NL9400111A

NL9400111A - Elektronenmicroscoop met Ramanspectroscopie.

Info

Publication number: NL9400111A
Application number: NL9400111A
Authority: NL
Inventors: Jan Greve; Clemens Antoni Va Blitterswijk; Hendrik Klaas Koerten
Original assignee: Biomat Res Group Stichting Azl
Priority date: 1994-01-24
Filing date: 1994-01-24
Publication date: 1995-09-01
Also published as: DE69504347T2; AU1427195A; WO1995020242A1; DE69504347D1; US5811804A; DK0766869T3; ES2122530T3; EP0766869B1; ATE170331T1; EP0766869A1

Description

Elektronenmicroscoop met Ramanspectroscopie.

De uitvinding heeft betrekking op een elektronenmicroscoop voorzien, in de langsasrichting gezien, van tenminste een elektronenbundelop-weksysteem, een condensor- en objectieflenzensysteem, een preparaatkamer, een projectielenzensysteem en een afbeeldingsscherm, welke elektronenmicroscoop bruikbaar is voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM). De uitvinding heeft tevens betrekking op een soortgelijke elektronenmicroscoop voorzien, in de langsasrichting gezien, van tenminste een elektro-nenbundelopweksysteem, een condensor- en objectieflenzensysteem, een preparaatkamer, en een elektronendetector, welke elektronenmicroscoop bruikbaar is voor scanning elektronenmicroscopie (SEM). Dergelijke microscopen zijn in de praktijk bekend.

Deze bekende elektronenmicroscoop is een instrument waarmede met hoog oplossend vermogen, in de grootte-orde van enkele tienden nanometers, structuren in dunne preparaten of oppervlakken, bijvoorbeeld met TEM, of in de grootte-orde van enkele nanometers, structuren in bulkpre-paraten bijvoorbeeld met SEM, zichtbaar kunnen worden gemaakt.

In een dergelijke microscoop, zoals weergegeven in figuur 1, wordt een elektronenbundel 1 geproduceerd in een uit kathode, wheneltcilinder en anode bestaand elektronenkanon 2. Met behulp van een magnetisch lenzensysteem 3. z.g. condensorlenzensysteem, wordt de elektronenbundel tot een coherente spot boven het preparaat 4 gefocusseerd, waarbij deze spot aan een scannende beweging kan zijn onderworpen.

Bij de transmissie elektronenmicroscoop (TEM) passeert de bundel het preparaat k en wordt hij met behulp van een magnetisch lenzensysteem, zoals objectief 5 en projectielenzen 6, geprojecteerd op een afbeeldingsscherm 7* zoals een fluorescerend scherm. Bij inval van de elektronenbundel licht dit scherm op en geeft een vergroot beeld weer van het preparaat.

Doordat zich in het preparaat atoomelementen met wisselend atoom-nummer bevinden wordt contrastvorming bereikt. Hierbij zijn zware elementen met een hoog atoomnummer moeilijker doorstraalbaar voor elektronen dan lichte elementen met een lager atoomnummer. Het gevolg hiervan is dat op plaatsen waar zich zware elementen bevinden, de elektronen geheel of gedeeltelijk worden teruggekaatst, terwijl elektronen op plaatsen, waar lichte elementen zich bevinden, vrij eenvoudig kunnen passeren. Hierdoor zal een uit verschillende chemische elementen opgebouwd preparaat dus ook wisselende hoeveelheden elektronen doorlaten. Op het scherm ontstaat een afbeelding die de hoogste helderheid geeft voor plaatsen, waar in het preparaat lichte elementen met een lager atoomnummer voorkomen en de laagste helderheid op plaatsen waar elementen met een hoog atoomnummer voorkomen. Een soort van schaduwbeeld ontstaat dus.

