Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania czynnej antybiotycznie mieszaniny, zawierajacej si- zomycyne i nowy antybiotyk G-52, ewentualnie w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych pochod¬ nych, podczas hodowli nieznanych dotychczas ga¬ tunków drobnoustrojów z rodzaju Micromonospora, mianowicie Micromonospora .zionensis.Drobnoustrój Micromonospora zionensis zostal zaklasyfikowany na podstawie jego wlasciwosci taksonomicznych i hodowlanych, obserwowanych na szeregu standardowych pozywek, jako nowy gatu¬ nek Micromonospora. Z obserwacji hodowli na tych pozywkach wydaje sie on byc bardziej spokrewnio¬ nym z Micromonospora echinospora, niz z jakim¬ kolwiek innym, opisanym dotychczas drobnoustro¬ jem, aczkolwiek znaczne róznice wystepuja przy porównywaniu Charaikterystk wzrostowych obu wymienionyclh wyzej drobnoustrojów. Róznice te sa szczególnie zauwazalne podczas hodowli na na- ^termjacych pozywkach: Pozywka M. zionensis agar glikozo- wo-aspara- ginowy wzrost ubogi, powierzchnia igjladka, bar¬ wa kremowa M. echinospora wzrost wyrazny, barwa jasno- brzoskwiniowa — g5IA, umiar¬ kowanie czer¬ wono pomaran¬ czowa 37 I Pozywka agar Bennetta agar Emersona agar owsiany z pasta po¬ midorowa przyswajanie ramnozy M. zionensis barwa czarna barwa — g;4nl czekoladowa; ciemnosza- rawo-zólta- wo-brazowa 81 barwa czarna tiobre M. echinospora barwa cierii- nokasztanowa g7 1/2PL; ciem¬ no -szarawo- czerwonawo- brazowa 47 barwa brazowo- czerwona g5NE",' silnie brazowa 55 barwa brudno- rpomaranczowa g 4LC; umiar^J kowanie poma¬ ranczowa 53 dobre Szczep Micromonospora zionensis- -zostal zdepono¬ wany w Northern Utilization Research and Deve- lopment Division, U.S. Department of. Agriculture, Peoria, Illinois, pod numerem NRRL 5466. Drobno¬ ustrój charakteryzuje sie nastepujacymi wlasciwo¬ sciami mikroskopowymi, .makroskopowymi i bio¬ chemicznymi : 87 63887 638 3 Charakterystyka taksonomiczna a) Obserwacje makroskopowe hodowli 30-dniowej, inkulbowanej w -temperaturze 24—26°C, na pozywce, skladajacej sde z 3% NZ Airume Type A (pepitom otrzymywany podczas pankreatycznego trawienia 5 kazeiny, produkowany przez Sheffield Chemical Co. of Norwich, New York), 1% dekstrozy oraz 1,5% agaru, wykazuja wzrost umiarkowany, brak grzyb¬ ni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwe g3cc pomidorowa, jasno-szarawo-zóltawo-brazo- !• wa 79. b) Obserwacje mikroskopowe drobnoustroju po 60 dniach inkubowania na pozywce, zawierajacej wyciag .do^dzowy^i sacharoze, wykazuja obfity 15 wzrost sporów o ksztalcie kulistym do sferycznego, o srednicy okóJo 1,0—1,5 |xm, wytwarzanych na krótkich sporoforach.W opisach drobnoustrojów stosuje sie dwa spo¬ soby oznaczania barw. Pierwszy zostal zaczerpniety 20 z „Color Harmony Manual", wydanie 4, 1958, wyda¬ ny przez Container Corporation of America, a opisy barw zostaly wziete z „Descriptive Color Name Dictionary", Taylor, Knoche i Granville, wydawca takze Container Corporation of America (1050). ss Drugie oznaczenie barwy jest synonimem albo pra¬ wie synonimem pierwszego i zostalo zaczerpniete z National Bureau of Standards Oircular No. 553 (1995), USA.Charakterystyka hodowlana 1. Micromonospora zionensis charakteryzuje sie na ogól dobrym wzrostem w temperaturze 28—37°C i brakiem wzrostu w temperaturze 45°C i powyzej.Jest drobnoustrojem aerobowym i rosnie dobrze sa w zakresie wartosci pH<=i6,5—8,3, przy czym naj¬ lepszy WHrodt i wytjwanzanie lanityfbiottytou ma miiej- sce przy wartosci pH okolo 7. 