NO135182B - - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrorer et nytt antibiotikum X-5108 til bruk

som vekstaktivator for fjærkre og en fremgangsmåte for dets fremstilling ved fermentering, isolering og rensning. Virknin-

gen av det nye antibiotikum på spesielle bakterier i kombina-

sjon med dets fysikalske og kjemiske egenskaper skiller det fra tidligere beskrevne antibiotika.

Det nye antibiotikum er, enten dette er nærværende i form av

et råkonsentrat eller i renset form, aktivt overfor forskjel-

lige mikroorganismer, enten disse er gram-positive eller gram-negative bakterier, og virker markant vekstfremmende på fjærkre.

Det nye antibiotikum, heretter betegnet som antibiotikum X-5108, fremstilles ved hjelp av en ny art av Streptomyces, Streptomyes sp. X-5108. Den nye antibiotikum-produserende streptomycet ble isolert fra en jordprove fra Bermuda. En levedyktig kultur av denne organisme, merket med laboratoriebenevnelsen streptomyces sp. S-5108, subkultur 3191-2, er deponert i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor denne kultur er tilfoyet ATCC-samlingen under registrerings-nr. 21.386. Den her beskrevne Streptomycesart, og som er angitt som Streptomyces

sp. X-5108, omfatter alle stammer av Streptomyces som produserer antibiotikum X-5108, og som ikke definitivt kan skilles fra stam-men ATCC 21386. Egenskapene til antibiotikum X-5108 er her beskrevet, og etter at egenskapene er kjente er det lett å skille stammene som produserer antibiotikum X-5108 fra andre.

Det folgende er en generell beskrivelse av organismen Stnsptomy-ces sp. X-5108, ATCC 21386, basert på karakteristika, såsom vekstomfang, pigment, morfologi, etc. De beskrivende farver og farveprovebetegnelser er vanligvis de som er anbefalt av the International Streptomyces Project (ISP): Shirling, E.B. og D. Gottlieb, 1966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Intl. J. Systematic Bact. 16: 313-340. Anvendte media for å oppnå diagnostiske spesielle kjennetegn og den senere dis-kuterte morfologiske beskrivelse, var de som er fremstilt ifolge Difco laboratoriumet for ISP5 hvorved identifisering og innhold av mediene vises i tabell 1.

Fordeling av egnet mengde for skrå-agar til minst 6 glass for hver kultur. Sterilisering, ved behandling i autoklav, avkjbling av glasse-ne med skrå-agar.

Substrat 3; Havreme1- agar

Koking eller dampbehandling av 20 g havremel i 1000 ml destillert vann i 20 minutter. Filtrering gjennom osteklede.

Tilsetning av destillert vann til filtrat-volumet er 1000 ml.

Tilsetning av spor-salt-losning ... 1,0 ml opplosning av 0,1 g henholdsvis FeS0^.7H20, MnCl2.4H20 og ZnS04.7H20 i 100 ml destillert vann. Regulering til pH 7,2 med NaOH.

Tilsetning av 18 g agar, og overforing i væske ved dampbehandling ved 100°C i 15-20 minutter.

Substrat 4: Uorganiske salter - stivelses- aqar.

Losning I: "Difco"-loselig stivelse 10,0 g. Tilberedd en pasta av stivelsen med en mindre mengde kaldt destillert vann til et volum på 500 ml.

Losning av spor-salter ... 1,0 ml av oppløsnin-gen som angitt under substrat 3

pH bor være mellom 7,0 og 7,4. Reguler ikke hvis

pH ligger innen dette område.

Bland stivelsessuspensjon og losningen med de

opploste salter.

Tilsett agar ("Difco") 20,0 g

Gjor agaren flytende ved dampbehandling ved 100 C

i 15-20 minutter.

S ubstrat 5; Glycerol- aparaqin- aqar

Losning med spor-salter .. 1,0 ml av oppløsningen

som angitt i substrat 3.

pH for denne opplosning er ca. 7,0 - 7,4. Reguler ikke hvis pH ligger innen dette område.

Agar 20,0 g Gjor agaren flytende ved dampbehandling ved 100°C

i 15-20 minutter.

Substrat 6: Pepton- qjær- ekstrakt- jern- aqar B act o-pept on-j ern-agar, dehydrat i-

pH bor være 7,0 - 7,2 for autoklavbehandlingen,

og reguler hvis nbdvendig.

Gjor agaren flytende ved dampbehandling ved 100°C i 15-20 minutter.

