NO153731B - Fremgangsmaate for isolering av fysiologisk aktive pterocarpanforbindelser i krystallinsk form. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte

for isolering av pterocarpanforbindelser i krystallinsk form fra roten av treet cabeca de negra.

Det er kjent at det vandige alkoholiske ekstrakt

av roten av det sydamerikanske cabeca de negra tre har vært tilgjengelig for plantasjearbeidere i den øvre Amazonas-jungel som en oral motgift mot slange- og edderkoppgift.

Ca. ti varianter av arten cabeca de negra er kjent i Syd-Amerika. Hverken arten av de aktive bestanddeler eller under-søkelse over bivirkninger, farmakologisk aktivitet, stabili-tet og lignende har vært publisert når det gjelder forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen. Pterocarpaner som utviser anti-mikrobiologiske egenskaper er blitt identifisert i litteraturen, se Heterocycles, Vol. 15, 1163 (1981).

Pterocarpanforbindelsene som isoleres i krystallinsk form ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, har formel (Ia)

og formel (Ib) Hensiktsmessig vil forbindelsene med de ovenfor angitte formler heretter bli angitt som cabenegrin Ia [3-hydroxy-4-(3<1->hydroxymethyl-buten-2<1>)-8,9-methylen-dioxy-pterocarpan] og cabenegrin Ib [2-(3<1->hydroxymethyl-butyl)-3-hydroxy-8,9-methylen-dioxy-pterocarpan], eller som forbindelser Ia og Ib. Oppfinnelsen utgjøres således av den trinnvise fremgangsmåte anvendt for å gjenvinne og isolere de hovedsakelig rene, 95 - 100%, krystallinske produkter angitt som cabenegrin Ia og cabenegrin Ib, og fremgangsmåten er kjennetegnet ved at a) det fremstilles et urent vandig alkoholisk ekstrakt fra fint oppdelt rot av treet cabeca de negra; b) ekstraktet oppkonsentreres til en oljeaktig rest; c) den oljeaktige rest behandles med vandig methanol og ekstraheres deretter med et alifatisk hydrocarbon med

5-8 carbonatomer;

d) det gjenværende vandige lag ekstraheres med ether og

e) etherlaget separeres kromatografisk.

Forbindelsene cabenegrin Ia og cabenegrin Ib har

farmasøytisk anvendelighet ved behandling av pattedyr, inn-befattet mennesker som er blitt forgiftet av gif.tige slanger og insekter. Det vil si at disse forbindelser virker som

kraftige motgifter mot virkningen av slange-og insekttoksiner. Forbindelsene Ia og Ib er også anvendbare ved behandling av virkningene av andre kjente organiske toksiner slik som E. coli endotoxin og den gift som produseres av Clostridium botulinum, vanligvis angitt som botulisme ved matforgiftning. Farmasøytisk tilgjengelighet er generelt indikert for behandling av virkningene i pattedyr av toksiner fremstilt av patogene bakterier (endotoksiner og exotoksiner) som an-griper nervesystemet i offeret og særlig hvor paralyse av respirasjonssystemet er fastslått. Behandling mot virkningene av cardio-vaskulære toksiner er også indikert.

Forbindelsene kan administreres oralt i væskeform slik som en suspensjon eller oppløst i en forenlig farmasøy-tisk bærer. Det rene krystallinske materiale kan administreres oralt i kapsel eller tablettform når det er sammensatt med egnede farmasøytiske bærere. Alternativt kan hver av forbindelsene cabenegrin Ia eller- Ib oppløses i en egnet væske-formig farmasøytisk bærer og løsningen kan administreres intra-venøst ved hjelp av sprøyter, eller ved hjelp av kateter hvor overvåkningsutstyr er tilgjengelig for' å bestemme virkningen av behandlingen. Om ønsket kan forbindelsene Ia og Ib blandes sammen i forskjellige forhold, og blandingen kan bearbeides som ovenfor beskrevet med egnede farmasøytiske bærere.

