Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia nowego antybiotyku, oznaczonego jako antybio¬ tyk X-5108, droga fermentacji, jego izolacja i oczysz¬ czanie. Wplyw nowego antybiotyku na specyficzne bakterie w polaczeniu z jego wlasnosciami fizyko¬ chemicznymi wyraznie wyrózniaja go od znanych antybiotyków.Wynalazek dotyczy otrzymywania antybiotyku X-5108 w czystej postaci, w formie rozcienczonej oraz w surowym ekstrakcie. Antybiotyk, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, niezaleznie od tego, czy obecny jest w postaci surowej, czy tez bardziej oczyszczonej, jest aktywny przeciwko calemu szere¬ gowi mikroorganizmów, wlaczajac w to bakterie gram-dodatnie i gram-ujemne i powoduje zwieksze¬ nie intensywnosci wzrostu w hodowli drobiu.Antybiotyk X-5108 jest nowym zwiazkiem o uni¬ kalnej strukturze, który rózni sie zasadniczo od zna¬ nych promotorów wzrostu. Dzieki wlasciwosci po¬ wodowania efektu silnego wzrostu u drobiu i niskiej toksycznosci stanowi korzystny czynnik zwiekszania wzrostu u zwierzat domowych.Nowy antybiotyk, oznaczony jako antybiotyk X-5108, wytwarzany jest przez nowy gatunek Strop- tomycas, Streptomyces sp. X-5108.Sposób wytwarzania nowego antybiotyku oznaczo¬ nego jako antybiotyk X-5108, polega na tym, ze szczep nowego gatunku Streptomyces Sp. X-5108, zwlaszcza szczep ATCC 21386, hoduje sie w wodnej pozyce, zawierajacej przyswajalne zródla weglowo¬ lo danow, azotu i soli nieorganicznych, w hodowli za¬ nurzeniowej w warunkach aerobowych, az do mo¬ mentu, w którym pozywka nabywa znacznej aktyw¬ nosci antybiotycznej na skutek wytwarzania anty¬ biotyku X-5108 i nastepnie izoluje sie tak wytwo¬ rzony antybiotyk X-5108 z podloza wodnego.Nowy promieniowiec, produkujacy antybiotyk, zo¬ stal wyizolowany z próbki ziemi, pobranej na Ber¬ mudach. Kultura tego organizmu, oznaczonego na¬ zwa laboratoryjna Streptomyces sp. X-5108, podkul¬ tura 3191 — zostala zlozona w American Type Cul- ture Collectian w Rockville, Maryland, gdzie zo¬ stala ona dolaczona do zbioru ATCC pod numerem 21386.Ogólny opis organizmu Streptomyces sp. X-5108, ATCC 21386 oparty na takich cechach charaktery¬ stycznych, jak wzrost, pigment, morfologia Ntid. jest nastepujacy. Oznaczenia kolorów i barw wzorców sa na ogól takie, jak te, które poleca International Streptomyces Project (ISP). Shirling, E.B. i D. Gott- lieb, 1966 "Methods for Characterisation of Strep¬ tomyces Species, Intl. J. Systematic Bact. 16, 313— 340. Podloza, stosowane do otrzymania charaktery¬ stycznych cech diagnostycznych oraz ponizej opi¬ sanych cech morfologicznych, byly przygotowane przez Laboratories Difco dla ISP. Ich sklad oraz cechy charakterystyczne sa przedstawione w tab¬ licy I.Nazwy kolorów pochodza z nastepujacych czterech zródel: ISCC-NBS U.S. Departament of Commerce, 87 26687 266 3 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names, National Bureau of Standarts Circular 553, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C: Tresner N.D. and E.j.Backus 1963" System of color wheels for streptomy- cete taxonomy" Appl. Microb. 11, 335—338. Ecker- strom, R. and CE. Foss, 1958, Color Harmony Ma¬ nuel, 4-th Edition, Container Corporation of Ame¬ rica, Chicago, Illinois, H. Prauser, 1964" Aptness and Application of Colour Codes for Exact Descrip- tion of Colours of Streptomycets, Z. Allg. Mikro¬ biologie 4, (1): 95—98.Wzrost. Kultura tworzy dobrze rozwinieta i roz¬ galeziona grzybnie wegetatywna oraz charaktery¬ styczna grzybnie powietrzna na wielu podlozach.Kultura zanurzona jest wzniesiona, twarda i szor¬ stka i zaleznie od zastosowanej pozywki jest bez¬ barwna, zólta, zóltobrazowa lub oliwkowo brazowa.Na agarze, zawierajacym wyciag drozdzowy i slo¬ dowy, na brzegach kultury tworza sie czarnobrazo- we kropki.Grzybnia powietrzna i/lub kolor spor w masie.Grzybnia powietrzna jest srednio rozwinieta, o fak- tunze podbnej do welwetu i zabarwiona jest na ko¬ lor szaro-bialy, jasno (d) i srednio szary (2 fe) i zól¬ tawoszary (2 dc), przy czym posiada cienki bialy pasek we wczesnym stadium wzrostu. Masa po¬ wietrzna (Kolowa Seria barwy Tresner-Backus) ma kolor Gy na pozywce ISP 2 do W-Gy na pozywce ISP 4 i 5. Tworza sie pierscienie koncentryczne oraz sektory kolonii. Wedlug charakterystyki bar¬ wy kultura nalezy do serii szarej (Pridham). Po- TÓwnanie niektórych wlasnosci Streptomyces sp.X-5108 z wlasnosciami innych czlonków serii szarej pokazane jest w tablicy 2.Morfologia. Lancuchy spor, wytwarzane w grzyb¬ ni powierznej, rozgaleziaja sie monopodialnie lub sympodialnie, tworzac lancuchy proste, petle, haki, rozszerzone i nieregularne spirale (3—4 skretów), pojawiaja sie o ksztalcie miotly. Lancuchy sa za¬ równo dlugie, jak i krótkie, ale glównie skladaja sie z wiecej niz 10 spor. Na wiekszosci pozywek obserwuje sie równiez sklerocje. Spory sa owalne i wydluzone oraz cylindryczne w ksztalcie (phalan- giform-Treaner). Powierzchnia spor jest gladka, bez zadnej ornamentacji, jak to zostalo stwierdzone w mikroskopie elektronowym (agar na pascie po¬ midorowej, 10 dni w temperaturze 28°C).Fizjologia. Pigment rozpuszczalny. Grzybnia wy¬ twarza slady brazowego pigmentu na agarze z wy¬ ciagiem drozdzowym i wyciagiem slodowym (po¬ zywka ISP 2), ale nie na pozywce ISP, nr 3, 4 i 5.Kolory odwrotne, (ang. reverse colours — zabar¬ wienie kultury od spodu po scieciu agaru). Wytwa¬ rza sie zabarwienie zólte do zóltobrazowego plus zielonego od 7—21 dni na pozywce ISP, 2, 4 i 5.Na wskazniku barwnym Dr Prausera kolory od¬ wrotne, wytworzone w ciagu 7 dni, to C 004b, Co m o bezbarwnym brzegu (pozywka 2 i Co 5a, Co 5b (pozywka 4 i 5). Dodatek kwasów lub lugu nie powoduje zmiany zabarwienia odwrotnego.Rózne reakcje fizjologiczne. Kultura jest chro- mogenna (wytwarza melanine) na agarze peptono- wo-zelazowym i tyrozynowym, jak równiez na bu¬ lionie trypton — wyciag drozdzowy. Niektóre cha- 4 rakterystyki hodowli Streptomyces sp. X-5108 sa zebrane w tablicy 3.Azotany nie ulegaja redukcji w bulionie azota¬ nów organicznych, skrobia jest hydrolizowana ak- tywnie, a zelatyna tylko w niewielkim stopniu jest doprowadzona do stanu cieklego po i4 dniach.Wskazówki, dotyczace innych róznorodnych reakcji fizjologicznych promieniowca, umieszczone sa w tablicy 4. Zuzycie zródel wegla wg Pridhama i Got- io lieba J. Bact, 56, 107—114 (1948) jest nastepujace: (11 dni w temperaturze 28°C) dobra fermentacja 1-arabinozy, d-fruktozy, d-mannitolu, 1-ramnozy, d-rafinozy i sacharozy, slabe zuzycie d-ksylozy i-inozytolu, a brak fermentacji celulozy. Dalsze in- formacje, dotyczace typu fermentacji zwiazków, za¬ wierajacych wegiel i azot, sa umieszczone w tab¬ licy 5. Kultura wykazuje dobry wzrost w tempera¬ turze 24°C i 37°C, lecz nie w temperaturze 42° czy 50°C.Na