NL8004751A

NL8004751A - Werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel tegen kanker, het aldus bereide geneesmiddel en een werkwijze voor het bereiden van de actieve stof uit een plantenrest.

Info

Publication number: NL8004751A
Application number: NL8004751A
Authority: NL
Original assignee: Zenyaku Kogyo Kk
Priority date: 1979-08-23
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1981-02-25
Also published as: PL226369A1; FR2463620A1; CA1144917A; IT1141617B; DE3031745A1; IT8068313A0; SE8005919L; GB2060379A

Description

-1- 21489/Vk/jl

Aanvrager: Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha, Tokio, Japan.

Korte aanduiding: Werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel tegen kanker, het aldus bereide geneesmiddel en een werkwijze voor het bereiden van de actieve stof uit een planten-5 rest.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel tegen kanker op basis van een plantenrest als actief middel door de plantenrest te mengen met hulpstoffen tot een voor 10 geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm. De uitvinding heeft verder betrekking op een geneesmiddel tegen kanker op basis van plantenresten ‘die met hulpstoffen zijn gebracht in een voor geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm en op een werkwijze voor het bereiden van een actieve stof tegen kanker uit een plantenrest.

15 De werkwijze voor de bereiding van het geneesmiddel wordt hier door gekenmerkt, dat als actief middel resten worden gebruikt van Marsde-nia cunduraneo Reichenbaeh fil. verkregen door extraheren en uit bepaalde elueerfracties door de extracten te onderwerpen aan hogedruk-vloeistofchro-* matografie.

20 Marsdenia cundurango Reichenbaeh fil. behoort tot de familie van Asclepiadaceae en is een heester in de vorm van een klimplant die in de natuur voorkomt op eB tussen de bergen in het noordwesten van Zuid-Amerika.De schors hiervan wordt gebruikt als een aromatisch maar bitter middel tegen maagpijn bij spijsverstoringen :.en/of anorexia, gewoonlijk in 25 de vorm van een vloeistofextract (commentaar uit de negende Japanse Pharmacopeia) .

De componenten van de schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. omvatten condurangogenin-A, condurangogenin-C en een groot aantal andere pregnaantype verbindingen en esters daarvan en glycociden en de extrac-30 tie, afscheiding, structuren en dergelijke van deze stoffen zijn bijvoorbeeld vermeld in de volgende literatuur:, hoewel nadere bijzonderheden hieromtrent ten opzichte van een groot aantal punten nog onduidelijk zijn.

R. Tschesche et. al., Tetrahedron, 2Λ_, bladzijde 1777 ( 1965); 21, bladzijde 1797 (1965); 23 , bladzijde 1461 (1967); en 24 , bladzijde 35 4359 (1968). M Pailer et al., Monatshefte für>Chemie, 106, bladzijde 37 (1975). Hiroschi Mitsuhashi et al., Chem. Pharm. Buil. , bladzijde 2522 (1968).

Uit de gedane onderzoekingen is gevonden dat bepaalde extracten 80 0 4 75 1 -2- 21489/Vk/ts van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. en bepaalde elueerfracties, verkregen door de extracten te onderwerpen aan hogedruk-vloeistofchromatogra-fie, hierna aangegeven als HPLC, een anti-tumorwerking hebben.

Zodoende zijn nieuwe extracten van Marsdenia cundurango Reichenbach 5 fil. verkregen en een werkwijze voor de bereiding hiervan, welke stoffen gebruikt kunnen worden als anti-tumor middelen. De extracten bestaan hoofdzakelijk uit dat deel van Marsdenia cundurango Reichenbach fil., dat oplosbaar is in lagere alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen afwijkend van tetrachloorkoolstof en onoplosbaar in alifatische koolwaterstoffen., 10 tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen.

Bij het uitvoeren van de werkwijze ter verkrijging van de actieve stof, gaat men bij voorkeur uit van de schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. .Deze schors is in de handel verkrijgbaar, maar wordt bij voorkeur goed gedroogd en fijn verdeeld zo snel mogelijk na het verzamelen 15 van de schors.

Met het oog op de aard en de bereiding van de extracten, is de volgorde waarin de oplosmiddelen worden toegepast niet kritisch en deze volgorde kan desgewenst.,, worden gevarieerd. Een bij voorkeur toegepaste werkwijze vólgens de uitvinding is de volgende.

20 Eerste bewerking.

Marsdenia cundurango Reichenbach fil. , met name de schors wordt fijn verdeeld en geëxtraheerd met een organisch oplosmiddel en het extract wordt ingedampt tot droog onder verlaagde druk. Als organisch oplosmiddel kan worden toegepast methanol, ethanol, isopropanol of een andere lagere 25 alcohol, maar methanol verdient de voorkeur. Voordat de extractie wordt uitgevoerd, kan Marsdenia cundurango Reichenbach fil. worden ontvet met een alifatische koolwaterstof, zoals pent'aan, hexaan, heptaan, ligrolne of petroleumether. Deze voorbehandeling wordt desgewenst uitgevoerd onder toepassing van hexaan in een hoeveelheid van 4-7 keren het gewicht van 30 Marsdenia cundurango Reichenbach fil.. Volgens een uitvoeringsvorm van deze extractie wordt de extractie uitgevoerd door het uitgangsmateriaal in het oplosmiddelmengsel bij kamertemperatuur gedurende meerdere tot tientallen uren te laten staan. Vervolgens wordt het mengsel afgefiltreerd ter verkrijging van een filtraat. Het residu wordt meerdere keren onder-35 worpen aan eenzelfde extractie-filtratie en al het filtraat wordt gecombineerd en ingedampt tot droog onder verlaagde druk ter verkrijging van een extract.

De extractie wordt gewoonlijk uitgevoerd bij normale temperatuur, 80 0 4 75 1 « Λ -3- 21489/Vk/ts maar het is ook mogelijk om de extractie uit te voeren bij een verhoogde temperatuur om de extractietijd te verkorten. Deze extractie onder verwarmen wordt bij voorkeur uitgevoerd op een waterbad bij een waterbadtemperatuur van 35-55 °C gedurende 4-6 uren onder toepassing van een terugvloeikoeler.

5 Deze extractie kan worden uitgevoerd in overeenstemming met de percolatie-methode.

De hoeveelheid oplosmiddel die wordt toegepast is 2-5 keren het gewicht van de schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil..Het extractie-residu wordt bij voorkeur onderworpen aan een extractie onder dezelfde om-10 standigheden hetgeen drie of meer keren wordt herhaald onder toepassing van het oplosmiddel in een hoeveelheid die overeenkomt met 0,4-08 keren de hoeveelheid oplosmiddel die eerst is toegepast.

De afscheiding kan worden uitgevoerd door filtratie over papier, centrifuren of dergelijke. Betere resultaten worden echter verkregen door 15 de afscheiding te bewerkstelligen door filtratie onder verlaagde druk, onder toepassing van in de handel verkrijgbare filtratiehulpstukken, zoals bijvoorbeeld Radiolite ( Showa Chemical Industry Co., Ltd. in Japan), Celite ( Wako Junyaku Industry ...Co., Ltd. in Japan), Fibra Cel ( Johns Manville Co.,

Ltd., U.S.A.).

20 Het verlagen van de druk wordt op gebruikelijke wijze bewerkstel ligd, bijvoorbeeld met behulp vai een een waterstraalpomp, vacuümpomp of dergelijke.

Als extractievat kan een vat worden gebruikt dat bekleed is met glas of met een geëmailleerd binnenoppervlak of van roestvrij staal.