Eksempel

a) Ca. 1/2 kg av de vaskede røtter av cabeca de negra treet oppdeles i små biter som deretter kan bløtgjøres, pul-veriseres eller på annen måte behandles for å bryte ned fiber-strukturen. Dette trinn kan utføres i en blander eller laboratoriehomogenisator. Røtter med mugg eller fungus anvendes ikke. De pulveriserte røtter plasseres deretter i en stor glassbeholder eller annet egnet kar som kan dekkes og deretter omrøres. En tilstrekkelig mengde av en blanding av vann og alifatisk alkohol med 1-4 carbonatomer, fortrinnsvis ethanol:vann 77:23,tilsettes for å dekke de pulveriserte røtter og omrøres kraftig i noen minutter. Karet inneholdende den vandige ethanol og røttene tillates å stå ved omgivende temperatur i minst 48 timer under leilighets-vis omrøring. Ved slutten av denne periode separeres den vandige alkoholiske løsning omfattende råekstraktet fra røt-tene på en hvilken som helst egnet måte, for eksempel ved å helle blandingen gjennom et middels filterpapir. De pulveriserte røtter kastes. Den filtrerte løsning har farve som sterk te.

Følgende prosedyre ble anvendt for å Isolere de aktive forbindelser fra råekstraktet som fremstilt ovenfor. b) Det vandige ethanoliske råekstrakt (135 ml) ble konsentrert ved forsiktig oppvarming under vakuum under dannelse av 1,2 g av et brunt oljeaktig residuum. c) Dette konsentrerte materiale ble behandlet med 50%-ig vandig methanol og løsningen ble ekstrahert ved kraftig risting med alifatisk hydrocarbon med 5-8 carbonatomer, fortrinnsvis med hexan. Hexanlaget ble fraskilt og kastet. d) Vannlaget ble ekstrahert med ether under kraftig risting. Etherlaget og vannlaget ble fraskilt, etherlaget

(64 0 milligram) ble satt til side. Vannlaget ble ekstrahert med n-butylalkohol under kraftig risting, n-butylalkohollaget ble fraskilt og satt til side for senere undersøkelse, og vannlaget ble kastet.

e) Det ovenfor ekstraherte etherlag ble fraskilt etter velkjente kromatografiske metoder. Fortrinnsvis underkastes

det ovenfor ekstraherte etherlag høytrykks væskekromatografi (HPLC) på Sephadex R* LH-20 som et første trinn og som annet trinn på silicagel under anvendelse av vandig methanol som elueringsmiddel. Denne prosedyre resulterer i to fraksjoner og den første separeres ytterligere med HPLC under anvendelse av "Partisil-10" eluert med 3 % methanol i methylenklorid under dannelse av rene faste forbindelser.

Forbindelsen identifisert som cabenegrin Ia gjen-vinnes som et hvitt, krystallinsk materiale i et utbytte på 4_4 mg. Et skarpt smeltepunkt på 167 - 168° C ble erholdt, og analyse viser at sammensetningen er C^H^Og. Rf-verdien av forbindelse Ia på tynnskiktskromatografi under anvendelse av silicagel CO/kiselguhr F-25 4 og benzen/ethylacetat/

methanol (15/4/1) var 0,53.

U.V.,C.D. og I.R. for forbindelse Ia er som følger: UV /i MeOH): 209 nm (e 75 ooo), 233 nm

Skulder (e 24 000), 309 nm (e 13 000)

CD (i MeOH): 213 nm (Ae -25,58), 220 nm

(Ae -2,00), 238 nm (Ae -9,84); 302 nm (Ae +3,15)

IR (i CHC13): 3500 cm"<1>, 1600 cm"<1>, 1113 cm 1, 925 cm 1.