2. Drobnoustrój nde wykazuje praktycznie wzrostu 40 na nastepujacych standardowych pozywkach: gliko- za z agarem Czapka, glikoza z asparagina, jablczan wapnia, zwykly agar, agar odzywczy, agar z jajka¬ mi (Dorset Egg Medium), zelatyna, skrobia oraz celuloza. 45 i3. Wytloki ziemniaczane —wzrost ubogi, barwa jasnoczerwonawobrazowa ;po dodaniu do wytloków ziemniaczanych weglanu wapniowego wzrost jest dobry, powierzchnia pofaldowana) barwa czarna. 50 4. Surowica Lofflera — wzrost umiarkowany, bar¬ wa kremowa, nastepuje uplynnienie substratu.. Agar z peptonem i glikoza — wzrost, po- wierachnia btanfrasta, brak grzybni powiefaanej, __ brak rozsianych pigmentów, barwa — g3dc jasno- bursztynowa; demnopomaranczowo-zólta 72. 6. Mleko lakmiuisowe — pepltomiiziacjia, reakcja kwasna. 7. Pozywka tyrozynowa — wzrost uibogi, tyrozy- noza nie jest wytwarzana. 8. Przyswajanie weglowodanów — drobnoustrój wykazuje dobry wzrost na D-arabinozie, L-anabi- nozie, D-galaktozie, D-glukozie, mannozie, sacharo- 65 4 zie, Dnklsylozie i skrobi; umiarkowany wzrost na D-laktozie, D-lewulozie i D-rybozie; ubogi wzrost na dulcytolu, glicerynie, L-inozytolu, D-mannitolu, melibiozie, melecytozie, rafinozie, L-ramnozie, sor- bitolu i salicynie. Celuloza jest rozkladana bardzo powoli. Pozywka kontrolna zawiera 0,5% wyciagu drozdzowego bez dodatku weglowodanów. Drobno¬ ustrój wykazuje ubogi wzrost na tej pozywce, z czego wynika, ze kazde zwiekszenie wzrostu drobnoustroju nalezy przypisac dodatkowi 1% we¬ glowodanu. 9. Przyswajanie azotu. Wszystkie wymliki dotycza pozywek, zawierajacych dodatek pojedynczego zró¬ dla azotu oraz 1% (waga na objetosc) glikozy. a) 0,5% wyciag drozdzowy Difco — wzrost do¬ bry, powierzchnia bloniasta, brak grzybni powietrz¬ nej, brak rozsianych pigmentów, barwa g4ng jasno- brazowa; silnieibrazowa 55. b) 1,0% NZ Amine Type A — wzrost umiarko¬ wany, powierzchnia plaska, brak grzybni powietrz¬ nej, brak rozsianych pigmentów, barwa g3ca per- lowo-rózowa; bladopomaranczowo-zólta 73. c) 1,0% asparaginy — wzrost ubogi, powierzchnia plaska* brak grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwa g5ng ceglasto-czerwona; umiar¬ kowanie czerwonawo-brazowa 43. d) 1,0% kwasu glutaminowego — wzrost i barwa takie same, jak w punkcie c. e) 1,0% azotanu sodowego — brak widocznego wzrostu. f) 1,0% azotanu amonowego — brak widocznego wzrostu.. Wrazliwosc na obecnosc soli — drobnoustrój toleruje najwyzej 3% chlorku sodowego w pozywce wzrostowej. 11. Agar Bennetta — wzrost dobry, powierzchnia pofaldowana, bloniasta, brak grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwa czarna. : 12. Aigair Eanersooa — waro&t umiarkowany, po¬ wierzchnia pofaldowana, brak grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwa czarna. 13. Agar z glikoza i wyciagiem drozdzowym ¦— wzrost dobry, powierzchnia pofaldowana, brak grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwa gGni brazowa; szarawo-czerwonawo-brazo- wa 46. 14. Agar Czapka — wzrost ubogi.. Agar tyrozynowy — wzrost bardzo ubogi;, na agarze tyrozynowym z wyciagiem miesnym brak wytwarzania tyrozynazy, wzrost umiarkowany, na agarze tyrozynowym z wyciagiem drozdzowym wy¬ twarzana jest tyrozynaza (krysztaly rozpuszczone), jasnobrazowe, rozsiane pigmenty. Obserwacje po 2 7 i 14 dlniiaidh (Gordon ii SmiMi J. Badt. 69, 147). 16. Pepton Iron Agar ^wzrost dobry, brak wy¬ twarzania siarkowodoru. •/ 17. Brain Heart Infusion Agar — wzrost umiair kowany, powierzchnia pofaldowana, bloniasta, brak87 638 6 grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwa g3Le, zóltego liscia klonu^silnie zóftawo- brazowa 74. 