25 Tweede bewerking.

Aan het extract, dat verkregen is bij de eerste bewerking wordt toegevoegd een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkool-stof, zoals chloroform of dichloormethaan, gevolgd door sterk schudden ter verwijdering van het onoplosbare gedeelte. Het onoplosbare gedeelte 30 wordt herhaaldelijk aan dezelfde bewerking onderworpen. De resterende oplossingen worden gecombineerd en ingedampt tot droog onder verlaagde druk, hetgeen direkt kan gebeuren of na filtratie onder afzuiging. De hoeveelheid toegepast oplosmiddel is 2-6 keren de hoeveelheid van het extract dat verkregen is bij de eerste bewerking. De respectievelijke residuen worden 35 bij voorkeur onderworpen aan dezelfde bewerking, hetgeen 4 of 5 keren wordt uitgevoerd, onder toepassing van het oplosmiddel in een hoeveelheid van 0,2-0,4 keren het volume van het eerst toegepaste oplosmiddel. De filtratie onder afzuiging kan worden uitgevoerd op dezelfde wijze als bij de egrste 80 0 4 75 1 -it- 21489/Vk/ts bewerking.

Derde bewerking.

Het extract dat is verkregen bij de tweede bewerking wordt opgelost in een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkoolstof, 5 zoals chloroform of dichloormethaan in een minimale hoeveelheid die noodzakelijk is om het eerste mengsel volledig op te lossen. Aan de verkregen oplossing wordt een alifatische koolwaterstof toegevoegd, zoals pentaan, n-hexaan of heptaan in een hoeveelheid die twee tot vier keren de volume-hoeveelheid is van de eerst toegepaste hoeveelheid, gevolgd door goed 10 roeren en het mengsel wordt gedurende enkele uren tot enkele tientallen uren bewaard om het onoplosbare gedeelte te verzamelen. Ook is het mogelijk om .tetrachloorkoolstof of een aromatische koolwaterstof zoals tolueen of benzeen toe te voegen aan het extract, hetgeen direkt kan plaats hebben in een hoeveelheid die gelijk is aan of tot drie keer de hoeveelheid van de 15 laatst toegepaste vloeistof en vervolgens worden opgewerkt tot de bovenvermelde stof zodat het onoplosbare gedeelte kan worden verzameld.

Het onoplosbare gedeelte wordt vervolgens herhaaldelijk aan dezelfde bewerking ondërworpen. Deze bewerking wordt bij voorkeur twee of drie keren uitgevoerd, elke keer onder toepassing van het oplosmiddel in een 20 hoeveelheid van 0,4 tot 0,6 keer de volumehoeveelheid van het oplosmiddel5 dat eerst is toegepast. Het aldus verkregen onoplosbare gedeelte wordt goed gedroogd bij een temperatuur van 50 °C of minder onder verlaagde druk en vervolgens fijn gemaakt ter verkrijging van een extract dat lijkt op een bruin poeder, dat hierna wordt aangegeven als extract A.

25 Het verzamelen van het onoplosbare gedeelte kan worden uitgevoerd door decanteren, filtratie onder afzuiging of centrifugeren.

Teneinde de totale kosten van de werkwijze volgens de uitvinding te minimaliseren en om de bewerking makkelijker uit te voeren wordt fijn verdeeld Marsdenia oundurango Reichenbach fil.,bijvoorbeeld in de vorm van 30 de schors, eerst geëxtraheerd met een alifatisch keton zoals aceton of jaethylethylketon ,een lagere alifatische ester zoalsnethylacetaat, ethyl-acetaat,of butylacetaat, een ether zoals diethylether, tetrahydrofuran of dioxan of met heet water of bij verhoogde temperatuur behandeld ( 110-130 °C gedurende 30 minuten of langer), direkt gevolgd door de extractie met 35 water of een waterige lagere alcohol en vervolgens kan het extract worden onderworpen aan de bovenvermelde drie bewerkingen. Hierbij kan de extractie op dezelfde wijze worden uitgevoerd als de eerstvermelde bewerking. Gewoonlijk is ^-glyccsi.dase, dat in staat is om de glucosebindingen van gjfcyco-siden te breken, aanwezig in de extracten van planten en dit enzym wordt 80 0 4 75 1 ·' « -5- 21489/Vk/ts geactiveerd in aanwezigheid van water. Daarom is de behandeling bij verhoogde temperatuur vereist wanneer water of een waterige lagere alcohol wordt toegepast.

Het aldus verkregen extract A is een mengsel van zes componenten 5 die karakteristieke pieken geven in de figuren zoals weergegeven in fig.

1-17 van de bijgevoegde tekening, wanneer deze onderworpen worden aan analytische HPLC en deze extracten hebben een anti-tumoractiviteit.

Vierde bewerking.

Teneinde een meer actief deel te verkrijgen uit extract A, wordt 10 het opgelost in chloroform in een minimale hoeveelheid die noodzakelijk is om een volledige oplossing te verkrijgen en aan de verkregen oplossing wordt toegevoegd n-hexaan in een zodanige hoeveelheid, dat de oplossing niet troebel wordt. Het verkregen monster van de oplossing wordt onderworpen aan normate fase HPLC ter verzameling van stof (eluens : een mengsel van 15 n-hexaan/chloroform/methanol met een volumeverhouding van 6:3:1). Wanneer de elueerpieken worden onderzocht met een detector kunnen twee fracties worden gekozen op basis van de pieken overeenkomend met Fr-2 en Fr-3 fracties weergegeven in de grafieken zoals fig. 18, van de bijgevoegde tekening, die eerst zijn verkregen door de eerder uitgevoerde testen, waarbij deze 20 fracties zijn verzameld en vervolgens worden deze ingedampt tot droog ter verkrijging van extracten.

Anderzijds kan extract A , verkregen bij de derde bewerking worden onderworpen aan de open kolom-methode waarbij een elueerbewerking wordt toegepast, achtereenvolgens met chloroform en een mengsel van chloroform 25 en methanol ( volumeverhouding 97 : 3 - 95 : 5) ter verwijdering van het minder polaire gedeelte en vervolgens elueren met een mengsel van chloroform en methanol (volumeverhouding 93 ’ 7) ter verkrijging van twee fracties overeenkomend met de bovenvermelde fracties Fr-2 en Fr-3· Hierbij correspondeert gewoonlijk de eerste helft van het eluaat met fractie Fr-2 en de twee-30 de helft met fractie Fr-3, maar de volumeverhouding van de twee fracties is bij voorkeur 60 : *10.

Vervolgens wordt het extract overeenkomend met fractie Fr-2 zoals boven aangegeven onderworpen aan de normale fase HPLC voor massaver-zameling ( eluens: een mengsel van n-hexaan/chloroform/methanol in een 35 volumeverhouding van 6 : 1 : 1). De elueerpieken kunnen worden bepaald met behulp van een detector, waarbij fracties worden gekozen op basis van-.-de' pieken overeenkomend met Fr-2-1 en Fr-2-2 fracties, weergegeven in fig. 19, verkregen bij eerder uitgevoerde testen en verzameld en elke fractie wordt 80 0 4 75 1 -6- 21489/Vk/ts ingedampt tot droog ter verkrijging van een wit poederachtig extract, hierna aangegeven als extract B-1 en extract B-2.

Anderzijds wordt het extract overeenkomend met Fr-3-fractie onderworpen aan de omgekeerde fase HPLC voor massaverzameling ( eluens : 65-75 5 vol. % waterige methanoloplossing). De elueerpieken kunnen worden bepaald met een detector,waarbij de fracties kunnen worden gekozen op basis van de piekhoogte overeenkomend met Fr-3-1, weergegeven in fig. 22, eerst verkregen door eerder uitgevoerde testen waarbij deze zijn verzameld en ingedampt tot droog ter verkrijging van een wit poedervormig extract, dat hierna· 10 wordt aangegeven als extract B-3.