Bij de scanning elektronenmicroscoop (SEM), die in figuur 2 is weergegeven en die in hoofdzaak dezelfde opbouw heeft als de transmissie elektronenmicroscoop, passeert ook de door een elektronenkanon 2 opgewekte elektronenbundel 1 een condensorlenzensysteem 3· De elektronenbundel wordt bij de SEM tot een spot op het preparaat gefocusseerd, waarbij deze spot door middel van een afbuigeenheid 10 aan een scannende beweging wordt onderworpen. De door het preparaat k teruggekaatste of terugverstrooide elektronen worden opgevangen op een elektronendetector 8 en worden na versterking in 11 gebruikt om intensiteitsvariaties op het scherm van een met de elektronenbundelscanning gesynchroniseerde kathode-straalbuis 12 teweeg te brengen.

De TEM geeft beelden van dunne preparaatsneden en kan derhalve het inwendige van te onderzoeken preparaat zichtbaar maken. Daarentegen geeft de SEM een beeld met behulp van de van het preparaat teruggekomen elektronen en is derhalve specifiek geschikt voor het weergeven van beelden van het oppervlak, of direct daaronder, van een preparaat. Er bestaan overigens ook z.g. scanning-transmissie elektronenmicroscopen (STEM) waarin de TEM en de SEM inrichtingen zijn gecombineerd en hun afbeel-dingsmogelijkheden zijn verenigd. Men zal hierbij via twee afzonderlijke monitors zowel het TEM beeld als het SEM beeld kunnen waarnemen.

In elk van bovengenoemde elektronenmicroscopen kan aanvullend een röntgendetector worden geplaatst. Gebruikmakend van de röntgenstralen die vrijkomen tengevolge van de bundel-preparaat interaktie kan met deze detector informatie over de aanwezigheid in het preparaat van bepaalde chemische elementen worden verkregen. Zoals bekend kunnen invallende primaire elektronen uit de elektronenbundel in botsing komen met de in het preparaat aanwezige elektronen van atomen. Als gevolg van deze botsing kunnen de elektronen, die zich in een van de binnenste schillen van de samenstellende atomen van het preparaat bevinden, uit hun baan worden gestoten waardoor een instabiel atoom ontstaat. Om deze instabiliteit op te heffen kan een elektron uit een hoge baan met bepaalde energietoestand terugvallen naar die lage baan en zal hierbij energie vrijkomen, die voor een deel in de vorm van röntgenstraling wordt uitgezonden en specifiek is voor het betreffende element.

In figuur 3 is aangegeven op welke wijze de elektronenbundel 1 na doorgang door de condensorapertuur 13 en de pools tukken .14 invalt op het op een roosterhouder 15 geplaatst preparaat. Een deel van de elektronenbundel passeert het preparaat en een objectief lens 16. De uit het preparaat vrijkomende röntgenstraling 18 wordt boven het preparaat in een röntgendetector 17 opgevangen en kan, bij onderzoek van een beeldpunt, in de vorm van een spectrum op een monitor (zie figuur 4) of, bij onderzoek van een geheel beeldelement, in de vorm van een verdelingsbeeld op een andere monitor worden weergegeven.

Door zoals eerder gesteld de elektronenbundel tot een scannende spot te focusseren op het te onderzoeken deel van het preparaat, kan de röntgenstraling voor dat specifieke preparaatdeel worden opgewekt. Het oplossend vermogen van deze röntgenmicroscopie wordt bepaald door de diameter van de elektronenbundel en ligt in de orde-grootte van 0,05 tot 0,5 pm. Het met behulp van deze röntgenmicroanalyse verkregen spectrum levert hoofdzakelijk gegevens over aanwezigheid van chemische elementen in het preparaat maar geen informatie over de opbouw van moleculen en/of kristallen ter plaatse. Wel kan informatie over het voorkomen van bepaalde kristallen bij de TEM worden verkregen uit het diffractiepatroon dat met een TEM kan worden gemaakt. Met een SEM kan echter geen diffractiepatroon worden verkregen en is de kennis van de betreffende onderzoeker over het preparaat bepalend of hij in staat is om de molecuul- en kris-talopbouw enigermate af te leiden uit de elementensamenstelling.