I tillegg til disse spektraldata ble følgende <1>H-NMR, <13>C-NMR og MS (El) data målt angående cabenegrinIa: <1>H-NMR: 1,83 (3H, d, 1Hz, 4'-CH3);

3,40 (2H, br, d, 7 Hz, C 1');

3.40 (2H, ddd, 7, 7,5 Hz, C 6a);

3,61 (2H, d, d, 11,7 Hz, c 63);

3,90 (2H, -OCH20-);

3,99 (2H, br7~ s, -CH2-OH)>

4,28 (1H, dd, ll,5"llz, C 6a);

5,45 (1H, br, t, 7 Hz, C 2');

5,45 (1H, d, 7 Hz, C lia);

6.41 (1H, s, C 10) ;

6,52 (1H, d, 9 Hz ( (C 2);

6,70 (1H, s, C 7);

7,23 (1H, d, 9 Hz, c 1) ppm.

<13>C-NMR: 13,74 (4'-CH3); 21,88 (C 1'); 40,16 (C 6a); 66 , 72 (C 6lT~68,72 (-CH2-OH) ; 79,10 (C lia);

93, 77 (C 10); 104, 73 Jc~ l ); 109,6 (C 2);

112,63 (C 4 eller C la); 115,01 (C 4 eller C la);

118,04 (C 6b); 123,4 9 (C 2'); 12 9,15 (C 1);

136,07 (C 3'); 141,67 (C 8); 148,06 (C 9);

154,20 (C 10a eller C 4a); 154,20 (C 10a eller C 4a);

155, 08 (C 3 ) ppm.

MS (18 eV):

M<+> = 36 8, 5 0 % m/e = 350, 100 %; 335, 95 %, 335, 95 %;

176, 65 %; 161, 90 %.

Den andre prøve av materiale gjenvunnet fra HPLC som ovenfor beskrevet, besto av en oljeaktig blanding på ca. 10 mg. Denne andre aktive fraksjon, som var erholdt fra HPLC av etherlaget som ovenfor beskrevet, ble behandlet som følger under dannelse av forbindelsen cabenegrin Ib.

Blandingen ble underkastet ytterligere HPLC under anvendelse av y-Bondapack C18 og methanol/acetonitril/H20/n-PrOH 71/71/5 9/2.- Forbindelse Ib ble erholdt i hovedsakelig ren - 95 - 100 % - krystallinsk form i et utbytte på ca.

1 mg. Strukturen av denne forbindelse er basert på følgende fysikalske konstanter, og analyser (MS) viser at sammensetningen er C2l<H>22^6"

<1>N-NMR: 0,69 (3H, d, 5,8 Hz, 3'-CH3)j

2,50 (2H, m, C 1');

2,67 (2H, m, C 1');

2,94 (1H, ddd, 9,1, 6,3, 4,9 Hz, C 6a);

3,10 (2H, dd, 8,8, 2,7 Hz, -CH2-OH);

3,18 (2H, dd, 8,8, 5,5 Hz, -CH^-OH);

3,50 (1H, dd, 9,1, 9,1 Hz, C"T<>>) ;

3,86 (1H, dd, 9,1, 4,9 Hz, C 6a);

5,27 (1H, d, 6,3 Hz, C lia);

5,30 (2H, -OCH20-);

5,33 (2H, -OCH2"0-);

6,36 (1H, C TOT;

6.52 (1H, C 4);

6.53 (1H, C 7);

7,08 (1H, C 1) ppm.

UV (i MeOH): 204 nm (e 116 000), 230 nm (e 8000),

2 92 nm (e 9 400), 308 nm (e .11800)

CD (i MeOH): 237 nm (Ae -6,68), 280 nm (Ae -0,46),

2 99 nm (Ae -1,72) .

Strukturen av forbindelse Ib er ved NMR data vist å være en 3:1 blanding av epimerer ved C-3'. Strukturene av begge forbindelser cabenegrin Ia og cabenegrin Ib er blitt fastslått ved syntese av deres respektive racemater.

De nye forbindelser fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er egnet for fremstilling av terapeutisk aktive preparater som er anti-gift for behandling av virkrr ningene av giftige slange- og insektbitt på pattedyr, innbe-fattet mennesker.