De aldus verkregen extracten volgens de uitvinding hebben de volgende karakteristieke punten.

1) Eigenschappen: a) Extract A is een bruin poeder terwijl extract B-1, B-2 en B-3 15 een wit poeder is. Deze poeders smaken bitter en geven een kaneelzuurachtige geur wanneer een natronloogoplossing hieraan wordt toegevoegd en het mengsel wordt verwarmd.

B) De oplosbaarheid ( extracten A, B-1, B-2 en B-3). .

Oplosbaar in lagere alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen, 20 behalve tetrachloorkoolstof.

Onoplosbaar in alifatische koolwaterstoffen, tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen.

2) U.V.-spectra ( extracten A, B-1, B-2 en B-3).

λ. * 280 nra in methanol.

max 25 3) Massaspectra ( extracten A, B-1, B-2 en B-3).

Geven een basispiek van een kaneelzuurkation bij m/e = 131 en een ionpiek van acetylkation bij m/e = 43.

Zodoende wordt de aanwezigheid van kaneelzuur en azijnzure esters in de extracten verondersteld.

30 4) Vloeistofchromatografie.

Omstand igh ed en.

Vulmiddel: silicagel (Wako-gel LC-5H-volledig poreus, fijngemaakt type, 5 ^i, bereid door Wako Junyako Co., Ltd. in Japan).

Kolom: inwendige diameter x lengte is 4 mm x 200 mm.

35 Elueermiddel: een mengsel van n-hexaan/chloroform/methanol (volume- verhouding a 7 : 2 : 1)

Stroomsnelheid : 1,5 ml/minuut 2

Druk: 30 kg/cm 80 04 75 1 * « -7- 21489/Vk/ts

Bepaling: bij Ü.V. = 280 nm ( 0,64 AUPS)

Onder de bovenvermelde omstandigheden werd 20 mg van elk van de extracten A, B-1, B-2, B-3 opgelost in 10 ml chloroform en onderworpen aan vloeistof chroma tograf ie. De verkregen karakteristieke figuren zijn weer-5 gegeven in fig. 1, 20-21 en 23» waarbij de gegevens betrekking hebben op de verbindingen verkregen uit extract A bereid in voorbeeld I, extract B-1 en B-2, bereid volgens voorbeeld XVIII en extract B-3 bereid in voorbeeld XIX.

5) Kleurreactie ( extracten A, B-1, B-2 en B-3).

10 Keiler Kiliani reactie ( Helvetic Chimica Acta., 31 , bl .. 883 ' (1948)): positief ( groenbruin) ' · . Liebermann Burchard reactie ( Iwanami’s Dictionary of Physics and Chemistry, 3e editie, blz. 1411 (1977)): positief (blauw-groen).

Zodoende wordt aangenomen dat de extracten in hoofdzaak bestaan uit 15 stereoïde glyccsi'.den met 2,6-deoxysuikereenheden.

De anti-tumoractiviteit van de extract® volgens de uitvinding werd bevestigd door het uitvoeren van experimenten die hieronder nader zijn toegelicht.

Twee typen tumoren Sarcoma-180 en Ehrlich carcinoma, werden gebruikt 2Q ter bepaling van de anti-tumoreigenschappen en de onderzochte tumoren waren van het subcutane tuberkel type. De groep van dieren waaraan de extracten volgens de uitvinding werdί.toegediend bestond uit zeven muizen terwijl de vergelijkende groep bestond uit tien muizen.

Test-methode.

25 1). Sarcoma-180.

De onderzochte dieren waren zes weken oude ICR-vrouwelijke muizen met een lichaamsgewicht van 30-32 g..

De tumor werd intraperitoneaal getransplanteerd in. de muis. Op de zevende dag na de transplantatie werden de goed gegroeide tumorcellen ver-wijderd en 4 x 10^ cellen werden vervolgens subcutaan getransplanteerd in het inguinale deel van de muis ter vorming van vaste tumoren. Na 24 uren gerekend vanaf de transplantatie en later werden de extracten volgens de uitvinding, opgelost in een fysiologische zoutoplossing intraperitoneaal aan de muizen toegediend.

25 Het volume van de respectievelijke oplossingen die toegediend wer den aan een muis was per keer 0,2 ml en de toediening werd gedurende 10 dagen voortgezet in een hoeveelheid van een keer per dag. Aan de vergelijkende groep muizen werd alleen een fysiologische zoutlopiossing toegediend.

Op de dertigste dag na de transplantatie werden de tumoren verwij- -8- 21489/Vk/ts derd om het gemiddelde gewicht te meten van de tumor van de muis in de groep, van dieren die behandeld waren met het extract volgens de uitvinding ( T) en die van de vergelijkende groep (C) ter berekening van T/C (%).

2) Ehrlich carcinoma.

5 De voor de experimenten toegepaste dieren waren zes weken oude ddY vrouwelijke muizen met een gewicht van 28-30 g.

De tumor werd intraperitoneaal getransplanteerd in de muizen . Op de zevende dag na de transplantatie werden de goed gegroèide tumorcellen verwijderd en 1,5 x 10^ cellen hiervan werden subcutaan getransplanteerd in 10 het inguineale deel van de muis ter vorming van Vaste tumoeen en vervolgens behandeld zoals beschreven bij Sarcoma-180 om de T/C-waarde (%) te berekenen.

De hierbij verkeegen gegevens zijn samengevat in tabel A.

80 0 4 75 1 * 4 -9- 21489/Vk/ts

Tabel A.

extract uit dosering tien T/C (%) voorbeeld keer ( rag/kg) Ëhrïich Γ” „n carcinoma ^ooma-180 5 A/I 40 34,1 15,2 A/III 40 39, 0 23 T 5 A/IV 40 32,3 35,2 10 A/V 40 44,7 31r 0 A/VI 40 40,1 39,3 A/VII 40 38,5 41,3 A/VIII 40 13»5 19 »8 15 Α/Ιχ lio 15 39>8 A/X 22,8 26,6 A/XI 40 . .. 32,1 40»° A/XII 40 30» 5 32}7 20 A/Xlïl 40 .40,3 28,4 A/XV 40 30 >0 22,2 A/XVII 40 23,1 19,0 B-1 /XVIII 15 24,3 13,6 25 B-2/XVIII 15 2 9,8 5,0 B-3/XIX 15 31,0 2 0,0 B-.1/XX 15 18,0 9,2 30 B-2/xx 15 21,0 4,7 B-3/m 15 3 0,3 15,2 8 0 0 4 75 1 35 -10- 21489/Vk/ts

Vervolgens werden de extracten volgens de uitvinding toegediend aan vijf weken ouden ddY vrouwelijke muizen met een lichaamsgewicht van 21-35 g, welke toediening intraperitoneaal werd uitgevoerd om de acute toxische waarden ( LD^) te bepalen. De hierbij verkregen resultaten 5 zijn samengevat in tabel B.

Tabel B.

I aMMMMM-MMBMMiW··· ......... > “ ' ’ extract uit voorbeeld LD (mg/kg) _5 Q _^_

A/I i+OO

10 A/VIII 1+15 A/XII 3 98 B-1/XVIII 610 15 B-2/XVIII 78 B-3/XIX 382 B-1/XX 608 B-2/XX 8 0 2C B-3/XXI 370

De extracten volgens de uitvinding kunnen oraal aan de mens worden toegediend, door injectie (intraveneus, subcutaan of intramusculair) of op 25 een andere wijze.