podstawie ornamentacji spor, ogólnej morfo¬ logii spor i rozgalezien sporoforów, zabarwienia w masie na róznych pozywkach oraz niekótyrch reak¬ cji biochemicznych i fizjologicznych uwaza sie, ze Streptomyces sp. X-5108 rózni sie od kazdej z kul- tur serii szarej, opisanej w literaturze.Hodowle organizmu Streptomyces sp. X-5108 w celu uzyskania pozadanego antybiotyku X-5108 mozna prowadzic przez stosowanie róznego typu technik fermentacyjnych. Na ogól stosuje sie naste- pujaca technike podstawowa, zarówno w technice hodowli w butli, jak i tanku fermentacyjnego.W fermentacji w butli sporami, zebranymi oza ze skosu agarowego, zaszczepia sie 100 ml pozywki w 500 ml kolbie Erlenmeyera i inkubuje w tempera- turze okolo 28°C na wytrzasarce obrotowej w cia¬ gu 7 dni. Pobiera sie aseptycznie próbki bulionu do prób in vitro 3-ciego, 5-ego i 7 dnia hodowli. Odpo¬ wiednio w celu przygotowania wiekszych objetosci bulionu przygotowuje sie inokudium w 6-litirowych 40 kolbach Erlenmeyera do wytrzasania lub w butel¬ kach pyrexowych, zaopatrzonych w urzadzenie do napowietrzania, pobierania próbek itd. Bulion ten przenosi sie nastepnie do tanków fermentacyjnych.Napowietrzanie w butlach i tankach prowadzi sie 45 przez przepuszczanie sterylnego powietrza przez pozywke fermentacyjna. Mieszanie w tankach za¬ pewnione jest dzieki mieszadlom mechanicznym.Czynniki, przeciwdzialajace tworzeniu sie piany ta¬ kie, jak olej smalcowy oraz olej sojowy itd., doda- 50 je sie w celu zmniejszenia tworzenia sie piany.Streptomyces sp. X-5108 mozna hodowac w sze¬ regu róznych podlozy cieklych. Pozywki szczegól¬ nie korzystne dla produkcji nowegp antybiotyku za¬ wieraja zródlo wegla przyswajalnego takie, jak 55 skrobia, glukoza, melas oraz inne podobne, zródlo azotu przyswajalnego takie, jak bialko, hydrolizat bialkowy, polipeptydy, aminokwasy, wyciag namo- kowy z kukurydzy, sole amonowe oraz nieorganicz¬ ne aniony i kationy takie, jak potas, sód, wapn, 69 magnez, siarczany, fosforany, chlorki itd. Pierwia¬ stki sladowe takie, jak kobalt, miedz, zelazo, mo¬ libden, bor itd, podawane sa jako zanieczyszczenia innych skladników pozywki.Aktywnosc antybiotyku X-5108 mozna .zmierzyc 65 in vitro, mierzac jego obszar inhibicji przeciwko87 266 gram-dodatnim bakteriom Bacillus E, stosujac zwy¬ kla agarowa cylinderkowa metode dyfuzyjna. Ewen¬ tualnie mozna równiez zastosowac gram-dodatnia Bacillus simplex. Obydwa gatunki bakterii wyka¬ zuja srednice zahamowania 20 mm w zetknieciu z arbitralnie obranym stezeniem 1 jednostka/ml.Przy stosowaniu tej metody oznaczenia hoduje sie kulture organizmu testowego w bulionie odzyw¬ czym, na przyklad Tryipticase Soy Broth w ciagu 24—42 godzin w temperaturze 28°C na trzesawce obrotowej (100 ml pozywki na 500 ml kolbe Erlen- mayera). Stosuje sie inokulum o stezeniu 0,25—0,5% w celu zaszczepienia 4 ml warstwy szczepiennej, która wylewa sie na utwardzone 20 ml podstawo¬ wego agaru odzywczego, umieszczonego w szklanej lub plastikowej szalce Petriego o pojemnosci 100 ml.Plytki oziebia sie przez przynajmniej dwie godziny przed wstawieniem cylinderków i napelnieniem ich roztworem testowym, zawierajacym antybiotyk. Na¬ stepnie plytki inkubuje sie w temperaturze 35°C w ciagu 18 godzin i srednice zahamowania mierzy sie z dokladnoscia do 0,5 mm. Nastepnie, z krzywych wzorcowych liczy sie aktywnosc w jednostkach na mililitr.Przyklady korzystnie stosowanych pozywek oraz wydajnosci produkcji antybiotyku, otrzymane z wy¬ trzasanej butelki i fermentacji w niepowietrzanym tanku, podane sa w tablicach 6—9. Z danych zeb¬ ranych w tych tablicach wynika, ze zlozone zwia¬ zki azotowe z róznych zródel podtrzymuja produk¬ cje antybiotyku, na przyklad materialy roslinne ta¬ kie, jak maczka sojowa lub z nasion" bawelny, plat¬ ki owsiane, wytloki z pomidorów, materialy zwie¬ rzece takie, jak maczka miesna, maczka rybna, hy¬ drolizat aminokwasowy, jak równiez komórki ba¬ kteryjne takie, jak drozdze Torula.Szereg zródel wegla umozliwia dobry wzrost i produkcje antybiotyku, na przyklad: glukoza, gli¬ cerol, dekstryna i skrobia zbozowa. Oprócz soli nie¬ organicznych juz obecnych w pozywkach natural¬ nych dodatek takich soli, jak fosforan potasu, weg¬ lan wapnia, siarczan magnezu oraz pierwiastków sladowych czasem powoduje lepszy wzrost i lepsza wydajnosc otrzymywanego antybiotyku (w zalez¬ nosci od skladników juz obecnych w pozywce pod¬ stawowej). Korzystna pozywka dla produkcji an¬ tybiotyku X-5108 w duzych fermentorach zawiera 1% odtluszczonej maki z nasion bawelny, 0,5% kon¬ centratu wyciagu namokowego z kukurydzy, 1% skrobi zbozowej, 0,1% K2HP04 i 0,1% weglanu wap¬ nia.Streptomyces sp. X-5108 moze równiez wykazy¬ wac dobry wzrost i produkowac antybiotyk na che¬ miczne okreslonych pozywkach, zawierajacych so¬ le amonowe, azotany lub aminokwasy (glutaminian, arginine, glicyne) jako zródlo azotu i glukoze, dek¬ stryne, skrobie, cytrynian, octan i temu podobne jako zródlo wegla z dodatkiem soli takich, jak fos¬ foran potasu, weglan wapnia, siarczan magnezu oraz pierwiastki sladowe takie, jak Fe"1-1", Cu++, Mn^, CO++, Zn**. Wyniki fermentacji Streptomyces sp.X-5108 na róznych pozywkach pokazane sa w tab¬ licy 10.Na ogól wydajnosc otrzymywania antybiotyku na pozywkach syntetycznych nie jest tak duza, jak dla zlozonych pozywek, zawierajacych azot, jak widac z tablicy 10.Antybiotyk X-5108 wytwarzany jest w wiekszej ilosci przy stosowaniu napowietrzania srodowiska fermentacyjnego. Co wiecej antybiotyk X-5108 moz¬ na wytwarzac w kazdej temperaturze, prowadzacej do korzystnego rozwoju mikroorganizmu. Na przy¬ klad Streptomyces sp. X-5108 hodowano w wytrza¬ sanych butelkach, inkubowanych w temperaturze 24°C, 28°C, 30°C i 32°C. Próby na obecnosc antybio¬ tyku po 3, 4, 5 i 6 dniach wykazaly, ze mozna bylo otrzymac mniej wiecej te sama wydajnosc maksy¬ malna w kazdej temperaturze, zawartej w grani¬ cach 24—32°C. Jednakze maksymalna ilosc antybio- tyku otrzymuje sie w ciagu 3—4 dni w temperatu¬ rze 30° i 32°C, podczas gdy potrzeba bylo na to 4 dni w temperaturze 28°C i 5—6 dni w temperaturze 24°C Zazwyczaj optymalna produkcje antybiotyku X-5108 otrzymuje sie w okresie okolo 2—10 dni.Wartosc pH pozywki fermentacyjnej zazwyczaj w czasie fermentacji pozostaje bliska srodowiska obo¬ jetnego lub tez odpowiada kwasnemu. Koncowa wartosc pH zalezy czesciowo od obecnych buforów, a czesciowo od poczatkowej wartosci pH, które ko- rzystnie jest bliskie obojetnemu przed sterylizacja.Po zakonczeniu fermentacji mozna zastosowac caly szereg operacji w celu izolacji i oczyszczenia antybiotyku X-5108. Opowiednie metody izolacji i oczyszczania polegaja na technice ekstrakcji roz- so puszczalnikami takiej, jak. ekstrakcja danej próbki lub tez ekstrakcja przeciwpradowa