NL8004751A

NL8004751A - METHOD FOR PREPARING A MEDICINAL AGAINST CANCER, THE MEDICINE PREPARED AND A PROCESS FOR PREPARING THE ACTIVE SUBSTANCE FROM A PLANT REST.

Info

Publication number: NL8004751A
Application number: NL8004751A
Authority: NL
Original assignee: Zenyaku Kogyo Kk
Priority date: 1979-08-23
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1981-02-25
Also published as: PL226369A1; FR2463620A1; CA1144917A; IT1141617B; DE3031745A1; IT8068313A0; SE8005919L; GB2060379A

Description

-1- 21489/Vk/jl-1- 21489 / Uk / yl

Aanvrager: Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha, Tokio, Japan.Applicant: Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha, Tokyo, Japan.

Korte aanduiding: Werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel tegen kanker, het aldus bereide geneesmiddel en een werkwijze voor het bereiden van de actieve stof uit een planten-5 rest.Brief designation: Method for the preparation of an anti-cancer drug, the drug thus prepared and a method for preparing the active substance from a plant residue.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een geneesmiddel tegen kanker op basis van een plantenrest als actief middel door de plantenrest te mengen met hulpstoffen tot een voor 10 geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm. De uitvinding heeft verder betrekking op een geneesmiddel tegen kanker op basis van plantenresten ‘die met hulpstoffen zijn gebracht in een voor geneeskundige doeleinden geschikte toedieningsvorm en op een werkwijze voor het bereiden van een actieve stof tegen kanker uit een plantenrest.The invention relates to a method for the preparation of an anti-cancer medicine on the basis of a plant residue as an active agent by mixing the plant residue with auxiliary substances to a dosage form suitable for medical purposes. The invention further relates to an anti-cancer drug based on plant residues "introduced with adjuvants in a medicamentally suitable dosage form and to a method for preparing an anti-cancer active agent from a plant residue.

15 De werkwijze voor de bereiding van het geneesmiddel wordt hier door gekenmerkt, dat als actief middel resten worden gebruikt van Marsde-nia cunduraneo Reichenbaeh fil. verkregen door extraheren en uit bepaalde elueerfracties door de extracten te onderwerpen aan hogedruk-vloeistofchro-* matografie.The process for the preparation of the medicament is characterized in that the active agent used is residues of Marsdenia cunduraneo Reichenbaeh fil. obtained by extraction and from certain elution fractions by subjecting the extracts to high pressure liquid chromatography.

20 Marsdenia cundurango Reichenbaeh fil. behoort tot de familie van Asclepiadaceae en is een heester in de vorm van een klimplant die in de natuur voorkomt op eB tussen de bergen in het noordwesten van Zuid-Amerika.De schors hiervan wordt gebruikt als een aromatisch maar bitter middel tegen maagpijn bij spijsverstoringen :.en/of anorexia, gewoonlijk in 25 de vorm van een vloeistofextract (commentaar uit de negende Japanse Pharmacopeia) .20 Marsdenia cundurango Reichenbaeh fil. belongs to the family of Asclepiadaceae and is a shrub in the form of a creeper that occurs naturally on eB between the mountains in the northwest of South America. The bark of this is used as an aromatic but bitter remedy for stomach pains during digestive disorders: and / or anorexia, usually in the form of a liquid extract (commentary from the ninth Japanese Pharmacopeia).

De componenten van de schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. omvatten condurangogenin-A, condurangogenin-C en een groot aantal andere pregnaantype verbindingen en esters daarvan en glycociden en de extrac-30 tie, afscheiding, structuren en dergelijke van deze stoffen zijn bijvoorbeeld vermeld in de volgende literatuur:, hoewel nadere bijzonderheden hieromtrent ten opzichte van een groot aantal punten nog onduidelijk zijn.The components of the bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. include condurangogenin-A, condurangogenin-C and a variety of other pregna type compounds and esters thereof and glycocides and the extraction, secretion, structures and the like of these substances are disclosed, for example, in the following literature, although further details in this regard of many points are still unclear.

R. Tschesche et. al., Tetrahedron, 2Λ_, bladzijde 1777 ( 1965); 21, bladzijde 1797 (1965); 23 , bladzijde 1461 (1967); en 24 , bladzijde 35 4359 (1968). M Pailer et al., Monatshefte für>Chemie, 106, bladzijde 37 (1975). Hiroschi Mitsuhashi et al., Chem. Pharm. Buil. , bladzijde 2522 (1968).R. Tschesche et. al., Tetrahedron, 210, page 1777 (1965); 21, page 1797 (1965); 23, page 1461 (1967); and 24, page 35 4359 (1968). M Pailer et al., Monatshefte für> Chemie, 106, page 37 (1975). Hiroschi Mitsuhashi et al., Chem. Pharm. Bump. , page 2522 (1968).

Uit de gedane onderzoekingen is gevonden dat bepaalde extracten 80 0 4 75 1 -2- 21489/Vk/ts van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. en bepaalde elueerfracties, verkregen door de extracten te onderwerpen aan hogedruk-vloeistofchromatogra-fie, hierna aangegeven als HPLC, een anti-tumorwerking hebben.From the studies conducted it was found that certain extracts 80 0 4 75 1 -2- 21489 / Vk / ts from Marsdenia cundurango Reichenbach fil. and certain elution fractions obtained by subjecting the extracts to high pressure liquid chromatography, hereinafter referred to as HPLC, have anti-tumor activity.

Zodoende zijn nieuwe extracten van Marsdenia cundurango Reichenbach 5 fil. verkregen en een werkwijze voor de bereiding hiervan, welke stoffen gebruikt kunnen worden als anti-tumor middelen. De extracten bestaan hoofdzakelijk uit dat deel van Marsdenia cundurango Reichenbach fil., dat oplosbaar is in lagere alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen afwijkend van tetrachloorkoolstof en onoplosbaar in alifatische koolwaterstoffen., 10 tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen.Thus, new extracts of Marsdenia cundurango Reichenbach 5 fil. and a method for the preparation thereof, which substances can be used as anti-tumor agents. The extracts mainly consist of that part of Marsdenia cundurango Reichenbach fil., Which is soluble in lower alcohols and chlorinated hydrocarbons different from carbon tetrachloride and insoluble in aliphatic hydrocarbons, carbon tetrachloride or aromatic hydrocarbons.

Bij het uitvoeren van de werkwijze ter verkrijging van de actieve stof, gaat men bij voorkeur uit van de schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. .Deze schors is in de handel verkrijgbaar, maar wordt bij voorkeur goed gedroogd en fijn verdeeld zo snel mogelijk na het verzamelen 15 van de schors.The bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. Is preferably used when carrying out the process for obtaining the active substance. This bark is commercially available, but is preferably well dried and finely divided as soon as possible after collection of the bark.

Met het oog op de aard en de bereiding van de extracten, is de volgorde waarin de oplosmiddelen worden toegepast niet kritisch en deze volgorde kan desgewenst.,, worden gevarieerd. Een bij voorkeur toegepaste werkwijze vólgens de uitvinding is de volgende.In view of the nature and preparation of the extracts, the order in which the solvents are used is not critical and this order can be varied if desired. A preferred method of the invention is as follows.

20 Eerste bewerking.20 First operation.

Marsdenia cundurango Reichenbach fil. , met name de schors wordt fijn verdeeld en geëxtraheerd met een organisch oplosmiddel en het extract wordt ingedampt tot droog onder verlaagde druk. Als organisch oplosmiddel kan worden toegepast methanol, ethanol, isopropanol of een andere lagere 25 alcohol, maar methanol verdient de voorkeur. Voordat de extractie wordt uitgevoerd, kan Marsdenia cundurango Reichenbach fil. worden ontvet met een alifatische koolwaterstof, zoals pent'aan, hexaan, heptaan, ligrolne of petroleumether. Deze voorbehandeling wordt desgewenst uitgevoerd onder toepassing van hexaan in een hoeveelheid van 4-7 keren het gewicht van 30 Marsdenia cundurango Reichenbach fil.. Volgens een uitvoeringsvorm van deze extractie wordt de extractie uitgevoerd door het uitgangsmateriaal in het oplosmiddelmengsel bij kamertemperatuur gedurende meerdere tot tientallen uren te laten staan. Vervolgens wordt het mengsel afgefiltreerd ter verkrijging van een filtraat. Het residu wordt meerdere keren onder-35 worpen aan eenzelfde extractie-filtratie en al het filtraat wordt gecombineerd en ingedampt tot droog onder verlaagde druk ter verkrijging van een extract.Marsdenia cundurango Reichenbach fil. in particular, the bark is finely divided and extracted with an organic solvent and the extract is evaporated to dryness under reduced pressure. As organic solvent, methanol, ethanol, isopropanol or other lower alcohol can be used, but methanol is preferred. Before the extraction is performed, Marsdenia cundurango Reichenbach fil. degreased with an aliphatic hydrocarbon such as pentane, hexane, heptane, ligrol or petroleum ether. This pretreatment is optionally carried out using hexane in an amount of 4-7 times the weight of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. According to one embodiment of this extraction, the extraction is carried out through the starting material in the solvent mixture at room temperature for several to tens of hours leave it. The mixture is then filtered to obtain a filtrate. The residue is subjected to the same extraction filtration several times and all the filtrate is combined and evaporated to dryness under reduced pressure to obtain an extract.

De extractie wordt gewoonlijk uitgevoerd bij normale temperatuur, 80 0 4 75 1 « Λ -3- 21489/Vk/ts maar het is ook mogelijk om de extractie uit te voeren bij een verhoogde temperatuur om de extractietijd te verkorten. Deze extractie onder verwarmen wordt bij voorkeur uitgevoerd op een waterbad bij een waterbadtemperatuur van 35-55 °C gedurende 4-6 uren onder toepassing van een terugvloeikoeler.The extraction is usually carried out at normal temperature, 80 0 4 75 1 «3 -3- 21489 / Vk / ts, but it is also possible to perform the extraction at an elevated temperature to shorten the extraction time. This heating extraction is preferably performed on a water bath at a water bath temperature of 35-55 ° C for 4-6 hours using a reflux condenser.

5 Deze extractie kan worden uitgevoerd in overeenstemming met de percolatie-methode.5 This extraction can be performed according to the percolation method.

De hoeveelheid oplosmiddel die wordt toegepast is 2-5 keren het gewicht van de schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil..Het extractie-residu wordt bij voorkeur onderworpen aan een extractie onder dezelfde om-10 standigheden hetgeen drie of meer keren wordt herhaald onder toepassing van het oplosmiddel in een hoeveelheid die overeenkomt met 0,4-08 keren de hoeveelheid oplosmiddel die eerst is toegepast.The amount of solvent used is 2-5 times the weight of the bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. The extraction residue is preferably subjected to an extraction under the same conditions which is repeated three or more times using the solvent in an amount corresponding to 0.4-08 times the amount of solvent used first.

De afscheiding kan worden uitgevoerd door filtratie over papier, centrifuren of dergelijke. Betere resultaten worden echter verkregen door 15 de afscheiding te bewerkstelligen door filtratie onder verlaagde druk, onder toepassing van in de handel verkrijgbare filtratiehulpstukken, zoals bijvoorbeeld Radiolite ( Showa Chemical Industry Co., Ltd. in Japan), Celite ( Wako Junyaku Industry ...Co., Ltd. in Japan), Fibra Cel ( Johns Manville Co.,The separation can be performed by filtration over paper, centrifugation or the like. However, better results are obtained by effecting the separation by vacuum filtration, using commercially available filtration aids, such as, for example, Radiolite (Showa Chemical Industry Co., Ltd. of Japan), Celite (Wako Junyaku Industry ... Co., Ltd. in Japan), Fibra Cel (Johns Manville Co.,

Ltd., U.S.A.).Ltd., U.S.A.).

20 Het verlagen van de druk wordt op gebruikelijke wijze bewerkstel ligd, bijvoorbeeld met behulp vai een een waterstraalpomp, vacuümpomp of dergelijke.Decreasing the pressure is effected in a usual manner, for instance with the aid of a water jet pump, vacuum pump or the like.