De er også egnet for behandling av patogene bak-terietoksiner slik som E. coli endotoksiner, botulisme og andre som utviser virkninger på sentralnervesystemet og beslektet respirasjonsparalyse, og for behandling av virkningene av cardiovaskulære toksiner på pattedyr.

Når det gjelder de nye forbindelser erholdt ved

de ovenfor beskrevne ekstraksjonsmetoder ble nærværet av fysiologisk aktive forbindelser bestemt ved in vivo tester under anvendelse av mus. Testdyr var Swiss Webster hvite mus av begge kjønn som veide 20 - 25 g. Hver gruppe av testdyr ble forgiftet med to og en halv ganger den lethale dose av slangegift fra Fer de Lance (Bothrops atrox) ved intra-peritoneal injeksjon. I fravær av behandling døde de forgiftede dyr i løpet av noen få minutter.

Konsentrater av forbindelser Ia og Ib erholdt fra hver av fraksjonene fra de ovenfor beskrevne ekstrak-sjonsskjemaer ble testet med hensyn til antigiftaktivitet ved injisering i musen umiddelbart etter forgiftning med en vandig ethanolisk løsning (77:23) av materialet isolert fra hver fraksjon. Hvert dyr ble behandlet med 0,25 ml av de respektive løsninger. På basis av denne protokoll var den minimale dose for overlevelse mot Fer de Lance gift 2,8 mg/kg av cabenegrin Ia og 2,0 mg/kg av cabenegrin ib.

Toksikologiske undersøkelser indikerer at administrering av vandige ethanoliske løsninger av cabenegrin Ia og

cabenegrin ib til friske testdyr ikke fremkaller noen signifikante forandringer i de vitale fysiologiske funksjoner. Administrering kan foretas ved intravenøs eller intramuskulær injeksjon, eller oralt via en mageslange. Ingen signifikant forandring ble observert i arterielt blodtrykk, hjertehastighet, respirasjon, EKG eller sentralt venøst trykk ved noe tidspunkt etter administrering av forbindelser Ia og Ib til normale, friske, (dvs. ikke-forgiftede) dyr.

Administrering påvirker ikke signifikant hvile-virkningspotensialer, endeplatepotensialer, nerveimpuls-overføring, neuro-muskulær funksjon eller hjernebølgeaktivi-tet i forsøksdyrene.

1. Motgiftvirkning overfor slangegift i hunder

Forgiftning med en lethal dose av slangegift, slik som Bothrops atrox, Crotalus adamamteuns, eller Crotalus atrox, fremkaller et bratt fall i arterielt blodtrykk, en nedsettelse av hjertehastighet og en økning i sentralt venøst trykk. Dette etterfølges av delvis gjenvinning av disse parametre,

og deretter ved en fullstendig respirasjons- og cardiovaskulær kollaps. Døden synes å skyldes en kombinasjon av perifer vaskulær kollaps og en avbrytelse av den normale respirasjonsmekanisme. I tillegg synes det å være en viss virkning fra disse gifter på sentralnervesystemet i forsøks-dyrene. Denne CNS-effekt utvises ved en nedsetning i både hjernens a- og |3-rytme (EEG) . Denne forandring er også for-bundet med en nedsettelse i impulstransmisjon over de moto-riske nerver og en progressiv blokkering av det neuromuskul-lære apparat som er lik det som fremkalles av curare. Giftene hadde ingen effekt på muskelrespons til direkte stimulering.

En serie av syv voksne beagle-hunder ble anvendt

for å undersøke effektiviteten av cabenegrin Ia og. Ib mot giftene. Hundene ble bedøvet med Na-pentobarbital (30 mg/kg) og overvåket med hensyn til forandringer i arterielt blodtrykk, h^rtehastighet, elektrocardiogram og respirasjon. Lethale doser (fem til ti ganger LD,-q) av lyofilisert re-konstituert Bothrops atrox (Fer de Lance) (2,5 mg - 5,0 mg/kg) eller (10 mg/kg) av slangegift fra sydamerikansk klapper-slange ble administrert.