przy ciaglym przeplywie w ukladzie ciecz — ciecz w kolumnach ekstrakcyjnych oraz chromatografia na zelu w ukla¬ dach niewodnych.Najkorzystniej antybiotyk X-5108 otrzymuje sie z pozywki przez oddzielenie' grzybni i innych nie¬ rozpuszczalnych cial stalych od bulionu fermentacyj¬ nego za pomoca takich konwencjonalnych metod, jak saczenie lub wirowanie. Antybiotyk X-5108 na- 40 stepnie ekstrahuje sie z odsaczonego lub odwirowa¬ nego bulionu odzywczego za pomoca jednorazowej ekstrakcji lub stosujac technike ekstrakcji przeciw- pradowej. Ekstrakcje rozpuszczalnikami organicz¬ nymi mozna prowadzic przy wartosci pH okolo 3— 45 7,5 przy zastosowaniu jako rozpuszczalnika estrów nierozpuszczalnych w wodzie takich, jak octan ety¬ lu, octan amylu, octan butylu i podobnych estrów alifatycznych, przy czym najkorzystniejszy jest oc¬ tan butylu. Najkorzystniejszy uklad rozpuszczalni- 50 ków do zastosowania przy oczyszczaniu technika ekstrakcji przeciwpradowej sklada sie z mieszaniny octanu etylu, izopropanolu i wodnego roztworu 0,1 m drugorzedowego fosforanu sodu.Koncowego oczyszczania antybiotyku X-5108 moz- 55 na dokonac technika chromatografii na zelu przez adsorpcje uprzednio oczyszczonych preparatów an¬ tybiotyku, na przyklad preparatu, uzyskanego tech¬ nika ekstrakcji rozpuszczalnikami, na usieciowa- nych zelach dekstranowych. W najkorzystniejszym 60 typie techniki oczyszczania koncowego, uprzednio oczyszczony antybiotyk chromatografuje sie na ze¬ lu Sephadex BH-20 i eluuje alkoholem.Po odsaczeniu lub odwirowaniu pozywki fermen¬ tacyjnej mozna zastosowac chromatografie cienko- 65 warstwowa lub* bibulowa w celu zanalizowania87 266 8 antybiotyku X-5108. Poniewaz antybiotyk posiada odpowiednia charakterystyke barwna, plamy wy¬ woluje sie przy zastosowaniu metody fluoryzuja¬ cych indykatorów, mozna tez korzystnie zastosowac bioautografie. Chromatografie mozna prowadzic na bibule, ale korzystnie na plytkach z zelu krzemion¬ kowego. Uklad rozpuszczalników, stosowany do chromatograimów cienkowarstwowych sklada sie z chloroformu, metanolu i wodnego roztworu .wo¬ dorotlenku amonu.Antybiotyk X-5108, otrzymany sposobem wedlug wynalazku, po oczyszczeniu stanowi bezpostaciowa substancje barwy zóltej. Sole kationowe antybioty¬ ku mozna utworzyc, stosujac antybiotyk X-5108 i farmaceutycznie dopuszczalna zasade organiczna lub nieorganiczna. Z pomiedzy soli antybiotyku X-5108, które mozna utworzyc, wymienia sie sole metali alkalicznych takie, jak sole sodowe i pota¬ sowe, sole metali ziem alkalicznych takie, jak sól wapniowa.Sole te mozna utworzyc, stosujac na przyklad wodne roztwory metali alkalicznych i wodorotlenki metali ziem alkalicznych. I tak roztwory antybio¬ tyku X-5108 w wodnym roztworze wodorotlenku sodu, wodnym roztworze wodorotlenku potasu lub wodorotlenku wapnia daja sól sodowa, potasowa i wapniowa. Sole te mozna stosowac do tych sa¬ mych celów biologicznych, co i antybiotyk. Ponie¬ waz roztwory soli antybiotyku X-5108, zwlaszcza sól sodowa, sa znacznie bardziej trwale, niz roztwory antybiotyku w postaci kwasu, korzystne jest stoso¬ wanie buforów lekko alkalicznych przy oczyszcza¬ niu przez ekstrakcje w przeciwpradzie i roztwory rozpuszczalnika amoniakalnego do chromatografii cienkowarstwowej i w ten sposób zmniejszanie ste¬ zenia antybiotyku w roztworze.Antybiotyk zawiera pierwiastki wegiel, wodór, tlen i azot w nastepujacych procentach wagowych: antybiotyk X-5108 sól sodowa wegiel 63,63 61,48 wodór 4 7,81 7,81 azot 3,48 3,32 tlen (przez róznice) 25,08 24,45 sód * — 2,94 Antybiotyk X-5108 jest rozpuszczalny w alkoho¬ lach na przyklad metanolu, etanolu, 1- i 2-propano- lu oraz III-rzed.butanolu, w estrach niemieszaja- cych sie z woda takich, jak octan etylu, octan amy- lu, octan butylu i inne estry alifatyczne oraz w chloroformie. Antybiotyk jest nierozpuszczalny w wodzie. Sól sodowa antybiotyku X-5108 jest roz¬ puszczalna w wodzie, nizszych alkoholach takich, jak metanol, etanol, izopropanol i butanol oraz w N-N-dwumetyloformamidzie, jest w niewielkim stopniu rozpuszczalna w alkoholu amylowym, czte- rowodorofuranie i dioksanie, w bardzo niewielkim stopniu rozpuszczalna w acetonie, octanie amylu, octanie butylu i octanie etylu, nierozpuszczalna w benzenie, chloroformie i eterze etylowym.Fizyczna charakterystyka antybiotyku X-5108 jest nastepujaca. Skrecalnosc optyczna soli sodowej an- tybiotyku X-5108 wynosi («) D =—82,8 (etanol, c= =0,52). Widmo w podczerwieni antybiotyku X-5108 w pastylce z KBr jest pokazane na fig. 1. Antybio¬ tyk wykazuje absorpcje, charakterystyczna w ob¬ szarze widma w podczerwieni przy nastepujacych dlugosciach fali wyrazonych w centymetrach od- wrotnych: szerokie pasmo przy 3400 silne pasmo przy 1660 szerokie pasmo przy 1580 silne pasma przy 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 oraz 995 Absorpcyjne widmo w podczerwieni soli sodowej antybiotyku X-5108 w pastylce z KBr pokazane jest na fig. 2. Sól sodowa wykazuje charakterystyczna absorpcje w obszarze podczerwonym widma przy na- stepujacych dlugosciach fali, wyrazonych w centy¬ metrach odwrotnych: szerokie pasmo przy 3400 silne pasma przy 1645, 1570,1500, 1388, 1105 i 1000.Widma absorpcyjne w nadfiolecie antybiotyku X-5108 przy zmiennych wartosciach pH jest po¬ kazane na fig. 3. Maksima w nadfiolecie wystepu¬ ja przy: 1% 0,1 n HC1 1% =A Xmax334m|i.(Ei/c°m =403) lmax233mn (E^m =610) Xmax 206 rai i(E f(?m = 500) bufor pH=7: f(izo- Xmax 327 myt .(E \°^m =423) propanol/K2HP04) Xmax 231 m^ i(E J°£m =660) 0,1 n KOH A.max 327 m^ i(E^°m =416) Xmax231miJi (E* i% = 647) Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego an- biotyku X-5108 jest pokazane na fig. 4. Widmo ma¬ gnetycznego rezonansu jadrowego uzyskano przez zastosowanie CDC18 jako rozpuszczalnika oraz czte- rometylosilanu (TMS) jako wewnetrznego standar¬ du. Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego da¬ je silne sygnaly przy 0,928, w obszarze pomiedzy 1,66 i 2,035, przy 3,16 oraz 3,435 w obszarze olefino- 45 wym.Antybiotyk X-5108 ma szerokie spektrum anty- bakteryjne, jak pokazano w tablicy 11. Spektrum antybakteryjne okreslono, stosujac metode cylinder- kowa opisana poprzednio. 