NO118484B

NO118484B -

Info

Publication number: NO118484B
Application number: NO63147927A
Authority: NO
Inventors: Atsushi Hirano; Sotoo Yamamoto; Tetsukazu Goto
Original assignee: Asahi Chemical Ind
Priority date: 1962-03-20
Filing date: 1963-03-18
Publication date: 1970-01-05
Also published as: BE629799A; NL290403A; GB1041734A; FR1390169A; SE316735B; LU43372A1; DK107283C; BR6347741D0; CH446375A

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre

ved aerob dyrking av mikroorganismen Microbacterium ammoniaphilum.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre ved aerob dyrking av mikroorgansimen Microbacterium ammoniaphilum, hvor denne podes i et dyrkingsmedium inneholdende kilder for karbohydrater, nitrogen samt uorganiske salter, i nærvær av biotin i en mengde som er stbrre enn den mengde som trenges for veksten, samt en overflateaktiv aktivator, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at det som aktivator anvendes polyetylenglykol-monostearat.

Det er tidligere kjent at mikro-organismer kan produsere og akkumulere L-glutaminsyre direkte i et dyrkingsmedium som'er sammensatt av karbohydrater, nitrogenkilder, uorganiske salter og andre næringsstoffer. De fleste av de stammer som benyttes industrielt for fremstilling av L-glutaminsyre trenger biotin for sin\écst. Det er derfor rimelig at styring av gjæringen ved hjelp av biotin spiller en vesentlig rolle. Dersom biotinmengden i dyrkingsmediet er mindre enn den mengde som trenges for optimal vekst, og biotinet således får virke under utilstrekkelige betingelser, vil det med god virkningsgrad fremstilles og akkumuleres L-glutaminsyre. Under betingelser hvor imidlertid biotinet er tilstede i overskudd i dyrkningsmediet, vil mikro-organismene formere seg i en slik grad åt det blir helt umulig å oppnå den onskede hensikt, det vil<*>si fremstilling av L-glutaminsyre.

I et vanlig anvendt syntetisk medium lar biotininnholdet seg lett kontrollere kvantitativt slik at det blir egnet for gjæring, men det syntetiske medium er som regel kostbart slik at det av okonomiske grunner ikke kan anbefales for industrielle prosesser. Som folge av dette er det blitt anvendt billige naturlige substanser som råmaterial for dyrkingsmediet. Disse har imidlertid forskjellig sammensetning fra parti til parti, og selv en liten mengde mais-stopvæske må analyseres omhyggelig dersom den skal kunne benyttes. Når avfallsmelasse (roe- eller rorsukker-melasse), enzymatisk og fra saccarose fremstilt råglukose etc. benyttes som karbohydratmaterial varierer dessuten disses sammensetning meget med behandlingsmåten av det rå plantematerial. Den store mengde biotin som frembringes av disse planter forårsaker dessuten en uhemmet vekst av mikro-organismene, hvilket forer til en nedsatt akkumlering av L-glutaminsyre.

Av denne grunn er anvendelsen av avfalls-melasse'og enzymatisk

og fra saccarose fremstilt råglukose som karbohydratmaterial, blitt ansett for å være umulig, til tross for at disse substanser dersom de kunne benyttes, klart viUe ha storre okonomiske fordeler enn ren glukose som hittil er benyttet.

Foreliggende oppfinnelse har muliggjort fremstilling av L-glutaminsyre med hoyt utbytte selv når dyrkingsmediet inneholder et overskudd av biotin, ved anvendelse av mikroorganismen

Microbacterium ammoniaphilum. (Denne mikroorganisme betegnes

med ATCC 1535^ og er deponert i American Type Culture Collection, Washington, D.C., USA den 12. februar 196^). Ved tilsetning av polyetylenglykolmonostearat (C1^H^^COOCCH2CH20)nH), et ikke-ionisk overflateaktivt middel av estertype, til dyrkingsmediet er det blitt mulig å fremstille store mengder L-glutaminsyre selv når dyrkingsmediet inneholder biotin i overskudd.

Overflateaktive midler er benyttet tidligere ved gjæringsprosesser med forskjellige mikro-organismer. Det .er kjent at særlig ikke-ioniske overflateaktive midler er virksomme med hensyn til å forhindre sammenklumping av mikroorganismene eller til å stimulere veksten av disse. Det er fra det franske patentskrift 1.266.757 kjent å tilsette et antibiotikum (cetyl-trimetylammonium-bromid; CTAB) som veksthemmer, men dette forte ikke til noe tilfredsstillende utbytte av L-glutaminsyre.

