med den generelle formel (I) ifølge krav 1 eller salter derav, karakterisert ved at man omsetter en forbindelse med den generelle formel: hvor R' betyr en fenylgruppe som eventuelt er substituert med en eller flere hydroksygrupper; X' betyr hydrogen eller 1 2 amino; R og R har den i Tcrav 1 angitte betydning; og hydrogenatomene i 6- og 7-stillingene har cis-konfigurasjon, med et enzym som er i stand til optisk selektivt deacylering, og som er oppnådd fra en mikroorganisme tilhørende en av slektene Aeromonas, Achromobacter, Arthrobacter, Acetobacter, Alcaligenes, Escherichia, Xanthomonas, Kluyvera, Glucono bacter, Clostridium, Comamonas, Corynebacterium, Sarcina, Staphylococcus, Spirillum, Bacillus, Pseudomonas, Flavo bacterium, Brevibacterium, Protaminobacter, Proteus, Beneckea, Micrococcus, Mycoplana og Rhodopseudomonas, og er i form av en renset enzymoppløsning, cellelegemer utvunnet fra en dyrkningsbuljong, en cellesuspensjon, en suspensjon av sprengte celler, et ekstrakt befridd for celler eller en dyrkningsvæske av mikroorganismen, hvoretter man utvinner den dannede optisk aktive forbindelse, eventuelt i form av et salt.
NO800314A 1979-02-10 1980-02-06 Optisk aktive cefalosporin-analoge og salter derav samt fremgangsmaate for deres fremstilling. NO155547C (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1453379A JPS55108872A (en) 1979-02-10 1979-02-10 Optically active cephalosporin analog
JP10707079A JPS5630976A (en) 1979-08-24 1979-08-24 Optically active cephalosporin analog
JP14648879A JPS5671092A (en) 1979-11-14 1979-11-14 Optical active cephalosporin analogous derivative

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO800314L NO800314L (no) 1980-08-11
NO155547B true NO155547B (no) 1987-01-05
NO155547C NO155547C (no) 1987-04-15

Family

ID=27280673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO800314A NO155547C (no) 1979-02-10 1980-02-06 Optisk aktive cefalosporin-analoge og salter derav samt fremgangsmaate for deres fremstilling.

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0014475B1 (no)
AR (1) AR226552A1 (no)
AU (1) AU5538180A (no)
CA (1) CA1146886A (no)
DE (1) DE3066533D1 (no)
DK (1) DK170072B1 (no)
ES (1) ES8101646A1 (no)
NO (1) NO155547C (no)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5671092A (en) * 1979-11-14 1981-06-13 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Optical active cephalosporin analogous derivative
US4708956A (en) * 1985-12-12 1987-11-24 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 3-position halogenated cephalosporin analogs and pharmaceutical compositions
IL84051A0 (en) * 1986-10-03 1988-03-31 Lilly Co Eli 7-((meta-substituted)phenylglycine)1-carba-1-dethiacephalosporins
DE3803169A1 (de) 1988-02-03 1989-08-17 Bayer Ag Ss-lactam-antibiotika, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als und in arzneimitteln
US5099015A (en) * 1991-01-10 1992-03-24 Eli Lilly And Company Trifluoromethyl 1-carba(1-dethia)cephems
IT1250698B (it) * 1991-07-24 1995-04-21 Mini Ricerca Scient Tecnolog Processo per la preparazione enzimatica di acidi 7-ammino-cefalosporanici.

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2714880A1 (de) * 1977-04-02 1978-10-26 Hoechst Ag Cephemderivate und verfahren zu ihrer herstellung
SE7902598L (sv) * 1978-03-25 1979-10-04 Kyowa Hakko Kogyo Kk Cephalosporinanaloger

Also Published As

Publication number Publication date
DK170072B1 (da) 1995-05-15
EP0014475A1 (en) 1980-08-20
DE3066533D1 (en) 1984-03-22
AU5538180A (en) 1980-08-14
NO155547C (no) 1987-04-15
ES488427A0 (es) 1980-12-16
AR226552A1 (es) 1982-07-30
EP0014475B1 (en) 1984-02-15
ES8101646A1 (es) 1980-12-16
NO800314L (no) 1980-08-11
DK54980A (da) 1980-08-11
CA1146886A (en) 1983-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4544154B2 (ja) 変異型ｄ−アミノトランスフェラーゼおよびこれを用いた光学活性グルタミン酸誘導体の製造方法
CA1171373A (en) Optically active cephalosporin analogs
US3239394A (en) Process for producing 7-amino-cephalosporanic acid
US4774179A (en) Process for preparing a 7-aminocephalosporanic acid compound
KR970000185B1 (ko) 아실아미노산 라세마제, 그의 제조방법 및 용도
NO147570B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av d-fenylglycin ved enzymatisk omdannelse av d,l-fenylhydantoin
NO155547B (no) Optisk aktive cefalosporin-analoge og salter derav samt fremgangsmaate for deres fremstilling.
US4335211A (en) Process for producing optically active cephalosporin analogs
US4981789A (en) One-step enzymatic conversion of cephalosporin C and derivatives to 7-aminocephalosporanic acid and derivatives
US5849568A (en) Resolution of racemic indene oxide to yield (1S,2R)-indene oxide using Diplodia gossipina
US4316958A (en) Process for producing optically active cephalosporin analogs
US5104800A (en) One-step cephalosporin c amidase enzyme
US5441888A (en) Process for producing D-mandelic acid from benzoylformic acid
US4302540A (en) Process of producing optically active cephalosporin analogs by enzyme selective deacylation
US4302541A (en) Process of producing optically active cephalosporin analogs by enzyme selective deacylation
US4332896A (en) Process for producing cephalosporin analogs
JP2712331B2 (ja) アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法および用途
NO802714L (no) Optisk aktive cefalosporin-analoge karbacefemforbindelser og salter derav, samt fremgangsmaate til fremstilling derav
SU1034607A1 (ru) Способ получени оптически активных производных цис-7-амино-1-азабицикло-(4,2,0)-окт-2-ен-8-он-2-карбоновой кислоты
KR100260837B1 (ko) 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법
JPH0898683A (ja) ７−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ
JP3866357B2 (ja) 熱安定性耐溶媒性エステル分解酵素
JPH08275776A (ja) 新規キチナーゼ及びその製造方法
JPH05339222A (ja) アミド化合物の製造方法
CZ76393A3 (en) Micro-biological process for preparing derivatives of malonyl-7-aminocephalosporanic acid