Wanneer de extracten volgens de uitvinding worden toegepast in· de vorm van een vast preparaat voor orale toediening, kan dit gebeuren met preparaten zoals tabletten, granules, poeders, capsules of dergelijke. De preparaten kunnen ook additieven bevatten zoals een hulpstof, met name een 30 saccharide of cellulosepreparaat, een bindmiddel zoals zetmeefcasta of methyl-cellulose, een vulmiddel, een desintegratiemiddel en dergelijte» welke stoffen gewoonlijk worden toegepast bij de bereiding van geneeskundige preparaten. Wanneer de extracten volgens de uitvinding worden toegepast ter verkrijging van een vloeistof die oraal kan worden toegedien, kan het pre-35 paraat gekozen worden uit een waterhoudend preparaat voor inwendig gebruik, suspensie, emulsie, stroop en dergelijke en verder in de vorm van gedroogde produkten die voor gebruik kunnen worden opgelost.

Wanneer de extracten volgens de uitvinding oraal worden toegediend aan volwassenen, kunnen de extracten worden toegepast in een dosering van 80 0 4 75 1 * * -11- 21489/Vk/ts 3,0-30,0 mg/kg (extract A) , 1,2-48,0 mg/kg (extract B—1), 1,2-6,0 mg/kg (extract B-2),of 1,2-30,0 mg/kg (extract B-3) per dag. De dosering kan natuurlijk worden verhoogd of verlaagd in afhankelijkheid van de omstandigheden van de ziekte, de ouderdom van de patiënt, de vorm van het prepa-5 raat en dergelijke.

De extracten volgens de uitvinding kunnen worden geïnjecteerd in de vorm van een waterige oplossing, suspensie of oliehoudende of waterige emulsie, maar gewoonlijk worden de injecties bereid door de actieve stof op te lossen of te suspenderen in een waterig medium zoals steriel water of een 10 fysiologische zoutoplossing. Indien noodzakelijk kunnen conventioneel toegepaste oplosmiddelen worden toegepast, evenals stabilisatoren, verduurza-mingsmiddelen, additieven ter bereiding van isotone oplossingen en dergelijke welke hulpstoffen kunnen worden toegevoegd aan de injecteerbare vloeistof.

De aldus verkregen injecteerbare preparaten worden intraveneus, 15intramusaulair, subcutaan of op een andere geschikte wijze toegediend.

Wanneer de injecties parenteraal aan volwassenen worden toegediend, kunnen deze 1,0-10,0 mg/kg extract A per dagtkrijgen toegediend of 0,4-16,0 mg/kg extract B-1, 0,4-2,0 mg/kg extract B-2 of 0,4-10,0 mg/kg extract B-3.

Dit gehalte kan natuurlijk worden verhoogd of verlaagd in afhankelijkheid 20 van de omstandigheden van de ziekte, de leeftijd van de patiënt, de vorm van het preparaat, de wijze van toediening en dergelijke.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, waarbij verwezen is naar de bijgevoegde tekening, waarin: fig. 1 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract 25a, verkregen volgens voorbeeld I, te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 2 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract A, verkregen in voorbeeld II te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 3 geeft een chromatogram weer dat verkregen is van extract A, verkregen in voorbeeld III door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

3° fig. 4 geeft een chromatogram weer van extract A, verkregen in voorbeeld IV door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 5 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld V door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 6 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in 35 voorbeeld VI door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 7 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld VII door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 8 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in -12- 21489/Vk/ts voorbeeld VIII ? door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 9 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld IX door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 10 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in 5 voorbeeld X door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 11 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XI door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 12 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XII door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

10 fig. 13 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XIII door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 14 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld Χ1Γ door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 15 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in 15 voorbeeld XV door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 16 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XVI door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 17 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XVII door dit te onderwerpen aan analytisch HPLC.

20 fig. 18 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract A verkregen in voorbeeld I te onderwerpen aan HPLC voor massaverzameling.

fig, .19 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door fractie Fr-2, aangegeven in fig. 18, te onderwerpen aan HPLC voor massaverzameling. fig. 20 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract 25 B-1, verkregen volgens voorbeeld XVIII te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 21 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract B-2, verkregen in voorbeeld XVIII te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 22 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door de Fr-3 fractie, aangegeven in fig. 18, te onderwerpen aan HPLC voor massa-30 verzameling.

fig. 23 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract B-3 verkregen in voorbeeld XIX te onderwerpen aan analytische HPLC.

fig. 24 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract B-1 verkregen in voorbeeld XX, te onderwerpen aan analytische HPLC.

35 fig. 25 geeft een chromatogram weer dat is verkregen door extract B-2, verkregen in voorbeeld XX te onderwenpen aan analytische HPLC.

fig. 26 geeft een chromatogram weer dat is verkregen door extract B-3 verkregen in voorbeeld XXI te onderwerpen aan analytische HPLC.

80 04 75 1 -13- 21489/Vk/ts t v VOORBEELD I.

1 1 Methanol werd toegevoegd aan 500 g fijn verdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. en het mengsel werd gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel afgefil-5 treerd en het residu werd op dezelfde wijze nogmaals drie keren behandeld, waarbij elke keer 0,75 1 methanol werd toegepast.

Alle filtraten werden gecombineerd en vervolgens ingedarapt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 69 g extract. Aan dit extract, overgebracht in een scheidtrechter, 10 weid toegevoegd 150 ml chloroform, waarna het mengsel flink werd geschud en vervolgens werdJeen chloroformlaag verkregen. Aan het residu werd 50 ml chloroform toegevoeg^, welke bewerking nogmaals drie keren weid uitgevoerd.

Alle chloroformextracten werden gecombineerd en vervolgens onderworpen aan filtratie onder afzuiging onder toepassing van een Fibra-Cel BH-40 ( Johns 15 Manville Co., Ltd.) als filtratiehulpstof. Het verkregen filtraat werd tot droog ingedampt bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 42 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform, dat hieraan weid toegevpegd, waarna 100 ml n-hexaan werd toegevoegd. Het verkregen mengsel werd goed geroerd en werd daarna gedurende 12 uren be-SOwaard. Vervolgens werd het gedecanteerd ter verkrijging van het onoplosbare gedeelte. Dit gedeelte werd opgelost in 25 ml chloroform, waarna 50 ml n-hexaan werd toegevoegd en de oplossing werd goed geroerd en werd gedurende 2 uren bewaard. De oplossing werd onderworpen aan decantatie ter verkrijging van het onoplosbare gedeelte en vervolgens op dezelfde wijze zoals 25 boven is aangegeven nogmaals drie keren bewerkt. Het uiteindelijk verkregen onoplosbare gedeelte werd gedroogd bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk gedurende 6 uren en fijn gemaakt ter verkrijging van 18 g bruin poedervormig extract A.

Het aldus bereide extract A in een hoeveelheid van 20 mg werd opge-30 lost in 10 ml chloroform en de verkregen oplossing werd onderworpen aan analytische HPLC ( vulmiddel silicagel-Wako-gel LC-5H, bereid door Wako Junyaku Industry Co, Ltd.,volledig poreus, fijn gemalen stof, 5yun, in een kolom met een binnendiameter x lengte van 4 mm x 200 mm en als elueer-middel werd een mengsel gebruikt van n-hexaan/chloroform/methanol in .een 35 vólumeverhouding van 7:2: 1. De stroomsnelheid bedroeg 1,5 ml/minuut 2 en de druk 30 kg/cm en de bepaling had plaats bij U.V. licht van 280 nm (0,64 AUFS)). De hierbij verkregen gegevens zijn weergegeven in het chromatogram van fig. 1.

an n l 7* 1 -14- 21489/Vk/ts VOORBEELD II.

Op dezelfde wijze als het eerste gedeelte van de bewerking in voorbeeld I is uitgevoerd werd nu 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. geëxtraheerd met chloroform.