18. Agar A z wyciagiem -slodowym — wzrost do¬ bry, powierzchnia pofaldowana, bloniasta-, brak grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów, barwa g5pg rdzawo brazowa; silnie brazowa 55. 19. Agar B z wyciagiem slodowym — wzrost do¬ bry, powierzchnia bloniasta, brak grzybni powietrz¬ nej, braik rozsianych pigmentów, barwa g4Lg jasno- brajzowa; umiarkowanie brazowa 58.Powyzsza charakterystyka hodowlana sluzy dla odróznienia Micromonospora zionensis od wszystkich innych, opisanych uprzednio.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania czynnej antybiotycznie mieszaniny, zawierajacej sizomycyne i antybiotyk G-52 polega na hodowaniu drobno¬ ustroju z gaitunku Micromonospora zionensis, zwla¬ szcza szczepu NRRL 5466, w pozywce, w warun¬ kach hodowli z napowietrzaniem. Mieszanine anty¬ biotyków lub jej skladniki wyodrebnia sie z brzecz¬ ki fermentacyjnej w postaci wolnej zasady lub w postaci dopuszczalnej w farmacji funkcjonalnej pochodnej. Duza ilosc antybiotyku jest wytwarzana podczas hodowli drobnoustroju w wodnym roztwo¬ rze pozywki w hodowli podpowierzchniowej z na¬ powietrzaniem. Jako przyswajalne zródla wegla moeina stosowac wegUoiwadlany takie, jiak wymie¬ nione w dalszej czesci opisu, szczególnie glikoze, ksyloze i sacharoze. Jako przyklad przyswajalnych zródel azotu sluzyc moga proteiny, aminokwasy oraz substancje, zawierajace te zwiazki, mp. wyciag miesny, wyciag drozdzowy, maka sojowa i podobne.Przyswajanie takich zródel azotu zostalo opisane poprzednio w czesci dotyczacej zuzywania azotu.Dobry wzrost i wytwarzanie antybiotyku osiaga sie, stosujac pozywki fermentacyjne i sposób postepo¬ wania opisany w przykladach przytoczonych w dal¬ szej czesci opisu. Do pozywek mozna dodawac sla¬ dowe ilosci soli nieorganicznych takich, jak siar¬ czan magnezu, siarczan zelaza i szczególnie chlorek kobaltu. Sole te dodaje sie dla zwiekszenia wytwa¬ rzania antybiotyku. Na ogól fermentacje prowadzi sie w temperaturze 23—38°C, korzystnie okolo 35°C, podczas ciaglego napowietrzania i mieszania z szyb¬ koscia okolo 250—400 obrotów na mlinute. W tych warunkach maksimum wytwarzania antybiotyków zachodzi.od 2 do 4 dnia fermentacji. Wartosc pH utrzymuje sie w granicach 6,5—8,3, korzystnie oko¬ lo TA Podczas fermentacji w malej skali, np. 10- litrowej, nie trzeba zazwyczaj korygowac wartosci pH po zaszczepieniu pozywki. Natomiast podczas fermentacji w duzej skali moze okazac sie niezbed¬ nym obnizanie lub podwyzszanie wartosci pH za pomoca, np. rozcienczonych 'kwasów, rozcienczonych roztworów wodorotlenków metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, weglanów i podobnych.Na ogól fermentacje prowadzi sie w dwu lub wiecej etapach, w tym w jednym lub dwóch sta¬ diach zarodnikowania i nastepnie stadium fermen¬ tacji. Z zasady stosuje sie w przypadku fermenta¬ cji w duzej skali dwa stadia zarodnikowania, zas w przypadku fermentacji na trzesawce jedno sta¬ dium. Podczas fermentacji, szczególnie po uplywie pierwszych 24 godzin, jej przebieg jest kontrolo¬ wany, np. -co 6—8 godzin, w celu uchwycenia mo¬ mentu maksymalnego wytwarzania antybiotyków.Oznaczenia mikrobiologiczne wykonuje sie, sto¬ sujac typowa metode krazkowa na pozywce Difco Antibiotic Medium No. 5 oraz jako drobnoustrój testowy Staphylococcus aureus ATTC 65538P. Sposób i wanumki praeprowiaidlzainiia oanaczieniila sa takie sa¬ me, jak dla neomycyn (Grove i Randall, Assay Me- thods of Antiibiotics ,wydane przez Medical Ency- clopedia Incorporated, 1955). Oznaczenia wykonuje sie wobec wzorcowego preparatu antybiotyku G-52 o mocy 1000 mcg/mg. Jeden mikrogram preparatu wzorcowego daje strefe zahamowania o sredni¬ cy 17,7 ± 1 mm. Moc wzorcowego