NO127761B

NO127761B -

Info

Publication number: NO127761B
Application number: NO00161318A
Authority: NO
Inventors: R Buening; K Diessel; H Konermann
Original assignee: Dynamit Nobel Ag
Priority date: 1965-01-20
Filing date: 1966-01-19
Publication date: 1973-08-13
Also published as: YU31527B; GB1092231A; DK114076B; US3462402A; NL6600695A; FR1463540A; AT263197B; BE675151A; FI43217C; LU50288A1; SE314471B; DE1494575A1; IL24968A; FI43217B; CH473241A

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av spiramycin II, spiramycin III

eller blandinger av disse.

Nærværende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av antibiotika kjent som spiramycin II og III.

Spiramycin, et antibiotikum sammensatt av tre komponenter med meget lignende egenskaper og kjent henholdsvis som spiramycin I, II og III, fremstilles ved kultivering av en stamme av Streptomyces ambofaciens, av hvilken en prøve er blitt deponert hos NRRL Peoria, Illinois, U.S.A., hvor den er blitt gitt betegnelsen NRRL 2420, eller en av dens mutanter, i et egnet kulturmedium. Organismen identifiseres som «Streptomyces ambofaciens NRRL 2420».

Den eksakte konstitusjon av disse spiramyciner er ennå ikke med sikkerhet kjent, men det er blitt funnet, at spiramycin II og III er henholdsvis acetyl- og propionylderivatene av spiramycin I. Spiramycin II og III kan krystalliseres, hvilket letter deres rensing og er en viktig fordel ved den farmasøytiske bruk.

En viktig fordel ved spiramycin II og III er deres lavere giftighet i sammenlig-ning med spiramycin I. Dette vises i den følgende tabell over doser (uttrykkt i g pr. kg) av de tre spiramyciner som gir en 50 pst.'s dødelighetsfaktor, hos mus behandlet subkutant (LD-,» g/kg. s.c).

Den antimikrobielle aktivitet in vitro

og in vivo av spiramycin II og III er minst lik den for spiramycin I.

Ved å bruke spesielle fermenteringsbe-tingelser, først og fremst ved å modifisere sammensetningen av kulturmediet, er det mulig å påvirke mengdeforholdet av de tre spiramyciner i produktet, som fremstilles av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420. Ikke desto mindre med de vanlige media brukt for fremstillingen av spiramyciner, hvilke media er basert på dårlig definerte og komplekse stoffer eller utelukkende syntetiske media, forblir spiramycin I-innholdet i det fremstilte spiramycin forholdsvis høyt. Det er således meget vanskelig å oppnå spiramycin II og III frie for spiramycin I annet enn i svært dårlige utbytter.

Det er blitt funnet, og dette danner basis for nærværende oppfinnelse, at ved å arbeide under egnede betingelser er det mulig å påvirke fermenteringen av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 eller dets mutanter på en slik måte at der oppnås en betraktelig økning av de relative mengder av spiramycin II og/eller spiramycin III

i det totale spiramycin fremstilt av mikro-organismene. I tilfelle av spiramycin III kan f. eks. en mengde på 75 til 80 vektspst. av det totale spiramycin oppnås som spiramycin Ili. Det er blitt funnet at Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 eller dets mutanter har evne til å omdanne spiramycin I til spiramycin II og III ved en enzymatisk acetylering eller propionylering. Under de beste betingelser kan omdannelsen av spiramycin I bli fullstendig.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for fremstilling av spiramycin II eller spiramycin III eller blandinger av disse be-står i kultivering av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 under aerobiske betingelser i et næringsmedium i nærvær av eddiksyre, propionsyre eller et salt, ester eller amid av disse eller et middel som genererer disse in situ under dyrkningsbetingelsene. Dyrkningen kan utføres på i og for seg kjente næringsmedia, som allerede kan in-neholde spiramycin I.

Utrykket «acetyleringsmiddel» brukes her for å angi eddiksyre, dens salter, f. eks. dens alkalimetallsalter, dens estere eller acetamid, eller forbindelser, som under dyrkningsbetingelsene gir enhver av disse f. eks. smørsyre og dens salter. For enkelhets skyld er det foretrukket å bruke eddiksyre eller natriumacetat i en konsentrasjon på mellom 0,1 og 30 g pr. 1. i mediet.

Utrykket «propionyleringsmiddel» brukes her for å angi propionsyre, dens salter, f. eks. dens alkalimetallsalter, dens estere, propionamid og som under dyrkningsbetingelsene utvikler enhver av disse, f. eks. propanol, valerian.syre og dens salter. For enkelhets skyld er det foretrukket å bruke propionsyre eller dens salter eller propionamid i en konsentrasjon mellom 0,1 og 30 g pr. 1. i mediet, og den optimale konsentrasjon er i området 2—15 g pr. 1.