Losning med sporsalter (Anvendelse som angitt under substrat 3, 4, 5 og 7) Tomatpasta- aqar (Berger)

Farvenavnene er tatt fra folgende fire kilder: ISCC-NBS U.S.. Department of Commerce, 1955, "The ISCC-NCB method of designat-ing colors and a dictionary of color names", National Bureau of Standards Circular 553, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.; Tresner, N.D. og E.J. Backus, 1963, "System of color wheels for streptomycete taxonomy," Appl.Microb., 11: 335-338; Eckerstrom, R. og CE. Foss, 1958, Color Harmony Manual, 4. utgave, Container Corporation of America, Chicago, Illinois; H. Prauser, 1964. "Aptness and Application of Colour Codes for Exact Description of Colours of Streptomycetes",

Z. Allg. Microbiologie, 4, (1): 95-98.

I vekstomfanget. Kulturen produserer et velutviklet og forgrenet substrat-mycelium og et karakteristisk luft-mycelium på mange medier. Veksten i nedsenket tilstand er forhdyet, hard og grov, og beroende på det anvendte næringsmedium er det farvelost, gult, gulbrunt eller olivenbrunt. Det er brun-svarte flekker ved "vekts-fronten" i gjærmalt-ekstraktagar (ISP medium 2).

Luft- mycelium og/ eller en masse sporefarvninq.

Luft-mycelium utvikles moderat med en flbyelslignende tekstur og er pigmentert grå-hvit, lys (d) og middels-grå (2 fe), og gul-

grå (2 dc) med en tynn hvit spiss på et tidlig vekststadium. Luft-masse-farve (Tresner-Backus Color wheel series) er Gy på ISP medium 2 til W-gy på ISP mediene 4 og 5. Ofte produseres konsen-triske ringer og koloni-segment. Farvekarakteristika plasserer kulturen i de grå serier ("the gray series") (Pridham). En sammenligning av visse egenskaper til Streptomyces sp. X-5108 med de for andre representanter for de grå serier vises i tabell 2.

Morfologi.

Sporekjeder, som produseres på luftmycelet, forgrener seg enak-set og flerakset, danner rette kjeder, sloyfer, haker, utstrakte og irregulære skuddspiraler (3-4 omdreininger), hvorved de også forekommer i en kostiignende form. Kjedene er både lange og kor-te, men de består hovedsakelig av mer enn.10 sporer. Sclerotia kan iakttas på de fleste medier. Sporene er langstrakt ovale og sylindriske (phalangiform-Tresner), og deres storrelse og bredde er hhv. 1,2 og 2 p.. Sporeoverflaten er ifolge elektron-mikro-skopi ren og uten noen ornamentering (tomatpasta-agar, 10 dager ved 28°C) .

Fysiologi.

Loselig_pigment

Spor av brunt pigment produseres på gjærekstrakt-maltekstrakt-agar (ISP medium 2), men ikke på ISO mediene 3, 4 og 5.

Reversible farver

Gul til gul-brun pluss gronn fås på 7-21 dager på ISP mediene

2, 4 og 5. Ifolge Dr. Prauser's farge-guide, så er i lopet av 7 dager produserte farver C 004b, Co 5m, med farvelos spiss (medium 2), og Co 5a, Co 5b (mediene 4 og 5). Tilsetning av alkali eller syre avstedkommer ingen endring på den reversible farve.

Dannelse av hydrogensulfid

Dannelse av hydrogensulfid a) på organisk substrat: positiv,

b) på uorganisk substrat: negativ.

Diverse fysiologiske reaksjoner

Kulturen er farveproduserende (produserer melanin) på pepton-jern- og tyrosin-agar, såvel som på trypton-gjærekstraktsubstrat. En sammenfatning av visse av kultur-karakteristikaene for Streptomyces sp. X-5108 vises i tabell 3.Nitrater reduseres ikke i organisk nitratsubstrat5 stivelse hydrolyseres virkningsfullt og gelatin har etter 14 dager bare i liten utstrekning overgått til flytende fase. En indikasjon på andre diverse fysiologiske reaksjoner for streptomyceten finnes i tabell 4.

Karbonkilde-utnyttelse ifolge Pridham og Gottlieb [j. Bact., 56, 107-114 (1948)] er som folger: (11 dager ved 28°C): god utnyttelse av 1-arabinose, d-fruktose, d-mannitol, 1-rhamnose, d-raffinose og sukrose; dårlig utnyttelse av d-xylose, i-ino-sitol og ingen utnyttelse av cellulose. Ytterligere informasjon med hensyn til karbon-nitrogen-utnyttelsen når det gjelder streptomyceten vises i tabell 5. Kulturen vokser godt ved 24°C og 37°C, men ikke ved 42°C eller 50°C. Sporesuspensjoner i destillert vann ble anvendt ved inokule-ringer, som ble tatt av tomat-skrå-agar. Utnyttelsen av karbon- og nitrogenforbindelser ble testet på det folgende basis-substrat:

For å teste karbon-kiIdene på dette basis-substrat, ble 2,64 g (NH^)2^®4 tilsatt pr. liter som vanlig nitrogenkilde,og karbon-kiIdene ble tilsatt i et mengdeforhold som tilsvarte 1% konsentrasjon, med unntagelse av natriumsaltene til de organiske syrer, og som ble anvendt i et konsentrasjonsfor-hold tilsvarende 0,15 %. For å prove nitrogen-kiIdene ble syntetisk basis-agar og 1% stivelse pluss nitrogen tilsvarende en konsentrasjon på 0,1 g nitrogen pr. liter anvendt.