Det har hittil ikke vært kjent at det ved tilsetning av

ikke-ionisk overflateaktivt middel, nemlig polyetylenglykol-monostearat, til et dyrkingsmedium som inneholder et biotin-overskudd, kan det fremstilles og akkumuleres L-glutaminsyre med like hoyt utbytte som ved prosesser hvor biotininnholdet er mindre enn den mengde som trenges for optimal vekst. Fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse er derfor både ny og fordelaktig. Polyetylen-glykolmonostearat kan med fordel tilsettes ved begynnelsen av den logaritmiske fase av bakterieveksten, nemlig etter et intervall på 7-8 timer.

Som karbo_hydratmaterial for gjæringen kan det brukes naturlige karbohydrater som avfallsmelasse (roe- og rorsukkermelasse), enzymatiske og sure stivelseshydrolysater og selvfolgelig slike kjemiske forbindelser som glukose, sukrose og fruktose.

Som kilde for nitrogen og uorganiske salter anvendes de forbindelser som anvendes ved den vanlige L-glutaminsyregjæringsprosess, f.eks. ammoniumklorid, ammoniumsulfat, urinstoff, ammoniakk, KH^PO^, I^HPO^, MgSO^^I^O, jernsalter, mangansalter o.l.

Fremgangsmåten gjennomføres ved å pode en L-glutaminsyre-produserende mikro-organisme horende til Microbacterium ammoniaphilum i et dyrkingsmedium inneholdende det utvalgte karbohydrat, nitrogenkilden, uorganiske salter samt et ovaskudd av "biotin .(mer enn 10 p./ l), idet mikro-organismen dyrkes under aerobe betingelser ved pH 6 til 8, og idet det som aktivator tilsettes et overflateaktivt middel, nemlig det ikke-ioniske polyetylenglykolmonostearat, til dyrkingsmediet en viss tid etter at dyrkingen er begynt, for derved å fremstille en stor mengde L-glutaminsyre i dyrkingsmediet, uten å forstyrres av at biotin

er tilstede i overskudd, idet den således fremstilte L-glutaminsyre til slutt fraskilles og utvinnes.

Blant de forskjellige betingelser for styring av dyrkingen er tidspunktet for tilsettingen av polyetylenglykolmonostearat (for å aksellerere fremstillingen av L-glutaminsyren) til mediet en viktig faktor og dominerer ofte det mengdemessige resulat man får av gjæringen.

Selvom tidspunktet for tilsettingen av polyetylenglykolmonostearatet kan variere over et bredt område avhengig av den art råmaterialer, stammer og det forkultiveringsmedium som anvendes, er som nevnt det beste tidspunkt for tilsettingen et tidlig trinn i den logaritmiske vekstfase for mikro-organismen, det vil si den 7. til 8. time etter at dyrkingen har tatt til. Med andre ord tilsettes polyetylenglykolmonostearat til mediet når verdien for den optiske tetthet (O.D. Value) for dyrkingsbuljongen når 0,3 til 0,U- (den optiske tetthet bestemmes ved å oppslemme 1,0 ml av dyrkingsbuljongen i 9,0 ml destillert vann og måle absorpsjonsindeksen, dvs. -log T, av den resulterende fortynnede buljong ved hjelp av et foto-elektrisk fotometer i en 1 0 mm selle med bolgelengden 655 m p.). Mangden av polyetylenglykolmonostearat som tilsettes må også varieres i avhengighet av de typer av råmaterial som er tilstede og også

i avhengighet av mengden av biotin som er tilstede i mediet, men i de fleste tilfelle vil en mengde av 0,05 til 0,^ g/dl være å foretrekke.

Ved fremstilling av L-glutaminsyre ved gjæring er det viktig å kontrollere pH i mediet, og ved utovelse av den foreliggende fremgangsmåte holdes pH i mediet fortrinnsvis innenfor området mellom 6 og 8 ved å tilsette stoffer som urinstoff, vandig ammoniakk og lignende.

En temperatur innenfor området mellom 28 til 33°C foretrekkes opprettholdt under gjæringen og da med gode resultater.

Ved anvendelse av foreliggende fremgangsmåte for syntetiske medier som inneholder overskudd av biotin eller ved halvsyntetiske medier som inneholder overskudd av mais-stopvæske og andre medietyper med biotinoverskudd, har fremgangsmåten den fordel at utbyttet og dyrkingsprosessen kan gjbres mer stabil enn ved vanlige fremgangs-måter hvor dyrkingsmediet inneholder en optimal biotinmengde.

Oppfinnelsen skal i det folgende forklares i detalj ved hjelp av folgende utforelseseksempler.

