NL1023309C2

NL1023309C2 - Werkwijze voor het moduleren van zetmeelkorrelgrootte in planten, transgene planten met veranderde zetmeelkorrelgrootte en toepassing van de zetmeelkorrels.

Info

Publication number: NL1023309C2
Application number: NL1023309A
Authority: NL
Inventors: Bernadette Sylvia De Pater; Martinus Petrus Maria Caspers
Original assignee: Tno
Priority date: 2003-04-29
Filing date: 2003-04-29
Publication date: 2004-11-01

Description

I *

Korte aanduiding: Werkwijze voor het moduleren van zetmeelkorrelgrootte in planten, transgene planten met veranderde zetmeelkorrelgrootte en toepassing van de zetmeelkorrels.

Zetmeel is een plantaardige substantie met een zeer breed toepassingsgebied. Zetmeel vormt het hoofdbestanddeel van de belangrijkste voedingsgewassen. Het type zetmeel heeft een belangrijke invloed op de toepasbaarheid van b.v. meel voor het bereiden van b.v. brood, koek en pasta's.

5 Daarnaast wordt zetmeel in gezuiverde en aangepaste vorm wel gebruikt in dressings, sausen, toetjes, bindmiddel en b.v. zelfs in boorvloeistoffen. Ook kan zetmeel door fysisch en/of chemische manipulaties worden omgezet in een grondstof voor (biologisch afbreekbare) verpakkingsmaterialen of alternatieve voedingsmiddelen (b.v snacks).

10

Het is gebleken dat de vorm waarin zetmeel wordt aangeboden van belang is voor de fysische en/of chemische eigenschappen van het zetmeel en het product waarin het zetmeel wordt verwerkt. In de onderhavige uitvinding is gevonden dat planten kunnen worden aangezet om zetmeelkorrels met een . 15 veranderde grootte te produceren. Hierdoor is mogelijk gewenste groottes te laten produceren en toe te passen. Een niet limiterend voorbeeld is bijvoorbeeld het verbeteren van het mondgevoel van voedselproducten als sauzen en spreads. Een grotere zetmeelkorrel geeft bijvoorbeeld een minder zalvig en meer rul gevoel in de mond hetgeen in bepaalde toepassingen als 20 prettiger wordt ervaren.

Wereldwijd bestaat er brede kennis over de opbouw en opslag van zetmeel in planten zoals de zaad- en knol-gewassen (b.v granen en aardappels). Zetmeelkorrels worden gevormd in zogenaamde amyloplasten. Dit 25 zijn celorganellen die zich middels insnoering vermenigvuldigen. In een aspect voorziet de onderhavige uitvinding in een werkwijze voor het veranderen van de gemiddelde zetmeelkorrelgrootte of de spreiding in de zetmeelkorrelgrootte in een verzameling amyloplast bevattende plantencellen waarbij de genoemde I plantencellen worden voorzien van een middel voor het moduleren van een proces van plastide-deling. Verrassenderwijs is gevonden dat de gemiddelde grootte van de zetmeelkorrels of de spreiding van de zetmeelkorrelgrootte in 5 een plantencel kan worden gemoduleerd door te interfereren met de deling van amyloplasten. Bij voorkeur wordt op een zodanig specifieke wijze met de I plastide-deling geïnterfereerd dat andere dan plastide-deling gerelateerde I processen in de cel niet of nauwelijks worden beïnvloed. Een geschikte wijze voor een dergelijke specifieke modulering is het manipuleren van het 10 insnoeringsproces waarmee een plastide zich deelt in twee separate plastiden.

I Het proces van plastiden-deling is een nauwkeurig gereguleerd I proces. Van verschillende genen is bekend dat zij betrokken zijn bij de deling I van plastiden in planten. Enkele van deze genen zijn FtsZ genen en de Min- I 15 genen (zie ook Colleti 2000; Osteryoung 1998; WO 98/00436 en WO 01/81601).