Utrykket «acyleringsmiddel» brukes her for å angi nevnte acetyleringsmiddel eller propionyleringsmiddel. Acyleringsmidlet kan tilsettes som en vandig oppløs-ning eller oppløst i et organisk oppløsnings-middel som metanol, etanol, aceton, benzol, dietyleter eller dikloretan. Acyleringsmidlet kan hvis ønskes, tilsettes i suksessivt små mengder uten å gi noen vesentlig forandring i den ønskede omdannelse.

I de vanlige komplekse eller syntetiske media gir fermenteringen ikke noen van-skeligheter og foregår normalt.

Hvor et medium som inneholder spiramycin I brukes, er det ønskelig å ta i be-traktning de forskjellige faktorer som fremmer biokjemisk omdannelse av spiramycin I til spiramycin II og III. For å oppnå de beste resultater er det nødvendig å dyrke Streptomyces ambaciens NRRL 2420 under betingelser som samtidig tillater utvikling av organismen og produksjon av det enzymatiske system. Videre er det hensiktsmessig å gjøre bruk av den omdannende evne kulturen har, ved å bruke den som et inokulat for tilsetning til media inneholdende spiramycin I.

Således kan Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 dyrkes i et kulturmedium som

til å begynne med inneholder spiramycin I, som skal omdannes, såvel som alle de nødvendige faktorer for produksjonen av det enzymatiske system og for omdannelsen av tilstedeværende spiramycin I til spiramycin II og III. Det er imidlertid blitt funnet særlig fordelaktig først å dyrke Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 under slike betingelser at det enzymatiske system danes, og derpå, som et annet trinn, å gjøre bruk av den omdannende evne er-hvervet av organismen ved å bringe dens mycelium i kontakt med spiramycin I og de nødvendige elementer for omdannelsen, dvs. stoffer som gir acetyl- eller propionylradikaler og aktivatorer.

Dyrkning av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 for produksjon av et acylerende enzymatisk system kan utføres på mange forskjellige media, særlig på media som vanligvis brukes, dvs. komplekse media eller syntetiske media. Imidlertid kan mengden og kvaliteten av det acylerende enzymatiske system variere over et vidt område alt efter sammensetningen av de brukte media. For å oppnå et mycelium som er i besiddelse av høy evne til å omdanne spiramycin I til spiramycin II og III, er det foretrukket meget omhyggelig å velge de forskjellige produkter som går inn i sammensetningen av mediet.

Det er blitt funnet særlig fordelaktig å bruke et syntetisk medium, som bare inneholder en kullhydratenergikilde, en kilde for ammoniakalsk kvelstoff og nøy-traliserende stoffer. Fortrinnsvis brukes glukose eller stivelse i mengder som varierer fra 1 til 100 g pr. 1., og optimum er mellom 40 og 60 g pr. 1. Blant ammonium-saltene er kloridet, sulfatet eller nitratet foretrukket. Mengden av ammoniakalsk kvelstoff kan variere mellom 0,1 og 10 g pr. l.; og optimum mellom 2 og 4 g pr. 1.

Begynnelses-pH for kulturen av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 skal justeres til mellom 5 og 9, og fortrinnsvis mellom 6,5 og 7,5 for å oppnå et produkt med høy evne til omdannelse av spiramycin I.

For å ungå forandring av pH i kulturmediet til verdier som er for lave, og som kan hemme et høyt utbytte av det enzymatiske acyleringssystem, er det hensiktsmessig å tilsette til kulturmediet nøytraliser-ende stoffer i adekvat mengde for å opprettholde pH ved den ønskede verdi. For dette formål kan der brukes alkaliske midler som alkali- og jordalkalimetallhydrok-syder og -karbonater i oppløsning eller suspensjon i vann.

Det er også mulig å tilsette et potenti-elt nøytraliserende stoff, som et uoppløse-lig karbonat av et jordalkaldmetall ved begynnelsen av gjæringen. Fortrinnsvis brukes kalsiumkarbonat i mengder mellom 1 og 50 g pr. 1., og optimum er ca. 25 g pr. 1.

Det er likeledes foretrukket å dyrke Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 under veldefinerte temperaturbetingelser for å oppnå maksimal produksjon av det acylerende enzymatiske system. Dyrkningen kan f. eks. utføres mellom 15 og 40° C. og fortrinnsvis mellom 23—27° C. Dyrkingen av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 kan utføres under de vanlige betingelser som kreves for aerobisk fermentering og mere spesielt i apparater som tillater både en god dispersjon av luften som er nødven-dig for respirasjonen av organismen og en god homogenisering av kulturen.

Det er blitt funnet at den omdannende evne av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 kulturer varierer med kulturens alder. Ved begynnelsen av dyrkningen er omdannelsesevnen praktisk talt proporsjonal med mengden mycelium tilstede i kulturene. Efter en viss tid når omdannelsesevnen en maksimal verdi, faller derpå, mens myceliet fortsetter sin vekst. I praksis er det blitt funnet at myceliet er i besiddelse av maksimal omdannelsesevne efter 30—150 timers kultur i de fleste tilfeller mellom 40 og 100 timer, og optimaltiden avhenger vesentlig av de generelle betingelser ved dyrkningen.