50 Antybiotyk X-5108 wykazuje niska toksycznosc przy podawaniu doustnym i pozajelitowym oraz znaczna aktywnosc antystreptokokowa zarówno sy- stemiczna (podawanie doustne), jak i lokalna (po¬ dawanie podskórne), aktywnosc przeciwko pneumo- 55 kokowa, jak i równiez w przypadku kokcydiozy je¬ lita slepego. U myszy antybiotyk jest stosunkowo nietoksyczny przy podawaniu doustnym i podskór¬ nym (wartosc LD50 wynosi 2000 przy 1,320 mg/kg).Antybiotyk przy podawaniu doustnym (CD50=52 60 mg/kg) i podskórnym (CD50=44 mg/kg) wykazuje aktywnosc przeciwko Steptococcus pyogenes, prze¬ ciwko Diplococcus pneumoniae (CD50=807 mg/kg przy podawaniu doustnym i 283 mg/kg przy poda¬ waniu podskórnym) oraz przeciwko gram-ujeminym 6B Proteus vulgaris.87 266 Antybiotyk X-5108 wykazuje dzialanie stymulu¬ jace wzrost drobiu i powoduje zwiekszenie wydaj¬ nosci karmy u zwierzat. I tak otrzymany sposobem wedlug wynalazku antybiotyk X-5108 stosuje sie jako aktywny skladnik nowych kompozycji, które 5 po podaniu doustnym drobiu daja zwiekszona szyb¬ kosc wzrostu i zwiekszona efektywnosc karmienia zwierzat Kompozycje te wytwarza sie przez zesta¬ wienie zrównowazonego odzywczo pokarmu dla dro¬ biu, który zaspokaja zapotrzebowanie tych zwierzat 10 na pozywienie, z antybiotykiem X-5108, stymuluja¬ cym szybki wzrost.Antybiotyk X-5108 w kompozycjach, stymuluja¬ cych wzrost, stosuje sie albo jako taki, albo w po¬ staci fizjologicznie dopuszczalnej jego soli, korzy- 15 stnie soli sodowej.Ponizej okreslenie antybiotyk X-5108 bedzie za¬ stosowanie w celu oznaczenia antybiotyku X-5108 oraz jego fizjologicznie dopuszczalnych soli katio¬ nowych. 20 Kompozycje stymulujace wzrost, zawierajace ja¬ ko aktywny skladnik antybiotyk X-5108, wytwarza sie w rózny sposób. Wedlug jednego z takich spo¬ sobów antybiotyk dodaje sie bezposrednio do ja¬ dalnego nietoksycznego nosnika. Korzystne jest, aby 25 nosnik posiadal wartosc odzywcza dla drobiu, przy czym najkorzystniejsze jest pozywienie, dajace wy¬ soka energie. Przy bezposrednim dodawaniu anty¬ biotyku do pozywienia, etap mieszania wykonuje sie przez zastosowanie znanych technik. Na przy- & klad materialy odzywcze, skladajace sie na pozy¬ wienie drobiu, wklada sie albo indywidualnie albo wspólnie do mieszalnika, po czym dodaje sie anty¬ biotyku i miesza do równomiernego wymieszania skladników. 35 Materialy odzywcze, zastosowane jako karma dla drobiu, jako nosnik dla antybiotyku X-5108 mozna zmieniac do pewnego stopnia w zaleznosci od spe¬ cyficznych potrzeb karmionego drobiu i koncowego # zastosowania tych zwierzat. Jednakze w wiekszosci 40 stosuje sie.zródla bialka takie, jak maczka rybna, maczka sojowa, kukurydza, produkty z orzecha ziemnego i temu podobne, oraz zródla weglowoda¬ nów takie, jak ziarna, maczki, maki i temu po¬ dobne. Podatkowo mozna utrzymac równowage mi- 45 neralna i w dziedzinie witamin przez wprowadze¬ nie do pozywienia potrzebnych mineralów, na przy¬ klad weglan sodu, potasu, magnezu, wapnia itd. oraz witamin, na przyklad witamin A, B12, D oraz tiaminy. Oczywiscie karma moze zawierac inne 50 konwencjonalne dodatki do karmy.Korzystnie przy wytwarzaniu kompozycji, stymu¬ lujacych wzrost, zawierajacych jako aktywny skladnik antybiotyk X-5108, wytwarza sie najpierw stezona mieszanine, przedmieszke, która nastepnie 55 mozna dodawac do karmy dla drobiu. Przy przygo¬ towywaniu stalego koncentratu, zawierajacego an¬ tybiotyk X-5108, stosuje sie jakikolwiek odpowie¬ dni nosnik lub material wypelniajacy jako skladnik bierny przy zalozeniu, ze jest on nieczynny w sto- eo sunku do dodatku, którym jest antybiotyk, oraz jest nietoksyczny dla drobiu, otrzymujacego kompozy¬ cje. Przykladami takich substancji sa materialy mi¬ neralne takie, jak mielone skorupki ostryg, jadalne wyroby maczne, materialy roslinne, morskie lub 65 zwierzece takie, jak stosowane w handlowych kar¬ mach dla zwierzat, maczka zbozowa, maczka cyt¬ rusowa, maczka sojowa, maczka rybna, skrawki miesa, wysuszone pozostalosci po fermentacji i te¬ mu podobne.Antybiotyk X-5108 mozna laczyc z jednym lub wiecej odpowiednich stalych nosników, tworzac papke, platki lub jakakolwiek inna postac za pomo¬ ca znanej odpowiedniej techniki. Na przyklad moz¬ na wytwarzac kompozycje przez rozdrobnienie lub sproszkowanie aktywnego skladnika oraz skladni¬ ków biernych przy zastosowaniu jakiegokolwiek handlowo dostepnego mlynka. Jezeli material od¬ zywczy nie jest obecny w czasie dokonywania mie¬ lenia lub proszkowania, otrzymany produkt moze byc zmieszany z jakimkolwiek innym latwo dostep¬ nym materialem odzywczym.Ilosc antybiotyku X-5108 wymagana do osiagnie¬ cia pozadanego stopnia stymulacji wzrostu i zwiek¬ szenia wydajnosci karmy jest krytyczna, ale moze byc zmieniana w z góry okreslonym zakresie. Ko¬ rzystnie kompozycja, stymulujaca wzrost, zawiera na 100 czesci wagowych karmy okolo 0,0001—0,01 czesci wagowych wyzej wymienionego materialu aktywnego, mianowicie antybiotyku X-5108 lub je¬ go farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Wyzsze ste¬ zenia antybiotyku X-5108, niz 0,1 czesci wagowych na 100 czesci wagowych karmy, na ogól nie wyka¬ zuja lepszych wyników, niz wyniki, uzyskane ze stezeniem 0,01 na 100. Tak wiec nie jest korzystne stosowanie ilosci wie£s.zych, niz 0,01 czesci wago¬ wych aktywnego skladnika na 100 czesci wagowych karmy. Korzystnie kompozycja, stymulujaca wzrost, zawiera na 100 czesci wagowe karmy okolo 0,0Q25 czesci wagowych aktywnego skladnika, antybioty¬ ku X-5108.Jak wspomniano wyzej, korzystnie wytwarza sie poczatkowo przedmieszke, zawierajaca jako aktyw¬ ny skladnik antybiotyk X-5108. Przygotowywanie przedmieszki, która mozna pózniej dodawac do kar¬ my, stanowi wygodna* metode stosowania kompo¬ zycji stymulujacej wzrost i zapewnia wlasciwe roz¬ mieszczenie aktywnego skladnika w karmie. Ilosc antybiotyku X-5108, obecnego w przedmieszce, nie jest scisle okreslona, Pozadane stezenie skladnika aktywnego w karmie osiaga sie bez wzgledu na po¬ ziom antybiotyku X-5108 w przedmieszce przez za¬ stosowanie ilosci przedmieszki, zdolnej do wytwo¬ rzenia karmy koncowej, zawierajacej efektywny po¬ ziom antybiotyku X-5108, jak okreslono poprzednio.Przedmieszka jest wygodnym sposobem dostarcze¬ nia kompozycji producentowi karmy lub hodowli drobiu, który moze nastepnie domieszac odpowied¬ nie ilosci mieszaniny stezonej do pozywienia dla drobiu w celu otrzymania karmy koncowej, zawie¬ rajacej efektywny poziom antybiotyku X-5108.W celu dokonania pomiaru efektu stymulujacego wzrost antybiotyku X-5108 przygotowuje sie karme podstawowa, zawierajaca nastepujace skladniki w nastepujacych ilosciach: s % wagowy zmielona kukurydza 56,075 maczka miesna i kostna (50% bialka) 4,000 maczka rybna (60% bialka) 4,000 maczka sojowa (50% bialka) 28,00087 266 11 odwodniona maczka z alfalfa 1,000 tluszcz zwierzecy 4,000 metionina 0,200 fosforan mineralny 0,250 weglan wapnia 1,200 5 sól jodowana 0,250 dodatek witamin 1,000 dodatek mmeralów sladowych 0,025 Antybiotyk X-5108 dodaje sie do tej porcji w sto¬ sunku 50 mg antybiotyku na 1 kg porcji. 