Eksempel 1

Sammensetning av podemedium:

Sammensetning av dyrkingsmedium:

% angivelsene for dyrkingsmediene refererer seg til vekt/volum % bortsett fra mais-stopvæsken og aminosyrelosningen som er angitt som volum pr. volum %.

Microbacterium ammoniaphilum ble dyrket i buljong-skråagar i 2h timer ved 30°C.

Kulturen ble suspendert i 30 ml sterilt vann, hvorpå 3 ml av suspensjonen ble podet på 150 ml av det ovenfor angitte steriliserte podemedium i en 500 ml Erlenmeyer kolbe.

Fremstillingen av denne podekultur ble utfort aerobisk ved 30°C i

20 timer.

Dyrkingsmediet for gjæringen var, som angitt ovenfor, et fullstendig syntetisk medium, hvor det ble tilsatt 20 jig/lit. biotin (den optimale biotinkonsentrasjon for podekulturen var 1,5 jig/lit. og den maksimalt nodvendige mengde for velst var 10^ig/lit. når karbohydratkonsentrasjonen var 5%). 100 ml av det steriliserte biotinholdige medium ble fylt over på en 1500 ml rystekulturflaske. Etter at podekulturen var ferdig ble 2$ av lbsningen benyttet til podning av det syntetiske gjæringsmedium hvorpå de forskjellige typer ikke-ioniske overflateaktive midler som er angitt i tabell 1, ble tilsatt i en mengde på 50 mg/100 ml og mediet dyrket i kB timer under aerobe betingelser.

Mengden av L-glutaminsyre ble deretter bestemt ved papirkromatografi som vist i tabell I.

+ mindre enn 1 mg/lit.

++ over 1 mg/lit. - under 20 mg/lit.

++++over 50 mg/lit.

Av tabellen fremgår det at det i alle tilfeller bortsett fra når sorbitanmonostearat ble benyttet, ble det produsert L-glutaminsyre ved tilsetning av et ikke-ionisk overflateaktivt middel i kulturmediet som inneholdt overskudd av biotin. Ved anvendelse av polyetylenglykolmonostearat ble det oppnådd overraskende store mengder L-glutaminsyre.

Eksempel 2.

Sammensetningen av pode-kulturmediet var den samme som i eksempel 1. Til dyrkingsmediet ble det tilsatt de mengderbiotin som er angitt

i tabell II. Konsentrasjonen av polyetylenglykolmonostearat fremgår av tabell II. Dyrkingsmediet ble behandlet som beskrevet i eksempel 1. Den mengde L-glutaminsyre som var produsert etter 3 dagers dyrking er også angitt i tabellen.

Som det fremgår av tabellen varierer polyetylenglykolmonostorat-tilsetningen noe med biotininnholdet i mediet; Det har imidlertid vist seg at det kan fremstilles L-glutaminsyre med godt utbytte, dersom polyetylenglykolmonostearat tilsettes, uansett hvor mye biotin mediet inneholder.

E ksempel 3

Sammensetningen av buljongen for dyrking av mikroorganismene var den samme som i eksempel 1.

Med tanke på anvendelsen av avfallsmelasse som karbohydratkilde

i dyrkingsbuljongen ble det benyttet 1,5$ glukose og 3>5$ sukrose som karbo_hydratmaterial i buljongsammensetningen under anvendelse av biotinmengder på 20/ug/l, 50 / ag/ l og 100/ag/1. Polyetylenglykol-monostearat ble tilsatt i de konsentrasjoner som er angitt i tabell III og gjæringen ble utfort på samme måte som i Eksempel 1. Den mengde L-glutaminsyre som var dannet etter 3 dager er angitt

i tabell III.

Tabellen bekrefter at det ved anvendelse av polyetylenglykol-monostearat oppnås et bemerkelsesverdig hoyt utbytte av L-glutaminsyre på tross av at kulturmediet inneholder overskudd

av biotin.

Eksempel h

Buljongen for dyrkingen hadde samme sammensetning som i eksempel 1.

Som karbohydratmaterial for dyrkingsmediet ble det benyttet avfallsmelasse (9,36$ -total-karbohydrat, tf,22$ direkte æduserende sukker og 2,3Mg/100 ml biotin) som var behandlet med ionevekslerharpiks og fortynnet til en konsentrasjon på ca. 5$» Bortsett fra at det ble benyttet mindre biotin (20 jig/lit. i eksempel 1 ) var sammensetningen og gjæringsteknikken den samme som i eksempel 1. Polyetylenglykolmonostearat ble anvendt i de konsentrasjoner som er angitt i tabell IV. L-glutaminsyremengden etter 3 dagers dyrking er angitt i den samme tabell.