Als extractievat kan een vat worden gebruikt dat bekleed is met glas of met een geëmailleerd binnenoppervlak of van roestvrij staal.As an extraction vessel, a vessel lined with glass or with an enamelled inner surface or stainless steel can be used.

25 Tweede bewerking.25 Second operation.

Aan het extract, dat verkregen is bij de eerste bewerking wordt toegevoegd een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkool-stof, zoals chloroform of dichloormethaan, gevolgd door sterk schudden ter verwijdering van het onoplosbare gedeelte. Het onoplosbare gedeelte 30 wordt herhaaldelijk aan dezelfde bewerking onderworpen. De resterende oplossingen worden gecombineerd en ingedampt tot droog onder verlaagde druk, hetgeen direkt kan gebeuren of na filtratie onder afzuiging. De hoeveelheid toegepast oplosmiddel is 2-6 keren de hoeveelheid van het extract dat verkregen is bij de eerste bewerking. De respectievelijke residuen worden 35 bij voorkeur onderworpen aan dezelfde bewerking, hetgeen 4 of 5 keren wordt uitgevoerd, onder toepassing van het oplosmiddel in een hoeveelheid van 0,2-0,4 keren het volume van het eerst toegepaste oplosmiddel. De filtratie onder afzuiging kan worden uitgevoerd op dezelfde wijze als bij de egrste 80 0 4 75 1 -it- 21489/Vk/ts bewerking.To the extract obtained in the first operation is added a chlorinated hydrocarbon other than carbon tetrachloride, such as chloroform or dichloromethane, followed by vigorous shaking to remove the insoluble portion. The insoluble portion 30 is repeatedly subjected to the same operation. The remaining solutions are combined and evaporated to dryness under reduced pressure, which can be done immediately or after filtration under suction. The amount of solvent used is 2-6 times the amount of the extract obtained in the first operation. Preferably, the respective residues are subjected to the same operation, which is performed 4 or 5 times, using the solvent in an amount of 0.2-0.4 times the volume of the first solvent used. The filtration under suction can be carried out in the same manner as in the basic 80 0 4 75 1 -it- 21489 / Vk / ts operation.

Derde bewerking.Third operation.

Het extract dat is verkregen bij de tweede bewerking wordt opgelost in een gechloreerde koolwaterstof afwijkend van tetrachloorkoolstof, 5 zoals chloroform of dichloormethaan in een minimale hoeveelheid die noodzakelijk is om het eerste mengsel volledig op te lossen. Aan de verkregen oplossing wordt een alifatische koolwaterstof toegevoegd, zoals pentaan, n-hexaan of heptaan in een hoeveelheid die twee tot vier keren de volume-hoeveelheid is van de eerst toegepaste hoeveelheid, gevolgd door goed 10 roeren en het mengsel wordt gedurende enkele uren tot enkele tientallen uren bewaard om het onoplosbare gedeelte te verzamelen. Ook is het mogelijk om .tetrachloorkoolstof of een aromatische koolwaterstof zoals tolueen of benzeen toe te voegen aan het extract, hetgeen direkt kan plaats hebben in een hoeveelheid die gelijk is aan of tot drie keer de hoeveelheid van de 15 laatst toegepaste vloeistof en vervolgens worden opgewerkt tot de bovenvermelde stof zodat het onoplosbare gedeelte kan worden verzameld.The extract obtained in the second operation is dissolved in a chlorinated hydrocarbon other than carbon tetrachloride, such as chloroform or dichloromethane in a minimum amount necessary to completely dissolve the first mixture. An aliphatic hydrocarbon, such as pentane, n-hexane or heptane, is added to the resulting solution in an amount that is two to four times the volume of the amount used first, followed by good stirring and the mixture is stirred for several hours. kept for several tens of hours to collect the insoluble part. It is also possible to add carbon tetrachloride or an aromatic hydrocarbon such as toluene or benzene to the extract, which can take place directly in an amount equal to or up to three times the amount of the last liquid used and then worked up to the above-mentioned substance so that the insoluble part can be collected.

Het onoplosbare gedeelte wordt vervolgens herhaaldelijk aan dezelfde bewerking ondërworpen. Deze bewerking wordt bij voorkeur twee of drie keren uitgevoerd, elke keer onder toepassing van het oplosmiddel in een 20 hoeveelheid van 0,4 tot 0,6 keer de volumehoeveelheid van het oplosmiddel5 dat eerst is toegepast. Het aldus verkregen onoplosbare gedeelte wordt goed gedroogd bij een temperatuur van 50 °C of minder onder verlaagde druk en vervolgens fijn gemaakt ter verkrijging van een extract dat lijkt op een bruin poeder, dat hierna wordt aangegeven als extract A.The insoluble portion is then repeatedly subjected to the same operation. This operation is preferably performed two or three times, each time using the solvent in an amount of 0.4 to 0.6 times the volume of the solvent 5 used first. The insoluble portion thus obtained is dried well at a temperature of 50 ° C or less under reduced pressure and then comminuted to obtain an extract resembling a brown powder, hereinafter referred to as extract A.

25 Het verzamelen van het onoplosbare gedeelte kan worden uitgevoerd door decanteren, filtratie onder afzuiging of centrifugeren.The collection of the insoluble part can be performed by decantation, suction filtration or centrifugation.

Teneinde de totale kosten van de werkwijze volgens de uitvinding te minimaliseren en om de bewerking makkelijker uit te voeren wordt fijn verdeeld Marsdenia oundurango Reichenbach fil.,bijvoorbeeld in de vorm van 30 de schors, eerst geëxtraheerd met een alifatisch keton zoals aceton of jaethylethylketon ,een lagere alifatische ester zoalsnethylacetaat, ethyl-acetaat,of butylacetaat, een ether zoals diethylether, tetrahydrofuran of dioxan of met heet water of bij verhoogde temperatuur behandeld ( 110-130 °C gedurende 30 minuten of langer), direkt gevolgd door de extractie met 35 water of een waterige lagere alcohol en vervolgens kan het extract worden onderworpen aan de bovenvermelde drie bewerkingen. Hierbij kan de extractie op dezelfde wijze worden uitgevoerd als de eerstvermelde bewerking. Gewoonlijk is ^-glyccsi.dase, dat in staat is om de glucosebindingen van gjfcyco-siden te breken, aanwezig in de extracten van planten en dit enzym wordt 80 0 4 75 1 ·' « -5- 21489/Vk/ts geactiveerd in aanwezigheid van water. Daarom is de behandeling bij verhoogde temperatuur vereist wanneer water of een waterige lagere alcohol wordt toegepast.In order to minimize the total cost of the process of the invention and to facilitate the operation, finely divided Marsdenia oundurango Reichenbach fil., For example in the form of bark, is first extracted with an aliphatic ketone such as acetone or ethyl ethyl ketone, a lower aliphatic ester such as ethyl acetate, ethyl acetate, or butyl acetate, an ether such as diethyl ether, tetrahydrofuran or dioxane or treated with hot water or at an elevated temperature (110-130 ° C for 30 minutes or more), followed immediately by the extraction with water or an aqueous lower alcohol and then the extract can be subjected to the above three operations. The extraction can herein be carried out in the same manner as the first mentioned operation. Usually, glyglycase phase, which is capable of breaking the glucose bonds of glycosides, is present in the extracts of plants and this enzyme is activated in 80 0 4 75 1 -5- 21489 / Vk / ts presence of water. Therefore, the treatment at elevated temperature is required when water or an aqueous lower alcohol is used.

Het aldus verkregen extract A is een mengsel van zes componenten 5 die karakteristieke pieken geven in de figuren zoals weergegeven in fig.The extract A thus obtained is a mixture of six components 5 which give characteristic peaks in the figures as shown in fig.

1-17 van de bijgevoegde tekening, wanneer deze onderworpen worden aan analytische HPLC en deze extracten hebben een anti-tumoractiviteit.1-17 of the accompanying drawing, when subjected to analytical HPLC and these extracts have anti-tumor activity.

Vierde bewerking.Fourth operation.

Teneinde een meer actief deel te verkrijgen uit extract A, wordt 10 het opgelost in chloroform in een minimale hoeveelheid die noodzakelijk is om een volledige oplossing te verkrijgen en aan de verkregen oplossing wordt toegevoegd n-hexaan in een zodanige hoeveelheid, dat de oplossing niet troebel wordt. Het verkregen monster van de oplossing wordt onderworpen aan normate fase HPLC ter verzameling van stof (eluens : een mengsel van 15 n-hexaan/chloroform/methanol met een volumeverhouding van 6:3:1). Wanneer de elueerpieken worden onderzocht met een detector kunnen twee fracties worden gekozen op basis van de pieken overeenkomend met Fr-2 en Fr-3 fracties weergegeven in de grafieken zoals fig. 18, van de bijgevoegde tekening, die eerst zijn verkregen door de eerder uitgevoerde testen, waarbij deze 20 fracties zijn verzameld en vervolgens worden deze ingedampt tot droog ter verkrijging van extracten.In order to obtain a more active part from extract A, it is dissolved in chloroform in a minimum amount necessary to obtain a complete solution and n-hexane is added to the resulting solution in such an amount that the solution is not cloudy is becoming. The resulting sample of the solution is subjected to normal phase HPLC to collect dust (eluent: a mixture of 15 n-hexane / chloroform / methanol with a volume ratio of 6: 3: 1). When the elution peaks are examined with a detector, two fractions can be selected based on the peaks corresponding to Fr-2 and Fr-3 fractions shown in the graphs such as Fig. 18 of the attached drawing, which are first obtained by the previously performed tests, in which these 20 fractions are collected and then they are evaporated to dryness to obtain extracts.

Anderzijds kan extract A , verkregen bij de derde bewerking worden onderworpen aan de open kolom-methode waarbij een elueerbewerking wordt toegepast, achtereenvolgens met chloroform en een mengsel van chloroform 25 en methanol ( volumeverhouding 97 : 3 - 95 : 5) ter verwijdering van het minder polaire gedeelte en vervolgens elueren met een mengsel van chloroform en methanol (volumeverhouding 93 ’ 7) ter verkrijging van twee fracties overeenkomend met de bovenvermelde fracties Fr-2 en Fr-3· Hierbij correspondeert gewoonlijk de eerste helft van het eluaat met fractie Fr-2 en de twee-30 de helft met fractie Fr-3, maar de volumeverhouding van de twee fracties is bij voorkeur 60 : *10.On the other hand, extract A obtained in the third operation can be subjected to the open column method using an elution operation, successively with chloroform and a mixture of chloroform 25 and methanol (volume ratio 97: 3 - 95: 5) to remove the less polar part and then eluting with a mixture of chloroform and methanol (volume ratio 93 '7) to obtain two fractions corresponding to the above-mentioned fractions Fr-2 and Fr-3 · Usually the first half of the eluate corresponds to fraction Fr-2 and the two-half half with fraction Fr-3, but the volume ratio of the two fractions is preferably 60: * 10.

Vervolgens wordt het extract overeenkomend met fractie Fr-2 zoals boven aangegeven onderworpen aan de normale fase HPLC voor massaver-zameling ( eluens: een mengsel van n-hexaan/chloroform/methanol in een 35 volumeverhouding van 6 : 1 : 1). De elueerpieken kunnen worden bepaald met behulp van een detector, waarbij fracties worden gekozen op basis van-.-de' pieken overeenkomend met Fr-2-1 en Fr-2-2 fracties, weergegeven in fig. 19, verkregen bij eerder uitgevoerde testen en verzameld en elke fractie wordt 80 0 4 75 1 -6- 21489/Vk/ts ingedampt tot droog ter verkrijging van een wit poederachtig extract, hierna aangegeven als extract B-1 en extract B-2.Then, the extract corresponding to fraction Fr-2 as indicated above is subjected to the normal phase HPLC for mass collection (eluent: a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 6: 1: 1). The elution peaks can be determined using a detector, choosing fractions based on the peaks corresponding to Fr-2-1 and Fr-2-2 fractions, shown in Figure 19, obtained in tests previously performed and collected and each fraction is evaporated to dryness to give a white powdery extract, hereinafter referred to as extract B-1 and extract B-2. 80 0 4 75 1 -6-21489 / Vk / ts.