I løpet av 15 minutter etter forgiftning ble en markert nedsettelse i hjertehastighet og blodtrykk observert. Fra 15 minutter til 30 minutter ble respirasjonen likeledes nedsatt fra en gjennomsnitt på 20 pr. minutt til 5 pr. minutt. Behandlingen ble startet når alvorlig cardiovaskulær svikt

og tydelig respirasjonsvanskeligheter ble observert (vanligvis fra 15 - 30 minutter etter forgiftning).

En løsning av cabenegrin la ble fremstilt ved å opp-løse 33 mg av det krystallinske materiale av forbindelsen i 100 ml vandig ethanol (25:75). På lignende måte ble en løs-ning av 24 mg cabenegrin lb i 100 ml vandig ethanol (15:75) fremstilt. Doser ble fremstilt for administrering ved om-røring av 5 ml av hver av de respektive alkoholiske løsninger av forbindelse Ia og Ib i 50 ml vann.

Administrering av de respektive løsninger ble foretatt gjennom en slange anbragt ned i magen på hunden. Behandlingen var som følger: Ingen umiddelbar respons ble observert etter behandlingen. Blodtrykk, hjertehastighet og respirasjon forble ekstremt lav. Ca. 30 minutter etter den første dose av den respektive alkoholiske løsning av forbindelse Ia og Ib fant det sted en langsom gradvis forbedring av respirasjonen etterfulgt av en delvis restaurering av hjertehastigheten og blodtrykket. Kontinuerlig behandling ble foretatt ved 30 minutters intervaller i 50 ml vann inntil alle overvåkede vitale tegn vendte tilbake til 10 % av kontrolldyrene. Det effektive doseområde er mellom 10 og 20 ml antigiftekstrakt pr. dyr. Fra to til fire doser er nødvendig. Etter observasjon i 8 - 10 timer ble dyrene anbragt i et oppholdsbur med mat og vann. Etter 24 timer utviste alle de 7 hunder tegn på nedsatt aktivitet. Etter 72 timer mottok alle hunder mat og vann. Ingen ytterligere terapi var nødvendig.

2. Aktivitet av cabenegrin Ia. og Ib ovérfor E. coli endotoxin

Tre voksne beagle-hunder ble anvendt for å demon-strere effektiviteten av cabenegrin Ia og Ib ved behandling av sjokk fremkalt av E. coli endotoxin. Hundene ble bedøvet med Na-pentabarbital (30 mg/kg) og overvåket med hensyn til forandringer i arterielt blodtrykk, hjertehastighet, EKG og respirasjon.

Lethale doser (1 mg/kg) av E. coli endotoxin ble injisert intravenøst i et kateter anbragt i venen i bakpoten på hundene. I det første forsøk ble det ikke foretatt noen antigiftbehandling og dyrene døde 2 timer etter injeksjon.

I de tre ytterligere tilfeller ble antigiftbehandling startet ved det tidspunkt hvor alvorlig cardiovaskulær kollaps og respirasjonsvanskeligheter kom til syne. Dette fant vanligvis sted i løpet av 1 1/2 time etter injeksjonen av toksinet.

Løsninger av cabenegrin Ia og Ib, fremstilt som ovenfor beskrevet, ble administrert ved hjelp av en mageslange i en enkelt dose på 10 ml i 100 ml vann til hver av hundene.

De således behandlede dyr overlevet og antok normal aktivitet.

3. Isolert hjertepreparering ( Langendorff)

En serie på 2 hundehjerteprepareringer ble testet for å måle antigifteffekten på coronar blodstrømning, hjertehastighet, EKG, kraft av ventrikulært kontraksjon og coronar vaskulær motstand når cabenegrin Ia og Ib ble gitt enten før eller etter lethal giftutfordring. Det ble observert at behandlingen synes å være i stand til å overvinne de toksiske virkninger av giften på de cardiovaskulære funksjoner. Disse effekter er en nedsettelse av kontraksjonskraften på hjertehastigheten. Coronær vaskulær motstand øker også pro-gressivt etter administrering av giften. Når løsninger inneholdende 0,05 mg/ml av enten forbindelse Ia eller forbindelse Ib ble injisert direkte i sirkulasjonssystemet før utfordrincf av tropisk klapperslangegift, ble det ikke observert noen skadelig effekt på hjertet. Tvert om ble kontraksjonskraften og coronar blodstrømning øket med 15 til 20 %.