preparatu siar¬ czanu antybiotyku G-52 wynosi w stosunku do wol¬ nej zasady 675 mcg/mg. Po zakonczeniu fermentacji produkt izoluje sie, stosujac kombinacje znanych metod izolacji, np. zakwaszenie, saczenie, adsorbcje, elucje, liofilizacje i podobne. W korzystnym spo¬ sobie izolowania cala brzeczke fermentacyjna za¬ kwasza sie, korzystnie kwasem mineralnym i saczy lub odwirowuje. Po zobojetnieniu substancje anly- bioryczne adsorbuje sie na odpowiednim kationo¬ wym wymieniaczu jonowym, np. Amberlicie IRC-50 (usleciowana zywica metakrylowa, zawierajaca gru¬ py karboksylowe, produkowana przez firme Rohm amid Haas, Filadelfia (USA), eluuje iiozciencaofiym roztworem zasady, korzystnie wodnym roztworem amoniaku, oraz liofilizuje. Otrzymuje sie w ten sposób wylacznie mieszanine antybiotyków, wy¬ tworzonych podczas fermentacji.Substancje czynna antybiotycznie rozdziela sie na poszczególne skladniki, poddajac surowy liofilizat chromatografii na nosniku stalym takim, jak tlenek glinu, ziemia okrzemkowa, krzemian magnezu lub loarzyTstaiie zel krzemionkowy. Elucje prowadzi sie w znany sposób, stosujac polarne rozpuszczalniki organiczne lub ich mieszaniny. Jesli stosuje sie do chromatografii zel krzemionkowy, korzystnym jest stosowanie do elucji dolnej warstwy mieszaniny rozpuszczalników, skladajacej sie z chloroformu, izopropanolu i stezonego roztworu amoniaku (2:1:1, objetosc na objetosc). Uzyskuje sie w ten sposób rozdzial produktu antybiotycznego na dwa glówne skladniki oraz sladowe ilosci niezidentyfi¬ kowanej jeszcze substancji aktywnej. Jako pierw¬ szy eluowany jest z kolumny antybiotyk G-52, a nastepnie sizomycyna.Sizomycyna jest antybiotykiem znanym. Znana jest równiez pod nazwa antybiotyku 66—40 lub ri- kamycyny. Jej ogólny wzór chemiczny podany jest w Chemical Communication, strona 285, 1971. The Chemical Society, Burlington Horuse, London. Spo¬ sób wytwarzania i wlasciwosci fizykochemiczne si- zomycyny zostaly opisane w Journal of Antiibiotics, Japonia, tom XXIII, nr 11, str. 551—565.Antybiotyk G-52 i jego dopuszczalne w farmacji pochodne hamuja wzrost drobnoustrojów Gram- -dodatnich i Gram-ujemnych. Antybiotyk G-52 i jego pochodne mozna takze stosowac in vivo i in vitro do niszczenia lub hamowania wzrostu wrazli¬ wych bakterii oraz, w polaczeniu z mydlami i srod¬ kami powierzchniowo czynnymi, do niszczenia i usuwania tych drobnoustrojów z powierzchni 39 40 45 50 55 6087 638 7 sprketu" laboratoryjnego, instrumentów chirurgicz¬ nych, szkla laboratoryjnego. Równiez antybiotyk -ten' i. jego- pochodne mozna stosowac do niszczenia lub znacznego hamowania rozwoju wrazliwych bak¬ terii u ssaków takich, jak myszyy szczury, psy, bydlo i" podobne.Okreslenie dopuszczalne w farmacji pochodne funkcjonalne dotyczy addycyjnych soli kwasowych, zasad Schaffa pochodnych óksazolidynowych oraz hydratów i solwaftów anttylbioftyku G-52 i jegjo po- chodnych! :' Antyfóioltyk G-52 jest subsltamcja sitiala o barwie "bialej, bardzo dobrze rozpuszczalna w wodzie i nie¬ co rozpuszczalna w wiekszosci polarnych rozpu¬ szczalników organicznych takich, jak nizsze dwual- kiloacyloarnidy, np. dwumetyloformamiid, nizsze dwualkilosulfotlenki, np. dwurnetylosulfoflenek, pi¬ rydyna i podobne.Antybiotyk G-52 wykazuje trwalosc podczas go¬ towania przynajmniej w ciagu 30 minut w buforze Macllvaines'a o pH=2—8 oraz w buforze o skla¬ dzie; Wodorotlenek sodowy — kwas borowy o/pH = 8—dO. W wiidlmiie absorpcji w nadfioleciie brak w izialkresiie z20—400 mim pasm absoirpicji.,. WJdmo magnetycznego rezonansu jadrowego an¬ tybiotyku. G-52 ^przedstawione jest na rysunku fig. 