Basert på sporeornamentering, sporenes generelle morfologi <p>g sporenes forgrening, en masse-farvninger på forskjellige medier og visse biokjemiske og fysiologiske reaksjoner, kommer man til at Streptomyces sp. X-5108 er forskjellig fra alle kulturer av de grå serier som er beskrevet i litteraturen. Det skal her henvises til tabell 2, hvor den forskjelligar-tede utnyttelse av karbonkilder når det gjelder Streptomyces sp. X-5108 sammenlignet med kjente Streptomyces-arter fremgår, samtidig som man også vil understreke den viktige omstendig-het at Streptomyces sp. X-5108 alene kan fremstille antibio-tikumet X-5108.

Dyrkning av organismen Streptomyces sp. X-51o8 for å produsere det onskede antibiotikum X-51o8, kan utfores ved å benytte forskjellige fermenteringsteknikker. Generelt kan de folgende grunnleggende fremgangsmåteteknikker anvendes ved både flaske-og tank-fremgangsmåter. Fra en fermenteringsflaske tas sporer fra en skrå-agar av kulturen ved hjelp av en metallsloyfe, og dette inokuleres i 100 ml næringsmedium som befinner seg i en 500 ml Erlenmeyer-flaske, hvorefter inkubasjonen pågår 7 dager ved 28°C i et roterende rysteapparat. Hele substratprbven fjer-nes under aseptiske betingelser for in vitro prover den tredje, femte, og syvende dagen. På samme måte ved fremstilling av storre mengder substrat blir podestoffet forst fremstilt i 6 liteis Erlenmeyer-ryste-f lasker eller i 22,2 liters pyrex-f lasker, som er utstyrt med anordninger for luftning, provetag-ning etc.. Dette substrat blir derefter overfort til fermente-ringstank. Luftning i flasker og tanker foretas ved å trykke steril luft gjennom fermenteringsmediet. Ytterligere omrbring foretas i tanker ved hjelp av mekaniske omrbrere. Antiskum-ningsmidler såsom spekkolje, soyabbnneblje etc. tilsettes i den utstrekning det er nbdvendig for kontroll av skumningen.

Streptomyces sp. X-51o8 kan dyrkes i forskjellige flytende dyrk-nings—medier. Medier som er spesielt anvendelige for produksjon av nye antibiotika inneholder en assimilerbar karbonkilde såsom stivelse, glukose, melas^er og lignende, en assimilerbar nitrogenkilde, såsom protein, protein-hydrolysat, polypeptider, aminosyrer, mais-stbp-væsker, ammoniumsalter samt uorganiske kationer og anioner, såsom kalium, natrium, kalsium, magnesium, sulfat, fosfat, klorid etc. Sporelementer såsom kobolt, kob-ber, jern, molybden, bor etc. medfblger som forurensninger sammen med andre bestanddeler i mediet.

Aktiviteten til antibiotikum X-51o8 kan måles in vitro ved hjelp av inhiberingssonen mot den gram-positive bakterie Bacillus E ved hjelp av den vanlige diffusjonsmetoden i bæger-plate-agar. Alternativt kan den gram-positive bakterie Bacillus simplex anvendes. Begge bakterier gir ca. 20 mm inhiberings-soner med en losning som inneholder ca. 1 enhet/ml. Med denne prbvemetode vokser en kultur av den provede mikroorganisme i næringsmiddelsubstrat, f.eks. "Trypticase"-soya-substrat ved 28°C i 24 til 42 timer i et roterende rysteapparat (100 ml materiale pr. 500 ml Erlenmeyer-flaske). Det anvendes en pode-stoff-konsentrasjon på 0,25 til 0,5 % for å inokulere 5 ml stop-sjikt som helles over et preherdet 20 ml base-næringsmid-del-agar-sjikt i et 100 ml glass eller Petri-skål av plastma-teriale. Platene kjoles minst 2 timer for man fyller med pro-velosning som inneholder antibiotikummet. Platene inkuberes derefter 18 timer ved 35°C og sonediametre måles med 0,5 mm noyaktighet. Beregninger av enhet pr. ml utfores tildels av standardkurver.

Eksempler på substrattyper, som foretrekkes anvendt, og utbyttet av antibiotikum på disse substrater i rysteflasker og i luftede fermenteringstanker vises i tabellene 6-9.

Tabell 6

Forskjellige næringsmidlers effekt på antibiotikum-utbvttet av Streptomyces sp. X- 51o8 i rysteflasker. Alle substrat inneholdt 1% dekstrin, 0,1% J^HPO^ og 0,1 % CaCO^. 1 ml med sporesuspensjon av Streptomyces sp. X-51o8 tale inokulert i substrat på hver 100 ml.