Anderzijds wordt het extract overeenkomend met Fr-3-fractie onderworpen aan de omgekeerde fase HPLC voor massaverzameling ( eluens : 65-75 5 vol. % waterige methanoloplossing). De elueerpieken kunnen worden bepaald met een detector,waarbij de fracties kunnen worden gekozen op basis van de piekhoogte overeenkomend met Fr-3-1, weergegeven in fig. 22, eerst verkregen door eerder uitgevoerde testen waarbij deze zijn verzameld en ingedampt tot droog ter verkrijging van een wit poedervormig extract, dat hierna· 10 wordt aangegeven als extract B-3.On the other hand, the extract corresponding to Fr-3 fraction is subjected to the reverse phase HPLC for mass collection (eluent: 65-75 5% by volume aqueous methanol solution). The elution peaks can be determined with a detector, the fractions being selected based on the peak height corresponding to Fr-3-1 shown in Fig. 22, first obtained by previously performed tests collected and evaporated to dryness to obtain of a white powdered extract, hereinafter referred to as · 10 as extract B-3.

De aldus verkregen extracten volgens de uitvinding hebben de volgende karakteristieke punten.The extracts according to the invention thus obtained have the following characteristic points.

1) Eigenschappen: a) Extract A is een bruin poeder terwijl extract B-1, B-2 en B-3 15 een wit poeder is. Deze poeders smaken bitter en geven een kaneelzuurachtige geur wanneer een natronloogoplossing hieraan wordt toegevoegd en het mengsel wordt verwarmd.1) Properties: a) Extract A is a brown powder while extract B-1, B-2 and B-3 15 is a white powder. These powders taste bitter and have a cinnamon acid-like odor when a sodium hydroxide solution is added and the mixture is heated.

B) De oplosbaarheid ( extracten A, B-1, B-2 en B-3). .B) The solubility (extracts A, B-1, B-2 and B-3). .

Oplosbaar in lagere alcoholen en in gechloreerde koolwaterstoffen, 20 behalve tetrachloorkoolstof.Soluble in lower alcohols and in chlorinated hydrocarbons, except carbon tetrachloride.

Onoplosbaar in alifatische koolwaterstoffen, tetrachloorkoolstof of aromatische koolwaterstoffen.Insoluble in aliphatic hydrocarbons, carbon tetrachloride or aromatic hydrocarbons.

2) U.V.-spectra ( extracten A, B-1, B-2 en B-3).2) U.V. spectra (extracts A, B-1, B-2 and B-3).

λ. * 280 nra in methanol.λ. 280 nra in methanol.

max 25 3) Massaspectra ( extracten A, B-1, B-2 en B-3).max 25 3) Mass spectra (extracts A, B-1, B-2 and B-3).

Geven een basispiek van een kaneelzuurkation bij m/e = 131 en een ionpiek van acetylkation bij m/e = 43.Give a base peak of a cinnamic acid cation at m / e = 131 and an ion peak of acetyl cation at m / e = 43.

Zodoende wordt de aanwezigheid van kaneelzuur en azijnzure esters in de extracten verondersteld.Thus, the presence of cinnamic acid and acetic acid esters in the extracts is assumed.

30 4) Vloeistofchromatografie.30 4) Liquid chromatography.

Omstand igh ed en.Circumstances.

Vulmiddel: silicagel (Wako-gel LC-5H-volledig poreus, fijngemaakt type, 5 ^i, bereid door Wako Junyako Co., Ltd. in Japan).Filler: Silica gel (Wako gel LC-5H fully porous, comminuted type, 5 ^ i prepared by Wako Junyako Co., Ltd. in Japan).

Kolom: inwendige diameter x lengte is 4 mm x 200 mm.Column: internal diameter x length is 4 mm x 200 mm.

35 Elueermiddel: een mengsel van n-hexaan/chloroform/methanol (volume- verhouding a 7 : 2 : 1)35 Eluant: a mixture of n-hexane / chloroform / methanol (volume ratio a 7: 2: 1)

Stroomsnelheid : 1,5 ml/minuut 2Flow rate: 1.5ml / minute 2

Druk: 30 kg/cm 80 04 75 1 * « -7- 21489/Vk/tsPressure: 30 kg / cm 80 04 75 1 * «-7- 21489 / Vk / ts

Bepaling: bij Ü.V. = 280 nm ( 0,64 AUPS)Provision: at Ü.V. = 280 nm (0.64 AUPS)

Onder de bovenvermelde omstandigheden werd 20 mg van elk van de extracten A, B-1, B-2, B-3 opgelost in 10 ml chloroform en onderworpen aan vloeistof chroma tograf ie. De verkregen karakteristieke figuren zijn weer-5 gegeven in fig. 1, 20-21 en 23» waarbij de gegevens betrekking hebben op de verbindingen verkregen uit extract A bereid in voorbeeld I, extract B-1 en B-2, bereid volgens voorbeeld XVIII en extract B-3 bereid in voorbeeld XIX.Under the above conditions, 20 mg of each of extracts A, B-1, B-2, B-3 were dissolved in 10 ml of chloroform and subjected to liquid chromatography. The resulting characteristic figures are shown in Figures 1, 20-21 and 23, the data relating to the compounds obtained from extract A prepared in example I, extract B-1 and B-2 prepared according to example XVIII and extract B-3 prepared in Example XIX.

5) Kleurreactie ( extracten A, B-1, B-2 en B-3).5) Color reaction (extracts A, B-1, B-2 and B-3).

10 Keiler Kiliani reactie ( Helvetic Chimica Acta., 31 , bl .. 883 ' (1948)): positief ( groenbruin) ' · . Liebermann Burchard reactie ( Iwanami’s Dictionary of Physics and Chemistry, 3e editie, blz. 1411 (1977)): positief (blauw-groen).10 Keiler Kiliani reaction (Helvetic Chimica Acta., 31, bl. 883 '(1948)): positive (green-brown)' ·. Liebermann Burchard reaction (Iwanami's Dictionary of Physics and Chemistry, 3rd edition, p. 1411 (1977)): positive (blue-green).

Zodoende wordt aangenomen dat de extracten in hoofdzaak bestaan uit 15 stereoïde glyccsi'.den met 2,6-deoxysuikereenheden.Thus, the extracts are believed to consist essentially of 15 steroid glycssides with 2,6-deoxy sugar units.

De anti-tumoractiviteit van de extract® volgens de uitvinding werd bevestigd door het uitvoeren van experimenten die hieronder nader zijn toegelicht.The anti-tumor activity of the extract® according to the invention was confirmed by carrying out experiments which are further explained below.

Twee typen tumoren Sarcoma-180 en Ehrlich carcinoma, werden gebruikt 2Q ter bepaling van de anti-tumoreigenschappen en de onderzochte tumoren waren van het subcutane tuberkel type. De groep van dieren waaraan de extracten volgens de uitvinding werdί.toegediend bestond uit zeven muizen terwijl de vergelijkende groep bestond uit tien muizen.Two types of tumors, Sarcoma-180 and Ehrlich carcinoma, were used to determine the anti-tumor properties and the tumors examined were of the subcutaneous tubercle type. The group of animals to which the extracts of the invention were administered consisted of seven mice while the comparative group consisted of ten mice.

Test-methode.Test method.

25 1). Sarcoma-180.25 1). Sarcoma-180.

De onderzochte dieren waren zes weken oude ICR-vrouwelijke muizen met een lichaamsgewicht van 30-32 g..The animals studied were six week old ICR female mice with a body weight of 30-32 g.

De tumor werd intraperitoneaal getransplanteerd in. de muis. Op de zevende dag na de transplantatie werden de goed gegroeide tumorcellen ver-wijderd en 4 x 10^ cellen werden vervolgens subcutaan getransplanteerd in het inguinale deel van de muis ter vorming van vaste tumoren. Na 24 uren gerekend vanaf de transplantatie en later werden de extracten volgens de uitvinding, opgelost in een fysiologische zoutoplossing intraperitoneaal aan de muizen toegediend.The tumor was transplanted intraperitoneally in. the mouse. On the seventh day after transplantation, the well-grown tumor cells were removed and 4x10 4 cells were then transplanted subcutaneously into the inguinal part of the mouse to form solid tumors. After 24 hours from transplantation and later, the extracts according to the invention, dissolved in physiological saline, were administered intraperitoneally to the mice.

25 Het volume van de respectievelijke oplossingen die toegediend wer den aan een muis was per keer 0,2 ml en de toediening werd gedurende 10 dagen voortgezet in een hoeveelheid van een keer per dag. Aan de vergelijkende groep muizen werd alleen een fysiologische zoutlopiossing toegediend.The volume of the respective solutions administered to a mouse was 0.2 ml at a time and the administration was continued in an amount of once a day for 10 days. Only a physiological saline run was administered to the comparative group of mice.

Op de dertigste dag na de transplantatie werden de tumoren verwij- -8- 21489/Vk/ts derd om het gemiddelde gewicht te meten van de tumor van de muis in de groep, van dieren die behandeld waren met het extract volgens de uitvinding ( T) en die van de vergelijkende groep (C) ter berekening van T/C (%).On the thirtieth day after transplantation, the tumors were removed to measure the mean weight of the mouse tumor in the group of animals treated with the extract of the invention (T-21489 / Vk / ts). ) and that of the comparative group (C) to calculate T / C (%).

2) Ehrlich carcinoma.2) Ehrlich carcinoma.

5 De voor de experimenten toegepaste dieren waren zes weken oude ddY vrouwelijke muizen met een gewicht van 28-30 g.The animals used for the experiments were six week old ddY female mice weighing 28-30 g.

De tumor werd intraperitoneaal getransplanteerd in de muizen . Op de zevende dag na de transplantatie werden de goed gegroèide tumorcellen verwijderd en 1,5 x 10^ cellen hiervan werden subcutaan getransplanteerd in 10 het inguineale deel van de muis ter vorming van Vaste tumoeen en vervolgens behandeld zoals beschreven bij Sarcoma-180 om de T/C-waarde (%) te berekenen.The tumor was transplanted intraperitoneally in the mice. On the seventh day after transplantation, the well-grown tumor cells were removed and 1.5 x 10 6 cells thereof were transplanted subcutaneously in the inguinal part of the mouse to form solid tumors and then treated as described in Sarcoma-180 for the T / C value (%).

De hierbij verkeegen gegevens zijn samengevat in tabel A.The data obtained herewith are summarized in table A.

80 0 4 75 1 * 4 -9- 21489/Vk/ts80 0 4 75 1 * 4 -9- 21489 / Vk / ts

Tabel A.Table A.

extract uit dosering tien T/C (%) voorbeeld keer ( rag/kg) Ëhrïich Γ” „n carcinoma ^ooma-180 5 A/I 40 34,1 15,2 A/III 40 39, 0 23 T 5 A/IV 40 32,3 35,2 10 A/V 40 44,7 31r 0 A/VI 40 40,1 39,3 A/VII 40 38,5 41,3 A/VIII 40 13»5 19 »8 15 Α/Ιχ lio 15 39>8 A/X 22,8 26,6 A/XI 40 . .. 32,1 40»° A/XII 40 30» 5 32}7 20 A/Xlïl 40 .40,3 28,4 A/XV 40 30 >0 22,2 A/XVII 40 23,1 19,0 B-1 /XVIII 15 24,3 13,6 25 B-2/XVIII 15 2 9,8 5,0 B-3/XIX 15 31,0 2 0,0 B-.1/XX 15 18,0 9,2 30 B-2/xx 15 21,0 4,7 B-3/m 15 3 0,3 15,2 8 0 0 4 75 1 35 -10- 21489/Vk/tsextract from dosage ten T / C (%) example times (rag / kg) hrïich Γ ”„ n carcinoma ^ ooma-180 5 A / I 40 34.1 15.2 A / III 40 39.0 23 T 5 A / IV 40 32.3 35.2 10 A / V 40 44.7 31r 0 A / VI 40 40.1 39.3 A / VII 40 38.5 41.3 A / VIII 40 13 »5 19» 8 15 Α / Ιχ lio 15 39> 8 A / X 22.8 26.6 A / XI 40. .. 32.1 40 ° A / XII 40 30 »5 32} 7 20 A / Xlil 40 .40.3 28.4 A / XV 40 30> 0 22.2 A / XVII 40 23.1 19.0 B-1 / XVIII 15 24.3 13.6 25 B-2 / XVIII 15 2 9.8 5.0 B-3 / XIX 15 31.0 2 0.0 B-.1 / XX 15 18.0 9 , 2 30 B-2 / xx 15 21.0 4.7 B-3 / m 15 3 0.3 15.2 8 0 0 4 75 1 35 -10- 21489 / Vk / ts

Vervolgens werden de extracten volgens de uitvinding toegediend aan vijf weken ouden ddY vrouwelijke muizen met een lichaamsgewicht van 21-35 g, welke toediening intraperitoneaal werd uitgevoerd om de acute toxische waarden ( LD^) te bepalen. De hierbij verkregen resultaten 5 zijn samengevat in tabel B.Subsequently, the extracts according to the invention were administered to five week old ddY female mice with a body weight of 21-35 g, which administration was performed intraperitoneally to determine the acute toxic values (LD ^). The results 5 hereby obtained are summarized in table B.