Uit een andere optisch spectroscopische techniek is nu de Raman-spectroscopie bekend, waarbij monochromatisch. licht op een preparaat wordt ingestraald. Het door het preparaat verstrooide licht zal naast licht met dezelfde golflengte als het ingestraalde licht, ook licht van andere golflengte bevatten. Deze golflengteverschuiving wordt veroorzaakt door een interaktie tussen moleculen van het preparaat en fotonen van het ingestraalde licht, welke ertoe leidt, dat de moleculen na de interaktie in een vibrationele energietoestand achterblijven, verschillend van de initiële. Verschillende molecuulvibraties leiden tot verschillende discrete golflengteverschuivingen. Op deze wijze wordt informatie verkregen over de moleculaire samenstelling en molecuulstructuur van het preparaat.

Een Ramanmicrospectrometer bestaat uit een normale lichtmicroscoop optisch gekoppeld aan een spectrometer voorzien van een gevoelige lichtdetector (photomultiplier, gekoelde CCD-camera). De ruimtelijke resolutie welke met een dergelijk instrument behaald kan worden, wordt bepaald door de optische diffractielimiet (i.e. ~ λ/2). De in de lichtdetector ingevangen Ramanfotonenenergie kan dienen om, bij onderzoek van een beeld- punt, een spectrum te vormen, zoals weergegeven in figuur 5i of om, bij onderzoek van een geheel beeldelement, een verdelingsbeeld weer te geven.

In figuur 6 is een zeer schematische opbouw weergegeven van een Ramanspectroscoop, waarmede bovengenoemde spectrometrie wordt bedreven. Met 20 is een lichtbron zoals een laser, met 21 een laserpremonochronoma-tor, met 22 een lenzen- en objectief systeem, met 23 een bundelsplitser, met 24 een objectief, met 25 een preparaat, met 26 een prisma, met 27 een ND filter, met 28 een camera, met 29 een monitor, met 30 een ruimtelijke filter, met 31 een lens, met 32 een Ramanspectrometer, bijvoorbeeld een fotovermenigvuldiger, en met 33 een stuureenheid en met 34 een x-y plotter weergegeven. Met deze Ramanspectroscoop kan in twee modi gewerkt worden. In de ene of imaging mode kan via de camera op de monitor 29 een verdelingsbeeld van de informatie in het spectrum bij specifieke Raman-componenten worden weergegeven. In de andere of analysemode kan een Ra-manspectrum van kleine gebieden of beeldpunten middels de spectrometer 32 worden onderzocht.

Een nadeel van deze bekende Ramanspectroscopie was het relatief brede golflengtespectrum en de grote spot size van de lichtbundel waarmee het preparaat konden worden aangestraald.

Bovengenoemde elektronenmicroscopie en Ramanspectroscopie wer-den tot nu toe afzonderlijk van elkaar bedreven. Indien de informatie uit deze twee technieken aan elkaar gerelateerd moet worden, is het buitengewoon lastig om de resultaten van deze technieken in synchroniciteit met elkaar te brengen. Daarnaast is de huidige vorm, waarin de Ramanspectroscopie in combinatie met lichtmicroscopie wordt toegepast, niet in staat om informatie over de ultra structuur van het preparaat te verschaffen. Intussen bestaat zowel in de materiaalkunde als in het medisch-biologisch onderzoek sterke behoefte aan het herkennen van moleculen en kristallen in elektronenmicroscopische preparaten

De uitvinding beoogt bovengenoemde problemen te ondervangen en een elektronenmicroscoop zodanig verder uit te voeren dat een eenvoudig hanteerbare en met Ramanspectrometrie efficiënt gecombineerde elektronenmicroscoop wordt verkregen, waarin de resultaten van beide analysetechnieken goed in overeenstemming met elkaar worden gebracht.