10 Efekt stymulujacy wzrost antybiotyku X-5108 zo¬ stal oznaczony przez karmienie drobiu ad libitum pozywieniem z dodatkiem antybiotyku. W próbie badanej zastosowano jednodniowe kurczeta Cornish Cross Sexed Broiler, po 10 kurczat (5 samców i 5 15 samic) na kazda próbe. Stosowano powtórzenia w celu zrównowazenia czynników ogrzewania, swiat¬ la i pozycji. Obserwowano ptaki przez okres dwóch tygodni i oznaczono wage grupowa kilka razy pod¬ czas tego okresu, a, wage indywidualna oznaczono 20 po uplywie 14 dni. Spozycie pokarmu bylo równiez rejestrowane oraz obliczano poprawe w wykorzy¬ staniu pokarmu w stosunku do próby kontrolnej.Jednoczesnie prowadzono doswiadczenie kontrol¬ ne w sposób powyzej opisany, z tym wyjatkiem, 25 ze kurczeta, zastosowane jako kontrola, karmione byly ad libitum pozywieniem, zawierajacym te sa¬ me skladniki odzywcze, ale nie zawierajacym do¬ datkowo antybiotyku X-5108.Nastepnie przeprowadzono nastepujace oblicze- 30 nia. Sredni przyrost wagi dla kazdej grupy dzieli sie przez sredni przyrost wagi grupy kontrolnej i wynik mnozy przez 100, aby uzyskac procentowy przyrost wagi. Przyrost jest to koncowa waga ciala kurczecia na koncu dwutygodniowej próby po od- 35 jeciu wagi poczatkowej w wieku 1 dnia, (srednia waga koncowa — sredniiia waga poczatkowa grupy testowej) _ (srednia waga koncowa — srednia waga * poczatkowa grupy kontrolnej) 40 -procentowy przyrost wagi W tablicy 12 zebrane sa wyniki doswiadczenia.Z tablicy tej widac, ze kurczeta, karmione pozy¬ wieniem z dodatkiem 50 mg antybiotyku X-5108 na kilogram pozywienia, wykazywaly zwiekszone tern- 45 po wzrostu w porównaniu z grupa kontrolna. W tym samym czasie, jak na to wskazuje 10% popra¬ wa w wydajnosci pozywienia, te same ptaki sku¬ teczniej wykorzystywaly swoje pozywienie.Doswiadczenie, opisane powyzej, wraz z kontrola so przeprowadza sie kilkakrotnie. W próbach tych zmieniano poziom antybiotyku X-5108. Kurczeta doswiadczalne karmiono pozywieniem z dodatkiem antybiotyku, zawierajacym aktywny skladnik w stosunku 5, 10, 25, 50 i 100 mg na kilogram karmy. 55 Próby te powtarzano w celu potwierdzenia wyni¬ ków. W próbie kontrolnej no w czterech powtórzeniach karma podstawowa, pozbawiona dodatku. Na wszystkich próbach ob¬ serwowano w okresie dwóch tygodni szybkosc 60 wzrostu w porównaniu z grupa kontrolna. Reje¬ strowano równiez spozycie pokarmu i obliczono po¬ prawe w wydajnosci zuzycia pokarmu w stosunku do kontroli. W ponizszych tablicach zebrano wyni¬ kidoswiadczen. 65 U Tablica 1 Podloza wzrostowe ISP -Podloze 1: Fodloze 2: 4,0 g ,0 g 4,0 g 1,0 litr ,0 g g 18,0 g bulion trypton — wyciag drozdzowy Bacto-Trypton (Difco) 5,0 g Bacto — wyciag drozdzowy (Difco) 3,0 g Woda destylowana 1,0 litr lpH=7,0—7,2 przed autofclawowaihiem ml bulionu rozlewa sie do probówek o srednicy 20 mm lub wiekszej, wyciag drozdzowy — wyciag slodo¬ wy — agar Bacto — wyciag drozdzowy (Difco) Bacto — wyciag ze slodu (Difco) Bacto — dekstroza (Difco) Woda destylowana Wartosc pH doprowadza sie do 7,3 i dodaje Bacto — agar Agar doprowadza sie do stanu cieklego, ogrzewajac go w temperaturze 100°C w ciagu 15—20 minut.Odpowiednie ilosci rozlewa sie do przynajmniej 6 probówek dla kazdej kultury, sterylizuje w autoklawie i pro¬ bówki oziebia jako skosy.Podloze 3: agar na platkach owsianych platki owsiane agar Gotuje sie lub trzyma w podgrzanej parze 20 g platków owsianych w 1000 ml wody destylowanej w ciagu 20 minut.Przesacza przez plótno, dodaje wody destylowanej, aby objetosc przesaczu wy¬ nosila ponownie 1000 ml. Dodaje roztwór pierwiastków sladowych, a mianowicie po Iml roztworu 0,1 g FeS04-7H20, MnCl2-4H20 i ZnS04;7H20 w 100 ml wo¬ dy destylowanej. Doprowadza ~wartosc pH do 7,2 za pomoca NaOH, dodaje 18 g agaru i doprowadza do stanu cieklego przez ogrzewanie w parze wodnej w temperaturze 10(PC w ciagu 15^20 mi¬ nut.Sole nieorganiczne agar ze skrobi Ze skrobi rozpuszczalnej Difco 10,0 g wytwarza sie paste z niewielka iloscia zimnej wody destylowanej i doprowa¬ dza do objetosci 500 ml.RoztwórII: K2HP04 (bezwodny) MgS04-7H20 NaCl (NH4)2S04 CaCO, Woda destylowana Roztwór soli sladowych takiego, jak w podlozu 3 Podloze 4: Roztwór I: 1,0 g 1,0 g 1,0 g 2,0 g 2,0 g 500 ml lml roztworu Wartosc pH powinna wynosic 7,0—7,4.Miesza sie zawiesine skrobi i roztwór soli dodaje agar (Difco) 20,0 g Doprowadza agar do stanu cieklego przez przepuszczenie przezen pary o87 266 13 14 1,0 g ,0 g 1,0 g 1,0 litr 1,0 ml 10 temperaturze 100°C w ciagu 15—20 mi nut.Podloze 5: Gliceryna-asparagina-agar L-asparagina (bezwodna) gliceryna K2HP04 (bezwodny) woda destylowana Roztwór substancji sladowych w postaci roztworu takiego, jak w podlozu 3 Wartosc pH tego roztworu wynosi oko¬ lo 7,0—7,4. Nie nalezy go zmieniac, je¬ zeli miesci sie w tym zakresie Agar 20,0 g Doprowadza sie agar do stanu cieklego przez umieszczenie w parze o tempera¬ turze 100°C w ciagu 15—20 minut.Podloze 6: Pepton-wyciag drozdzowy — zelazo-agar Bacto-pepton-agar zelazowy, bezwodny (Difco) Bacto-wyciag drozdzowy (Difco) Woda destylowana Wartosc pH powinna wynosic przed autoklawowaniem.Agar doprowadza sie do stanu cieklego przez ogrzewanie w parze o tempera¬ turze 100°C w ciagu 15—20 minut.Podloze 7: Agar tyrozynowy Gliceryna 15,0 g L-tyrozyna (Difco) 0,5 g 36,0 g 1,0 g 1,0 litr 7,0—7,2 L-asparagina (Difco) K2HP04 (bezwodny) MgS04-7H20 NaCl FeS04-7H20 Woda destylowana 1,0 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g . 0,01 g 1,0 litr Roztwór pierwiastków sladowych w postaci roztworu takiego, jak w podlozu3 1,0 ml Wartosc pH doprowadza sie do 7,2—7,4 Bacto-agar 20,0 g Agar doprowadza sie do stanu cieklego przez ogrzewanie w parze w tempera¬ turze 100°C w ciagu 15—20 minut.Roztwór pierwiastków sladowych (we-. dlug wskazówek w podlozach 3, 4, 5 i 7).FeS04-7H20 0,1 g MnCl2-4H20 0,1 g ZnS04-7H20 0,1 g woda destylowana 100,0 ml Agar na pascie pomidorowej (Berger) glukoza 10,0 g K2HP04 • 1,0 g pasta pomidorowa 20,0 g pepton Wilsona 1,0 g CaC08 2,0 g Agar 15,0 g Woda z kranu 1000,0 ml Sterylizuje sie pod cisnieniem 15 lbs w ciagu 30 minut, wartosc pH doprowa¬ dza do 6, 9.Tablica 2 * Porównanie wlasnosci Streptomyces X-5108 z innymi przedstawicielami serii szarej Wlasnosci powierzchnia spor morfologia kolor wytwarzanie melaniny wytwarzanie antybiotyku zródlo wegla: glukoza d-ksyloza 1-arabinoza 1-ramnoza d-fruktoza d-rafinoza d-mannitol i-inozytol salicyna galaktoza Strepto¬ myces X-5108 sm RA Gy + X-5108 + + + + + + + + nie wyko¬ nano + S. antibio- ticus Pfizer 15784-1 sm RA Gy +. cleando^ mycyna + + + + + — + — — + S. sureo- faciens Lederle A-377 sm RA Gy — Chloroter- tacyklina + + + — + — — — — + S. griseo- luteus Umezawa sm RA Gy — grizeolu- teina + + — — + — + — — + 1 S. purpu- reofuscus Waksman sm RA Gy + antytri- choimonas + + + — — — — — — + x S. viridifa- ciens sm RA Gy — tetracykli- na + — — — + — — — — + S. sp.Rivett Peters No 11 sm RA Gy + streptoli- na + — + — + — — — + + 1 Dane, dotyczace szczepów innych, niz Steptomyces X-5108, zostaly wziete z literatury