5 De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk, ter verkrijging van 46 g extract. Aan dit extract werd 100 ml methanol toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en vervolgens afgefiltreerd. Het residu, teet hieraan toegevoegd 30 ml methanol, werd nogmaals 4 keren behandeld op een wijze zoals boven 10 is aangegeven. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 24 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform die hieraan werd toegevoegd en vervolgens verder behandeld zoals aangegeven in voorbeeld I ter verkrijging van 13 g bruin poedervormig extract A. De gegevens 15 met betrekking tot dit extract na het te hebben onderworpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 2.

VOORBEELD III. .

Hierbij ging men tewerk op dezelfde manier als aangegeven in voor-20 beeld I, doch onder toepassing van ethanol in plaats van methanol in de eerste bewerking, zodat 14,1 g poedervormig bruin extract A werd verkregen.

De gegeveis met betrekking tot dit extract A wanneer dit is onderworpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als vermeld in voorbeeld I zijn weergegeven in fig. 3.

25 VOORBEELD IV.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald waarbij echter isopropanol werd toegepast in plaats van methanol in de eerste •bewerking, zodat 13,7 g bruin poedervormig extract A werd verkregen.

De gegevens met betrekking tot extract A, onderworpen aan HPLC, 30 onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn vermeld in fig. 4.

VOORBEELD V.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald onder toepassing echter van dichloormethaan in plaats van chloroform bij de twee-35 de bewerking, zodat 16 g bruin, poedervormig extract A werd verkregen.

De gegevens met betrekking tot dit extract A na HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I zijn weergegeven in fl8'5' 80 0 4 75 1 -15- 21489/Vk/ts VOORBEELD VI.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald, waarbij echter pentaan werd gebruikt in plaats van n-hexaan in de derde bewerking, zodat 15,9 g bruin, poedervormig extract A werd verkregen.

5 De gegevens die verkregen zijn door dit extract A te onderwerpen aan een HPLC -bewerking onder omstandigheden zoals aangegeven in voorbeeld I, zijn samengevat in fig. 6.

VOORBEELD VII.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald, waar-10 bij echter heptaan werd gebruikt in plaats van n-hexaan bij de derde bewerking, zodat 16,8 g bruin, poedervormig extract A werd verkregen.

De gegevens met betrekking tot de HPLC-bewerking van dit extract A onder dezelfde omstandigheden als vermeld in voorbeeld I zijn weergegeven in fig. 7.

15 voorbeeld VIII.

Aan 40 g extract verkregen door het uitvoeren van de eerste en tweede bewerking zoals vermeld in voorbeeld I werd toegevoegd 50 ml tetra-ohloorkoolstof en het mengsel werd goed geroerd en gedurende 12 uren bewaard. Vervolgens werd het mengsel onderworpen aan decantatie ter verkrij-20 ging van het onoplosbare gedeelte. Aan dit onoplosbare gedeelte werd 25 ml tetrachloorkoolstof toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en werd gedurende 5 uren bewaard. Het mengsel werd onderworpen aan decantatie ter verkrijging van het onoplosbare gedeelte, dat vervolgens op dezelfde wijze nogmaals twee keren werd behandeld. Het uiteindelijk verkregen onoplosbare 25 deel werd gedroogd bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk gedurende 6 uren en fijngemaakt ter verkrijging van 17,4 g bruin, poedervormig extract A.

De gegevens die verkregen zijn door dit extract A te onderwerpen aan HPLC, onder dezelfde ^omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, 30 zijn weergegeven in fig. 8.

VOORBEELD IX.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld XVIII werd herhaald,waarbij echter tolueen werd gebruikt in plaats van tetrachloorkoolstof in de derde bewerking , zodat 12,3 g bruin, poedervormig extract A werd verkre-35 gen.

De gegevens met betrekking tot dit extract A na een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergege- ïenlnfl8·9 80 0 4 75 1 -16- 21489/Vk/ts VOORBEELD X.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld VIII werd herhaald waarbij echter benzeen wérd gebruikt in plaats van tetrachloorkoolstof in de derde bewerking, zodat 16,4 g bruin, poedervormig extract A werd 5 verkregen.

De gegevens met betrekking tot dit extract A, onderworpen aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn vermeld in fig. 10.

VOORBEELD XI.

10 . De werkwijze die aangegeven is in de eerste stap van voorbeeld I

werd herhaald waarbij 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd geëxtraheerd met aceton. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 43 g extract.

15 Aan dit extract werd toegevoegd 100 ml methanol en het mengsel werd goed geroerd en afgefiltreerd. Aan het residu werd 30 ml methanol toegevoegd en nogmaals vier keren bewerkt zoals boven is aangegeven. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 22 g extract. Aan het 20 extract werd 150 ml chloroform toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en afgefiltreerd. Aan het residu werd 50 ml chloroform toegevoegd en dit werd op dezelfde wijze als boven aangegeven nogmaals drie keren bewerkt. Alle filtraten werden gecombineerd en onderworpen aan filtratie onder afzuiging onder toepassing van Fibra Cel.BH-40 ( Johns Manville Co., Ltd) als 25 filtratiehulpstof en het verkregen filtraat werd ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 20 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform dat hieraan werd toegevoegd en vervolgens opgewerkt zoals aangegeven in voorbeeld I, ter verkrijging van 11,3 g bruin, poedervormig extract A.

30 De gegevens met betrekking tot dit extract A nadat het onderworpen is aan een HPLC-bewerking , onder omstandigheden zoals vermeld in voorbeeld I, zijn samengevat in fig. 11.

VOORBEELD XII.

De eerste trap van de bewerking zoals vermeld in voorbeeld I, werd 35 herhaald onder toepassing van 500 g fijnverdeelde schors-van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. dat werd geëxtraheerd met ethylacetaat. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 38 g extract. Aan dit extract 80 0 4 75 1 -17- 21489/Vk/ts werd 100 ml methanol toegevoegd en behandeld op dezelfde wijze als aangegeven in voorbeeld XI ter verkrijging van 15,8 g bruin poedervormig extract A.

De gegevens verkregen door dit extract A te onderwerpen aan een 5 HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 12.

VOORBEELD XIII.

Op dezelfde wijze als vermeld voor de eerste trap in voorbeeld I, werd 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. 10 geëxtraheerd met dioxaan. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog tij een temperatuur van 50 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 60 g extract.

Aan dit extract werd toegevoegd 100 ml methanol en vervolgens werd het mengsel op dezelfde wijze behandeld als aangegeven is in voorbeeld XI 15 ter verkrijgipg van 16 g bruin, poedervormig extract A.

De gegevens met betrekking tot dit extract A, nadat het onderworpen is aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zi.jn weergegeven in fig. 13.

VOORBEELD XIV.

20 Aan 500 g fijnverdeelte schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd toegevoegd 1 liter methanol en het mengsel werd gekookt onder terugvloeikoeling op een waterbad bij een temperatuur van 50 °C onder toepassing van een terugvloeikoeler, welke extractie gedurende 5 uren werd uitgevoerd. De filtratie werd onder verhoogde temperatuur bewerkstelligd 25 en het residu waaraan 0,75 1 methanol was toegevoegd werd behandeld op dezelfde wijze als boven is aangegeven, welke bewerking nogmaals drie keren werd uitgevoerd. Vervolgens werd het mengsel opgewerkt zoals aangegeven in '’voorbeeld I ter verkrijging van 21,5 g bruin, poedervormig extract A.

De gegevens met betrekking tbt dit extract A nadat het onderworpen 30 is aan een HPLC-bewerking onder omstandigheden zoals vermeld in voorbeeld I, zijn aangegeven in fig. 14.

VOORBEELD XV.

Aan 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd 2,5 liter heet water toegevoegd, welk mengsel goed werd geroerd.