Dit wordt bij een elektronenmicroscoop van de in de aanhef genoemde soort volgens de uitvinding aldus bereikt dat een lichtbron en in de optische as van de lichtbundel daarvan een bijbehorend lenzensysteem aanbrengbaar is, ten behoeve van Ramanspectroscopie, voor inkoppeling van de lichtbundel in - en uitkoppeling van preparaatbetrokken Ramanstraling uit - de preparaatkamer, en dat op de optische as in de microscoop een lichtbundel- en Ramanstraling geleidingssysteem is geplaatst om de lichtbundel naar - en de Ramanstraling vanaf - het preparaat te geleiden.

Het is bij deze uitvoering volgens de uitvinding verrassenderwijs gebleken dat, door gebruik te maken van moderne technieken bij de opwekking van lichtbundels van zeer kleine diameter en hoge intensiteit, de toepassing van Ramanspectroscopie, in termen van oplossend vermogen, in de elektronenmicroscopie zeer doelmatig is.

De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van een uit-voeringsvoorbeeld met verwijzing naar de tekeningen, waarin:

Figuur 1 een principeschema toont van een bekende transmissie elektronenmicroscoop (TEM);

Figuur 2 een principeschema toont van een bekende scanning elektronenmicroscoop (SEM);

Figuur 3 een detailweergave toont van een preparaatkamer met een röntgenmicroanalyse-detector;

Figuur 4 een voorbeeld toont van een röntgenmicroanalyse-spectrum van een beeldpunt;

Figuur 5 een voorbeeld toont van een Ramanspectrum;

Figuur 6 een principeschema toont van een bekende Ramanspectros- coop;

Figuur 7 een principeschema toont van een uitvoeringsvoorbeeld volgens de uitvinding; en

Figuren 8a en 8b twee varianten tonen van een ander uitvoerings-voorbeeld volgens de uitvinding.

In figuur 7 is met 40 schetsmatig een transmissie elektronenmicroscoop aangegeven. In deze elektronenmicroscoop is met 41 een elektronenkanon, met 42 een condensorlenzensysteem, met 43 een bundeldeflector, met 45 in het algemeen een preparaatkamer, met 44 een preparaatdrager, met 46 een intermediate- en projectielenzensysteem, met 49 een frame-shifter, met 48 een afbeeldingsscherm, en met 47 een CCD camera aangegeven. Het spreekt vanzelf dat, hoewel niet aangegeven, een röntgenmicroanalysede-tector kan zijn ingebouwd zoals in figuur 3·

Volgens de uitvinding is de elektronenmicroscoop verrassenderwijs gecombineerd met een Ramanmicrospectroscoop. In figuur 7» die een voorbeeld van een uitvoeringsvorm toont, is met 50 een lichtbron, zoals een microlaser, met 51 in het algemeen een objectief- en lenzensysteem, met 52 een halfdoorlatende plaat, en met 53 een Ramanspectrometer aangegeven.

Verder is in de microscoop een lichtbundel- en Ramanstraling geleidings-systeem aangebracht voor geleiding van de ingekoppelde lichtbundel naar het preparaat en voor geleiding en uitkoppeling van de van het preparaat afkomstige Ramanstraling. Dit systeem kan bijvoorbeeld een in de elektronenmicroscoop scheef op de microscooplangsas geplaatste optisch element 54 zijn. Dit optische element kan uit een wegklapbare of vast uitgevoerde reflecterende plaat bestaan. De uitvoering kan zodanig zijn dat de plaat 54 op het snijpunt van de microscooplangsas en de optische as van het lenzensysteem 51 is geplaatst onder een hoek van 45® tot beide assen. In de hier weergegeven vaste uitvoering van de plaat 54 is deze met een microdoorboring van bijvoorbeeld 50 pm voorzien voor doorlating van de elektronenbundel, waardoor elektronenmicroscopie- en Ramanspectrometrie-metingen gelijktijdig mogelijk zijn. Bij een variant is de plaat 54 weg-klapbaar en dicht, d.w.z. zonder doorboring, uitgevoerd en zullen de elektronenbundel en de laserbundel voor de resp. metingen afwisselend passeren.