Alle substrater inneholdt 0,1% K2HP04 og 0,1 % CaC03 når ikke annet sis. 1 ml sporesuspensjon av Streptomyces sp. X-51o8 ble inokulert i substrat på hver lOO ml. Ved granskning av de data som er samlet i disse tabeller kan man se at komplekse nitrogenholdige materialer fra forskjellige kilder understotter produksjon av antibiotika, f.eks. plante-substrater (soyabonne- eller bomullsfro-mel, havremel, faste kjerne-fruktpartikler i tomater, mais-fermenterings-losninger)5 animal-ske materialer (fiskemel) lett fordoyelig .kjottmel, aminosyre-hydrolysat) og mikrobielle celler (Torula gjær)..

Et antall karbonkilder, som f.eks. glukose, glycerol, dekstrin' og maisstivelse, forårsaker god vekst og antibiotikum-produksjon. I tillegg til de i naturlige substrater allerede nærværende uorganiske salter, så vil en tilsetning av salter, som f.eks. kaliumfosfat, kalsiumkarbonat, magnesiumsulfat og sporelementer, ofte oke veksten og utbyttet av antibiotikum (avhengig av de i base-substratet allerede nærværende komponenter). Et av de fore-trukne substrat for produksjon av antibiotikum X-5108 i store fermenteringsbeholdere inneholder 1 prosent avfettet bomullsfro-mel, 0,5 prosent mais-stop-væskekonsentrat, 1 prosent maisstivelse, 0,1 prosent K2HP04 og 0,1 prosent kalsiumkarbonat.

Streptomyces sp. X-5108 vil også vokse godt og produsere antibiotikum på en del kjemisk definerte, syntetiske substrater som inneholder ammoniumsalter, salpetersyrer eller aminosyrer (glu-tamat, arginin og glycin) som nitrogenkilder, med glukose, dekstrin, stivelse, sitrat, acetat og lignende som karbonkilder, med tilsetninger av salter såsom kaliumfosfat, kalsiumkarbonat og magnesiumsulfat, og videre sporeelementer som Fe<++>, Cu<++>, Mn<++>, Co<++>, Zn<++>. Resultatene av fermentering av Streptomyces sp. X-5108 på forskjellige syntetiske substrater vises i tabell 10. Vanligvis er utbyttene av antibiotikum på det syntetiske substrat som vist i tabell 10 ikke så hoye som på komplekse nitrogenholdige substrater. Produksjonen av antibiotikum X-51o8 forsterkes ved hoy luftning av fermenteringsmediet. Dessuten kan produksjonen av antibiotikum X-51o8 påvirkes ved enhver temperatur som leder til en tilfredsstillende vekst av mikroorganismen. F.eks. vokste Streptomyces sp. X-51o8 i rysteflasker som var inkubert ved

24°, 28°, 30° og 32°C. Antibiotikum-analyser efter 3, 4, 5 og 6 dager viste at omtrent det samme maksimale utbytte kunne oppnås ved en hvilken som helst temperatur mellom 24 og 32°C.

Det hoyeste utbytte ble imidlertid oppnådd i lopet av 3-4 dager ved 30° og 32°C/ mens det tok 4 dager ved 28°, 5-6 dager ved 24°C. Vanligvis erholdes optimal produksjon av antibiotikum X-51o8 mellom 2 og 10 dager. Fermenteringsmediet forblir normalt ne-sten noytralt eller på den sure siden under fermenteringen. Den endelige pH avhenger av nærværende puffer, og delvis av mediets opprinnelige pH, hvilket fortrinnsvis er noytralt for sterili-seringen.

Efter at fermenteringen er fullfort kan flere fremgangsmåter anvendes for isoleringen og rensningen av antibiotikum X-51o8. Egnede isolasjons- og rensnings-fremgangsmåter omfatter losnings-middeLekstraksjons-teknikk, såsom satsvis ekstraksjon eller kontinuerlig motstromsvæske-væskeekstraksjonskolonner, og gel-gjennomtrengnings-kromatografi i et ikke-vandig system.

Ved en foretrukken fremgangsmåte utvinnes antibiotikum X-51o8 fra substratet ved å separere mycelium og eventuelle ulbste partikler fra fermenteringslosningen på konvensjonell måte, såsom ved filtrering eller sentrifugering. Antibiotikum X-5108 blir derefter ekstrahert fra den filtrerte eller sentrifugerte fermenteringslosning enten satsvis eller ved motstroms-ekstrak-sjonsteknikk. Væskeekstraksjon kan finne sted i et pH område fra ca. 3 til ca. 7,5, og ved å anvende som løsningsmiddel vann-uloselige estere, såsom etylacetat, amylacetat, butylacétat og lignende alifatiske estere, hvorved butylacétat er foretrukket. Et foretrukket lbsningsmiddelsystem for anvendelse ved motstroms-rensningsteknikk består av en blanding av etylacetat, isopropanol og 0,1 M vandig sekundær riatriumfosfat-16sning. Sluttrensningen av antibiotikum X-51o8 kan oppnås ved gel-gjennomtrengningskromatografi. Denne rensningsteknikk består av adsorpsjon av pre-rensende materialer av antibiotikummet, f.

eks. erholdte materialer fra lbsningsmiddel-ekstraksjonsteknikkene, hvorved man anvender kryssbundne eller polymeriserte dekstran-geler. Ifolge en foretrukken fremgangsmåte ved sluttrensningen blir det pre-rensede antibiotikumpreparat kromatografert på Sephadéx LH-20 og eluering med alkohol.