35 Het mengsel bleef· daarna gedurende een nacht staan bij kamertemperatuur.

Het mengsel werd afgefiltreerd en het residu werd nogmaals vier keren behandeld op de wijze zoals boven aangegeven, waarbij elke keer 1 liter heet water werd toegepast. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot 80 04 75 1 -18- 21489/Vk/ts droog bij een temperatuur van 50°C onder verlaagde druk ter verkrijging van 94 g extract.

Aan dit extract werd 300 ml methanol toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en afgefiltreerd. Aan het residu werd 100 ml methanol 5 toegevoegd en deze behandeling werd nogmaals vier keren uitgevoerd. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 53 g extract.

Aan dit extract werd in een scheidtrechter 150 ml chloroform toegevoegd en het mengsel werd vervolgens behandeld op dezelfde wijze als aange-10 geven is in voorbeeld I ter verkrijging van 5,6 g bruin poedervormig extract A.

De gegevens verkregen door dit extract A te onderwerpen aan een HPLC-bewerking zoals vermeld in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 15. VOORBEELD XVI.

15 Fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd in een hoeveelheid van 500 g verwarmd in een autoclaaf bij 120 °C gedurende 30 minuten, waarna 2 liter water werd toegevoegd en vervolgens werd het mengsel gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel afgefiltreerd en aan het residu werd 1 liter water toegevoegd 20 en deze behandeling nogmaals vier keren uitgevoerd op dezelfde wijze als boven is aangegeven. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 50 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 96 g extract. Vervolgens werd het mengsel behandeld op een wijze zoals aangegeven is in voorbeeld XV ter verkrijging van 6,8 g bruin, poedervormig 25 extract A.

De gegevens verkregen door dit extract A te onderwerpen aan een HPLC-bewerking onder omstandigheden zoals vermeld in voorbeeld I, zijn aangegeven in fig. 16.

VOORBEELD XVII.

30 Fijnverdeeld schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil.

werd in een hoeveelheid van 500 g verwarmd in een autoclaaf bij een temperatuur van 120 °C gedurende 30 minuten waarna 1,5 liter 50 vol.$ waterige methanoloplossing werd toegevoegd en het mengsel werd gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel afge-35 filtreerd en aan het residu werd 0,75 liter 50 vol. % waterige methanol-oplossing toegevoegd en deze behandeling werd nogmaals vier keren uitgevoerd, op de wijze zoals boven is aangegeven. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 50 °C onder verlaag- 80 0 4 75 1 t -19- 21489/Vk/ts de druk ter verkrijging van 103 g extract. Vervolgens werd het mengsel opgewerkt soals vermeld in voorbeeld XV ter verkrijging van 9 g bruin, poedervormig extract A.

De gegevens met bfetrekking tot dit extract dat onderworpen is aan 5 een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 17.

VOORBEELD XVIII.

In 50 ml chloroform werd 6 g extract A opgelost, verkregen in voorbeeld I. Vervolgens werd n-hexaan toegevoegd aan het verkregen mengsel in 10 een zodanige maximale hoeveelheid, dat geen vertroebeling optrad en de verkregen oplossing werd onderworpen aan HPLC voor massa-verzameling ( System 500 vervaardigd door Waters Co., Ltd.). Hierbij werd als vulmiddel gebruikt

Preppak 500-Silica ( vervaardigd door Waters Co,,Ltd.), whetgeen een volle- 2 dig poreus siliciumoxydegel is, bolvormig, met een oppervlak van 320 m /g. 15 De toegepaste kolom had een inwendige diameter en lengte van respectievelijk 57 mm en 300 mm en Bevatte 325 g vulmiddel. Als elueermiddel werd gebruikt een mengsel van n-hexaan/chloroform/raethanol in een volumeverhouding van 6 : 3 : 1 en bij eer}, stroomsnelheid van 150 ml/minuut, terwijl de be- -4 paling werd uitgevoerd bij RI ( 1/20 x 10 RIüFS). De pieken die werden 20 verkregen werden waargenomen met een detector, waarbij een eluaat werd gekozen op basis van de piek» corresponderende met de Fr-2-fractie zoals aangegeven in fig. 18, welke fractie gedurende 12 minuten werd verzameld. De bovenvermelde bewerking werd nogmaals twee keren uitgevoerd, waarbij elke keer 6 g extract A werd gebruikt, verkregen in voorbeeld I. Alle eluaten 25 werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C ter verkrijging van 5,54 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform, waarna n-hexaan werd toegevoegd in een maximale hoeveelheid, waarbij echter geen troebelheid werd veroorzaakt. De verkregen oplossing werd vervolgens onderworpen aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstan-30 digheden als boven is aangegeven, behalve dat een mengsel bestaande uit n-hexaan/chloroform/methanol in een volumeverhouding van 6:1:1 werd gebruikt als elueermiddel. De verkregen elueerpieken werden bepaald met < een '.detector, waarbij een eluaat werd gekozen op basis van de piek overeenkomst met de Fr-2-1 fractie, zoals aangegeven in fig. 19» welke fractie 35 gedurende 6 minuten en 30 seconden werd verzameld en afzonderlijk hiervan werd een ander eluaat gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-2-fractie, zoals in fig. 19 is aangegeven, welke fractie gedurende 8 minuten werd verzameld.

80 04 75 1 -20- 21489/Vk/ts

De respectievelijke fracties werden »ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C ter verkrijging van 1,98 g wit poeder overeenkomend met extract B-1, hetgeen correspondeert met de Fr-2-1-fractie en 0,91 g wit poeder dat overeenkomt met extract B-2 overeenkomend met de Fr-2-2-5 fractie.

De gegevens die verkregen zijn door deze extracten B-1 en B-2 te onderwerpen aan een HPLC-behandeling onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I zijn respectievelijk aangegeven in fig. 20 en, 21.

10 voorbeeld XIX.

Een eluaat uit de eerste HPLC-bewerking voor massa-verzameling in voorbeeld XVIII, verzameld gedurende 13 minuten op basis van de piek overeenkomend met de Fr-3 fractie zoals aangegeven in fig. 18, werd ingedampt tot droog ter verkrijging van 2,88 g extract. Dit extract werd opgelost in 15 een 70 vol. % waterige methanoloplossing en vervolgens onderworpen aan een HPLC-bewerking voor massa-verzameling ( System 500 vervaardigd door Waters Co., Ltd.) waarbij als vulmiddel Preppak 500-C18 ( bereid door Waters Co., Ltd.) werd gebruikt ais..,chemisch gebonden type C—18. Hierbij werd een kolom gebruikt met een binnendiameter van 57 mm en een lengte van 300 mm 20 en als elueermiddel een 70 vol. % waterige methanoloplossing. De stroomsnelheid bedroeg 100 ml /minuut en de bepaling had plaats bij RI (1/50 x -4 10 RIUFS). De elueerpieken werden waargenomen met een detector, waarbij een eluaat werd gekozen op basis van de piek overeenkomend met Fr-3-1-fractie aangegeven in fig. 22 en deze- fractie werd gedurende 12 minuten 25 verzameld en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C ter verkrijging van 0,88 g wit poedervormig extract B-3.

De gegevens die verkregen zijn door dit extract B-3 te onderwerpen aan HPLC- onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 23.

3° VOORBEELD XX.

Het extract A, verkregen in voorbeëd II, werd in een hoeveelheid van 13 g opgelost in 30 ml chloroform en gesdsorbeerd op 80 g silicagel (Wako-gel C-200 bereid door Wako Junyaku Co.,Ltd.) met een korrelgrootte van 75^pi, waarbij een kolom werd toegepast met een inwendige diameter van 35 3 cm en een lengte van 22 cm, gepakt met dit silicagel. De adsorptie had plaats volgens een '’droog1' procédé.