Efter å ha fremstilt, som beskrevet en kultur av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420, eller en av dens mutanter, for produksjon av det enzymatiske acyleringssystem, som omdanner spiramycin I til spiramycin II og III, er det derpå nødvendig å anbringe kulturen under betingelser som vil gjøre bruk av dens omdannende evne. Der kan tilsettes til den oppnådde kultur både spiramycin I, som skal omdannes og de nødvendige elementer for omdannelsen, dvs. acyleringsmidler og aktivatorer. Myceliet av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 kan også isoleres og anbringes i et egnet omdannende medium, inneholdende spiramycin I, acyleringsmidler og aktivatorer.

Det er blitt funnet at mengden av oppnådde omdannelsesprodukter av spiramycin I varierer i overensstemmelse med naturen av acylradikalene til stede i omdannelsesmediet. Således blir propionylradikalene bundet lettere til spiramycin I enn acetyl-radikalene. Hver gang de to typer radi-kaler samtidig er til stede i omdannelsesmediet er der en foretrukken utnyttelse av propionylradikalene for å omdanne spiramycin I til spiramycin III. Således kan omdannelsen av spiramycin I til spiramycin III lettes ved bruken av stoffer med evne til å tilføre et overskudd av propionylradikalet. Den spesifikke omdannelse av spiramycin I til spiramycin II opptrer bare i fravær av alle stoffer med evne til å til-føre propionylradikalet til det omdannende medium. Da Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 i mange tilfeller og i de fleste media danner stoffer med evne til å tilføre et propionylradikal, kan den spesifikke omdannelse av spiramycin I utelukkende til spiramycin II bare utføres under kontrol-lerte betingelser.

Hvis de fremstilte kulturer for fremstilling av acyleringssystemet direkte brukes som omdannende medium, oppnåes praktisk talt rent spiramycin III ved tilsetning av et propionyleringsmiddel. Ved tilsetning av et acetyleringsmiddel omdannes spiramycin til en blanding av spiramycin II og III på grun av nærværet i mediet av små mengder av propionyleringsmiddel.

Hvis imidlertid myceliet av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 kulturen skilles fra mediet som er blitt brukt for å pro-dusere det enzymatiske acyleringssystem, er det mulig å gjennomføre en nøyaktig kontroll av omdannelsen av spiramycin I. Det er i virkeligheten tilstrekkelig å tilsette til myceliet, i tillegg til foretrukne aktivatorer, stoffer med evne til å tilføre acyl-radikaler. I overensstemmelse med arten av disse oppnås da spiramycin II, spiramycin III eller en blanding av disse to. Denne prosess er særlig fordelaktig for fremstillingen av spiramycin II, som bare kan oppnås i nærvær av stoffer med evne til å til-føre acetylradikaler og utelukkelse av stoffer med evne til å tilføre propionylradikaler, særlig slike som stammer fra metabolismen av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420.

Spiramycin I kan brukes i ren tilstand eller i blanding med spiramycin II og III. En slik blanding oppnås ved de vanlige pro-sesser for fremstillingen av rått spiramycin. Spiramycinet kan brukes i form av basen eller et salt og tilsettes til omdannelsesmediet i fast eller oppløst form. For å forenkle behandlingen kan spiramycin brukes f. eks. i form av basen oppløst i vann, metanol, etanol, dietylester, aceton, benzol eller dikloretan. Den kan også brukes som et salt, mere spesielt hydrokloridet, sulfatet, acetatet eller propionatet i vandig oppløs-ning.

Fortrinnsvis velges konsentrasjonen av oppløsningene av spiramycin som skal tilsettes omdannelsesmediet slik at der ikke blir noen vesentlig fortynning av sistnevnte medium. Den endelige konsentrasjon av spiramycin i omdannelsesmediet kan vari-eres f. eks. mellom 1 og 50 g pr. 1, men det er særlig fordelaktig å bruke en konsentrasjon av spiramycin I mellom 5 og 20 g pr. 1. Denne konsentrasjon kan oppnås ved en eneste tilsetning av spiramycin I eller ved tilsetning av flere porsjoner uten å gi vesentlige variasjoner i det ønskede om-dannelsesprodukt.

Som det fremgår av det foranstående vil en kultur av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420, som har et enzymatisk acyleringssystem med den foretrukne tilsetning av acyleringsmidler, bevirke den enzymatiske omdannelse av spiramycin I, som er gjenstanden for nærværende oppfinnelse.

Tilsetningen av mineral- eller organ-iske salter fører vanligvis ikke til noen vesentlige variasjoner i mengden av omdannet spiramycin. Ikke desto mindre er det blitt funnet at visse anioner og kationer har en gunstig effekt på omdannelsen av spiramycin I til spiramycin II og III, enten ved å fremskynde omdannelsen eller ved å øke mengden av omdannet spiramycin.