Tabel B.Table B.

I aMMMMM-MMBMMiW··· ......... > “ ' ’ extract uit voorbeeld LD (mg/kg) _5 Q _^_I aMMMMM-MMBMMiW ··· .........> “'' extract from example LD (mg / kg) _5 Q _ ^ _

A/I i+OOA / I i + OO

10 A/VIII 1+15 A/XII 3 98 B-1/XVIII 610 15 B-2/XVIII 78 B-3/XIX 382 B-1/XX 608 B-2/XX 8 0 2C B-3/XXI 37010 A / VIII 1 + 15 A / XII 3 98 B-1 / XVIII 610 15 B-2 / XVIII 78 B-3 / XIX 382 B-1 / XX 608 B-2 / XX 8 0 2C B-3 / XXI 370

De extracten volgens de uitvinding kunnen oraal aan de mens worden toegediend, door injectie (intraveneus, subcutaan of intramusculair) of op 25 een andere wijze.The extracts of the invention can be administered to man orally, by injection (intravenous, subcutaneous or intramuscular) or otherwise.

Wanneer de extracten volgens de uitvinding worden toegepast in· de vorm van een vast preparaat voor orale toediening, kan dit gebeuren met preparaten zoals tabletten, granules, poeders, capsules of dergelijke. De preparaten kunnen ook additieven bevatten zoals een hulpstof, met name een 30 saccharide of cellulosepreparaat, een bindmiddel zoals zetmeefcasta of methyl-cellulose, een vulmiddel, een desintegratiemiddel en dergelijte» welke stoffen gewoonlijk worden toegepast bij de bereiding van geneeskundige preparaten. Wanneer de extracten volgens de uitvinding worden toegepast ter verkrijging van een vloeistof die oraal kan worden toegedien, kan het pre-35 paraat gekozen worden uit een waterhoudend preparaat voor inwendig gebruik, suspensie, emulsie, stroop en dergelijke en verder in de vorm van gedroogde produkten die voor gebruik kunnen worden opgelost.When the extracts according to the invention are used in the form of a solid preparation for oral administration, this can be done with preparations such as tablets, granules, powders, capsules or the like. The compositions may also contain additives such as an adjuvant, especially a saccharide or cellulose composition, a binder such as starch casta or methyl cellulose, a filler, a disintegrant and the like which are commonly used in the preparation of medical compositions. When the extracts according to the invention are used to obtain a liquid that can be administered orally, the preparation can be selected from an aqueous preparation for internal use, suspension, emulsion, syrup and the like and further in the form of dried products that can be dissolved before use.

Wanneer de extracten volgens de uitvinding oraal worden toegediend aan volwassenen, kunnen de extracten worden toegepast in een dosering van 80 0 4 75 1 * * -11- 21489/Vk/ts 3,0-30,0 mg/kg (extract A) , 1,2-48,0 mg/kg (extract B—1), 1,2-6,0 mg/kg (extract B-2),of 1,2-30,0 mg/kg (extract B-3) per dag. De dosering kan natuurlijk worden verhoogd of verlaagd in afhankelijkheid van de omstandigheden van de ziekte, de ouderdom van de patiënt, de vorm van het prepa-5 raat en dergelijke.When the extracts according to the invention are administered orally to adults, the extracts can be used in a dose of 80 0 4 75 1 * * -11- 21489 / Vk / ts 3.0-30.0 mg / kg (extract A) , 1.2-48.0 mg / kg (extract B-1), 1.2-6.0 mg / kg (extract B-2), or 1.2-30.0 mg / kg (extract B- 3) per day. The dose can of course be increased or decreased depending on the conditions of the disease, the age of the patient, the form of the composition and the like.

De extracten volgens de uitvinding kunnen worden geïnjecteerd in de vorm van een waterige oplossing, suspensie of oliehoudende of waterige emulsie, maar gewoonlijk worden de injecties bereid door de actieve stof op te lossen of te suspenderen in een waterig medium zoals steriel water of een 10 fysiologische zoutoplossing. Indien noodzakelijk kunnen conventioneel toegepaste oplosmiddelen worden toegepast, evenals stabilisatoren, verduurza-mingsmiddelen, additieven ter bereiding van isotone oplossingen en dergelijke welke hulpstoffen kunnen worden toegevoegd aan de injecteerbare vloeistof.The extracts according to the invention can be injected in the form of an aqueous solution, suspension or oil-containing or aqueous emulsion, but usually the injections are prepared by dissolving or suspending the active substance in an aqueous medium such as sterile water or a physiological saline. If necessary, conventionally used solvents can be used, as well as stabilizers, preservatives, additives for preparing isotonic solutions and the like which can be added to the injectable liquid.

De aldus verkregen injecteerbare preparaten worden intraveneus, 15intramusaulair, subcutaan of op een andere geschikte wijze toegediend.The injectable preparations thus obtained are administered intravenously, intramuscularly, subcutaneously or in another suitable manner.

Wanneer de injecties parenteraal aan volwassenen worden toegediend, kunnen deze 1,0-10,0 mg/kg extract A per dagtkrijgen toegediend of 0,4-16,0 mg/kg extract B-1, 0,4-2,0 mg/kg extract B-2 of 0,4-10,0 mg/kg extract B-3.When injected parenterally to adults, these may be administered 1.0-10.0 mg / kg extract A per day or 0.4-16.0 mg / kg extract B-1, 0.4-2.0 mg / kg extract B-2 or 0.4-10.0 mg / kg extract B-3.

Dit gehalte kan natuurlijk worden verhoogd of verlaagd in afhankelijkheid 20 van de omstandigheden van de ziekte, de leeftijd van de patiënt, de vorm van het preparaat, de wijze van toediening en dergelijke.This level can of course be increased or decreased depending on the conditions of the disease, the age of the patient, the form of the preparation, the mode of administration and the like.

De uitvinding wordt nader toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden, waarbij verwezen is naar de bijgevoegde tekening, waarin: fig. 1 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract 25a, verkregen volgens voorbeeld I, te onderwerpen aan analytische HPLC.The invention is further illustrated by the following examples, reference being made to the accompanying drawing, in which: Figure 1 shows a chromatogram obtained by subjecting extract 25a obtained according to Example I to analytical HPLC.

fig. 2 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract A, verkregen in voorbeeld II te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 2 shows a chromatogram obtained by subjecting extract A obtained in Example II to analytical HPLC.

fig. 3 geeft een chromatogram weer dat verkregen is van extract A, verkregen in voorbeeld III door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Fig. 3 shows a chromatogram obtained from extract A obtained in Example III by subjecting it to analytical HPLC.

3° fig. 4 geeft een chromatogram weer van extract A, verkregen in voorbeeld IV door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Fig. 4 shows a chromatogram of extract A obtained in example IV by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 5 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld V door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 5 shows a chromatogram of extract A obtained in Example V by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 6 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in 35 voorbeeld VI door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 6 shows a chromatogram of extract A obtained in Example VI by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 7 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld VII door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 7 shows a chromatogram of extract A obtained in Example VII by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 8 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in -12- 21489/Vk/ts voorbeeld VIII ? door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 8 shows a chromatogram of extract A obtained in -12- 21489 / Vk / ts Example VIII? by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 9 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld IX door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 9 depicts a chromatogram of extract A obtained in Example IX by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 10 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in 5 voorbeeld X door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 10 shows a chromatogram of extract A obtained in Example X by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 11 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XI door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 11 shows a chromatogram of extract A obtained in Example XI by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 12 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XII door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 12 shows a chromatogram of extract A obtained in Example XII by subjecting it to analytical HPLC.

10 fig. 13 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XIII door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 13 shows a chromatogram of extract A obtained in Example XIII by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 14 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld Χ1Γ door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 14 shows a chromatogram of extract A obtained in example Χ1Γ by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 15 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in 15 voorbeeld XV door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 15 shows a chromatogram of extract A obtained in Example XV by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 16 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XVI door dit te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 16 shows a chromatogram of extract A obtained in Example XVI by subjecting it to analytical HPLC.

fig. 17 geeft een chromatogram weer van extract A verkregen in voorbeeld XVII door dit te onderwerpen aan analytisch HPLC.Figure 17 depicts a chromatogram of extract A obtained in Example XVII by subjecting it to analytical HPLC.

20 fig. 18 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract A verkregen in voorbeeld I te onderwerpen aan HPLC voor massaverzameling.Fig. 18 shows a chromatogram obtained by subjecting extract A obtained in Example I to HPLC for mass collection.

fig, .19 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door fractie Fr-2, aangegeven in fig. 18, te onderwerpen aan HPLC voor massaverzameling. fig. 20 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract 25 B-1, verkregen volgens voorbeeld XVIII te onderwerpen aan analytische HPLC.FIG. 19 shows a chromatogram obtained by subjecting fraction Fr-2, indicated in FIG. 18, to HPLC for mass collection. Figure 20 shows a chromatogram obtained by subjecting extract 25 B-1 obtained according to Example XVIII to analytical HPLC.

fig. 21 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract B-2, verkregen in voorbeeld XVIII te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 21 shows a chromatogram obtained by subjecting extract B-2 obtained in Example XVIII to analytical HPLC.

fig. 22 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door de Fr-3 fractie, aangegeven in fig. 18, te onderwerpen aan HPLC voor massa-30 verzameling.Figure 22 depicts a chromatogram obtained by subjecting the Fr-3 fraction indicated in Figure 18 to HPLC for mass collection.

fig. 23 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract B-3 verkregen in voorbeeld XIX te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 23 depicts a chromatogram obtained by subjecting extract B-3 obtained in Example XIX to analytical HPLC.

fig. 24 geeft een chromatogram weer dat verkregen is door extract B-1 verkregen in voorbeeld XX, te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 24 shows a chromatogram obtained by subjecting extract B-1 obtained in Example XX to analytical HPLC.

35 fig. 25 geeft een chromatogram weer dat is verkregen door extract B-2, verkregen in voorbeeld XX te onderwenpen aan analytische HPLC.Fig. 25 shows a chromatogram obtained by subjecting extract B-2 obtained in Example XX to analytical HPLC.

fig. 26 geeft een chromatogram weer dat is verkregen door extract B-3 verkregen in voorbeeld XXI te onderwerpen aan analytische HPLC.Figure 26 shows a chromatogram obtained by subjecting extract B-3 obtained in Example XXI to analytical HPLC.

80 04 75 1 -13- 21489/Vk/ts t v VOORBEELD I.80 04 75 1 -13- 21489 / Vk / ts t v EXAMPLE I.