Eerst werden eluaten verkregen door elueren met 160 ml chloroform, 200. ml van een mengsel van chloroform en methanol in een volumeverhouding 80 0 4 75 1 -21- 21489/Vk/ts van 97 : 3 en vervolgens 200 ml van een mengsel bestaande uit chloroform en methanol in een volumeverhouding van 95 : 5, welke eluaten werden afge-voerd en vervolgens werd een eluaat verkregen door elueren met 1 liter van een mengsel bestaande uit chloroform en methanol in een volumeverhouding van 5 93 : T» dat werd verdeeld in een eerste fractie van 600 ml en een tweede fractie van 400 ml.De eerste fractie van 600 ml werd ingedampt en vervolgens gedroogd bij 45 °C onéer verlaagde druk gedurende 6 uren en fijngemaakt ter verkrijging gan 4,21 g extract.

Dit extract werd opgelost in 40 ml chloroform, waarna n-hexaan werd 10 toegevoegd in een maximale hoeveelheid, zodat geen troebelheid werd bewerkstelligd. De verkregen oplossing werd onderworpen aan een HPLC-massa-verzameling, waarbij System 500 werd toegepast vervaardigd door Wates Co., Ltd. Het vulmiddel bestond uit Preppak 500-Silica, hetgeen volledig poreus sili- cagel is»bereid door Waters Co., Ltd., welk vulmiddel bolvormig is en een 2 15 oppervlak heeft van 320 m /g. De kolom had een inwendige diameter van 57 mm en een lengte van 300 mm en bevatte 325 g vulmiddel. Als elueermiddel werd een mengsel gebruikt van n-hexaan/chloroform/methanol in een volumeverhouding van 6 : 1 ; 1. De stroomsnelheid bedroeg 150 ml/minuut en de bepaling -4 werd uitgevoerd bij RI ( 1/20 x 10 RIUFS).

20 Terwijl de elueerpieken werden waargenomen met een detector werd · een eluaat gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-1 fractie aangegeven in fig. 19 en deze fractie werd verzameld gedurende 6 minuten en 30 seconden en een ander eluaat werd gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-2- fractie aangegeven in dezelfde figuur en ver-25 zameld gedurende 8 minuten. De respectievelijke fracties werden ingedampt tot droog ter verkrijging van 0,85 g wit poedervormig extract B-1 overeenkomend met de FP-2-1i-fractie en 0,72 g wit poedervormig extract B-2, overeenkomend met de Fr-2-2-fraotie.

De gegevens die verkregen zijn door de aldus verkregen extracten 30 B-1 en B-2 .te onderwerpen aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn vermeld in de figuren 24 en 25. VOORBEELD XXI.

Van de laatste helft van het eluaat werd een hoeveelheid van 400 ml, verkregen door het elueren van de silicagel-kolom met een mengsel 35 van chloroform en methanol (volumeverhouding 93 : 7) in voorbeeld XX, ingedampt en vervolgens gedroogd bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk gedurende 6 uren en fijngemaakt ter verkrijging van 1,76 g extract. 0()0 4 75 1 -22- 21489/Vk/ts

Dit extract werd opgelost in 30 ml van een 70 vol. % waterige methanoloplossing en vervolgens onderworpen aan HPLC voor massa-verzameling met behulp van System 500,vervaardigd door Waters Co., Ltd, waarbij als vulmiddel Preppak 500-C18,bereid door Waters Co., Ltd. werd toegepast 5 als chemisch gebonden type C—18. De kolom had een binnendiameter van 57 mm en een lengte van 300 mm en als elueermiddel werd 70 vol. % waterige methanoloplossing gebruikt. De stroomsnelheid bedroeg 100 ram /minuut en de bepaling had plaats bij RI ( 1/50 x 10*^ RIÜFS).

De elueerpieken werden waargenomen met een detector en een eluaat 10 werd gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-3-1-fractie aangegeven in fig. 22 en deze fractie werd verzameld gedurende 12 minuten en vervolgens tot droog ingedampt ter verkrijging van 0,48 g wit poedervormig extract B-3.

De gegevens verkregen door het aldus verkregen extract B-3 te 15 onderwerpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 26.

-CONCLUSIES- 80 0 4 75 1

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel tegen kanker op basis van een plantenrest als actief middel door de plantenrest te mengen 5 met hulpstoffen tot een voor geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm, met het kenmerk, dat als actief middel resten worden gebruikt van Marsdenia cundurango Reichenbach fil., verkregen door extraheren en uit bepaalde elueerfracties, door de extracten te onderwerpen aan een hoge druk-vloeistofchromatografische bewerking.

2. Werkwijze voor het bereiden van een actieve stof uit een plantenrest met het kenmerk, dat Marsdenia cundurango Reichenbach fil. wordt geëxtraheerd waarüj de extracten verder kunnen worden onderworpen aan elueren en aan hogedruk-vloeistofchromatografie.

3. Extract van Marsdenia cundurango Reichenbach fil., verkregen volgens 15 een werkwijze beschreven in conclusie 2, met het kenmerk, dat het extract oplosbaar is in lageie alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen afwijkend van tetrachloorkoolstof en onoplosbaar in alifatisehe koolwaterstoffen, tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen en een chromatogram geeft, zoals weergegeven in fig. 20 wanneer onderworpen aan een analytische 20 HPLC-bewerking, waarbij als vulmiddel silicagel wordt toegepast, volledig poreus en fijngemaakt tot een grootte van 5 μm, waarbij een kolom wordt gebruikt met een inwendige diameter van 4 mm en een lengte van 200 mm en een elueermiddel dat bestaat uit een mengsel van n-hexaan/chloroform/metha- nol in een volumeverhouding van 7:2:1, een stroomsnelheid van 1,5 ml/ 2 25 minuut en een druk van 30 kg/cm en de bepaling is uitgevoerd metU.V.-280 nm (0,64 AUFS).

4. Extract verkregen volgens een werkwijze aangegeven in conclusies 2, met het kenmerk, dat het extract oplosbaar is in lagere alcoholen en in een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkoolstof en onop- 30 losbaar in alifatisehe koolwaterstoffen, tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen en een chromatogram geeft overeenkomend met fig. 21 wanneer het is onderworpen aan een analytische HPLC-bewerking waarbij als j vulmiddel silicagel wordt gebruikt van een poreus type en met een grootte van 5 yum, de kolom een inwendige diameter heeft van 4 mm en een lengte van 35 200 mm, het elueertaiddel bestaat uit een mengsel van n-hexaan/chloroform/ methanol in een volumeverhouding van 7:2: 1, de stroomsnelheid 1,5 ml/ 2 minuut is en de druk 30 kg/cm en de bepaling wordt uitgevoerd met U.V. bij 280 nm ( 0,64 AUFS). 80 04 75 1 -24- 21489/Vk/ts

5. Extract verkregen volgens de werkwee aangegeven in conclusie 2, met het kenmerk, dat het extract oplosbaar is in lagere alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen afwijkend van tetrachloorkoolstof en onoplosbaar in alifatische koolwaterstoffen, tetrachloorkoolstof of aromatische 5 koolwaterstoffen en een chromatogram geeft overeenkomend met fig. 23 wanneer het wordt onderworpen aan een analytische HPLC-bewerking waarbij het vulmiddel silicagel is, volledig poreus en een grootte van 5 jm in een kolom met een inwendige diameter van 4 mm en een lengte van 200 mm en het elueer-middel een mengsel is van n-hexaan/chloroform/methanol in een volumeverhou-10ding van 7 : 2 : 1 en de stroomsnelheid 1,5 ml/minuut is en de druk 30 kg/ p cm bedraagt en de bepaling wordt uitgevoerd bij U.V. -280 nm (0,64 AUFS).