Blant anioner som er i besiddelse av aktiverende egenskaper i den enzymatiske reaksjon, er klor, som kan tilsettes i form av alkali eller jordalkalimetallklorider eller som andre metallklorider forutsatt at det tilstedeværende metall ikke hemmer omdannelsen. Mengden klor tilsatt til mediet i form av klorid kan være mellom 0,1 og 20 g pr. 1, og optimum er fra ca. 1 til 3 g pr. 1.

Blant kat joner som har evne til å ak-tivere omdannelsen er magnesium, jern og kobolt, og det siste er den foretrukne akti-vator for den enzymatiske acyleringsreak-sjon. Disse metaller kan tilsettes i form av klorid, sulfat, nitrat eller ethvert annet salt, som ikke hindrer den enzymatiske reaksjon. Således kan f. eks. magnesium og jern brukes i mengder mellom 0,1 og 500 mg pr. 1 i det omdannende medium, og optimum er mellom 5 og 10 mg pr. 1. Kobolt kan f. eks. brukes i mengder mellom 0,1 og 1000 mg pr. 1, og optimum er mellom 10 og 400 mg pr. 1.

For å forårsake omdannelsen av spiramycin I til spiramycin II og III under de best mulige betingelser, er det derfor nød-vendig å tilsette til kulturen av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420, som har det enzymatiske acyleringssystem, spiramycin I som skal omdannes, acylerende midler og aktivatorer som foran nevnt.

Disse forskjellige elementer kan tilsettes samtidig eller til forskjellig tid. I siste tilfelle foretrekkes det å tilsette spiramycin I efter acyleringsmidlet og aktivatorene.

Det er blitt funnet fordelaktig i visse tilfeller å tilsette en energikilde som glukose eller stivelse samtidig med spiramycin I, acyleringsmidlene og aktivatorene. Dette er spesielt av betydning, når myceliet av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 skilles fra sitt kulturmedium og anbringes i et medium inneholdende bare spiramycin, acyleringsmidler og aktivatorer. Således kan f. eks. glukose eller stivelse tilsettes i en mengde mellom 1 og 50 g pr. 1., og optimum er ca. 10 g pr. 1..

Når kulturen som inneholder det enzymatiske acyleringssystem brukes som omdannende medium, tilsettes de forskjellige elementer fortrinnsvis ved en pH mellom 5 og 8 og mest fordelaktig mellom 6 og 7. Det er noen ganger ønskelig, for å utføre omdannelsen under de best mulige betingelser, å modifisere pH av kulturen i det øye-blikk tilsetningen av de forskjellige elementer skjer. For .dette kan sure eller alkaliske stoffer brukes, som ikke har noen hemmende egenskaper på omdannelsesre-aksjonen. F. eks. kan saltsyre, svovelsyre, salpetersyre, eddiksyre, propionsyre eller sitronsyre eller natrium-, kalium-, ammo-nium-, kalsium- eller bariumhydroksyder brukes.

Når omdannelsen utføres ved å skille myceliet av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 fra mediet og bringe myceliet sammen med spiramycin, acyleringsmidler, aktivatorer og energikilder, er det fordelaktig å regulere pH mellom 3 og 8 ved hjelp av sure eller basiske midler som nettopp beskrevet. pH kan også reguleres ved hjelp av puffermedia, som eddiksyreacetatet, propionsyre-propionat, sitronsyre-citrat og ftalsyre-ftalat blandinger.

Dessuten, likegyldig hvilken metode som velges, kan det være fordelaktig å kor-rigere variasjonene i pH, som er fremkalt i løpet av omdannelsen ved tilsetning av sure eller basiske midler eller pufferblan-dinger.

Omdannelsen av spiramycin I til spiramycin II og III ved Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 fordrer at kulturen av organismen holdes ved perfekte aerobiske betingelser, hvilken av foranstående metoder enn brukes. Det er derfor nødvendig efter tilsetningen av de forskjellige elementer å holde omdannelsesmediet under luftnings-betingelser og bevegelse lignende dem brukt for den opprinnelige kultur.

Temperaturen, ved hvilken den enzymatisk acylerende omdannelse utføres, er ikke meget kritisk. Vanligvis vil en tempe-råtur mellom 15 og 40° C brukes, og optimum er i området 25° C.

Omdannelsen av spiramycin I til spiramycin II og III er en relativt hurtig omdannelse og en stor mengde spiramycin I omdannes i løpet av 24 timer. For å oppnå det maksimale omdannelsesutbytte, er det hensiktsmessig å opprettholde en tilstrekkelig lang kontakt mellom det enzymatiske acyleringssystem, spiramycinet og de andre elementer, og flere dager kan være nød-vendig for å få en fullstendig omvandling av systemet.