sm — gladki pod mikroskopem elektronowym; RA — retinaculum aportum; Gy — seria szara; (+) = wzrost; (—) = nie fermentuje87 266 16 Tablica 3 Charakterystyka kultury Streptomyces sp. X-5108 (Inkubacja: 14 dni. Temperatura: 28°C) Podloze (stale)1 agar na sacharozie Czapeka asparagina-deks- troza —0,25% pasta pomidorowa pepton-agar agar skrobiowy agar Krainsky'ego na glukozie Nycophil agar (BBL) agar odzywczy na wyciagu drozdzowym agar z gliceryna skrawek kartofla skrawek marchwi Wzrost dobry dobry dobry dobry dobry dobry dobry sredni do dobrego (10 da) dobry dobry Grzybnia powietrzna i/lub spory grzybnia powietrzna biala¬ wa, sporulacja dobra, biala grzybnia powietrzna puszy¬ sta do proszkowatej, sporu- lujaca w kolarze ciemno¬ szarym grzybnia powietrzna biala do jasnoszarej, sporulacja dobra, szara sporulacja dobra zmienia¬ jacego sie w ciemnoszara biale brzegi grzybnia powietrzna biala, sporulacja dobra zmienia¬ jaca sie w ciemnoszara brak sporulacji brak sporulacji mokra kolor kremowy brak sporulacji brak sporulacji Pigment rozpusz¬ czalny niewielka ilosc ciem¬ nobrazowy brak brak brak brak niewielka ilosc ciemny ciemny brak czarny — Kolor odwrotny reverse color; za¬ barwienie kultury od spodu po scie¬ ciu agaru niewielka ilosc, zólty pomaranczowy do zóltego pomaranczowo- ciemnozólty pomaranczowo- zólta cytrynowozólty niewielka ilosc, zólty szarawy do zólto- brazowego niewielka ilosc, zólty — — 1-wzrost byl równiez dobry na wszystkich na- 4U charozie Czapeka, bulion na glukozie Krainsky'ego stepujacych podlozach cieklych: bulion na trypt- i bulion cytrynian wapnia-gliceryna. onie (ciemny pigment rozpuszczalny; indol nega- 2-wzrost byl dobry w ciagu 8 dni na tym podlo- tywny 3 dni) bulion odzywczy FDA, bulion na sa- zu w temperaturze 24°, 28°, 32° i 37°, ale nie w temperaturze 42°C.Tablica 4 Reakcja fizjologiczna Streptomyces sp. X-5108 Podloze 1 1 bulion na azotanie orga¬ nicznym bulion na azotanie orga¬ nicznym zelatyna w 18°C (15%) zelatyna (15%) w 18°C agar pepton-zelazo (Kligler) Okres inkubacji 2 8 dni 13 dni dni 12 dni 14 dni Wzrost 3 sredni brak spor dobry; ciemny pigment sredni, ciemny pigment rozpuszczalny wzrost sredni do dobrego pigment brazowo-czarny dobry, bardzo niewielka sporulacja Reakcje fizjologiczne 4 brak redukcji azotanów brak gazu brak redukcji azotanów brak gazu zelatyna nie jest dopro¬ wadzona do stanu cieklego doprowadzenie do stanu cieklego w niewielkim stopniu chromogenna (wytwarza¬ nie melaniny)87 266 17 mleko lakmusowe mleko lakmusowe agar Dorset Egg agar Dorset Egg 1 2 6 dni 13 dni 3 dni dni . 1 3 sredni wzrost powierzchniowy sredni wzrost powierzch¬ niowy brak sporulacji dobry sporulacja lekko biala bardzo dobry wzrost, glównie sporuje w kolorze jasnoszarym 1S *4 1 kolor lakmusu nie zmie¬ niony, brak scinania sie lub klarowania kolor lekko brazowy, brak scinania sie lub klaro¬ wania — niewielka ilosc ciemnego pigmentu Tablica^5 Typy fermentacji zródel wegla i azotu przez Streptomyces sp. X-5108 Inkubacja 14 dni. Temperatura 28°C Zródlo wegla 1-arabinoza | 1-ramnoza d-ksyloza d-mannitol i-inozytol glukoza fruktoza sacharoza rafinoza skrobia d-ryboza d-galaktoza d-mannoza cellobioza laktoza maltoza dekstryna dulcitol arytritol sorbitol Fer¬ men¬ tacja1) 1 3 3 3 3 3 3 3 0 1 3 • 3 3 3 3 3 0 0 0 1 Zródlo wegla gliceryna octan cytrynian jablczan szczawian salicylan bursztynian winian fenol (0,1%) zródlo azotu: (NH4)tS04 NaNO, azotyn sodu acetamid asparagina tyrozyna dl-tryptofan kontrola i ujemna Fer¬ men¬ tacja1) 0—1 3 2 2 1 0 2 0 0 1 1 1 1 3 3 2 0—1 l) 3 — dobra fermentacja 2 — srednia fermentacja 1 — slaba fermentacja 0 — brak zuzycia kontrola ujemna, brak wegla daje 0 40 45 Do zaszczepiania stosuje sie zawiesimy spor po¬ branych ze skosów z agaru pomidorowego w wo¬ dzie destylowanej. Zuzycie zwiazków wegla i azo¬ tu bada sie na nastepujacym podlozu podstawo¬ wym: KH2P04 K2HP04 MgS04*7H20 CuS04-5H20 FeS04-7H20 2,38 g ,65 g 1,00 g 0,0064 g 0,0011 g MnCl2-4H20 ZnS04-7H20 agar wada destylo¬ wana 0,0079 g 0,0015 g g 1,0 litr wartosc pH pod¬ loza doprowadza sie do 6,8—7,0.W celu zbadania zródel wegla na tym podlozu podstawowym dodaje sie 2,64 g (NH4)2S04 na litr jako wspólnego zródla azotu, zródla wegla doda¬ je sie w stezeniu 1% za wyjatkiem soli sodowych kwasów organicznych, które stosuje sie w slezeniu 0,15%. W celu zbadania zródel azotu stosuje sie podloze podstawowe syntetyczne na agarze z do¬ datkiem 1% skrobi i zródla azotu w stezeniu 0,1 g azotu ina litr.Tablica 6 i. Wplyw zmian pozywienia na wydajnosc antybiotyku, produkowanego przez Steptomyces sp. X-5108 w butlach wytrzasanych • Wszystkie podloza zawieraly 1% dekstryny, 50 0,1% K2HP04 i 0,1% CaCO,. Do kazdych 100 ml po¬ zywki zaszczepiono lml zawiesiny spor Streptomy¬ ces sp. X-5108. 55 60 65 Nr do¬ swiad¬ czenia 1 2 Wszystkie zródla azo¬ tu dodane w steze¬ niach 1% z wyjatkiem 17 i 23 (2%) Wyciag maczki miesnej BY-100 (Oommercial Solventa Corp.) Wiek w dniach 6 Aktyw¬ nosc an¬ tybioty¬ ku w jednost¬ kach/ml 50 4587 266 19 c.d. tablicy 6 Nr do- swiad- 1 czenia 3 4 8 9 11 12 13 14 16 17 19 21 22 23 24 Wszystkie zródla azo¬ tu dodane w steze¬ niach 1% z wyjatkiem 17 i 23 (2%) Proflo (Traders Cii Mili Co) Platki owsiane (Quaker Oats Co) Scyalose (odtluszczo¬ na maka sojowa) Maczka bialkowa z orzechów ziemnych Maczka bialkowa z orzechów kokosowych Wytloki z pomidorów Maczka olejowa z na¬ sion lnu Maczka kukurydziana Suszone ziarno i roz¬ puszczalne pozostalosci z destylacji spirytusu zbozowego (H. Walker) Soludri (Schenley Dis- tillers) Maczka rybna (Gorton) Skrawki ryb (Wilkinson) Mieszanina cukru mlecznego z albumina Suszone drozdze Torula Autolizat drozdzowy Hydrolizat enzyma¬ tyczny soi Kwasny hydrolizat bialka zboza (Huron Mills) Homegenizowana skondensowania ryba Protopepton 366 (La- * boratoria Wilsona) Wyciag namokowy z kukurydzy Wiek w dniach • 5 Aktyw¬ nosc an¬ tybioty¬ ku w jednost¬ kach/ml 32 41 50 57 37 33 74 51 16 50 38 16 33 12 27 18 26 | Tablica 7 Wplyw zmian pozywienia na wydajnosc antybiotyku, produkowanego przez Streptomyces sp. X-5108 w wytrzasanych butelkach Nr do¬ swiad¬ czenia 1 2 3 4 7 8 9 11 12 13 14 16 17 Sklad podloza w % 1 wyciag maczki miesnej, 1 dekstryna 1 pozostalosc po fer¬ mentacji ziarna (BY-100), 1 dekstryna 1 odtluszczona maka z nasion bawelny (Proflo), 1 dekstryna 1 skrawki ryby 1 suszone ziarno i rozpuszczalne pozo¬ stalosci z destylacji spirytusu zbozowego (H. Walker), 1 dekstryna (3) lecz bez CaC08 (3) lecz bez CaCOs lub K2HP04 (8) lecz tylko 0,25 Proflo (8) lecz 2,0 Proflo 1 Proflo, 1 glukoza 1 Proflo, 1 skrobia 1 Proflo, 1 gliceryna 1 Proflo, 1 cukier surowy 1 Proflo, 1 maltoza 1 Proflo, 1 laktoza 1 Proflo, 1 mannitol Wiek w dniach 4 4 4 4 6 4 4 4 4 6 6 4 4 4 4 6 Aktyw¬ nosc an¬ tybioty¬ ku w jednost¬ kach/ml 40 67 52 40 138 19 1 i 34 12 47 21 21 14 22 26 45 Wszystkie podloza zawieraly 0,1% K2HP04 i 0,1% CaCOs, jezeli nie powiedziano inaczej. Do kazdych 100 ml pozywki zaszczepiono 1 ml zawiesiny spor Streptomyces sp. X-5108.Tablica 8 Wplyw zmian w pozywce na wydajnosc produkcji antybiotyku przez Streptomyces X-5108 w wytrzasanych butelkach i napowietrzanych kadziach. Jezeli nie powiedziano inaczej, kazda pozywka zawierala 0,5% CaC03 i 0,1% K2HPQ4.Sklad pozywki w % Pozy¬ cja 1 1 2 Wytloki z pomidorów 2 1 2 Rozpusz¬ czalne pozo¬ stalosci z destylacji spirytusu zbozowego 3 1 0 Skrobia kukurydziana 4 1 1 Glukoza 0,5 0,5 Wydajnosc antybiotyku jedinostki B. simplex na ml Butle, 7 dni 6 150 100 Tanki, 6 dni (w dwóch po¬ wtórzeniach) 7 100, 120 71, 46 |21 87 266 c.d. tablicy 8 1 1 3 4 6 7 2 0 1 1 1 1 Proflo, 3 2 1 1 1 1 . 