1."Widmo wykonano na. spektrometrze Varian A-60-A {Varian „Associates, 611 Hansen Way, Palo Alto, Cajjifoirnia) w. roiztwotrzie antybiotyku w diezkiefi wo¬ dzie (D2Ó). Nastepujace maksima (piki) absorpcji brano pod uwage przy okreslaniu struktury* 1^2(f jypm (siiiri^let), 1,20 ppm (muiitiplet), 343 ppm (siinglet), 2,50 ppm (siinglet), 3,80 ppim (kwtarteft), 4,02 -ppm. (dublet), 5,03 ppm (szeroki singlet), ,07 ppm (dublet) oraz 5,35 ppm (dublet)..."Widmo antybiotyku G-52 w podczerwieni, w ole¬ ju parafinowym. przedstawia fig. ,2. W widmie ma¬ sowym antybiotyku G-52 stwierdzono obecnosc jonu masowego przy 461, potwierdzonego podczas dalszej fragmentacji czasteczki, co odpowiada empiryczne¬ mu wzorowi C20H3s)N5O9, ^Przytoczone wyzej dane fizykochemiczne, szcze¬ gólnie widma magnetycznego rezonansu jadrowego, w poclczerwieni oraz masowe sa zgodne ze struktu¬ ra,, okreslona plaskim wzorem i/lub przestrzennym wzorem 2. .Antybiotyk' G-52 nalezy do grupy antybiotyków aminoglikozydowych, tej samej, co gentamycyna, neomycyna', paromorhycyria; tcbramycyna, sizomy- cyina, kainamycyinia i. podobne. Jest on zwiazkiem o charalklterze. zasadowym, tworzacym niteltoiksyczne addycyjne sofe, sole..kwaisowe z kwasami organicz¬ nymi i nieorganicznymi takimi, jak ikwas sioilny, siarkowy/fosforowy, octowy, stearynowy, propiono- wy, winowy,'. maleinowy, benzoesowy i podobne.Mozna takze stosowac kwasy wielozasadowe cze¬ sciowo zobojetnione, np. zasada nieorganiczna taka, jak wodorotlenek sodowy, lub zasada organiczna.Na ogól sole addycyjne z kwasami mineralnymi ta¬ kimi, jak kwas solny, siarkowy, fosforowy i podob¬ ne,"sa rozpuszczalne w wodzie.' Podczas miareczko^ Wania wodinego roztworu- antybiotyku G-S2 mnigj riiiz: wStechiometryczna iloscia kwasu mozliwe jest JotrzymywanieL czesciowych addycyjnych soli kwa~- 8 sowych. Okreslenie — addycyjna sól kwasowa — dotyczy wszystkich omówionych wyzej zwiazków.Sole te wykazuja taka sama aktywnosc przeciwbak- teryjna, co wyjsciowa wolna zasada, róznia sie je- dynie rozpuszczalnoscia. Mozna wiec te sole stoso¬ wac w taki sam sposób i do tych samych celów, jak to zostalo opisane powyzej.Dopuszczalne w farmacja zasady Schiffa óksazoli¬ dynowych pochodnych antybiotyku G-52 otrzymuje io sie na ogól w reakcji alkoholowego roztworu anty¬ biotyku w postaci wolnej zasady z nadmiarem al¬ dehydu. Reakcje prowadzi sie w podwyzszonej tem¬ peraturze, korzystnie w temperaturze wrzenia, w ciagu okolo jednej godziny, a nastepnie chlodzi roztwór i otrzymuje produkt, zazwyczaj w postaci krystalicznej. Jak Widac ze wzorów 1 ii 2, czaste¬ czka antybiotyku zawiera 'tuzy wolnie pierwsizorze- dowe grupy aminowe, mogace tworzyc zasady Schaf¬ fa. W czasteczce znajduje sie takze drugorzedowa grupa aminowa, sasaaidiujaca z grupa ihyidroksylowa, która w reakcji z aldehydem tworzy pierscien oksa- zolidynowy. Tak wiec podczas reakcji antybiotyku z nadmiarem aldehydu na kazdy mol antybiotyku zuzywa sie cztery mole aldehydu i tworzy sie zasa- da Schiiffa oksazolidynowej pochodnej antybiotyku.Pochodne tego typu stosuje sie do takich samych celów, jakie zostaly opisane wyzej. Jednak ze wzgledu na inna rozpuszczalnosc, lepiej jest je sto¬ sowac w postaciach oleistych takich, jak kremy, galaretki lub masci. Pochodne oksazolidynowe zasad Schiffa nie rozpuszczaja sie praktycznie w wodzie I co wiecej w zakwaszonym srodowisku wodnym ulegaja rozkladowi. Natomiast sa one rozpuszczalne w wiekszosci uzywanych, nie kwasowych rozpu- 95 szczalników organicznych.Korzystnymi pochodnymi sa takie, które otrzy¬ muje sie w reakcji antybiotyku z aldehydem, za¬ wierajacym