Efter filtrering eller sentrifugering av fermehteringsmediet,

kan man anvende tynnsjikt- eller papirkromatografi for å ana-lysere antibiotikum X-51o8. På grunn av farvekarakteristika til antibiotikummet kan flekkene gjores synlige ved å anvende fluoriserings-indikeringsmetode, og dessuten kan bioautografisk metode også anvendes med fordel. Kromatograferingen kan utfores på papir, men det er forétrukket å utfore den på sili-ka-gel-glassplater. Losningsmiddelsystemet,som anvendes for tynnsjikt-kromatogram består av kloroform, metanol og vandig ammo-niumhydroksyd.

Det nye antibiotikum ifolge oppfinnelsen, d.v.s. antibiotikum X-51o8, er efter rensningen en amorf gul substans. Kationiske salter av antibiotikummet kan dannes ved å anvende antibiotikum X-51o8 og en farmasoytisk akseptabel uorganisk eller organisk base. Blant de salter av antibiotikum X-51o8, som kan dannes,

er alkalimetallsalter, såsom natrium- og kaliumsalter, og jord-alkalimetallsalter, slik som kalsiumsaltet.

Disse salter kan dannes f.eks. ved å anvende vandige losninger av alkalimetall- og jordalkalimetall-hydroksyder. Således danner losninger av antibiotikum X-51o8 i vandig natriumhydroksyd, vandig kaliumhydroksyd eller kalsiumhydroksyd natrium-, kalium-eller kalsiumsaltet. Disse salter kan anvendes for de samme bio-logiske formål som antibiotikummet. På grunn av at losninger av salter av antibiotikum X-51o8, og da spesielt natriumsaltet, er betydelig mere stabile enn losninger av antibiotikummet i ikke-saltform, blir det foretrukket å anvende svakt alkaliske puffere ved rensning ved hjelp av motstroms-fordeling og ammo-niakalske losningsmiddelblandinger for tynn-sjiktskromatografi for at konsentrasjonen av antibiotikum i lbsningen skal bli minimal. Natriumsaltet i det etterfolgende eksempel 2 besitter således en bket stabdLitet overfor den korresponderende syre.

Antibiotikummet inneholder elementene karbon, hydrogen, oksygen, og nitrogen i hovedsaken folgende vektsprosenter.

Antibiotikummet X-51o8 er lbselig i alkoholer, f.eks. metanol, etanol, 1- og 2-propanol, og tert-butyl-alkohol; vannulbselige estere, f.eks. etylacetat, amylacetat, butylacétat og lignende alifatiske estere; og kloroform. Antibiotikummet er ulbselig i vann. Natriumsaltet av antibiotikum X-51o8 er lbselig i vann, lavere alkoholer, såsom metanol, etanol, isopropanol og butanol, og N,N-dimetylformamid; noe loselig i amylalkohol, tetra-hydrofuran og dioksan; meget lite lbselig i aceton, amylacetat, butylacétat og etylacetat; og er ulbselig i benzen, kloroform og etyleter.

I det folgende gjengis fysikalske karakteristika for antibiotikum X-51o8: Den optiske rotasjon for natriumsaltet av antibiotikum X-51o8 er /a7D 25 = -82,8 (etanol,

c = 0,52).

Det infrarbde absorbsjonsspektrum for antibiotikum X-51o8 i en liten KBr kule vises i fig. 1. Antibiotikummet oppviser absorbsjonskarakteristika i spektrets infrarbde område ved folgende bblgelengder uttrykt i resiproke centimetre:

Bredt bånd ved 3400

Sterkt bånd ved 1660

Bredt bånd ved 1580

Fremtredende bånd ved 1580, 1380,

1250, 1100, 1040 og 995.

Det infrarbde absorbsjonsspektrum for natriumsaltet til antibiotikum X-51o8 i en liten KBr kule vises i fig. 2. Natriumsaltet oppviser absorbsjonskarakteristika i spektrets infrarbde område ved folgende bblgelengder uttrykkt i resiproke centimetre:

Bredt bånd ved 3400

Fremtredende bånd ved 1645, 1570, 1500 1388, 1105 og 1000.

Det ultrafiolette absorbsjonsspektrum for antibiotikum X-51o8 hhv. salter derav ved forskjellige pH-nivåer" vises i fig. 3. Ultrafiolett-maksima opptrer ved:

Det kjernemagnetiske resonansspektrum for antibiotikummet X-filo8 vises i fig. 4. Man erholdt NMR-spektret ved å anvende CdCl^ som løsningsmiddel og tetrametylsilan (TMS) som intern standard. NMR-spektret oppviser fremtredende signaler ved 0,92£ i området mellom 1,66 og 2,03&, ved 3,16 og 3,43<£og i det ole-finiske område.