Når enten forbindelse Ia. eller forbindelse Ib

ble gitt etter lethal utfordring av tropisk klapperslangegift bevirket antigiften en tilbakeføring av kontraksjon og hjertehastighet til normale nivåer og motvirket de mindre arrhytmier fremkalt av forgiftningen.

4. Neurofysiologisk funksjon

Tre hunder og én katt ble testet med hensyn til antigifteffekten på den neuromuskulære funksjon, virknings-potensialet og hjernebølgeaktiviteten etter forgiftning med lethale doser av Fer de Lance-gift.

Slangegift nedsetter både hjernebølgeaktiviteten og nerveimpulsoverføringen. Disse bringes praktisk talt tilbake, om enn ikke fullstendig, til normale nivåer ved administrering av cabenegrin Ia og Ib. virkningspotensialer og neuromuskulær funksjon forble nedsatt i 30 til 60 minutter etter behandling med hver av forbindelsene. Dette ble etterfulgt av en langsom, gradvis tilbakevending til kontroll-nivåer fra 12 til 24 timer.

I visse forsøk hvori fullstendig neuromuskulær blokkering fant sted og hvor dyrene ikke lenger var i stand til spontan respirasjon, var en kunstig ventilasjon nødven-dig inntil virkningen av forbindelsen hadde manifestert seg. Dette kunne finne sted etter forgiftning, men så snart det var oppnådd stabilisering var dyrene i stand til spontan pusting og ingen ytterligere behandling var nødvendig.

Cortikal elektrisk aktivitet nedsettes markert

(25 - 35 %) av giften. Disse forandringer ble bragt tilbake til normale nivåer ved administrering av forbindelsene cabenegrin Ia og Ib. Etter behandling ble det ikke observert noen ytterligere forandring.

Resultatene av disse undersøkelser indikerer at oral eller intravenøse doser av cabenegrin Ia og Ib er i stand til å behandle tilstander som klinisk var betraktet å være enten cardiotoksiske og/eller neurotoksiske i natur uten noen observerbare bivirkninger.

Som ovenfor angitt, er forbindelsene fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egnet for fremstilling av forskjellige farmasøytiske preparater, fortrinnsvis for oral administrering eller for parenterale injeksjoner.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for isolering av pterocarpanforbindelsene med formel (Ia) og formel (Ib) i krystallinsk form, samt alle optiske isomerer og racemiske blandinger derav, karakterisert ved at a) det fremstilles et urent vandig alkoholisk ekstrakt fra fint oppdelt rot av treet cabeca de negra; b) ekstraktet oppkonsentreres til en oljeaktig rest; c) den oljeaktige rest behandles med vandig methanol og ekstraheres deretter med et alifatisk hydrocarbon med 5-8 carbonatomer; d) det gjenværende vandige lag ekstraheres med ether og e) etherlaget separeres kromatografisk.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen ifølge trinn c ) av den oljeaktige rest erholdt i trinn b) utføres med hexan.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at etherlaget fra trinn d) underkastes høytrykks væskekromatografi, det elueres med methanol, en første og en andre fraksjon adskilles, fra den første fraksjon utvinnes en forbindelse med formel (Ia) og fra den andre fraksjon utvinnes en forbindelse med formel (Ib).

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den første fraksjon underkastes høytrykks væskekromatografi og eluering med methanol og methylenklorid, og/eller den andre fraksjon underkastes høytrykks væskekromatografi og eluering med methanol, aceto-nitril, vann og n-propylalkohol.