4 1 1,5 0 0 skrobia, 0,1 * 5 1 0,5 0 1,5 0 CaCOg 0,1 K2HPQ4 6 91 140 180 54 94 7 88, 119 150, 124 125, 126 nie wykonano 97 (4 dni) Tablica 9 Fermentacja w kadziach a) na róznych podlozach Nr do¬ swiad¬ czenia KI 2 KI 3 Kil KI 4 Ki 6 | | Sklad podloza w % 1 rozpuszczalne po¬ zostalosci z destyla¬ cji spirytusu zbo¬ zowego, 1 dekstry¬ na, 0,1 K2HP04, 0,1 CaC08 1 1-glutaminian so¬ du, 1 dekstryna, 0,1 wyciag namokowy z kukurydzy, 0,15 K2HP04, 0,05 Mg so4 1 wytloki z pomi¬ dorów, 1 rozpusz¬ czalne pozostalosci z destylacji spiry¬ tusu zbozowego, 1 skrobia kukury¬ dziana, 0,5 glukoza, 0,5 CaC08, 0,1 K2HP04 0,5 Proflo */, 0,5 rozpuszczalne po¬ zostalosci z desty¬ lacji spirytusu zbo¬ zowego, 0,5 wytloki z pomidorów, 0,5 pasta z wyciagu miesnego (protope- pton nr 366), 1 skro¬ bia, 0,1 CaCOj, 0,1 K2HP04 1,0 Proflo W, 0,5 wyciag inamokowy z kukurydzy, 1,0 skrobia kukury¬ dziana, 0,1 CaC03, I zbioru 6 7 4 4 0,1 K2HP04 Aktyw¬ nosc w jedno¬ stkach E/ml 67 100 200 91 0 1 260 40 45 50 55 w kadzi fermentacyjnej ze stali weglowej o po¬ jemnosci 750 galonów (zawierala ona 500 galo¬ nów), a K4 przeprowadzono w kadzi fermenta¬ cyjnej ze stali weglowej o pojemnosci 4200 ga¬ lonów (zawierala ona 3200 galonów pozywki), b) Proflo jest produktem z odtluszczonych nasion bawelny firmy Traders Oil Mil Co., Fort Worth, Texas^ Tablica 10 Produkcja antybiotyku przez Streptomyces v X-5108-na podlozach syntetycznych 1 / Sklad podloza w % 1,0 glutaminian sodu, 1 dekstryna, 0,1 K2HP04, 0,05 MgS04 1,0 mieszanina amino¬ kwasów1), 1 dekstryna, 0,1 K2HP04, 0,1 soli USP 1 bulion2) Czapeka-Doxa BBL 1,0 arginina, 1,0 dekstry¬ na, 0,1 K2HP04, 0,1 CaCOg, 0,05 MgS04 1,0 kwas dl-asparagino- wy, 1,0 dekstryna, 0,1 K2HP04, 0,1 CaC08, 0,05 MgS04 0,1 glutaminian sodu, 0,5 (NH4)2HP04, 1 glukoza, 1 dekstryna, 0,1 K2HP04, 0,1 CaC03, 0,1 KCl, 0,05 MgS04 0,33 (NH4)2S04, 1,5 gluko¬ za, 0,1 cytrynian sodu, 0,05 octan sodu, 0,05 NaCl, 0,025 MgS04 • 7H20, 0,01 K2HP04, 0,3 GaC08, 0,001 MnS04 • 4H20, 0,004 ZnS04- 7H20, 1,6X10"6 K2CrQ7 Wiek hodo¬ wli w dniach 6 6 7 Aktywnosc antybioty¬ ku w jed¬ nostkach E/ml 7,6 11,5 4,4 0,8 .. 0,8 6,6 ( a) KI 1, KI 2 i KI 3 wszystkie przeprowadzono w kadziach fermentacyjnych ze stali nierdzewnej o pojemnosci 100 galonów, które na ogól zawie¬ raly 65 galonów podloza; KI 6 przeprowadzono 65 1) Sta-Miino B Staleya 2) 3% sacharoza, 0,3% NaN08, 0,1 K2HP04, 0,05 MgS04, 0,05 KOI, 0,001 FeS04, sprzedawane przez Baltimore Biological Laboratories87 266 23 ~ Tablica 11 Spektrum przeciw mikrobom antybiotyku X-5108 in vitro Srednica obszaru zahamowania*) w mm 24 Organizmy testowe 1 1 Escherichia coli Paecilomyces varioti Mycobacterium phlei Bacillus simplex Pseudomonas aeruginosa Aerobacter aerogenes Streptomyces cellulosae Sarcina Luteu Bacillus E Surowa sól sodowa an¬ tybiotyku X-5108 1 mg/ml 2 17,3 (18) 0 (0) 1925.3 39,3cs (20) 2) 14,0 (12,5) 12,0 17 (14,5) 31,3 (21) 3) 27,7csi(21,5)3) 36,3 cns (31) 3) Czysta sól sodowa an¬ tybiotyku X-5108 1 mg/ml 3 18,0(18,5) 0 (0) ,2 27,5 40,3cs (20) 2) ,0 (13) 14,3 19 (15,5) 33,0 (21) 3) 29,7cs (22) 3) 27,2cns (32) 3) c.d. tablicy 11 1 Bacillus sub- tilis . Serratia mar- cescens Candida albicans Penicillium digitatum Saccharomyices cerevisiae Staph. aureus Bacillus Bodenheimera Proteus vulgaris 2 16,0 22J (17) 24) 14,7 22,7 (22) siady (0) 0 0 (0) 14,5cs (13) ,8cs (18) 16,3 21,2 (20)3) 3 1 17,023(17)24 ,7 24 (22,5) slady (0) • 0 0 (0) ,8cs (14) 21,7cs (18) 16,7 22,2(20)3) 1) Tam, gdzie podano dane podwójne z dana w prawym górnym rogu, wskazuje to na obecnosc drugiego mniej wyraznego obszaru zahamowa¬ nia. Skróty es i cns oznaczaja odpowiednio jas¬ ny i ostro odgraniczony oraz jasny i nieostro od¬ graniczony obszar zahamowania. * 2) przy stezeniu 0,001 mg/ml 3) przy stezeniu 0,1 mg/ml dla Bacillus E przy 0,01 mg/ml obszar zahamowania wynosil 22 mm dla <306).Tablica 12 Dodatek anty¬ biotyku mg/kg pokarmu kontro¬ la pod¬ stawo¬ wa 0 anty¬ biotyk X-5108 50 Przyrost w ciagu dwóch tygodni* g±2 SE** kontrola podsta¬ wowa 154±8 antybio¬ tyk X-5108 185±12 Przyrost w % kontro¬ la pod¬ stawo¬ wa 100 anty¬ biotyk X-5108 120 Wydajnosc karmy kontrola podsta¬ wowa 1,55 antybio¬ tyk X-5108 1,39 Poprawa wy¬ dajnosci kar¬ my w % kontro¬ la pod¬ stawo¬ wa — anty¬ biotyk X-5108 + 12 * przecietna dla 40 kurczat ** blad sredni standardowy Dodatek kontrola podst. antybiotyk X-5108 kontrola podst. antybiotyk X-5108 kontrola podst. antybiotyk X-5108 kontrola podst. antybiotyk X-5108 kontrola podst. antybiotyk X-5108 kontrola podst. antybiotyk X-5108 Ilosc podana mg/kg ^_ 50 — 50 — — — — 100 Tablica Liczba ptaków 48 24 18 18 48 18 48 18 48 18 13 Przyrost w ciagu 2 tygodni 149 175 152 173 146 180 149 183 149 185 149 182 • Przyrost w o/0 100 117 100 114 100 123 100 123 100 124 100 122 Wydaj¬ nosc karmy 1,54 1,37 1,47 1,38 1,59 1,37 1,51 1,39 1,54 1,41 1,54 1,33 Poprawa wydaj¬ nosci karmy _ + 12 — + 7 — + 16 — +9 — + 13 — + 1487 266 *5 Wynalazek jest blizej wyjasniony w ponizszych przykladach. Jezeli nie eaznaczono inaczej, wszy¬ stkie temperatury podane sa w stopniach Celsju¬ sza i wszystkie stosunki podane sa w czesciach wagowych.Przyklad I. Fermentacja Streptomyces sp, X-5108. Zawiesine spor Streptomyces sp. X-5108 z hodowli na skosie z agaru odzywczego zaszcze¬ pia sie do butli pyrexowej o pojemnosci 5 galonów z napowietrzeniem, zawierajacej 15 litrów pozywki o nastepujacym skladzie: 1% maczki sojowej 1% brazowego cukru 0,25% cial stalych z wyciagu namokowego z kuku¬ rydzy 0,1% K2HP04 0,1% CaCOs 0,5% oleju smakowego, przeciwdzialajacego two¬ rzeniu siepiany ' Po czterech dniach prowadzenia hodowli w tem¬ peraturze 28*C z napowietrzeniem grzybnie o po¬ staci nitkowej przenosi sie do kadzi fermentacyj¬ nej ze stali nierdzewnej o pojemnosci 100 galonów, zawierajacej 60 galonów pozywki o nastepujacym skladzie: 1% odtluszczonej maki z nasion bawelny (Proflo) 1% skrobi kukurydzianej 