w czasteczce do 12 atomów wegla. Sa to aldehydy alifatyczne, alicykliczne, aromatyczne i heterocykliczne. Jest oczywiste, ze aldehydy i ke¬ tony o strukturze pierscieniowej moga zawierac rózne podstawniki takie, jak rodnik hydroksylowy, atom chlorowca, rodnik nitrowy, nizszy rodnik al- koksylowy, nizszy rodnik alkanoilooksylowy i po¬ dobne, Przykladowo moze to byc aldehyd octowy, krotonowy, furfural, aldehyd cyklopentylooctowy, wanilina, aldehyd weratrowy, benzofenon, aldehyd benzoesowy, aldehyd salicylowy, pirydoksal i po¬ dobne. Produkty ich reakcji z antybiotykiem G-52 50 równiez tworza sólwaty. Przytoczone wyzej przy¬ klady maja na celu jedynie zilustrowanie wynalaz¬ ku, nie wprowadzajac zadnych ograniczen.Nalezy wspomniec, ze antybiotyk G-52 i jego 55 addycyjne sole. kwasowe, podobnie jak i inne an- tyibiotykii laminoiglljiikoizyiclowie, tjwtotnza hydraty i sól¬ waty, trudne do rozlozenia. Wyodrebnione produk¬ ty zawieraja wode lub inny rozpuszczalnik zazwy¬ czaj w ilosci jednego mola na mol antybiotyku. 60 W wiekszosci przypadków produkt mozna stosowac w postaci hydratu lub solwatu, przy korekcji jedy¬ nie ilosci antybiotyku.- W tablicy I przedstawiono porównanie danych chromatograficznych antybiotyku G-52 z innymi .w -antybiotykami ammogtykozydowyrnj. -87638 9 10 Wartosci RF antybiotyków aminoglikozydawych podczas chromatografii bibulowej Uklad rozwijajacy 80% metanol z dodatkiem 3% (waga na objetosc) chlorku sodowego, chromatografia zstepujaca*) Propanol, pirydyna, kwas octowy, woda (6:4:1:3, objetosc na ¦dbjetosc), chromatografia wstepujaca 80% (objetosc na objetosc) fenol, chromatografia wstepujaca Chloroform, metanol, 17% roztwór wodny amoniaku (2:1 :1) Butanon-2,III-rz.-butanol, metanol, stezony roztwór wodny amoniaku (16:31 :6) Anty-.. •biotyk G-52 0,55 0,29 0,45 0,48 0,73 Sizomy- cyna Gentamycyna Neomy¬ cyna Kana- mycyria 0,45 0,57 0,56 0,48 0,17 0,28 0,22 0,34 0,30 0,22 0,05 0,08 0,45 0,45 0,45 0,45 0,12 0,17 0,21 | 0,67 | 0,40 | 0,21 | | Watftoscii Rtb) laotyfbio^ów, t = 16 godlzrai 0,59 0,75 0,65 JParo- momyi- cyna 0,28 0,07 -0,2 a) bibula buforowana 0,95 m siarczanem sodowym i 0,05 m kwasnym siarczanem sodowym b) R = R w czasie t Nowy produkt czynny antybiatyczmie, szcraeigólnie antybiotyk G-52 i jego dopuszczalne w farmacji pochodne oraz mieszanina antybiotyku G-52 i sizo mycyny wraz z pochodnymi moga byc podawane domiejscowo, pozajelitowo, doustnie lulb doodbytni¬ czo. Miejscowo mozna antybiotyk podawac w po¬ staci masci, zarówno hydrofilowych, jak i hydrofo¬ bowych, w postaci plynów do przemywania, wod- nych i niewodnych zawiesin lub w postaci kremów.Stosuje sie lacznie z nosnikami farmaceutycznymi takimi, jak woda, oleje, wazeliny, poliestry, poli¬ alkohole i podobne. Zasady jSchifEa pochodnych óksazolidynowych antybiotyku G-52 nadaja sie szczególnie do przygotowywania niewodnych pre¬ paratów do stosowania miejscowego, gdyz wyka¬ zuja one zgodnosc z typowymi nosnikami farma¬ ceutycznymi, stosowanymi w tym przypadku. Pre¬ paraty do stosowania miejscowego zawieraja na 40 ogól okolo 0,1—3,0 g antybiotyku w 100 g masci, kremu lub plynu do przemywania. Stosuje sie je na ogól, nakladajac lagodnie na miejsce uszkodzo¬ ne 2—3 razy dziennie. Antybiotyk mozna równiez podawac doustnie w postaci kapsulek, tabletek lub 45 eliksirów. W tej postaci jest on szczególnie przy¬ datny w przypadkach leczenia biegunek, wywoly¬ wanych zakazeniem przewodu zoladkowo-jelitowe^ go przez drobnoustroje, wrazliwe na jego dzialanie.Substancje o dzialaniu antybiotycznym, wytwa- 50 rzane sposobem wedlug wynalazku, mozna równiez