Antibiotikum X-51o8 har et bredt antimikrobielt spektrum som vises i tabell 11. Det antimikrobielle spektrum ble bestemt ved å anvende agar-diffusjon-bæger-plate-metodene som tidligere beskrevet. Antibiotikum X-51o8 oppviser lav oral og parenteral toksisitet, markert antistreptokokk-aktivitet både systemisk (oralt admini-stret) og lokalt (subkutanost administrert), aktivitet overfor pneumococcus og caecal coccidiosis. På mus er antibiotikummet relativt utoksiskt ved oral og subkutanos administrasjon (re-spektive LD^q verdier = 2.000 og 1.320 mg/kg). Antibiotikummet er aktivt ved oral administrasjon (CD50 = 52 mg/kg) og ved subkutanos administrasjon CD^Q = 44 mg/kg) mot Strepto-coccus pyogenes, og det er også aktivt mot Diplococcus pneumo-niae (CD^0 = 807 mg/kg p.o. og 283 mg/kg sbc), såvel som mot gram-negative Proteus vulgaris-infeksjon.

Antibiotikum X-5108 oppviser aktivitet som vekstfremmende middel på fjærkre og gir en forsterket næringsmiddeleffekt. Folge-lig er;anvendelsen av antibiotikum X-51o8 somden aktive komponent i nye og anvendbare sammensetninger, som ved oral administrasjon til fjærkre resulterer i en oket veksthastighet og en forsterket fbreffekt på dyrene. Administrasjon av disse sammensetninger foretas ved produsert og med hensyn til næringsmidler balansert fjærkrefor, hvilket tilfredsstiller dyrenes krav til næringsmidler, og som dessuten inneholder det aktive vekstfremmende middel antibiotikum X-51o8.

Når antibiotikum X-51o8 anvendes ved fremstillingen av de vekstfremmende sammensetninger, så er den antibiotiske kompo-..nent .utvalgt, f ra gruppen bestående av antibiotikummet og et eller annet fysiologisk akseptabelt salt av antibiotikummet og et kation, fortrinnsvis natriumsaltet. I den folgende omtale vil uttrykket antibiotikum X-51o8 bli anvendt for å angi antibiotikum X- 51o8 og dettes fysiologisk akseptable salter.

Nærværende oppfinnelses karakteristika og formål vil bedre for-stås ved hjelp av de folgende eksempler. Når ikke annet sis er alle temperaturer angitt i Celsius-grader, og alle deler er angitt som vektsdéler.

Eksempel 1.

Fermentering av Streptomyces sp. X- 51o8

En sporesuspensjon av Streptomyces sp. X-51o8 fra en nærings-middel-skrå-agar i et reagensglass ble inokulert i en 22 liters gjennomluftet Pyrex-flaske, som inneholdt 15 liter substrat av folgende sammensetning:

1 % soyabonnemel

1 % brunsukker

0,25 % mais-stop-partikler 0,1 % K2HP04

0,1 % CaC03

0,5 % spekkolje som antiskumningsmiddel.

Efter fire dagers vekst ved 28°C samt under gjennomluftning,

ble det trådagtige utbytte overfort til et 440 liters stort fermenteringsapparat av rustfritt stål, og som inneholder 264

liter substrat med folgende sammensetning:

1 % avfettet bomullsfro-mel (Proflo)

1 % maisstivelse

0,25 % mais-stop-partikler

0,1% CaC03

0,1 K2HP04

og spekkolje som antiskummiddel.

Substratets pH ble regulert til 6,8 for inokulering. Tanken ble gjennomluftet og veksten fikk pågå 5 dager. Innholdene av fer-menteringsapparatene ble derpå filtrert fra ved hjelp av kisel-

gur "Hyflo Filter Cell". Filtratets pH ble regulert til 3,5,

og filtratet ble ekstrahert med halve volumet butylacétat. Det klarede ekstrakt ble konsentrert under redusert trykk ved un-

der 40°C til en brun sirup, som efter finfordeling med petro-leumeter, ga et fast pulver, antibiotikum X-51o8, og som har en aktivitet på 120 enheter Bacillus k pr. mg.

Eksempel 2.

Rensning av antibiotikum X- 51o8 ved satsvis losninqsmiddel- ekstraksjon . i Den satsvise losningsmiddel-ekstraksjons-fremgangsmate ble utfort pa 13.200 liter fermenteringssatser, hvilke oppviste in vitro ca.