1 1 Methanol werd toegevoegd aan 500 g fijn verdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. en het mengsel werd gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel afgefil-5 treerd en het residu werd op dezelfde wijze nogmaals drie keren behandeld, waarbij elke keer 0,75 1 methanol werd toegepast.1 1 Methanol was added to 500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. and the mixture was left at room temperature overnight. The mixture was then filtered off and the residue was treated in the same manner three more times, using 0.75 L of methanol each time.

Alle filtraten werden gecombineerd en vervolgens ingedarapt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 69 g extract. Aan dit extract, overgebracht in een scheidtrechter, 10 weid toegevoegd 150 ml chloroform, waarna het mengsel flink werd geschud en vervolgens werdJeen chloroformlaag verkregen. Aan het residu werd 50 ml chloroform toegevoeg^, welke bewerking nogmaals drie keren weid uitgevoerd.All filtrates were combined and then evaporated to dryness at a temperature of 45 ° C under reduced pressure to obtain 69 g of extract. 150 ml of chloroform were added to this extract, transferred to a separatory funnel, the mixture was shaken vigorously and then a chloroform layer was obtained. 50 ml of chloroform was added to the residue, this operation being carried out again three times.

Alle chloroformextracten werden gecombineerd en vervolgens onderworpen aan filtratie onder afzuiging onder toepassing van een Fibra-Cel BH-40 ( Johns 15 Manville Co., Ltd.) als filtratiehulpstof. Het verkregen filtraat werd tot droog ingedampt bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 42 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform, dat hieraan weid toegevpegd, waarna 100 ml n-hexaan werd toegevoegd. Het verkregen mengsel werd goed geroerd en werd daarna gedurende 12 uren be-SOwaard. Vervolgens werd het gedecanteerd ter verkrijging van het onoplosbare gedeelte. Dit gedeelte werd opgelost in 25 ml chloroform, waarna 50 ml n-hexaan werd toegevoegd en de oplossing werd goed geroerd en werd gedurende 2 uren bewaard. De oplossing werd onderworpen aan decantatie ter verkrijging van het onoplosbare gedeelte en vervolgens op dezelfde wijze zoals 25 boven is aangegeven nogmaals drie keren bewerkt. Het uiteindelijk verkregen onoplosbare gedeelte werd gedroogd bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk gedurende 6 uren en fijn gemaakt ter verkrijging van 18 g bruin poedervormig extract A.All chloroform extracts were combined and then subjected to suction filtration using a Fibra-Cell BH-40 (Johns 15 Manville Co., Ltd.) as a filtration aid. The resulting filtrate was evaporated to dryness at a temperature of 40 ° C under reduced pressure to obtain 42 g of extract. This extract was dissolved in 50 ml of chloroform, which was added thereto, and 100 ml of n-hexane was added. The resulting mixture was stirred well and then stored for 12 hours. It was then decanted to yield the insoluble portion. This portion was dissolved in 25 ml of chloroform, 50 ml of n-hexane was added and the solution was stirred well and stored for 2 hours. The solution was subjected to decantation to obtain the insoluble portion and then processed three more times in the same manner as indicated above. The insoluble portion finally obtained was dried at a temperature of 45 ° C under reduced pressure for 6 hours and comminuted to obtain 18 g of brown powdered extract A.

Het aldus bereide extract A in een hoeveelheid van 20 mg werd opge-30 lost in 10 ml chloroform en de verkregen oplossing werd onderworpen aan analytische HPLC ( vulmiddel silicagel-Wako-gel LC-5H, bereid door Wako Junyaku Industry Co, Ltd.,volledig poreus, fijn gemalen stof, 5yun, in een kolom met een binnendiameter x lengte van 4 mm x 200 mm en als elueer-middel werd een mengsel gebruikt van n-hexaan/chloroform/methanol in .een 35 vólumeverhouding van 7:2: 1. De stroomsnelheid bedroeg 1,5 ml/minuut 2 en de druk 30 kg/cm en de bepaling had plaats bij U.V. licht van 280 nm (0,64 AUFS)). De hierbij verkregen gegevens zijn weergegeven in het chromatogram van fig. 1.The extract A thus prepared in an amount of 20 mg was dissolved in 10 ml of chloroform and the resulting solution was subjected to analytical HPLC (filler silica gel-Wako gel LC-5H, prepared by Wako Junyaku Industry Co, Ltd., fully porous, finely milled dust, 5yun, in a column with an inner diameter x length of 4 mm x 200 mm and as eluent a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 7: 2 was used: 1. The flow rate was 1.5 ml / minute 2 and the pressure was 30 kg / cm and the determination was made under UV light of 280 nm (0.64 AUFS)). The data obtained here is shown in the chromatogram of Fig. 1.

an n l 7* 1 -14- 21489/Vk/ts VOORBEELD II.an n l 7 * 1 -14- 21489 / Vk / ts EXAMPLE II.

Op dezelfde wijze als het eerste gedeelte van de bewerking in voorbeeld I is uitgevoerd werd nu 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. geëxtraheerd met chloroform.In the same manner as the first part of the operation in Example I was carried out, 500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. extracted with chloroform.

5 De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk, ter verkrijging van 46 g extract. Aan dit extract werd 100 ml methanol toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en vervolgens afgefiltreerd. Het residu, teet hieraan toegevoegd 30 ml methanol, werd nogmaals 4 keren behandeld op een wijze zoals boven 10 is aangegeven. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 24 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform die hieraan werd toegevoegd en vervolgens verder behandeld zoals aangegeven in voorbeeld I ter verkrijging van 13 g bruin poedervormig extract A. De gegevens 15 met betrekking tot dit extract na het te hebben onderworpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 2.The filtrates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 40 ° C under reduced pressure, to obtain 46 g of extract. 100 ml of methanol were added to this extract and the mixture was stirred well and then filtered. The residue, added to this, 30 ml of methanol, was treated a further 4 times in a manner as indicated above 10. The filtrates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 45 ° C under reduced pressure to obtain 24 g of extract. This extract was dissolved in 50 ml of chloroform which was added thereto and then further treated as indicated in Example I to obtain 13 g of brown powdered extract A. The data relating to this extract after being subjected to HPLC under the same conditions as indicated in example I, are shown in fig. 2.

VOORBEELD III. .EXAMPLE III. .

Hierbij ging men tewerk op dezelfde manier als aangegeven in voor-20 beeld I, doch onder toepassing van ethanol in plaats van methanol in de eerste bewerking, zodat 14,1 g poedervormig bruin extract A werd verkregen.This was done in the same manner as in Example 1, but using ethanol instead of methanol in the first operation to obtain 14.1 g of brown extract A powder.

De gegeveis met betrekking tot dit extract A wanneer dit is onderworpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als vermeld in voorbeeld I zijn weergegeven in fig. 3.The details of this extract A when subjected to HPLC under the same conditions as in Example 1 are shown in Figure 3.

25 VOORBEELD IV.EXAMPLE IV.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald waarbij echter isopropanol werd toegepast in plaats van methanol in de eerste •bewerking, zodat 13,7 g bruin poedervormig extract A werd verkregen.The procedure indicated in Example I was repeated, however, using isopropanol instead of methanol in the first operation to obtain 13.7 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tot extract A, onderworpen aan HPLC, 30 onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn vermeld in fig. 4.The data regarding extract A, subjected to HPLC, under the same conditions as indicated in example I, are shown in figure 4.

VOORBEELD V.EXAMPLE V.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald onder toepassing echter van dichloormethaan in plaats van chloroform bij de twee-35 de bewerking, zodat 16 g bruin, poedervormig extract A werd verkregen.The procedure outlined in Example 1 was repeated using dichloromethane instead of chloroform in the second operation to obtain 16 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tot dit extract A na HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I zijn weergegeven in fl8'5' 80 0 4 75 1 -15- 21489/Vk/ts VOORBEELD VI.The data related to this extract A after HPLC processing under the same conditions as indicated in Example 1 are shown in fl8'5 '80 0 4 75 1 -15- 21489 / Vk / ts EXAMPLE VI.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald, waarbij echter pentaan werd gebruikt in plaats van n-hexaan in de derde bewerking, zodat 15,9 g bruin, poedervormig extract A werd verkregen.The procedure set forth in Example I was repeated, using pentane instead of n-hexane in the third operation to obtain 15.9 g of brown powdered extract A.

5 De gegevens die verkregen zijn door dit extract A te onderwerpen aan een HPLC -bewerking onder omstandigheden zoals aangegeven in voorbeeld I, zijn samengevat in fig. 6.The data obtained by subjecting this extract A to an HPLC operation under conditions as indicated in Example I are summarized in Figure 6.

VOORBEELD VII.EXAMPLE VII.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld I werd herhaald, waar-10 bij echter heptaan werd gebruikt in plaats van n-hexaan bij de derde bewerking, zodat 16,8 g bruin, poedervormig extract A werd verkregen.The procedure set forth in Example I was repeated, however, using heptane instead of n-hexane in the third operation to obtain 16.8 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tot de HPLC-bewerking van dit extract A onder dezelfde omstandigheden als vermeld in voorbeeld I zijn weergegeven in fig. 7.The data related to the HPLC processing of this extract A under the same conditions as in Example I are shown in Figure 7.

15 voorbeeld VIII.Example VIII.

Aan 40 g extract verkregen door het uitvoeren van de eerste en tweede bewerking zoals vermeld in voorbeeld I werd toegevoegd 50 ml tetra-ohloorkoolstof en het mengsel werd goed geroerd en gedurende 12 uren bewaard. Vervolgens werd het mengsel onderworpen aan decantatie ter verkrij-20 ging van het onoplosbare gedeelte. Aan dit onoplosbare gedeelte werd 25 ml tetrachloorkoolstof toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en werd gedurende 5 uren bewaard. Het mengsel werd onderworpen aan decantatie ter verkrijging van het onoplosbare gedeelte, dat vervolgens op dezelfde wijze nogmaals twee keren werd behandeld. Het uiteindelijk verkregen onoplosbare 25 deel werd gedroogd bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk gedurende 6 uren en fijngemaakt ter verkrijging van 17,4 g bruin, poedervormig extract A.To 40 g of extract obtained by carrying out the first and second operations as mentioned in Example I, 50 ml of carbon tetrachloride were added and the mixture was stirred well and stored for 12 hours. Then the mixture was subjected to decantation to obtain the insoluble part. To this insoluble portion was added 25 ml of carbon tetrachloride and the mixture was stirred well and stored for 5 hours. The mixture was subjected to decantation to obtain the insoluble portion, which was then treated twice more in the same manner. The insoluble portion finally obtained was dried at a temperature of 45 ° C under reduced pressure for 6 hours and crushed to obtain 17.4 g of brown powdered extract A.

De gegevens die verkregen zijn door dit extract A te onderwerpen aan HPLC, onder dezelfde ^omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, 30 zijn weergegeven in fig. 8.The data obtained by subjecting this extract A to HPLC under the same conditions as indicated in Example 1, 30 are shown in Figure 8.

VOORBEELD IX.EXAMPLE IX.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld XVIII werd herhaald,waarbij echter tolueen werd gebruikt in plaats van tetrachloorkoolstof in de derde bewerking , zodat 12,3 g bruin, poedervormig extract A werd verkre-35 gen.The procedure set forth in Example XVIII was repeated, however using toluene instead of carbon tetrachloride in the third operation to obtain 12.3 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tot dit extract A na een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergege- ïenlnfl8·9 80 0 4 75 1 -16- 21489/Vk/ts VOORBEELD X.The data related to this extract A after an HPLC operation under the same conditions as indicated in example I are shown: 980 0 4 75 1 -16-21489 / Vk / ts EXAMPLE X.

De werkwijze die aangegeven is in voorbeeld VIII werd herhaald waarbij echter benzeen wérd gebruikt in plaats van tetrachloorkoolstof in de derde bewerking, zodat 16,4 g bruin, poedervormig extract A werd 5 verkregen.The procedure indicated in Example VIII was repeated, however using benzene instead of carbon tetrachloride in the third operation to obtain 16.4 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tot dit extract A, onderworpen aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn vermeld in fig. 10.The data related to this extract A, subjected to an HPLC operation under the same conditions as indicated in Example I, is shown in Figure 10.