Efter å ha omdannet spiramycin I til spiramycin II og III kan sistnevnte skilles efter kjente metoder, slik som motstrøms-fordeling, kromatografi på aluminiumoksyd eller andre absorbsjonsmidler, eller frak-sjonert krystallisasjon. For å fastslå de relative mengder av de forskjellige spiramyciner i løpet av omdannelsen eller ved dens slutt, er det hensiktsmessig å bruke karakteriseringsmetoder som papirkromatografi på omdannelsesmediet og å sam-menligne de oppnådde kromatogrammer med et kontrollkromatogram tilsvarende kjente mengder av de forskjellige spiramyciner isolert i ren tilstand.

De følgende eksempler vil tjene til å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel I.

En 2 liters Erlemmeyer-flaske chargeres med 250 cm<3> av det følgende medium: pH justeres til 6,8 ved tilsetning av natriumhydroksyd og chargen fullendes med:

Dette medium steriliseres i 45 minutter ved 120° C. Efter avkjøling podes det med en kultur på agar av stammen Streptomyces ambofaciens NRRL 2420. Kulturen plaseres på et rystebord i 48 timer.

300 cm<3> Erlenmeyerflasker chargeres

med 50 cm<3> av følgende medium:

pH justeres til 6,8 med natriumhydroksyd. Der tilsettes derpå: Kalsiumkarbonat 5 g Propionamid tilsettes derpå i de mengder, som er angitt i nedenstående tabell, hvilken viser de oppnådde resultater.

Erlenmeyer-flaskene på 300 cm<3> og deres innhold steriliseres i 20 minutter ved 120° C og podes derpå efter kjøling med 4 cm<3> av kulturen fra 2-liters Erlenmeyer-flaskene og holdes ved 25° C på et rystebord. Mengdebestemmelsene og analysene av antibiotika utføres på den 6., 7. og 8. dag av dyrkningen for å bestemme den maksimale aktivitet og de respektive mengder av de tre spiramyciner.

Ekesmpel II.

Et 170 liters fermenteringskar chargeres med:

pH justeres til 6,8 ved hjelp av natriumhydroksyd og chargen fullendes med:

Mediet steriliseres ved 120° C i 45 minutter. Efter justeringen av temperaturen til 25° C, podes mediet med 250 cm<3> av kultur av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 fra en Elenmeyer-flaske.

Kulturen i fermenteringskaret luftes og holdes i bevegelse i 25 timer og brukes til å pode produksjonskulturen. Sistnevnte utføres i et 30 liters fermenteringskar med følgende medium:

pH justeres til 6,5 med natriumhydroksyd. Chargen fullendes med: Kalsiumkarbonat 75 g Soyabønneolje 60 g Mediet steriliseres i 40 minutter ved 120° C. Efter kjøling er volumet 15 liter og pH er 6,8.

Mediet podes derpå ved overføring av 2 liter av inokulatet fra 170 1. Fermenteringskaret omrøres derpå med en turbin med 550 omdreininger pr. minutt og luftes med 1 m<3> luft pr. time og holdes ved 25° C.

Fra begynnelsen av behandlingen faller pH for å nå en verdi av 5—6 efter 60 timer. Denne første fase tilsvarer eksakt til forbruket av glukose. pH stiger derpå langsomt inntil 90 timer (6,2) og derpå meget hurtig og passerer 7 ved 100 timer. Den endelige aktivitet av næringssuppen er 645 mcg/cm<3>. De respektive vektsmengder av de tre fremstilte spiramyciner er som følger: I 12 %, II 13 %, III 75 %

En lignende prosess utført med samme medium, men uten propionamid gir efter 120 timer en aktivitet på 760 mcg/cm<3> med følgende mengder: I 24 %, II 53 %, III 23 %

Eksempel III.

Inokulatet fremstilles som i eksempel II. Fremstillingen av kulturen utføres denne gang i et 800 liters fermenteringskar chargeret med følgende medium: Stivelse 16.00 kg Ammoniumklorid 1.600 kg pH justeres til 6,7 ved tilsetningen av natriumhydroksyd (36° Be, 1450 cm<3>) og chargen fullendes med: Mediet steriliseres ved gjennomledning av damp av 120° C i 40 minutter. Efter kjøling er volumet 400 liter og pH er 6,7. Mediet podes derpå ved en overføring av 40 liter inokulat fra fermenteringskaret på 170 liter, omrøres med en turbin med 205 omdreininger pr. minutt, luftes med 15 m<3 >luft pr. time og holdes ved 25° C. Efter 150 timers fermentering er aktiviteten av næringssuppen ved dens maksimum: 660 mcg/cm<3>. De respektive vektsmengder av de tre fremstilte spiramyciner er som føl-ger: I 17 %, II 8 %, III 75 %

Eksempel IV.

En 2 liters Erlenmeyer-flaske chargeres

med 250 cm<3> av det følgende medium.

pH justeres til 6,8 med natriumhydroksyd og kalsiumkarbonat — 5 g — tilsettes til mediet.