De met moderne microlasers opwekbare lichtbundels kunnen een hoge intensiteit met zeer smalle bandbreedte hebben. Tevens kan de laserbundel in doorsnede klein worden gemaakt waardoor de Ramanmicrospectroscopie in termen van oplossend vermogen die van de röntgenmicroanalyse benadert. De door de microlaserbron 50 via een glasvezel en objectieflens met hoge numerieke apertuur ingekoppelde lichtbundel wordt via de plaat 54 op het preparaat ingestraald. De vervolgens van het preparaat afkomstige Ramanstraling wordt door de plaat 54 afgebogen, uitgekoppeld en via de plaat 52 naar de Ramanspectrometer 53 geleid.

Bij een andere uitvoeringsvorm volgens de uitvinding, waarvan twee varianten in figuren 8a en 8b zijn weergegeven, is het laser- en Ramange-leidingssysteem op instelbare wijze naast de microscoopas geplaatst, waarbij het preparaat afzonderlijk daarmee kan worden uitgelijnd.

In figuur 8a is schetsmatig de ene variant bij een TEM aangegeven. Met 6l is de lensspoel, met 62 de poolschoen, met 63 de preparaatdrager met preparaat, met 65 het laser·· en Ramangeleidingssysteem, met 66 een laser- en Ramanlens en met 67 een optische vezel aangegeven. In figuur 8b is schetsmatig de andere variant bij «jen SEM aangegeven. Met 71 is de lensspoel, met 72 de poolschoen, met 73 de preparaatdrager met preparaat, met 75 bet laser- en Ramangeleidingssysteem, met 76 een laser- en Ramanlens en met 77 een optische vezel aangogeven, Bij de ene variant is bijvoorbeeld een klein deel van de pooJschoenen 62 weggenomen ten behoeve van de plaatsing van het systeem 65- Bij de andere variant is meer ruimte beschikbaar voor het systeem 75· In beide varianten is de preparaatdrager beweegbaar tussen de posities A en B, waardoor afwisselend metingen met de elektronendetector (en röntgendetector) in positie A en metingen met de Ramanspectroscoop in positie B kunnen worden verricht. In de laatste positie wordt via de optische vezel de laserbundel ingekoppeld en evenwijdig aan de microscooplangsas op het preparaat ingestraald en de van het preparaat afkomstige Ramanstraling uitgekoppeld.

De uitvinding kan met voordeel worden toegepast zowel in materiaalkunde als in de biologie. Bijvoorbeeld bij het vervaardigen van implantaten voor botweefsel is het van belang om de apatietkristallen, die in de anorganische matrix van botweefsel voorkomen en de kristallen in calcium-fosfaatkeramieken, die worden toegepast als botimplantaat, te karakteriseren. Daarnaast is het van belang om in proefdierexperimenten vast te stellen of, en zo ja in welke mate, veranderingen in de samenstelling van beide matrices optreden gedurende de implantatieperiode. Ook is het dan voordelig om de aard van eventuele degradatieprodukten, die ontstaan door de cellulaire afbraak, vast te stellen.

Het is met behulp van bovengenoemde uitvoering volgens de uitvinding met veel voordeel mogelijk om (delen van) een preparaat nauwkeurig te onderzoeken door gelijktijdige waarneming van het elektronenmicrosco-piebeeld op een eerste monitor, en het Ramanspectrum/spectroscopiebeeld op een tweede monitor, en eventueel aangevuld het röntgenanalysespec-trum/röntgenanalysebeeld op een derde monitor. Doordat de röntgenanalyse elementinformatie en de Ramananalyse molecuulinformatie verschaft kunnen op verrassende wijze beide worden gecombineerd, waardoor zowel het rönt-gensignaal als het Ramansignaal afzonderlijk beter kunnen worden geïnterpreteerd en ze elkaar versterken.

Met de boven aangegeven uitvoeringsvoorbeelden is het aantal te verwachten toepassingen voor molecuulherkenningssystemen in een elektronenmicroscoop buitengewoon groot.