VOORBEELD XI.EXAMPLE XI.

10 . De werkwijze die aangegeven is in de eerste stap van voorbeeld I10. The method indicated in the first step of Example I

werd herhaald waarbij 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd geëxtraheerd met aceton. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 43 g extract.500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. was extracted with acetone. The filtrates were combined and evaporated to dryness at 40 ° C under reduced pressure to obtain 43 g of extract.

15 Aan dit extract werd toegevoegd 100 ml methanol en het mengsel werd goed geroerd en afgefiltreerd. Aan het residu werd 30 ml methanol toegevoegd en nogmaals vier keren bewerkt zoals boven is aangegeven. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 22 g extract. Aan het 20 extract werd 150 ml chloroform toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en afgefiltreerd. Aan het residu werd 50 ml chloroform toegevoegd en dit werd op dezelfde wijze als boven aangegeven nogmaals drie keren bewerkt. Alle filtraten werden gecombineerd en onderworpen aan filtratie onder afzuiging onder toepassing van Fibra Cel.BH-40 ( Johns Manville Co., Ltd) als 25 filtratiehulpstof en het verkregen filtraat werd ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 20 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform dat hieraan werd toegevoegd en vervolgens opgewerkt zoals aangegeven in voorbeeld I, ter verkrijging van 11,3 g bruin, poedervormig extract A.100 ml of methanol were added to this extract and the mixture was stirred well and filtered. 30 ml of methanol were added to the residue and processed a further four times as indicated above. The filtrates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 45 ° C under reduced pressure to obtain 22 g of extract. 150 ml of chloroform were added to the extract and the mixture was stirred well and filtered. 50 ml of chloroform was added to the residue and this was processed three more times in the same manner as indicated above. All filtrates were combined and subjected to suction filtration using Fibra Cel.BH-40 (Johns Manville Co., Ltd) as a filtration aid and the resulting filtrate was evaporated to dryness at a temperature of 40 ° C under reduced pressure to obtain of 20 g of extract. This extract was dissolved in 50 ml of chloroform which was added thereto and then worked up as indicated in Example I to obtain 11.3 g of brown powdered extract A.

30 De gegevens met betrekking tot dit extract A nadat het onderworpen is aan een HPLC-bewerking , onder omstandigheden zoals vermeld in voorbeeld I, zijn samengevat in fig. 11.The data regarding this extract A after it has been subjected to an HPLC operation, under conditions as mentioned in example I, are summarized in figure 11.

VOORBEELD XII.EXAMPLE XII.

De eerste trap van de bewerking zoals vermeld in voorbeeld I, werd 35 herhaald onder toepassing van 500 g fijnverdeelde schors-van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. dat werd geëxtraheerd met ethylacetaat. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 38 g extract. Aan dit extract 80 0 4 75 1 -17- 21489/Vk/ts werd 100 ml methanol toegevoegd en behandeld op dezelfde wijze als aangegeven in voorbeeld XI ter verkrijging van 15,8 g bruin poedervormig extract A.The first step of the operation as in Example 1 was repeated using 500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. that was extracted with ethyl acetate. The filtrates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 45 ° C under reduced pressure to obtain 38 g of extract. To this extract 80 0 4 75 1 -17-21489 / Vk / ts, 100 ml of methanol was added and treated in the same manner as in Example XI to obtain 15.8 g of brown powdered extract A.

De gegevens verkregen door dit extract A te onderwerpen aan een 5 HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 12.The data obtained by subjecting this extract A to an HPLC operation under the same conditions as indicated in Example I are shown in Fig. 12.

VOORBEELD XIII.EXAMPLE XIII.

Op dezelfde wijze als vermeld voor de eerste trap in voorbeeld I, werd 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. 10 geëxtraheerd met dioxaan. De filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog tij een temperatuur van 50 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 60 g extract.In the same manner as for the first step in Example I, 500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. 10 extracted with dioxane. The filtrates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 50 ° C under reduced pressure to obtain 60 g of extract.

Aan dit extract werd toegevoegd 100 ml methanol en vervolgens werd het mengsel op dezelfde wijze behandeld als aangegeven is in voorbeeld XI 15 ter verkrijgipg van 16 g bruin, poedervormig extract A.100 ml of methanol were added to this extract and then the mixture was treated in the same manner as indicated in Example XI to obtain 16 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tot dit extract A, nadat het onderworpen is aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zi.jn weergegeven in fig. 13.The data relating to this extract A after it has been subjected to an HPLC operation under the same conditions as indicated in Example 1 are shown in Figure 13.

VOORBEELD XIV.EXAMPLE XIV.

20 Aan 500 g fijnverdeelte schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd toegevoegd 1 liter methanol en het mengsel werd gekookt onder terugvloeikoeling op een waterbad bij een temperatuur van 50 °C onder toepassing van een terugvloeikoeler, welke extractie gedurende 5 uren werd uitgevoerd. De filtratie werd onder verhoogde temperatuur bewerkstelligd 25 en het residu waaraan 0,75 1 methanol was toegevoegd werd behandeld op dezelfde wijze als boven is aangegeven, welke bewerking nogmaals drie keren werd uitgevoerd. Vervolgens werd het mengsel opgewerkt zoals aangegeven in '’voorbeeld I ter verkrijging van 21,5 g bruin, poedervormig extract A.20 To 500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. 1 liter of methanol was added and the mixture was refluxed on a water bath at a temperature of 50 ° C using a reflux condenser, which extraction was carried out for 5 hours. The filtration was effected under elevated temperature and the residue to which 0.75 L of methanol had been added was treated in the same manner as above, which operation was performed three more times. The mixture was then worked up as indicated in Example 1 to obtain 21.5 g of brown powdered extract A.

De gegevens met betrekking tbt dit extract A nadat het onderworpen 30 is aan een HPLC-bewerking onder omstandigheden zoals vermeld in voorbeeld I, zijn aangegeven in fig. 14.The data concerning this extract A after it has been subjected to an HPLC operation under conditions as mentioned in example I are shown in fig. 14.

VOORBEELD XV.EXAMPLE XV.

Aan 500 g fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd 2,5 liter heet water toegevoegd, welk mengsel goed werd geroerd.To 500 g of finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. 2.5 liters of hot water was added, which mixture was stirred well.

35 Het mengsel bleef· daarna gedurende een nacht staan bij kamertemperatuur.The mixture was then left overnight at room temperature.

Het mengsel werd afgefiltreerd en het residu werd nogmaals vier keren behandeld op de wijze zoals boven aangegeven, waarbij elke keer 1 liter heet water werd toegepast. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot 80 04 75 1 -18- 21489/Vk/ts droog bij een temperatuur van 50°C onder verlaagde druk ter verkrijging van 94 g extract.The mixture was filtered and the residue was again treated four times as above, using 1 liter of hot water each time. All filtrates were combined and evaporated to 80 04 75 1 -18-21489 / Vk / ts dry at a temperature of 50 ° C under reduced pressure to obtain 94 g of extract.

Aan dit extract werd 300 ml methanol toegevoegd en het mengsel werd goed geroerd en afgefiltreerd. Aan het residu werd 100 ml methanol 5 toegevoegd en deze behandeling werd nogmaals vier keren uitgevoerd. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 53 g extract.300 ml of methanol were added to this extract and the mixture was stirred well and filtered. 100 ml of methanol 5 was added to the residue and this treatment was carried out a further four times. All filtrates were combined and evaporated to dryness at 45 ° C under reduced pressure to obtain 53 g of extract.

Aan dit extract werd in een scheidtrechter 150 ml chloroform toegevoegd en het mengsel werd vervolgens behandeld op dezelfde wijze als aange-10 geven is in voorbeeld I ter verkrijging van 5,6 g bruin poedervormig extract A.150 ml of chloroform were added to this extract in a separatory funnel and the mixture was then treated in the same manner as indicated in Example 1 to obtain 5.6 g of brown powdered extract A.

De gegevens verkregen door dit extract A te onderwerpen aan een HPLC-bewerking zoals vermeld in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 15. VOORBEELD XVI.The data obtained by subjecting this extract A to an HPLC operation as mentioned in Example I are shown in Fig. 15. EXAMPLE XVI.

15 Fijnverdeelde schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil. werd in een hoeveelheid van 500 g verwarmd in een autoclaaf bij 120 °C gedurende 30 minuten, waarna 2 liter water werd toegevoegd en vervolgens werd het mengsel gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel afgefiltreerd en aan het residu werd 1 liter water toegevoegd 20 en deze behandeling nogmaals vier keren uitgevoerd op dezelfde wijze als boven is aangegeven. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 50 °C onder verlaagde druk ter verkrijging van 96 g extract. Vervolgens werd het mengsel behandeld op een wijze zoals aangegeven is in voorbeeld XV ter verkrijging van 6,8 g bruin, poedervormig 25 extract A.15 Finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. was heated in an autoclave at 120 ° C in an amount of 500 g for 30 minutes, after which 2 liters of water were added and then the mixture was left overnight at room temperature. The mixture was then filtered and 1 liter of water was added to the residue and this treatment was carried out again four times in the same manner as indicated above. All filtrates were combined and evaporated to dryness at 50 ° C under reduced pressure to obtain 96 g of extract. Then, the mixture was treated in the manner indicated in Example XV to obtain 6.8 g of brown powdered extract A.

De gegevens verkregen door dit extract A te onderwerpen aan een HPLC-bewerking onder omstandigheden zoals vermeld in voorbeeld I, zijn aangegeven in fig. 16.The data obtained by subjecting this extract A to an HPLC operation under conditions as mentioned in example I are shown in fig. 16.

VOORBEELD XVII.EXAMPLE XVII.

30 Fijnverdeeld schors van Marsdenia cundurango Reichenbach fil.30 Finely divided bark of Marsdenia cundurango Reichenbach fil.

werd in een hoeveelheid van 500 g verwarmd in een autoclaaf bij een temperatuur van 120 °C gedurende 30 minuten waarna 1,5 liter 50 vol.$ waterige methanoloplossing werd toegevoegd en het mengsel werd gedurende een nacht bewaard bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het mengsel afge-35 filtreerd en aan het residu werd 0,75 liter 50 vol. % waterige methanol-oplossing toegevoegd en deze behandeling werd nogmaals vier keren uitgevoerd, op de wijze zoals boven is aangegeven. Alle filtraten werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 50 °C onder verlaag- 80 0 4 75 1 t -19- 21489/Vk/ts de druk ter verkrijging van 103 g extract. Vervolgens werd het mengsel opgewerkt soals vermeld in voorbeeld XV ter verkrijging van 9 g bruin, poedervormig extract A.was heated in an autoclave at a temperature of 120 ° C in an amount of 500 g for 30 minutes after which 1.5 liters of 50 vol. aqueous methanol solution was added and the mixture was left overnight at room temperature. The mixture was then filtered and 0.75 liters of 50 vol. Added to the residue. % aqueous methanol solution was added and this treatment was carried out an additional four times as described above. All filtrates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 50 ° C under a reduced pressure of 19 21489 / Vk / ts to obtain 103 g of extract. The mixture was then worked up as described in Example XV to obtain 9 g of brown powdered extract A.

De gegevens met bfetrekking tot dit extract dat onderworpen is aan 5 een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 17.The data relating to this extract which has been subjected to an HPLC operation under the same conditions as indicated in Example I are shown in Figure 17.

VOORBEELD XVIII.EXAMPLE XVIII.