Av eksempelet fremgår det at det ved anvendelse av polyetylenglykol-monostearat i passende konsentrasjoner oppnås et bemerkelsesverdig hoyt utbytte av L-glutaminsyre når den totale karbohydrat-. konsentrasjon er 5$5den anvendte avfallsmelasse er behandlet med ionevekslerharpiks og buljongen inneholder 12^3 ng/100 ml biotin-overskudd.

Eksempel 5

Sammensetning av podemediet:

Sammensetning av dyrkingsmediet:

Under anvendelse av de ovenfor angitte dyrkingsmedier ble det dyrket en stamme på samme måte som i eksempel 1, og kulturen ble benjttet til poding av et hoved-dyrkhgsmedium. Dyrkingsmediet ble tilsatt 50 mg/100 ml polyetylenglykolmonostearat. Etter 3 dagers dyrking var den fremstilte mengde L-glutaminsyre 23,7 mg/ml. Samtidig med dette ble det foretatt en dyrking under identiske •betingelser uten anvendelse av polyetylenglykolmonostearat, hvilket forte til en L-glutaminsyremengde på bare 1,6 mg/ml.

Etter avsluttet dyrking ble bakteriene fjernet og væsken inndampet under oppvarming. L-glutaminsyrektystallene lot seg lett utfelle ved avkjoling av den inndampede buljong ved justering av dens pH-verdi til 3,2. De utfelte grove krystaller ble deretter torket ved sentrifugering.

Eksempel 6

Sammensetningene av podemediet og hoveddyrkingsmediet var de

samme som i det foregående eksempel, bortsett fra at biotininnholdet ble endret til 100 p. g/ 1. Den mengde L-glutaminsyre som ble fremstilt i lbpet av 3 dagers dyrking var 1*+,8 mg/ml, mens det ble oppnådd et utbytte på 21,5 mg/ml L-glutaminsyre ved tilsetning av 150 mg/100 ml polyetylenglykolmonostearat til dyrkingsbuljongen.

Eksempel 7

Mikroorganismene ble dyrket i et podemedium som hadde den samme sammensetning som i eksempel 5» I hoveddyrkingsmediet ble det benyttet 1,5$ glukose og 3,5$ sukrose som karbo-hydratmaterial, og dyrkingen ble utfort med en sammensetning og etter en metode som var identisk med den i eksempel 5> L-glutaminsyremengden etter 3 dager var 23,6 mg/ml og 1,2 mg/ml henhv. med og uten polyetylen-glykolmonostearat.

Eksempel 8

Mikroorganismene ble dyrket i et podemedium som hadde samme sammensetning som i eksempel 1. Som karbohydratmaterial for hovedmediet ble det benyttet avfallsmelasse (total-karbohydrat* 62,57$, direkte reduserende sukker: 20,07$, biotin: 8ky7 jig/100 g,

L-glutaminsyre 0,5 mg/ml) som ble fortynnet til en konsentrasjon

på ca. 5$. Dyrkingen ble utfort i et dyrkingsmedium med en sammensetning og ved en fremgangsmåte som var lik den som er beskrevet i eksempel 5, bortsett fra at mediet ikke inneholdt 20 pg/ 1 biotin. Ved tilsetning av 150 mg/100 ml polyetylenglykol-monostearat til hovedmediet ble det oppnådd 1*+,7 mg/ml L-glutaminsyre ved 3 dagers dyrking. Uten anvendelse av polyetylenglykolmonostearat ble det under de samme betingelser bare oppnådd 0,7 mg/ml glutaminsyre.

Eksempel 9

Mikroorganismene ble dyrket i en podekultur som angitt i eksempel 5« Forsukret stivelseslosning (total-karbohydrat 56,3#j direkte reduserende sukker M3,8# og biotin 83^ig/100 ml) som var forsukret ved anvendelse av et forsukringsenzym i flytende form ble justert til et total-karbohydratinnhold på ca. 5$. Dyrkingen ble gjennomfort som i det foregående eksempel og forte til L-glutaminsyremengder på 17,9 og 0,3 mg/ml henhv. med 150 mg/100 ml polyetylenglykolmonostearat og uten polyetylenglykolmonostearat.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre ved aerob dyrking av mikroorganismen Microbacterium ammoniaphilum, hvor denne podes i et dyrkingsmedium inneholdende kilder for karbohydrater, nitrogen samt uorganiske salter, i nærvær av biotin i en mengde som er storre enn den mengde som trenges for veksten, samt en overflateaktiv aktivator, karakterisert ved at det som aktivator anvendes polyetylenglykolmonostearat.