stosowac w • postaciach cieklych takich, jak roz¬ twory, zawiesiny i podobne, w leczeniu chorób uszu i oczu. Mozna je takze [podawac pozajelitowo, np. domiesniowo. Roztwory lub zawiesiny do iniek- 55 cji podaje sie zazwyczaj 2—4 razy dziennie, w ilo¬ sci okolo 1—5 mg antybiotyku na kilogram wa&i ciiaJa oMianoiae. Dokladna dawka, mieizaHeznie od po¬ staci leku, zalezy od rodzaju i zaawansowania iTi~ fekcji, wrazliwosci drobnoustroju oraz indywidual- 60 nych cech osobnika, poddawanego leczeniu.Podane ponizej przyklady ilustruja sposób we¬ dlug wynalazku. --¦¦¦¦•¦- Przyklad I. Fermentacja Micromonospora 95 zionensis w ferrnentorach. .."¦'..¦¦; Wlasciwosci biologiczne antybiotyku G-52 Aktywnosc przeciwbakteryjna in vitro Najmniejsze stezenie hamujace Drobnoustrój Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus 45 Streptococcus py^genes C Escherichia coli 11775 Escherichia coli 578 J KlebsieHa pneumoniae Ad 17^(kR Proteus miralbilis 8019 Pseudomonas aeruginosa 236-GR Pseudomonas aeruginosa 130-GR Salmonella paratyphi 13311 Pozywka testowa: tryptoza z fosforanem, pH mfcg/mjl 1 0,3 0,8 3,0 7,5 0,8 ¦7.5 17,5 7,2 Aktywnosc antybiotyku G-52 in vivo wobec myszy Dzialanie chroniace a ^Drobnoustrój Staphylococcus aureus Gray Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Sposób podawania* podskórnie podskórnie podskórnie tmcg/kg ,2.5 1,5 Toksycznosc ostra D Sposób podawania dozylnie podskórnie dootrzewnowo LD5ft/mg/kg 50 400 200 1 a) Siarczan antybiotyku G-52 podawano w pojedynczej dawce myszom, rasy Cartworth Farms CF-l, o wadze 18— g, W godzine po zakazeniu dootrzewnowym smiertelna iloscia patogennego drobnoustroju (107 osobników), ilosc myszy, które przezyly oznaczono po 48 godzinach po za¬ kazeniu i analizowano wyniki, stosujac standardowa ana¬ lize wiarygodnosci w celu wyznaczenia wartosci PBS9» z 95% pewnoscia. b) Toksycznosc ostra antybiotyku G-52 w postaci siar¬ czanu, oznaczono w zwykly sposób, podajac antybiotyk myszom (rasy CF-l) dozylnie,, podskórnie i dootrzewno¬ wo. Otrzymane wyniki analizowano, stosujac standardowa analize wiarygodnosci i obliczono wartosc LDM z 95% pewnoscia.87638 11 12 A. Stadium zarodnikowania. Serie kolb o pojem¬ nosci 300 ml, zawierajacych kazda po 100 ml jalo¬ wej pozywki A, opisanej w dalszej czesci, zaszcze¬ pia sie drobnoustrojem M. zionensis ze skosów aga¬ rowych. Kolby infcubuje sie, podczas ciaglego mie¬ szania, w ciagu 2—4 dni, az do uzyskania obfitego wzrostu. Korzystnie jest prowadzic inkubacje na trzesawce obrotowej o okolo 250—300 obrotach na minute, w temperaturze okolo 35°C.B. Drugie stadium zarodnikowania. Porcje po ml inokulum, przygotowanego podczas stadium A, przenosi sie do kolb Erlenmeyera o pojemnosci 2 litry, zawierajacych po 500 ml jalowej pozyw¬ ki A. Inkulbuje sie na trzesawoe obrotowej w wa¬ runkach, opisanych w stadium A, korzystnie w temperaturze 28°C, az do osiagniecia obfitego wzn stu.C. Stadium fermentacji. Porcje po 500 ml zarod¬ nikujacej hodowli dodaje sie do fermentorów o po¬ jemnosci 14 litrów, zawierajacych po 10 litrów po¬ zywki fermentacyjnej B, opisanej ponizej. Calosc fermentuje sie podczas mieszania przy okolo 200— 500, korzystnie okolo 400 obrotach na minute, w temperaturze okolo 26—38°C, korzystnie okolo 35°C i przy napowietrzaniu okolo 3-^5 litrów na minute.Po uplywie pierwszych 24 godzin rozpoczyna sie w odpowiednich odstepach czasu oznaczenia celem uchwycenia momentu maksymalnego wytwarzania antybiotyku, a nastepnie izoluje mieszanine anty¬ biotyków w sposób, opisany w przykladzie II.Pozywka- A Sacharoza 25 g Wyciag namokowy kukurydzy (suszony) 5 