0,25% cial stalych z wyciagu namokowego z kuku¬ rydzy 0,1% CaCOs 0,1% K2HP04 oraz olej smalcowy jako czynnik przeciwpienny Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 6,8 przed zaszczepieniem. Kadz fermentacyjna napowietrza sie i hodowle utrzymuje przez 5 dni. Nastepnie odsacza sie zawartosc kadzi fermentacyjnej przy zastoso¬ waniu ziemi okrzemkowej (Hyflo Filter Celi). War¬ tosc pH przesaczu doprowadza sie do 3,5 po czym przesacz ekstrahuje sie polowa Objetosci octanu butylu. Sklarowany wyciag zateza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze ponizej 40°C do brazowego syropu, z którego po roztarciu z eterem naftowym otrzymuje sie w postaci proszku anty¬ biotyk X-5108 o aktywnosci 120 jednostek Bacillus E/mg.Przeklad II. Oczyszczenie antybiotyku X-5108 za pomoca ekstrakcji rozpuszczalnikami.Proces ekstrakcji rozpuszczalnikami prowadzi sie na ilosci 3000 galonów brzeczki fermentacyjnej, która w próbie in vitro wykazywala aktywnosc okolo 130 jednostek/ml w stosunku do B. simplex.Odsaczona brzeczke ekstrahuje sie octanem butylu przy wartosci pH=7,5. Ekstrakt organiczny po przemyciu woda zateza sie w temperaturze ponizej 50°C, a do tak powstalego roztworu bezwodnego do¬ daje sie dwuetylomalonianu sodowego w celu do¬ prowadzenia wartosci pH do 9,0. Otrzymany zólty 26 osad odsacza sie i przemywa octanem butylu. Na¬ stepnie rozdziela sie pomiedzy wode z octanem bu¬ tylu, a wartosc pH doprowadza sie do 4. Faze or¬ ganiczna oddziela sie i poddaje obróbce, jak wyzej z tym wyjatkiem, ze dodaje sie dwuetylomalonia¬ nu sodowego do wartosci pH=8,5. Ten drugi osad jeszcze zakwasza sie i ekstrahuje swieza porcje oc¬ tanu butylu. Nastepnie ekstrakt traktuje sie Darco G-60 i wytraca sól sodowa antybiotyku X-5108 przez dodatek dwuetylomalonianu sodu do wartosci pH=8,0. W ten sposób otrzymuje sie zólta sól sodo¬ wa, która po przemyciu i wysuszeniu wykazuje in vitro aktywnosc okolo 430 jednostek/ml przy za¬ stosowaniu do B. simplex. Wyzej wymieniona me- toda ekstrakcji jest streszczona na nastepujacym schemacie: ' Schemat izolacji antybiotyku X-5108. etap 1. 300 galonów calkowitej pozywki (po fer¬ mentacji trwajacej 5—6 dni) odsacza sie komórki za pomoca Hyflo etap 2. 2600 galonów brzeczki fermentacyjnej (pH=7,5) (jesli konieczne doprowadza sie sie do wartosci pH za pomoca HsP04) ekstrahuje sie za pomoca 600 galonów octanu butylu etap 3. 580 galonów „octanu butylu 1" dwukrotnie przemywa sie za pomoca 25 galonów wody i zateza sie etap 4. 80 galonów „koncentratu octanu butylu 1" dodaje sie dwuetylomalonianu sodowe¬ go do pH=9 (okolo 1-^1,5 litrów l,7n roz¬ tworu), osad odsacza sie przemya 1 galo- 40 nem octanu butylu etap 5. „osad 1" rozpuszcza sie w 25 galonach H20, pH do¬ prowadza do 4 za pomoca 15% HsP04, 45 ekstrahuje sie dwukrotnie octanem buty¬ lu (20+10 galonów) etap. 6. 28 galonów „octanu butylu 2" ¦dwukrotnie przemywa sie 2 galonami H20 50 i zateza etap. 7. 4 galony „koncentratu octanu butylu 2" dodaje sie dwuetylomalonianu sodu do pH— 8,5, osad odsacza sie, przemywa 1 ga- 55 lonem octanu butylu etap 8. „osad 2" rozpuszcza sie w 20 galonach H20, pH do¬ prowadza sie do 5 za pomoca 15% H8P04, 60 dwukrotnie ekstrahuje octanem butylu i(15+7,5 galonów) etap 9. 21 galonów „octanu butylu 3" przemywa sie dwukrotnie 2 galonami H20 66 i zateza87 2 27 etap 10. 4 galony „koncentratu octanu butylu 3" miesza sie. z 50 gramami Darco G-60 przez 1 godzine w temperaturze pokojowej, odsa¬ cza i zateza etap 11. 2 galony „octanu butylu" dodaje sie dwuetylomalonianu sodu do pH=3, osad odsacza, przemywa 1 galonem octanu butylu, nastepnie 1 galonem eteru naftowego (30—60°), suszy w temperaturze io 56°C i pod cisnieniem 0,5 mm przez 36 go¬ dzin.Sól sodowa antybiotyku X-5108 jako bez¬ postaciowe cialo stale o barwie zóltej.Przyklad III. Oczyszczenie antybiotyku X-5108 metoda ekstrakcji przeciwpradowej Aparatura: Liczba probówek — 200 objetosc ifiazy górnej — 40ml 20 objetosc fazy dolnej — 40 ml Szarza: g antybiotyku X-5108, otrzymanego droga ekstrak¬ cji rozpuszczalnikami organicznymi surowej brzecz- 25 ki fermentacyjnej, rozpuszczono w 40 ml fazy gór¬ nej Uklad rozpuszczalników: octan etylu, izopropanol 0,1 m, wodny roztwór dru- 30 gorzedowego fosforanu sodu, 12 : 9 :20 (objetoscio¬ wo) Charakterystyka podzialu: Liczba przeniesien — 200 probówka, zawierajaca maksimum po 200 przenie- 35 sieniach — 159 stosunek podzialu 3,88 Technika wykonania: zbiera sie frakcje 150—170 i dodaje butanolu-1 w celu wyekstrahowania anty- 4o biotyku z fazy organicznej. Odrzuca sie faze wod¬ na, a faze organiczna przemywa sie czterokrotnie woda. W koncu usuwa sie wode azeotropowo z fa¬ zy organicznej i produkt koncowy wytraca przez dodanie eteru naftowego. Otrzymuje sie 3 gramy 45 materialu o wlasnosci antybiotyku o aktywnosci okolo dwukrotnie wiekszej, niz material poczatko¬ wy.Przyklad IV. Oczyszczanie antybiotyku X-5108 50 za pomoca chromatografii na Sephadex-LH-20 Wartosc pH etanolowego roztworu 300 mg próbki antybiotyku uprzednio oczyszczonego za pomoca ekstrakcji przeciwpradowej doprowadza sie do 8— 9 za pomoca roztworu metoksylanu sodu (mokry 56 papierek wskaznikowy) i przenosi material na ko¬ lumne Sephadex LH-20 (290X41 mm) zrównowazo¬ na 3A alkoholem. Kolumne rozwija sie 3A alkoho¬ lem, przy czym glówny obszar antybiotyku pojawia sie przy objetosci wycisku 950—1200 ml. Frakcje po 60 tym nastepujace zawieraja szereg barwnych praz¬ ków, posiadajacych minimalna aktywnosc biologicz¬ na. Aktywne frakcje zbiera sie i odparowuje do ma¬ lej objetosci, po czym dodaje eteru naftowego w ce¬ lu wytracenia antybiotyku. Powstajacy zólty osad, 65 28 sól sodowa antybiotyku X-5108 wykazuje obecnosc tylko jednej plamy w TLC, Rf=0,19 (zel krzemion¬ kowy F-254, wykrycie w swietle UV) i Rf=0,29 (zel krzemionkowy, ziemia okrzemkowa, detekcja bio- autograficzna).Przyklad V. Uzyskiwanie antybiotyku X-5108 z jego soli sodowej. 0,464 g soli sodowej antybiotyku X-5108, uzyska¬ nego droga chromatografii na Sephadex LH-20, rozpuszcza sie w 4,6 ml lodowatej wody i dodaje 10 ml octanu etylu w celu utworzenia ukladu dwufa¬ zowego. Do tej mieszaniny, przygotowanej w roz¬ dzielaczu, dodaje sie 1 ml pierwszorzedowego fos¬ foranu sodu (60 g NaH^P04 • H20 w 100 ml wody).Poczatkowo tworzacy sie osad rozpuszcza sie przy wytrzasaniu. Odrzuca sie faze wodna, a faze orga¬ niczna przemywa sie czterokrotnie jedna objetoscia lodowatej wody i odwadnia azeotropowo !(etanol).Stezony roztwór (— ml) rozciencza sie dwiema obje- tosciami octanu etylu i dodaje eter etylowy kro¬ plami, az do utworzenia sie zmetnienia i w kon¬ cu dodaje 30 ml eteru naftowego. Powstaly w ten sposób osad odsacza sie i suszy w temperaturze po¬ kojowej w celu uzyskania antybiotyku X-5108. PL