6. Extract verkregen zoals aangegeven in de werkwijze beschreven in conclusie 2, met het kenmerk, dat het extract oplosbaar is in lagere alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen afwijkend van tetrachloorkoolstof en 15onoplosbaar in alifatische koolwaterstoffen, tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen en een chromatogram geeft overeenkomend met fig. 1, wanneer het wordt onderworpen aan een analytische HPLC-bewerking waarbij als vulmiddel volledig poreuze silicagel wordt gebruikt met een grootte van 5 um en een kolom met een inwendige diameter van 4 mm en een lengte van 20200 mm, een elueermiddel bestaande uit een mengsel van n-hexaan/chloroform/ methanol in een vèlumeverhouding van 7 ’ 2:1 bij een stroomsnelheid van 2 1,5 ml /minuut en een druk van 30 kg/cm en de detectie wordt bewerkstelligd bij U.V. -280 nm (0,64 AUFS).

7. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat een extract 25 wordt bereid zoals aangegeven in conclusie 3, door een extract van Marsde- nia cundurango Reichenbach fil. , verkregen door het te behandelen met de volgende drie soorten oplosmiddelen in een willekeurige volgorde M een lagere alcohol voor het verzamelen van het gedeelte dat hierin oplosbaar is, 30 2) een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkool stof voor het verzamelen van het hierin oplosbare gedeelte en 3. een alifatische koolwaterstof, tetrachloorkoolstof of een aromatische koolwaterstof voor het' verwijderen van dat gedeelte dat hierin oplosbaar is , welk extract wordt onderworpen aan HPLC in een System 500 35 met als vulmiddel Preppak 500-siliciumoxyde wordt gebruikt en een kolom met een inwendige diameter van 57 mm en een lengte van 300 mm, als elueermiddel een mengsel van n-hexaan/chloroform/methanol in een volumeverhouding van 6:3:1, een stroomsnelheid van 150 ml/minuut en de bepaling wordt uit- 80 04 75 1 -4 -25- 21489/Vk/ts gevoerd bij RI (1/20 x 10 RIUFS) ter verzameling van de elueerfractie gekozen op basis van de piek· overeenkomend met de Fr-2 fractie aangegeven in fig. 18 en vervolgens de fractie wordt onderworpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als boven is aangegeven, behalve dat een ander mengsel 5 n-hexaan/chloroform/methanol wordt gebruikt met een volumeverhouding van 6 : 1 : 1 in plaats van de verhouding 6 : 3 : 1, welk 'mengsel gebruikt wordt als elueermiddel ter verzameling van de elueerfracties gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-fractie weergegeven in fig. 19·

8. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat een extract wordt 10 bereid zoals aangegeven in conclusie 4, door het extract van Marsdenia cun-durango Reichenbach fil., verkregen door het te behandelen met de volgende drie oplosmiddelen in willekeurige volgorde: 1. een lagere alcohol voor het verzamelen van dat gedeelte dat hierin oplosbaar is, 15 2) een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkoolstof en 3. een alifatische koolwaterstof, tetrachloorkoolstof.of een aromatisch koolwaterstof voor het verwijderen van dat deel dat hierin oplosbaar is, v welk extract wordt, onderworpen aan HPLC onder dezelfde ; omstandigheden als aangegeven in conclusie 7, waar tij de elueerfractie wordt verzameld, ge-20 kozen op basis van de piek corresponderend met de Fr-2-fractie aangegeven in fig. 18 en vervolgens de fractie wordt onderworpen aan HPLC onder toepassing van dezelfde omstandigheden als boven is aangegeven waarbij echter een ander mengsel -n-hexaan/chloroform/methanol wordt toegepast met een volumeuerhouding van 6 : T : 1 in plaat3 van 6:3:1 als elueermiddel 25 ter verzameling van de elueerfractie gekozen op basis van· de piek corresponderende met de Fr-2-2-fractie aangegeven in fig. 19·

9- Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat een extract wordt bereid zoals aangegeven in conclusie 5, door een extract van Marsdenia cundurango Reichenbach fil., verkregen door een behandeling met de 30 volgende drie soorten oplosmiddelen in een willekeurige volgorde: 1. een lagere alcohol voor het verzamelen van het gedeelte dat hierin oplosbaar is, , 2) een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkoolstof voor het verzamelen van het gedeelte dat hierin oplosbaar is en 35 3) een alifatische koolwaterstof, tetrachloorkoolstof of een aro matische koolwaterstof, ter verwijdering van het gedeelte dat hierin oplosbaar is, te onderwerpen aan HPLC, op een wijze zoals aangegeven in conclusie 80 04 75 1 % -26- 21489/Vk/ts 7, waarbij de elueerfracties worden gekozen op basis van de piek» overeenkomend met de Fr-3 fractie aangegeven in fig. 18 en vervolgens de fractie wordt onderworpen aan een ander HPLC-systeem t.w. System 500, met als vulmiddel Preppak 500-C18, terwijl een kolom wordt gebruikt met een inwen-5 dige diameter van 57 mm en een lengte van 300 mm en als elueermiddel een 70 val. % waterige methanoloplossing, de stroomsnelheid 100 ml/minuut is -4 en de bepaling wordt uitgevoerd bij RI ( 1/50 x 10 RIUFS) ter verzameling van de elueerfractie gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr- 3-1 fractie aangegeven in fig. 22.

10. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8,met het kenmerk dat het extract wordt onderworpen aan,in plaats van de eerste HPLC,een open kolommethode in een sili-cagelkolom waarbij het elueren wordt bewerkstelligd met chloroform en vervolgens met chloroform/methanol (volumeverhouding 97 :3 en 95 : 5)-mengsels en vervolgens met een chloroform/methanolmengsel (volumeverhouding 93 : 7) 15 ter verzameling van de eerste helft van de elueerfractie.

11. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het extract wordt onderworpen, in plaats van de eerste HPLC-bewerking aan een open kolommethode met'een kolom gevuld met. silicagel en het elueren plaats heeft met chloro”-form en vervolgens met chloroform/methanolmengsels met een volumeverhouding 20 van 97 : 3 en 95 : 5 en vervolgens met een chloroform/methanolmengsel (volumeverhouding 93 : 7 ) ter verzameling van de laatste he r.‘ft van de elueerfractie.

12. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij een extract wordt bereid zoals aangegeven in conclusie 6, met het kenmerk, dat Marsdenia cundurango Reichen- 25 bach fil. wordt behandeld met de volgende drie soorten oplosmiddelen in een volgorde die willekeurig gekozen kan worden: 1. een lagere alcohol voor het verzamelen van het gedeelte dat hierin oplosbaar is, 2. een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetraghloorkoolstof 30 voor het veczamelen van dat gedeelte dat hierin oplosbaar is en 3. een alifatische koolwaterstof, tetrachloorkoolstof of een aromatisch koolwaterstof ter verwijdering van het gedeelte dat hierin oplosbaar is.

13· Werkwijze) volgens conclusie 7-12, met het kenmerk, dat het extract 35 dat verkregen is door extraheren van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. wordt verkregen met een alifatisch keton, een lagere alifatische ester of ether of met heet water of met water of een waterhoudende lagere alcohol, na een direkte warmtebehandeling bij 110 - 130 °C gedurende 30 minuten, 80 0 4 75 1 -27- 2t489/Vk/ts uitgevoerd met het uitgangsmateriaal.

14. Geneesmiddel tegen kanker op basis van plantenresten die met hulpstoffen zijn gebracht in een voor geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm, met hèt kenmerk, dat de actieve stof een extract is van 5 Marsdenia cundurango Reichenbach fil., zeals beschreven in de conclusies 3-6. 4 80 0 4 75 1