130 enheter/ml overfor B. simplex. Den filtrerte kulturvæske

ble ekstrahert med butylacétat ved pH 7,5. Det organiske ekstrakt ble, efter vaskning med vann, flash-konsentrert ved temperaturer under 50°C og til den resulterende vandige losning ble det tilsatt natriumdietylmalonat-reagens for å bringe pH til 9,0. Det dannede gule bunnfall ble filtrert fra og vasket med butylacétat. Det ble derefter fordelt mellom vann-butylacetat, og pH ble regulert til 4. Den organiske fase ble separert og beheindlet som ovenfor beskrevet, bortsett fra at natriumdiétyl-malonat-reagensen ble tilsatt inntil man fikk pH 8,5. Dette andre bunnfall ble surgjort ennå engang og ekstrahert med friskt butylacétat. Ekstraktet ble derefter behandlet med "Darco G-60", og natriumsaltet av antibiotikum X-51o8 ble til slutt utfelt ved tilsetning av natriumdietylmalonat til pH 8,0. Efter vaskning og torking viste det således erholdte gule natriumsalt in vitro ca. 430 enheter/ mg overfor B. simplex. Den ovenfor beskrevne ekstraksjonsfremgangsmåte er anskueliggjort ved hjelp av folgende flyteskjema.

Flvteskjema for isolering av antibiotikum X- 51o8

Eksempel 3.

Rensning av antibiotikum X- 51o8 ved hjelp av motstroms-fordeling..

Instrument;

Antall ror - 200

Volum av ovre fase - 40 ml

Volum av nedre fase - 40 ml.

Sats:

5 g antibiotikum X-51o8 som erholdes ved losningsmiddel-ekstraksjon av rå fermenteringslosning, og opplost i

40 ml ovre fase.

Losningsmiddelsystem:

Etylacetat, isopropanol, vandig O,1 M sekundær natriumfosfatlosning, 12:9:20 v/v.

Fordeli ngs- karakteri st ika:

Antall overforinger - 200

Toppror efter 200 overforinger - 159

Fordelingsforhold - 3,88

Fremgangsmåte:

Fraksjonene 150-170 ble slått sammen og 1-butanol ble tilsatt for å ekstrahere antibiotikummet i den organiske fase. Den vandige fase ble tomt ut, og den organiske fase ble vasket 4 ganger med vann. Til slutt ble vannet fjernet azeotropt fra

den organiske fase, og produktet ble utfelt ved tilsetning av petroleter. 3 g av det antibiotiske materiale ble utvunnet, og som har en biopotens tilnærmet to ganger den for utgangsmateri-alet.

Eksempel 4.

Rensning av antibiotikum X- 51o8 ved kromatografi på

" Sephadéx LH- 20"

En etanolisk losning av 300 mg antibiotikumprove, som tidligere var renset ved hjelp av motstroms-fordeling, ble regulert til pH 8-9 ved hjelp av en natriummetoksydlosning (vått indika-torpapir), og derefter tilfort en "Sephadex LH-20"-kolonne (290 x 41 mm) og frigjort med "3A alkohol". Kolonnen ble"frem-kalt»' med "3A alkohol", hvorved hoveddelen av den antibiotiske sone kommer frem når eflueht-volumet er 950-1200 ml. Folgende fraksjoner inneholder et antall farvede soner med neglisjerbar biologisk aktivitet. De aktive fraksjoner ble slått sammen og fordampet til et lite volum, hvortil eter og petroleter ble tilsatt for å utfelle antibiotikummet. De resul-■■ terende gule partikler, hvilke var natriumsaltet av antibiotikum X-51o8, oppviste bare én flekk ved tic, R^ = 0,19 (silika-gel"F-254y påvist ved UV lys) og Rf = 0,29 (silika-gelAisel-gur, bioautografisk påvisning).

E ksempel 5.

F remstilling av antibiotikum X- 51o8 fra natriumsaltet.

0;. 464 g av natriumsaltet til antibiotikum X-51o8, og som var utvunnet ved kromatografi på "Sephadex LH-20", ble opplost i 4,6 ml isvann,og 10 ml etylacetat ble tilsatt for å danne et 2-fase-system. Til denne blanding, som befant seg i en separa-sjonstrakt, ble det tilsatt 1 ml primær natriumfosfatlosning (50 g Na^PO^-^O i lOO ml vann). Det forst dannede bunnfall ble opplost ved rystning. Den vandige fase ble tomt ut, og den organiske fase ble vasket 4 ganger, med hver gang et volum is-vann og dehydratisert azeotropt (etanol). Konsentratet (2 ml) ble fortynnet med to volumdeler etylacetat,og dietyleter ble

dråpevis tilsatt til uklarhet fås, og til slutt tilsettes 30 ml petroleter. Det resulterende bunnfall ble samlet opp ved filtrering og torket ved romtemperatur hvorved man erholdt antibiotikum X-51o8.

Måling av de vekststimulerende effekter av antibiotikum X- 51o8 En base-mengde ble fremstilt og inneholdt de folgende navngitte komponenter i de her angitte mengder:

Antibiotikum X-51o8 ble tilsatt til denne blanding i et forhold som tilsvarte 50 mg antibiotikum pr. kg blanding.