In 50 ml chloroform werd 6 g extract A opgelost, verkregen in voorbeeld I. Vervolgens werd n-hexaan toegevoegd aan het verkregen mengsel in 10 een zodanige maximale hoeveelheid, dat geen vertroebeling optrad en de verkregen oplossing werd onderworpen aan HPLC voor massa-verzameling ( System 500 vervaardigd door Waters Co., Ltd.). Hierbij werd als vulmiddel gebruikt6 g of extract A, obtained in Example 1, was dissolved in 50 ml of chloroform. Then n-hexane was added to the obtained mixture in a maximum amount such that no cloudiness occurred and the resulting solution was subjected to HPLC for mass collection ( System 500 manufactured by Waters Co., Ltd.). This was used as a filler

Preppak 500-Silica ( vervaardigd door Waters Co,,Ltd.), whetgeen een volle- 2 dig poreus siliciumoxydegel is, bolvormig, met een oppervlak van 320 m /g. 15 De toegepaste kolom had een inwendige diameter en lengte van respectievelijk 57 mm en 300 mm en Bevatte 325 g vulmiddel. Als elueermiddel werd gebruikt een mengsel van n-hexaan/chloroform/raethanol in een volumeverhouding van 6 : 3 : 1 en bij eer}, stroomsnelheid van 150 ml/minuut, terwijl de be- -4 paling werd uitgevoerd bij RI ( 1/20 x 10 RIüFS). De pieken die werden 20 verkregen werden waargenomen met een detector, waarbij een eluaat werd gekozen op basis van de piek» corresponderende met de Fr-2-fractie zoals aangegeven in fig. 18, welke fractie gedurende 12 minuten werd verzameld. De bovenvermelde bewerking werd nogmaals twee keren uitgevoerd, waarbij elke keer 6 g extract A werd gebruikt, verkregen in voorbeeld I. Alle eluaten 25 werden gecombineerd en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C ter verkrijging van 5,54 g extract. Dit extract werd opgelost in 50 ml chloroform, waarna n-hexaan werd toegevoegd in een maximale hoeveelheid, waarbij echter geen troebelheid werd veroorzaakt. De verkregen oplossing werd vervolgens onderworpen aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstan-30 digheden als boven is aangegeven, behalve dat een mengsel bestaande uit n-hexaan/chloroform/methanol in een volumeverhouding van 6:1:1 werd gebruikt als elueermiddel. De verkregen elueerpieken werden bepaald met < een '.detector, waarbij een eluaat werd gekozen op basis van de piek overeenkomst met de Fr-2-1 fractie, zoals aangegeven in fig. 19» welke fractie 35 gedurende 6 minuten en 30 seconden werd verzameld en afzonderlijk hiervan werd een ander eluaat gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-2-fractie, zoals in fig. 19 is aangegeven, welke fractie gedurende 8 minuten werd verzameld.Preppak 500-Silica (manufactured by Waters Co., Ltd.), which is not a completely porous silica gel, spherical, having a surface of 320 m / g. The column used had an internal diameter and length of 57 mm and 300 mm, respectively, and contained 325 g of filler. The eluent used was a mixture of n-hexane / chloroform / raethanol in a volume ratio of 6: 3: 1 and at a flow rate of 150 ml / minute, while the assay was performed at RI (1/20 x 10 RIüFS). The peaks obtained were observed with a detector, choosing an eluate based on the peak corresponding to the Fr-2 fraction as indicated in Figure 18, which fraction was collected for 12 minutes. The above operation was carried out again twice using 6 g of extract A each time, obtained in Example 1. All eluates were combined and evaporated to dryness at a temperature of 40 ° C to obtain 5.54 g of extract. This extract was dissolved in 50 ml of chloroform, after which n-hexane was added in a maximum amount, but did not cause turbidity. The resulting solution was then subjected to an HPLC operation under the same conditions as indicated above except that a mixture consisting of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 6: 1: 1 was used as the eluent. The elution peaks obtained were determined with a detector, choosing an eluate based on the peak agreement with the Fr-2-1 fraction, as shown in Figure 19, which fraction was collected for 6 minutes and 30 seconds. and separately from this, another eluate was chosen based on the peak corresponding to the Fr-2-2 fraction, as shown in Figure 19, which fraction was collected for 8 minutes.

80 04 75 1 -20- 21489/Vk/ts80 04 75 1 -20- 21489 / Vk / ts

De respectievelijke fracties werden »ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C ter verkrijging van 1,98 g wit poeder overeenkomend met extract B-1, hetgeen correspondeert met de Fr-2-1-fractie en 0,91 g wit poeder dat overeenkomt met extract B-2 overeenkomend met de Fr-2-2-5 fractie.The respective fractions were evaporated to dryness at a temperature of 40 ° C to obtain 1.98 g of white powder corresponding to extract B-1, which corresponds to the Fr-2-1 fraction and 0.91 g of white powder corresponds to extract B-2 corresponding to the Fr-2-2-5 fraction.

De gegevens die verkregen zijn door deze extracten B-1 en B-2 te onderwerpen aan een HPLC-behandeling onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I zijn respectievelijk aangegeven in fig. 20 en, 21.The data obtained by subjecting these extracts B-1 and B-2 to an HPLC treatment under the same conditions as indicated in Example I are shown in Figures 20 and 21, respectively.

10 voorbeeld XIX.10 example XIX.

Een eluaat uit de eerste HPLC-bewerking voor massa-verzameling in voorbeeld XVIII, verzameld gedurende 13 minuten op basis van de piek overeenkomend met de Fr-3 fractie zoals aangegeven in fig. 18, werd ingedampt tot droog ter verkrijging van 2,88 g extract. Dit extract werd opgelost in 15 een 70 vol. % waterige methanoloplossing en vervolgens onderworpen aan een HPLC-bewerking voor massa-verzameling ( System 500 vervaardigd door Waters Co., Ltd.) waarbij als vulmiddel Preppak 500-C18 ( bereid door Waters Co., Ltd.) werd gebruikt ais..,chemisch gebonden type C—18. Hierbij werd een kolom gebruikt met een binnendiameter van 57 mm en een lengte van 300 mm 20 en als elueermiddel een 70 vol. % waterige methanoloplossing. De stroomsnelheid bedroeg 100 ml /minuut en de bepaling had plaats bij RI (1/50 x -4 10 RIUFS). De elueerpieken werden waargenomen met een detector, waarbij een eluaat werd gekozen op basis van de piek overeenkomend met Fr-3-1-fractie aangegeven in fig. 22 en deze- fractie werd gedurende 12 minuten 25 verzameld en ingedampt tot droog bij een temperatuur van 40 °C ter verkrijging van 0,88 g wit poedervormig extract B-3.An eluate from the first mass collection HPLC operation in Example XVIII, collected for 13 minutes based on the peak corresponding to the Fr-3 fraction as shown in Figure 18, was evaporated to dryness to obtain 2.88 g extract. This extract was dissolved in a 70 vol. % aqueous methanol solution and then subjected to a HPLC mass collection operation (System 500 manufactured by Waters Co., Ltd.) using as filler Preppak 500-C18 (manufactured by Waters Co., Ltd.) as .., chemically bonded type C-18. A column with an inner diameter of 57 mm and a length of 300 mm was used for this purpose, and a 70 vol. % aqueous methanol solution. The flow rate was 100 ml / minute and the determination was made at RI (1/50 x -4 RIUFS). The elution peaks were observed with a detector, choosing an eluate based on the peak corresponding to Fr-3-1 fraction indicated in Figure 22 and this fraction was collected for 12 minutes and evaporated to dryness at a temperature of 40 ° C to obtain 0.88 g of white powdered extract B-3.

De gegevens die verkregen zijn door dit extract B-3 te onderwerpen aan HPLC- onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 23.The data obtained by subjecting this extract B-3 to HPLC under the same conditions as indicated in Example I are shown in Figure 23.

3° VOORBEELD XX.3 ° EXAMPLE XX.

Het extract A, verkregen in voorbeëd II, werd in een hoeveelheid van 13 g opgelost in 30 ml chloroform en gesdsorbeerd op 80 g silicagel (Wako-gel C-200 bereid door Wako Junyaku Co.,Ltd.) met een korrelgrootte van 75^pi, waarbij een kolom werd toegepast met een inwendige diameter van 35 3 cm en een lengte van 22 cm, gepakt met dit silicagel. De adsorptie had plaats volgens een '’droog1' procédé.The extract A, obtained in pre-prepared II, was dissolved in 30 ml of chloroform in an amount of 13 g and absorbed on 80 g of silica gel (Wako gel C-200 prepared by Wako Junyaku Co., Ltd.) With a grain size of 75 ^ pi, using a column with an internal diameter of 35 cm and a length of 22 cm, packed with this silica gel. The adsorption took place according to a "dry1" process.

Eerst werden eluaten verkregen door elueren met 160 ml chloroform, 200. ml van een mengsel van chloroform en methanol in een volumeverhouding 80 0 4 75 1 -21- 21489/Vk/ts van 97 : 3 en vervolgens 200 ml van een mengsel bestaande uit chloroform en methanol in een volumeverhouding van 95 : 5, welke eluaten werden afge-voerd en vervolgens werd een eluaat verkregen door elueren met 1 liter van een mengsel bestaande uit chloroform en methanol in een volumeverhouding van 5 93 : T» dat werd verdeeld in een eerste fractie van 600 ml en een tweede fractie van 400 ml.De eerste fractie van 600 ml werd ingedampt en vervolgens gedroogd bij 45 °C onéer verlaagde druk gedurende 6 uren en fijngemaakt ter verkrijging gan 4,21 g extract.Eluates were first obtained by eluting with 160 ml of chloroform, 200 ml of a mixture of chloroform and methanol in a volume ratio of 80 0 4 75 1 -21- 21489 / Vk / ts of 97: 3 and then 200 ml of a mixture consisting of chloroform and methanol in a volume ratio of 95: 5, which eluates were removed and then an eluate was obtained by eluting with 1 liter of a mixture consisting of chloroform and methanol in a volume ratio of 5 93: T »which was divided into a first 600 ml fraction and second 400 ml fraction. The first 600 ml fraction was evaporated and then dried at 45 ° C under reduced pressure for 6 hours and crushed to obtain 4.21 g of extract.

Dit extract werd opgelost in 40 ml chloroform, waarna n-hexaan werd 10 toegevoegd in een maximale hoeveelheid, zodat geen troebelheid werd bewerkstelligd. De verkregen oplossing werd onderworpen aan een HPLC-massa-verzameling, waarbij System 500 werd toegepast vervaardigd door Wates Co., Ltd. Het vulmiddel bestond uit Preppak 500-Silica, hetgeen volledig poreus sili- cagel is»bereid door Waters Co., Ltd., welk vulmiddel bolvormig is en een 2 15 oppervlak heeft van 320 m /g. De kolom had een inwendige diameter van 57 mm en een lengte van 300 mm en bevatte 325 g vulmiddel. Als elueermiddel werd een mengsel gebruikt van n-hexaan/chloroform/methanol in een volumeverhouding van 6 : 1 ; 1. De stroomsnelheid bedroeg 150 ml/minuut en de bepaling -4 werd uitgevoerd bij RI ( 1/20 x 10 RIUFS).This extract was dissolved in 40 ml of chloroform, after which n-hexane was added in a maximum amount so that no turbidity was achieved. The resulting solution was subjected to an HPLC mass collection using System 500 manufactured by Wates Co., Ltd. The filler consisted of Preppak 500-Silica, which is fully porous silica gel prepared by Waters Co., Ltd., which filler is spherical and has a surface area of 320 m / g. The column had an internal diameter of 57 mm and a length of 300 mm and contained 325 g of filler. As the eluent, a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 6: 1 was used; 1. The flow rate was 150 ml / minute and assay -4 was performed at RI (1/20 x 10 RIUFS).

20 Terwijl de elueerpieken werden waargenomen met een detector werd · een eluaat gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-1 fractie aangegeven in fig. 19 en deze fractie werd verzameld gedurende 6 minuten en 30 seconden en een ander eluaat werd gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-2-2- fractie aangegeven in dezelfde figuur en ver-25 zameld gedurende 8 minuten. De respectievelijke fracties werden ingedampt tot droog ter verkrijging van 0,85 g wit poedervormig extract B-1 overeenkomend met de FP-2-1i-fractie en 0,72 g wit poedervormig extract B-2, overeenkomend met de Fr-2-2-fraotie.While the elution peaks were observed with a detector, an eluate was chosen based on the peak corresponding to the Fr-2-1 fraction indicated in Fig. 19 and this fraction was collected for 6 minutes and 30 seconds and another eluate was chosen based on the peak corresponding to the Fr-2-2 fraction indicated in the same figure and collected for 8 minutes. The respective fractions were evaporated to dryness to obtain 0.85 g of white powdered extract B-1 corresponding to the FP-2-1i fraction and 0.72 g of white powdered extract B-2 corresponding to the Fr-2-2 fraud.