Mediet steriliseres i 45 minutter ved 120° C. Efter kjøling podes det med en kultur på agar av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420. Kulturen rystes på et rystebord i 48 timer ved 25° C.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres med 40 cm<2> med følgende medium:

pH for mediet justeres til 7 med natriumhydroksyd. Mediet steriliseres derpå i 30 minutter ved 120° C. Efter kjøling podes innholdet av hver Elenmeyer-flaske med 4 cm<:1> av det tidligere beskrevne inokulat. Kulturen rystes på et rystebord ved 25° C. Efter 45 timer er soppveksten utmerket. 20 cm" av en steril vandig oppløsning inneholdende 12 g/l av ren spiramycin I base og 6 g/l av natriumpropionat tilsettes derpå til hver Erlenmeyer-flaske. Omrørin-gen av kulturen holdes i gang i 24 timer og derpå blandes innholdene av alle Erlenmeyer-flaskene. Den kromatografiske analyse av næringssuppene viser at sistnevnte inneholder 2,6 g/l av uomdannet spiramycin I og 1,4 g/l av en blanding inneholdende 20 pst. spiramycin II og 80 pst. spiramycin III.

Eksempel V.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres med 40 cm<3> av følgende medium:

pH av mediet justeres til 7 før tilsetningen av kalsiumkarbonat. Mediet steriliseres derpå i 30 minutter ved 120° C. Efter kjølning podes inneholdene av hver Erlenmeyer-flaske med 4 cm<3> av et inokulat fremstilt som angitt i eksempel IV.

Kulturen omrøres på et rystebord ved 25° C. Efter 48 timers utvikling tilsettes 20 cm<3> av en steril vandig oppløsning inneholdende 12 g/l av ren spiramycin I base, og 6 g/l natriumpropionat tilsettes til hver Erlenmeyer-flaske. Kulturen tillates å utvikle seg på rystebordet i 3 dager. Efter denne tiden blandes innholdene av Erlenmeyer-flaskene. Den kromatografiske analyse av næringssuppen viser at den nå inneholder 2,1 g/l av uomdannet spiramycin I og 1,9 g/l av en av spiramycin I omdannet blanding inneholdende 6 pst. spiramycin II og 94 pst. spiramycin III.

Eksempel VI.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres med 40 cm<3> av følgende medium:

Disse Erlenmeyer-flasker steriliseres, I

podes og dyrkes under betingelsene beskrevet i eksempel V. Efter 48 timers fermentering tilsettes 20 cm<3> av en steril vandig oppløsning, inneholdende 9 g/l rent spiramycin I base og 6 g/l natriumpropionat til hver Erlenmeyer-flaske.

Efter tre dagers inbubasjon finnes det efter papirkromatografiering av næringssuppen at der er tilbake 0,96 g/l uomdannet spiramycin I og at 2,04 g/l spiramycin I er blitt omdannet til en blanding inneholdende 11 pst. spiramycin II og 89 pst. spiramycin III.

Eksempel VII.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres

med 40 cm<3> av følgende medium:

Disse Erlenmeyer-flasker steriliseres, podes og dyrkes under betingelsene beskrevet i eksempel V. Efter 48 timers dyrkning av kulturen tilsettes 20 cm3 av en steril vandig oppløsning inneholdende 12 g/l ren spiramycin I base og 6 g/l natriumpropionat til hver Erlenmeyer-flaske. Erlenmeyer-flaskene deles derpå i 4 grupper. Den før-ste gruppe blir som den er. Til de andre tre grupper tilsettes henholdsvis magne-siumsulfat, jernsulfat og koboltklorid. Tilsetningen av disse salter er slik, at hvert metall opptrer i en konsentrasjon på 1 millimol pr. liter i omdannelsesmediet. Efter tre dagers utvikling blandes innholdet av Erlenmeyer-flaskene fra hver gruppe og analyseres ved papirkromatografi. Resultatene av analysen er som følger:

Eksempel VIII.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres, steriliseres, podes og dyrkes under betingelsene beskrevet i eksempel VIII. Efter 48 timers kultur deles Erlenmeyerflaskene

i to grupper. Hver Erlenmeyer-flaske i den første gruppe tilsettes 20 cm<3> av en vandig oppløsning inneholdende 12 g/l ren spiramycin I base og 6 g/l natriumpropionat. Hver Erlenmeyer-flaske i den annen gruppe tilsettes 20 cm<3> av samme oppløsning, til hvilken der er tilsatt 30 g/l natriumklorid. Hver gruppe Erlenmeyer-flasker behand-les som ovenfor og resultatene av kromatografisk analyse er som følger:

Eksempel IX.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres med 50 cm<3> av følgende medium:

Erlenmeyer-flaskene steriliseres, podes og dyrkes under betingelsene beskrevet i eksempel V.