g Wyciag drozdzowy 5 g N—Z amine (produkcji Sheffield Chemical Company) 5 g Weglan wapniowy 5 g Woda wodociagowa 1000 ml Poftywka B Makasojowa 30 g Dekstryna ziemniaczana 500 g Dekstroza 5 g Edamin (produkcji Sheffiels ChemicalCompany) 5 g Weglan wapniowy 7 g Siarczan zelazowy 10—s moli/litr Chlorek kobaltowy 10—• mofli/litr Wodawodociagowa 1000 ml Przyklad II. Izolacja patodiuktou czynnego anity- biotyicande. Do 60 litrów brzeczki fermentacyjnej dodaje sie 380 g kwasu szczawiowego i pH dopro¬ wadza do wartosci 2 za pomoca 6 n kwasu siar¬ kowego. Calosc miesza stie w ciagu 20 minut, saczy i przemywa osad woda. Przesacze laczy sie i pH doprowadza do wamtosci 7 za pomoca 6n wodiaro- tlenku amonowego, po czym dodaje sie podczas mieszania do 600—700 g wymieniacza kationowego Amberlit IRC-50, w formie amoniowej. Zywice od¬ sacza gie, pirzemywa woda i eluujje 2n wodloroltlen- kiem amonowym. Eluaty zateza sie do objetosci okolo 100 ml i liofilizuje, otrzymujac mieszanine antybiotyków. Chromatografia bibulowa w ukladzie rozwijajacym, skladajacym sie z chloroformu, me¬ tanolu i 17% wodorotlenku amonowego (2:1:1, ob- 95 jetosc na objetosc) wykazala, ze mieszanina sklada sie z sizomycyny i antybiotyku G-52, w ilosci 300 mcg/mg.Przyklad III. Rozdzial mieszaniny antybio- tycznej. 1000 g zelu krzemionkowego zawiesza sie w dolnej warstwie mieszaniny rozpuszczalników, skladajacej sie z chloroformu, izopropanolu i ste¬ zonego roztworu amoniaku (2:1:1, objetosc na obje¬ tosc) i nastepnie miesza w ikofLumnlie szManej o sred- io nicy zewnetrznej okolo 5 cm, otrzymujac warstwe zelu o wysokosci okolo 100 cm. Nastepnie rozpusz¬ cza sie 12,4 g mieszaniny z przykladu II w wodzie i miesza z okolo 100 g zelu krzemionkowego. Za¬ wiesine podaje sie na szczyt kolumny i eluuje dol- na warstwa, opisanej wyzej mieszaniny rozpusz¬ czalników, z szybkoscia okolo 1 ml/minute i zbiera frakcje po 10 ml. Kazda z frakcji poddaje sie chro¬ matografii bibulowej w ukladzie rozpuszczalników: chloroform : metanol: 17% roztwór amoniaku (2:1:1, *0 objetosc na objetosc), nanoszac równolegle na dwa paski bibulowe. Antybiotyki znajduja sie zazwyczaj we frakcjach 600—790. Jeden z chromatogramów wywoluje sie odczynnikiem ninhydrynowym, drugi zas poddaje bioautografii na plytkach z agarem, za- ss kazonym drobnoustrojem Staphylococcus aureus ATCC 6538P, w celu potwierdzenia, ze frakcje, da¬ jace dodatnia reakcje z ninhydryna, sa czynne bio¬ logicznie. Frakcje, zawierajace poszczególne anty¬ biotyki, laczy sie, zateza i liofilizuje, otrzymujac so antybiotyk G-52 i sizomycyne. Frakcje, schodzace pierwsze z kolumny, mniej polarne, zawieraja an¬ tybiotyk G-52.Przyklad IV. Otrzymywanie siarczanu anty¬ biotyku G-52. 800 mg antybiotyku rozpuszcza sie w 100 ml wody i doprowadza pH do wartosci 4,2 za pomoca kwasu siarkowego. Calosc miesza sie z we¬ glem aktywnym, korzystnie typu Darco C-60, pro¬ dukowanym przez Atlas Powder Company, Wii- imington, Delaware. Po mieszaniu w ciagu 1 godzi- 40 ny saczy sie, przesacz zateza i dodaje do 10 obje¬ tosci metanolu. Po odsaczeniu wytraconego osadu otrzymuje sie okolo 1,0 g zwiazku tytulowego o mo¬ cy 660 mcg/ mg.Przyklad V. Otrzymywanie antylbiotyku G-52 45 w postaci wolnej zasady. 800 mg siarczanu anty¬ biotyku G-52 rozpuszcza sie w okolo 10 ml wody i poddaje chromatografi na kolumnie z wymienia¬ czem anionowym IRA-401S w formie wodorotleno¬ wej, o wymiarach 2 cm (srednica zewnetrzna) na 50 25 cm. Antybiotyk eluuje sie woda, eluaty zateza do objetosci okolo 10 ml i liofilizuje, otrzymujac okolo 487 mg zwiazku tytulowego o mocy okolo 1000 mcg/mg. PL