Claims

1. Elektronenmicroscoop voorzien, in de langsasrichting gezien, van tenminste een elektronenbundelopweksysteem, een condensor- en objectief-lenzensysteem, een preparaatkamer, een projectielenzensysteem en een afbeeldingsscherm, welke elektronenmicroscoop bruikbaar is voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM), met het kenmerk, dat een lichtbron en in de optische as van de lichtbundel daarvan een bijbehorend lenzensysteem aanbrengbaar is, ten behoeve van Ramanspectroscopie, voor inkoppeling van een lichtbundel in - en uitkoppeling van preparaatbetrokken Ramanstraling uit - de preparaatkamer, en dat op de optische as in de microscoop een lichtbundel- en Ramanstraling geleidingssysteem is geplaatst om de lichtbundel naar - en de Ramanstraling vanaf - het preparaat te geleiden.

2. Elektronenmicroscoop voorzien, in de langsasrichting gezien, van tenminste een elektronenbundelopweksysteem, een condensor- en objectief-lenzensysteem, een preparaatkamer, en een elektronendetector, welke elektronenmicroscoop bruikbaar is voor scanning elektronenmicroscopie (SEM), met het kenmerk, dat een lichtbron en in de optische as van de lichtbundel daarvan een bijbehorend lenzensysteem aanbrengbaar is, ten behoeve van Ramanspectroscopie, voor inkoppeling van een lichtbundel in - en uitkoppeling van preparaatbetrokken Ramanstraling uit - de preparaatkamer, en dat op de optische as in de microscoop een lichtbundel- en Ramanstraling geleidingssysteem is geplaatst om de lichtbundel naar - en de Ramanstraling vanaf - het preparaat te geleiden.

3· Elektronenmicroscoop volgens conclusie 1 of 2, waarin het lichtbundel- en Ramanstraling geleidingssysteem een optisch element bevat dat is geplaatst op het snijpunt van de microscooplangsas en de optische as. k. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 1 of 2, waarin het lichtbundel" en Ramanstraling geleidingssysteem naast de microscooplangsas is geplaatst, en de houder voor het preparaat daarmee kan worden uitgelijnd.

5. Elektronenmicroscoop volgens conclusie waarin het lichtbundel- en Ramanstraling geleidingssysteem een optisch element bevat dat is geplaatst op de optische as.

6. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 4, waarin de lichtbundel via een optische vezel naar het lichtbundel- en Ramanstraling geleidings-systeem wordt gevoerd, waarbij de uittredende lichtbundel evenwijdig aan de microscooplangsas invalt op het preparaat.

7. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 3 of 5. waarin het Raman-spectroscopie-lenzensysteem buiten de preparaatkamer is geplaatst zodanig dat de optische as loodrecht staat op de microscooplangsas, waarbij het optische element onder een hoek van ^5° ten opzichte van beide assen staat.

8. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 3 of 5. waarin het optische element een reflectieplaat is.

9. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 3 en 8, waarin de reflectieplaat wegklapbaar is om afwisselend de elektronenbundel te laten passeren en de lichtbundel en de Ramanstraling af te buigen.

10. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 3 en 8, waarin de reflectieplaat vast is uitgevoerd en ter plaatse van het snijpunt van de microscooplangsas en de optische as een microdoorboring heeft om, simultaan of afwisselend, de elektronenbundel te laten passeren en de lichtbundel en de Ramanstraling af te buigen.

11. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 1, waarin in het Raman-spectroscopie-lenzensysteem op de optische as een halfdoorlatende reflectieplaat is geplaatst om de Ramanstraling af te buigen naar een Raman-spectrometer.

12. Elektronenmicroscoop volgens conclusie 1, waarin de lichtbron een microlaser is.

13· Elektronenmicroscoop volgens conclusie 1, waarin in de preparaatkamer een röntgenmicroanalysedetector is geplaatst voor opname van in het preparaat opgewekte röntgenstraling.