Efter 52 timers dyrkning tilsettes hver Erlenmeyer-flaske 1 cm<3> av en 15 pst.'s natriumpropionatoppløsning. Erlenmeyer-flaskene deles derpå i to grupper. Hver Erlenmeyer-flaske av første gruppe tilsettes 2 cm<3> av en 15 pst.'s oppløsning av ren spiramycin I base i metanol. Hver Erlenmeyer-flaske av den annen gruppe mottar en oppløsning av samme blanding men i aceton. Kulturen tillates derpå å utvikle seg i 72 timer på rystebord. Innholdene av Erlenmeyer-flaskene av samme gruppe forenes og analyseres kromatografisk. Resultatene av omdannelsen er følgende:

Eksempel X.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres som i foregående eksempel, steriliseres i 30

minutter ved 120° C. og podes hver med 6 cm<3> av et inokulat fremstilt som beskrevet i eksempel IV. Erlenmeyer-flaskene får utvikle seg på et rystebord ved 25° C. og deles derpå i tre grupper. Efter 48 timers dyrkning tilsettes hver Erlenmeyer-flaske av første gruppe 2 cm<3> av en 15 pst.'s opp-løsning i metanol av ren spiramycin I base og 1 cm<3> av en 15 pst.'s vandig oppløs-ning av natriumpropionat. De samme til-setninger gjøres til hver av Erlenmeyer-flaskene av de to andre grupper, men efter henholdsvis 72 og 96 timers dyrkning. Dyrkningen i hvert tilfelle fortsetter i tre dager efter tilsetningen av spiramycin. Innhol-dende av Erlenmeyer-flaskene av samme gruppe analyseres ved papirkromatografi. Den følgende tabell viser resultatene av analysen.

Eksempel XI.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres

med 50 cm<3> av følgende medium:

Erlenmeyer-flaskene steriliseres i 30 minutter ved 120° C, kjøles og smittes med 5 cm<3> inokulat, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel IV. Efter tre dagers kultur ved 25° C. på et rystebord tilsettes til hver Erlenmeyerflaske 5 cm<3> av en vandig opp-løsning, inneholdende 100 g/l ren spiramycin I base, propionsyre 38 g/l, koboltkloridheksahydrat 10 g/l, og hvis pH er blitt justert til 6,5 ved tilsetning av natriumhydroksyd. Dyrkningen fortsettes ytterligere i tre dager og Erlenmeyer-flaskenes innhold analyseres ved papirkromatografi. 8,7 g/l spiramycin I er blitt omdannet til en blanding inneholdende 9 pst. spiramycin II og 91 pst. spiramycin III.

Eksempel XII.

300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres med 50 cm<3> av følgende medium:

Erlenmeyer-flaskene steriliseres, podes og utvikles under betingelsene beskrevet i eksempel V. Efter 96 timers kultur tilsettes til hver Erlenmeyer-flaske 5 cm<8> av en vandig oppløsning, inneholdende 140 g/l av en rå spiramycinbase (inneholdende henholdsvis 59,27 og 14 pst. spiramycin I, II og III), 56 g/l propionsyre, 0,5 g/l koboltkloridheksahydrat, og hvis pH ble justert til 6,5 med natriumhydroksyd. Dyrkningen fortsettes i tre dager og Erlenmeyer-flaskenes innhold analyseres kromatografisk. Av de tilsatte 8,26 g/l spiramycin I, var 6,3 g/l blitt omdannet til en blanding inneholdende 13 pst. spiramycin II og 87 pst. spiramycin III.

Eksempel XIII.

To 300 cm<3> Erlenmeyer-flasker chargeres med 50 cm<3> av følgende medium:

Erlenmeyer-flaskene steriliseres, podes og utvikles under betingelsene beskrevet i eksempel V. Efter 72 timers dyrkning sen-trifugeres Erlenmeyer-flaskenes innhold og den væske som flyter ovenpå fjernes. Halvdelen av den sentrifugerte masse suspenderes i 50 cm<3> av en vandig oppløsning plasert i en 300 cm<3> Erlenmeyer-flaske og inneholdende 6 g/l ren spiramycin I base, 2,3 g/l propionsyre, 1 g/l koboltkloridheksahydrat, idet pH for nevnte oppløsning justeres til 6,5 ved tilsetning av natriumhydroksyd. Den anen halvdel av den sentrifugerte masse suspenderes i 50 cm<3> av den vandige oppløsning av den samme sammensetning, men inneholdende i tillegg 10 g/l glukose.

De to Erlenmeyer-flasker inneholdende suspensjonen av mycelium utvikles ved 25° C. på et rystebord i to dager. Efter denne tidsperiode analyseres hver av Erlenmeyer-flaskenes innhold ved kromatografi. Resultatene av omdannelsen er som følger:

Eksempel XIV.

En 300 cm<3> Erlenmeyer-flaske chargeres med 50 cm<3> av følgende medium:

Erlenmeyer-flasken steriliseres, podes og utvikles under betingelsene beskrevet i eksempel V. Efter 72 timers kultur sentri-fugeres Erlenmeyer-flaskens innhold og den væske som flyter ovenpå fjernes. Den sentrifugerte masse suspenderes i 50 cm<3 >av en pufferoppløsning i en 300 cm<3> Erlenmeyer-flaske, og denne pufferoppløsning inneholder 9,85 g/l iseddik og 4,9 g/l natriumacetat. pH er 4. Den inneholder i tillegg 6,45 g/l ren spiramycin I hydroklorid og 1 g/l koboltkloridheksahydrat. Erlen-meyerf lasken inneholdende suspensjonen av mycelium utvikles ved 25° C. på et rystebord i 80 timer. Erlenmeyer-flaskens innhold analyseres derpå ved papirkromatografi. Det er således funnet, at 2,40 g/l spiramycin I er blitt omdannet til en blanding inneholdende 90 pst. spiramycin II og 10 pst. spiramycin III.