De vekststimulerende effekter av antibiotikum X-51o8 ble bestemt ved å fore fjærkre (ad libitum) på den antibiotiske til-leggsblanding. Ved forsokene ble 1 dags gamle "Cornish Cross Sexed"Broiler-kyllinger anvendt, ved proven ble det anvendt 10 kyllinger pr. prove (5 hånlige og 5 hunlige).] Provegruppene fikk adgang til blanding. En plannert vilkårlig fordeling av provene ble gjort for å sjalte ut faktorer som varme, lys og lokalisering. Kyllingene ble iakttatt i lopet av en 2 ukers periode, hvorved gruppe-vekten ble bestemt flere ganger i lopet av perioden, og hvorved hver enkelt ble veidd efter 14 dager. Forkonsumeringen ble også notert og forbedringen med hensyn til f bref f ektiviteten ble beregnet sammenlignet mad kontrollfia Et kontrollforsbk ble samtidig utfort på samme måte som ovenfor beskrevet, bortsett fra at kyllingene her ble foret ad libitum på en blanding som inneholdt samme næringsmiddelkomponenter bortsett fra antibiotikummet X-51o8.

Den gjennomsnittlige vektsokning for hver prbvegruppe ble di-vidert med den gjennomsnittlige vektsokning for den negative kontrollgruppe, og kvotienten multiplisert med 100 for derved å gi prosentuell vektsokning. Vektsokningen er den endelige kroppsvekten til kyllingen ved avsluttningen av det 2 uker lange forsdk minus den opprinnelig vekt til den 1 dags gamle kyllingen.

Efterfblgende tabell 12 sammenfatter resultatene fra forsbket.

Fra etterfølgende tabell kan man se at kyllingene som fbres med blandingen som er tilsatt 50 mg antibiotikum X-51o8 pr. kg for resulterer i en bket vekst i forhold til kontrollforsok. På samme tid, hvilket vises ved en lo %'ig forbedring av fbr-effektiviteten, vil de samme kyllinger mere effektivt utnytte foret.

Forsoket som er beskrevet ovenfor sammen med kontrollforsok ble gjentatt flere ganger ved at man anvendte den samme basisblanding. Ved disse .forsok varierte meng-

de*nivået for antibiotikum X-51o8. Forsokskyllingene ble foret med fbrblandinger som inneholdt den aktive komponent i mengdeforhold på 5, 10, 25, 50 og lOO mg/kg for. Disse forsok ble gjentatt for å bekrefte resultatene. Ved kontrollforsok ble fire gjentagelser med 10 kyllinger foretatt, hvorved kyllingene ble foret med basis-blandingen uten tilsetning av antibiotikum. Ved alle forsok ble vekstforholdet iakttatt over en periode på 2 uker i sammenligning med kontrollgruppen. For-konsumeringen

ble også notert og forbedringer med hensyn til fbr-effektivi-teten i sammenligning med kontrollforsbk ble beregnet. Tabell 13 angir resultatene av disse serieforsbk.

Claims (2)

1. .1. Antibiotikum X-51o8 til bruk som vekststimulerende middel for fjærkre, karakterisert ved at antibiotikummet er et gult amorft stoff med folgende trekk: a) analyse: Karbon 63,36%, hydrogen 7,81%, nitrogen 3,48%, oksygen "25,08%. b) loselig i metanol, etanol, 1- og 2-propanol, tert.butyl-alkohol, etylacetat, amylacetat, butylacétat og kloroform, c) et infrarodt absorpsjonsspektrum som vist på vedlagte fig. 1, d) et kjerne-magnetisk resonans

   spektrum som vist på vedlagte fig. 4,

   og fysiologisk aksepterbare kationiske salter av dette.
2. 2. Natriumsaltet av antibiotikum X-5108 ifolge krav 1, karakterisert ved at saltet er et gult, amorft stoff med folgende trekk: a) analyse: Karbon 61,48%, hydrogen 7,81%, nitrogen 3,32%, oksygen 24,45%,natrium 2,94%, b) loselig i vann, metanol, etanol, isopropanol, butanol og N,N-dimetylformamid, c) har en optisk rotasjon på [a]D 25 <=> -82,8 (etanol, c = 0,52), d) et. infrarodt absorpsjonsspektrum,

   som vist på vedlagte fig. 2,e) et ultrafiolett spektrum som r vist på vedlagte fig. 3 med absorpsjonsmaksima ved: 3. Fremgangsmåte for fremstilling av , et nytt antibiotikum X-5108 ifolge krav 1, karakterisert ved at man dyrker Streptomyces sp X-5108 på et vandig nær-ingsmiddel substrat , som inneholder assimilerbare karbohydrat- og nitrogenkilder, Qg uorganiske salter, under submerse, aerobe betingelser, og at man gjenvinner det således produserte antibiotikum X-51o8 fra nevnte vandige substrateventuelt i form av et fysiologisk aksepterbart salt. 4. Fremgangsmåte ifolge krav 3, karakterisert ved at det anvendes organismen Streptomyces sp. X-5108 ATCC 21386.