De gegevens die verkregen zijn door de aldus verkregen extracten 30 B-1 en B-2 .te onderwerpen aan een HPLC-bewerking onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn vermeld in de figuren 24 en 25. VOORBEELD XXI.The data obtained by subjecting the thus obtained extracts B-1 and B-2 to an HPLC operation under the same conditions as indicated in Example I are shown in Figures 24 and 25. EXAMPLE XXI.

Van de laatste helft van het eluaat werd een hoeveelheid van 400 ml, verkregen door het elueren van de silicagel-kolom met een mengsel 35 van chloroform en methanol (volumeverhouding 93 : 7) in voorbeeld XX, ingedampt en vervolgens gedroogd bij een temperatuur van 45 °C onder verlaagde druk gedurende 6 uren en fijngemaakt ter verkrijging van 1,76 g extract. 0()0 4 75 1 -22- 21489/Vk/ts400 ml of the last half of the eluate obtained by eluting the silica gel column with a mixture of chloroform and methanol (volume ratio 93: 7) in Example XX was evaporated and then dried at a temperature of 45 ° C under reduced pressure for 6 hours and crushed to obtain 1.76 g of extract. 0 () 0 4 75 1 -22- 21489 / Vk / ts

Dit extract werd opgelost in 30 ml van een 70 vol. % waterige methanoloplossing en vervolgens onderworpen aan HPLC voor massa-verzameling met behulp van System 500,vervaardigd door Waters Co., Ltd, waarbij als vulmiddel Preppak 500-C18,bereid door Waters Co., Ltd. werd toegepast 5 als chemisch gebonden type C—18. De kolom had een binnendiameter van 57 mm en een lengte van 300 mm en als elueermiddel werd 70 vol. % waterige methanoloplossing gebruikt. De stroomsnelheid bedroeg 100 ram /minuut en de bepaling had plaats bij RI ( 1/50 x 10*^ RIÜFS).This extract was dissolved in 30 ml of a 70 vol. % aqueous methanol solution and then subjected to HPLC for mass collection using System 500 manufactured by Waters Co., Ltd, with filler Preppak 500-C18 prepared by Waters Co., Ltd. was used as chemically bound type C-18. The column had an inner diameter of 57 mm and a length of 300 mm and 70 vol. % aqueous methanol solution used. The flow rate was 100 ram / minute and the determination was made at RI (1/50 x 10 * RIÜFS).

De elueerpieken werden waargenomen met een detector en een eluaat 10 werd gekozen op basis van de piek overeenkomend met de Fr-3-1-fractie aangegeven in fig. 22 en deze fractie werd verzameld gedurende 12 minuten en vervolgens tot droog ingedampt ter verkrijging van 0,48 g wit poedervormig extract B-3.The elution peaks were observed with a detector and an eluate 10 was chosen based on the peak corresponding to the Fr-3-1 fraction indicated in Figure 22 and this fraction was collected for 12 minutes and then evaporated to dryness to give 0 , 48 g of white powdered extract B-3.

De gegevens verkregen door het aldus verkregen extract B-3 te 15 onderwerpen aan HPLC onder dezelfde omstandigheden als aangegeven in voorbeeld I, zijn weergegeven in fig. 26.The data obtained by subjecting the thus obtained extract B-3 to HPLC under the same conditions as indicated in Example I are shown in Fig. 26.

-CONCLUSIES- 80 0 4 75 1-CONCLUSIONS- 80 0 4 75 1

Claims

Method for the preparation of an anti-cancer drug based on a plant residue as an active agent by mixing the plant residue with auxiliary substances to form a dosage form suitable for medical purposes, characterized in that residues of Marsdenia cundurango Reichenbach are used as active agent fil., obtained by extraction and from certain elution fractions, by subjecting the extracts to a high pressure liquid chromatography operation.

2. Process for preparing an active substance from a plant residue, characterized in that Marsdenia cundurango Reichenbach fil. is extracted allowing the extracts to be further subjected to elution and high-performance liquid chromatography.

3. Extract of Marsdenia cundurango Reichenbach fil., Obtained according to a method described in claim 2, characterized in that the extract is soluble in low alcohols and in chlorinated hydrocarbons different from carbon tetrachloride and insoluble in aliphatic hydrocarbons, tetrachlorocarbon or aromatic hydrocarbons and gives a chromatogram, as shown in Fig. 20 when subjected to an analytical HPLC operation using silica gel filler, completely porous and comminuted to a size of 5 μm, using a column with an internal diameter of 4 mm and a length of 200 mm and an eluent consisting of a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 7: 2: 1, a flow rate of 1.5 ml / 2 minutes and a pressure of 30 kg / cm and the assay was performed with UV-280 nm (0.64 AUFS).

4. Extract obtained according to a method as claimed in claims 2, characterized in that the extract is soluble in lower alcohols and in a chlorinated hydrocarbon deviating from carbon tetrachloride and insoluble in aliphatic hydrocarbons, tetrachlorocarbon or aromatic hydrocarbons and gives a corresponding chromatogram. Fig. 21 when subjected to an analytical HPLC operation using as a filler silica gel of a porous type and having a size of 5 µm, the column has an internal diameter of 4 mm and a length of 35 200 mm, the eluent consists of a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 7: 2: 1, the flow rate is 1.5 ml / 2 minutes and the pressure is 30 kg / cm and the determination is carried out with UV at 280 nm (0.64 AUFS). 80 04 75 1 -24- 21489 / Vk / ts

5. Extract obtained according to the working method indicated in claim 2, characterized in that the extract is soluble in lower alcohols and in chlorinated hydrocarbons different from carbon tetrachloride and insoluble in aliphatic hydrocarbons, carbon tetrachloride or aromatic hydrocarbons and gives a chromatogram corresponding to fig. 23 when subjected to an analytical HPLC operation in which the filler is silica gel, completely porous and 5 µm in size in a column with an internal diameter of 4 mm and a length of 200 mm and the eluent is a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 7: 2: 1 and the flow rate is 1.5 ml / minute and the pressure is 30 kg / p cm and the determination is carried out at UV -280 nm (0.64 AUFS).

6. Extract obtained as indicated in the method described in claim 2, characterized in that the extract is soluble in lower alcohols and in chlorinated hydrocarbons different from carbon tetrachloride and insoluble in aliphatic hydrocarbons, carbon tetrachloride or aromatic hydrocarbons and gives a chromatogram corresponding to fig. 1, when subjected to an analytical HPLC operation using a fully porous silica gel filler of 5 µm in size and a column with an internal diameter of 4 mm and a length of 20200 mm, an eluent consisting of a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 7: 2: 1 at a flow rate of 1.5 ml / minute and a pressure of 30 kg / cm and detection is effected at UV -280 nm (0.64 AUFS).

7. Process according to claim 2, characterized in that an extract is prepared as indicated in claim 3, by an extract of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. obtained by treating it with the following three kinds of solvents in any order M a lower alcohol for collecting the portion soluble therein, 2) a chlorinated hydrocarbon different from carbon tetrachloride for collecting the portion soluble therein and 3. an aliphatic hydrocarbon, carbon tetrachloride or aromatic hydrocarbon to remove that soluble portion thereof, which extract is subjected to HPLC in a System 500 using filler Preppak 500 silica and a column of internal diameter of 57 mm and a length of 300 mm, as eluent a mixture of n-hexane / chloroform / methanol in a volume ratio of 6: 3: 1, a flow rate of 150 ml / minute and the determination is carried out. 80 04 75 1 - 4 -25- 21489 / Vk / ts fed at RI (1/20 x 10 RIUFS) to collect the elution fraction selected based on the peak corresponding to the Fr-2 fraction indicated in Fig. 18 and then the fraction is subjected to HPLC under the same conditions as indicated above except that a different mixture of 5 n-hexane / chloroform / methanol is used with a volume ratio of 6: 1: 1 instead of the ratio 6: 3: 1, which mixture is used as an eluent to collect the eluent fractions selected based on the peak corresponding to the Fr-2 fraction shown in Fig. 19.

8. Process according to claim 2, characterized in that an extract is prepared as indicated in claim 4, by the extract of Marsdenia cun-durango Reichenbach fil. Obtained by treating it with the following three solvents in any order: 1 a lower alcohol for collecting that portion which is soluble therein, 2) a chlorinated hydrocarbon other than carbon tetrachloride and 3. an aliphatic hydrocarbon, carbon tetrachloride, or an aromatic hydrocarbon for removing that portion which is soluble herein. extract is subjected to HPLC under the same; conditions as set forth in claim 7, where the elution fraction is collected, selected based on the peak corresponding to the Fr-2 fraction indicated in Fig. 18, and then the fraction is subjected to HPLC under the same conditions as indicated above, however, using a different mixture -n-hexane / chloroform / methanol with a volume ratio of 6: T: 1 in plate 3 of 6: 3: 1 as eluent 25 to collect the elution fraction selected based on the peak corresponding to the Fr-2-2 fraction indicated in fig. 19

9- Process according to claim 2, characterized in that an extract as prepared in claim 5 is prepared by an extract of Marsdenia cundurango Reichenbach fil. Obtained by treatment with the following three kinds of solvents in any order: 1. a lower alcohol for collecting the portion soluble therein, 2) a chlorinated hydrocarbon different from carbon tetrachloride for collecting the portion soluble therein and 3) an aliphatic hydrocarbon, tetrachloride or aromatic hydrocarbon for removal of the portion soluble herein, to be subjected to HPLC, in a manner as recited in claim 80 04 75 1% -26-21489 / Vk / ts 7, wherein the elution fractions are selected based on the peak »corresponding to the Fr -3 fraction indicated in Fig. 18 and then the fraction is subjected to another HPLC system, viz System 500, with filler Preppak 500-C18, while a column is used with an inner diameter of 57 mm and a length of 300 mm and as eluant a 70 trap. % aqueous methanol solution, the flow rate 100 ml / minute is -4 and the determination is made at RI (1/50 x 10 RIUFS) to collect the elution fraction selected based on the peak corresponding to the Fr-3-1 fraction indicated in fig. 22.

Method according to claim 7 or 8, characterized in that the extract is subjected, instead of the first HPLC, to an open column method in a silica gel column, eluting with chloroform and then with chloroform / methanol (volume ratio 97 : 3 and 95: 5) mixtures and then with a chloroform / methanol mixture (volume ratio 93: 7) to collect the first half of the elution fraction.

11. A method according to claim 9, characterized in that the extract is subjected to an open column method with a column filled with, instead of the first HPLC operation. Silica gel and elution takes place with chloroform and then with chloroform / methanol mixtures with a volume ratio of 97: 3 and 95: 5 and then with a chloroform / methanol mixture (volume ratio 93: 7) to collect the latter. "from the elution fraction.

12. A method according to claim 2, wherein an extract is prepared as indicated in claim 6, characterized in that Marsdenia cundurango Reichenbach fil. is treated with the following three types of solvents in an arbitrarily selectable order: 1. a lower alcohol for collecting the portion soluble therein, 2. a chlorinated hydrocarbon other than carbon tetrachloride for collecting that portion herein. is soluble and 3. an aliphatic hydrocarbon, carbon tetrachloride or aromatic hydrocarbon to remove the portion soluble therein.

Process) according to claims 7-12, characterized in that the extract obtained by extracting Marsdenia cundurango Reichenbach fil. is obtained with an aliphatic ketone, a lower aliphatic ester or ether or with hot water or with water or an aqueous lower alcohol, after a direct heat treatment at 110 - 130 ° C for 30 minutes, 80 0 4 75 1 -27-2t489 / Vk / ts performed with the starting material.

A plant remedy for cancer based on adjuvants brought with adjuvants in a dosage form suitable for medical purposes, characterized in that the active ingredient is an extract of Marsdenia cundurango Reichenbach fil., As described in claims 3-6. 4 80 0 4 75 1