Eksempel XV.

Der plaseres suksessivt i et 170 liters

f ermenteringskar:

pH justeres til 6,7 med 750 cm3 natri-umhydroksydoppløsning (400 g/l NaOH). Der tilsettes derpå:

Fermenteringskaret og dets innhold steriliseres ved gjenomløp av damp i 40 minutter ved 122° C, hvilket gir et slutt-volum på 120 liter. Efter kjøling og justering av temperaturen til 25° C. podes fermenteringskaret med 250 cm<3> av et inokulat, fremstilt som beskrevet i eksempel IV. Mediet omrøres derpå med en propell med 350 omdreininger pr. minutt og luftes med 5 m<3> luft pr. time. Efter 23 timers dyrkning er utviklingen av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 rikelig.

Et 30 liters fermenteringskar chargeres derpå med følgende:

Fermenteringskaret og dets innhold steriliseres i 40 minutter ved 122° C. Efter avkjøling og justering av temperaturen til 25° C, tilsettes 375 g kalsiumkarbonat i steril suspensjon i 2 liter vann, hvilket gir et volum av mediet på 15 liter. pH er da 7,5.

Mediet podes med 1,5 liter inokulat fra 170 liters fermenteringskaret tidligere beskrevet og tillates å henstå i 23 timer. Mediet omrøres med en propell med 550 omdreininger pr. minutt og luftes med 1 m<3 >luft pr. time. Efter 48 timers dyrkning er en god utvikling av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 til stede og kulturmediet har en pH på 6,5. En vandig oppløs-ning dannet av:

tilsettes til mediet.

Den brukte spiramycinbase er et rått produkt som inneholder henholdsvis 65, 23 og 12 pst. spiramycin I, II og III.

Dyrkningen fortsettes derpå under de samme temperaturbetingelser, omrøring og luftning i 90 timer. Fermenteringskaret tømmes derpå og 13,75 liter næringssuppe oppnås. Papirkromatografi av næringssup - pen viste at all spiramycin I var blitt omdannet til en blanding av spiramycin II og III, idet mengdene var henholdsvis 29 og 71 pst. av sluttproduktet. Ekstraksjon av næringssuppen gir 122 g spiramycinbase, sammensatt av henholdsvis 25 pst. og 75 pst. spiramycin II og III.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av spiramycin II, spiramycin III eller blandinger av disse, ved dyrkning av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 eller en mutant av denne, under aerobiske betingelser i et vanlig næringsmedium eller i et medium som ineholder spiramycin I, karakterisert ved at dyrkningen utføres i nærvær av eddiksyre, propionsyre eller et salt, ester eller amid av disse eller et middel som utvikler enhver av disse in situ under dyrkningsbetingelsene, og som tilsettes til nevnte medium.

2. Fremgangsmåte efter påstand 1, karakterisert ved at næringsmediet inneholder en kullhydratenergikilde, en kilde for ammoniakalsk nitrogen og et alkalisk stoff til å holde pH mellom 5 og 9.

3. Fremgangsmåte efter påstand 2, karakterisert ved at kullhydratenergikilden er glukose eller stivelse, kilden for ammoniakalsk nitrogen er ammoniumklorid, -nitrat eller -sulfat og at det alkaliske stoff er et alkalimetall- eller jordalkalimetall-hydroksyd eller -karbonat som holder pH-verdien mellom 6,5 og 7,5.

4. Fremgangsmåte efter enhver av de foregående påstander, karakterisert ved at kulturmediet inneholder et metallklorid og /eller et salt av magnesium, jern eller kobolt.

5. Fremgangsmåte efter enhver av de foregående påstander, karakterisert ved at der først fremstilles et inokulat av Streptomyces ambofaciens NRRL 2420 eller en mutant av denne ved bruk av et næringsmedium opprinnelig fritt for spiramycin og for tilsatt eddiksyre, propionsyre eller et salt, ester eller amid av disse eller et middel, som utvikler enhver av disse in situ under dyrkningsbetingelsene, og at nevnte inokulat anvendes for å pode et annet næringsmedium inneholdende spiramycin I og tilsatt eddiksyre, propionsyre eller et salt, ester eller amid av disse, eller et middel som utvikler enhver av disse in situ under dyrkningsbetingelsene og at dyrkningen fortsettes.

6. Fremgangsmåte efter påstand 5, karakterisert ved at det annet næringsmedium podes med mycelium som er isolert fra den første kultur.