FtsZ eiwitten vormen een contractiele ring aan de binnenkant van de I buitenmembraan van een plastide (Colleti (2000; Osteryoung 1998). Bij I insnoering wordt de contractiele ring kleiner tot dat uiteindelijk de afsnoering I plaatsvindt. Bijvoorbeeld de Min-genen blijken, althans in bacteriën, I 20 betrokken bij de plaatsing van de ring tijdens plastiden-deling. In de onderhavige uitvinding is gebleken dat het mogelijk is de zetmeelkorrelgrootte verdeling in planten te moduleren door interferentie met de expressie van I eiwitten die betrokken zijn bij de plastiden-deling in planten. Door interferentie met de Min eiwit expressie is het mogelijk een grotere dan wel I 25 kleinere spreiding in de gemiddelde zetmeelkorrelgrootte te bereiken. Dit I wordt bereikt door de plaatsing van de ring zodanig te beïnvloeden dat zij meer I centraal gelegen is (hetgeen leidt tot een homogenere verdeling van de I korrelgrootte en dus een lagere spreiding) of juist meer extreem gelegen is I zodat juist een grotere spreiding in de korrelgrootte wordt verkregen. Bij I 30 voorkeur wordt het proces van plastidendeling gemoduleerd door de expressie I ‘ 3 van FtsZ eiwitten te beïnvloeden en dan bij voorkeur de expressie van het FtsZl eiwit.

Middelen waarmee het proces van plastidendeling kan worden gemoduleerd omvatten middelen voor het manipuleren van de expressie van 5 nucleizuren die coderen voor de endogene eiwitten die betrokken zijn bij het proces van plastidendeling. Dit kan bijvoorbeeld door veranderingen aan te brengen in regulator-sequenties in genen voor deze endogene eiwitten waardoor een hogere of lagere expressie van het endogene eiwit wordt verkregen. Een dergelijke ingreep is mogelijk middels bijvoorbeeld homologe 10 recombinatie. In deze uitvoeringsvorm is het middel het nucleïnezuur waarmee de homologe recombinatie wordt gekatalyseerd. In een geprefereerde uitvoeringsvorm is het middel een nucleïnezuur coderend voor een FtsZ gen of een functioneel deel, afgeleide of analoog daarvan. Bij voorkeur een nucleïnezuur van een FtsZl gen of een functioneel deel, afgeleide of analoog 15 daarvan. Andere middelen voor het moduleren van plastidendeling in een cel zijn peptiden of antilichamen die de functie beïnvloeden van een eiwit dat is betrokken bij het plastideninsnoeringsproces of complex, bijvoorbeeld een FtsZ eiwit of een Min-eiwit. Deze beïnvloeding van de functie hoeft niet noodzakelijkerwijs de hoeveelheden van deze componenten zoals FtsZ, in de cel 20 te beïnvloeden.

Door het gehele coderende gebied middels een expressiecassette in het genoom van de plantencel te verankeren, bijvoorbeeld door gebruikmaking van ongerichte integratie in het genoom via Agrobacterium tumefaciens 25 gemedieerde plant transformatie, is het mogelijk gebleken de gemiddelde zetmeelkorrelgrootte in plantencellen te moduleren. In de verschillende klonale lijnen werden lijnen met een gemiddeld kleinere zetmeelkorrel en lijnen en met een gemiddeld grotere zetmeelkorrel gevonden. De verschillen in de diverse lijnen zijn vermoedelijk het resultaat van verschillen in expressie 30 van het nucleïnezuur door een verschillende integratieplaats of door * ' - . :j Γt H epigenetische mechanismen. Een vergroting van de gemiddelde korrelgrootte werd ook bereikt door zogenaamde antisense moleculen van een FtsZ gen in te brengen. Zonder gebonden te zijn aan theorie wordt verondersteld dat in beide gevallen met de expressie van het FtsZ eiwit in de behandelde plantencel en 5 zijn nakomelingen wordt geïnterfereerd. Deze specifieke interferentie leidt tot een veranderde plastidendeling, waarschijnlijk via interferentie met het insnoerings-mechanisme, en daarmee een afwijking van de gemiddelde grootte van de zetmeelkorrel. Er wordt verondersteld dat een uiteindelijke verlaging van de FtsZ eiwit expressie in de behandelde plantencel leidt tot een 10 gemiddeld grotere zetmeelkorrel terwijl een uiteindelijke verhoging van de

FtsZ eiwit expressie leidt tot een gemiddeld kleinere zetmeelkorrel. Wat het I mechanisme ook is, het blijkt dat de gemiddelde grootte van de zetmeelkorrel kan worden beïnvloed door nucleïnezuur dat afkomstig is van een FtsZ gen of een functioneel deel, afgeleide of analoog daarvan in de cel te brengen. Een 15 functioneel deel van een FstZ gen is een deel dat instaat is de expressie van I endogeen FtsZ eiwit te verlagen of de hoeveelheid FtsZ eiwit (afkomstig van I een endogeen gen of toegevoegd gen) te verhogen, bijvoorbeeld door een I antisense, een co-suppressie effect, een RNAi ,een selectieve restrictie of een overexpressie van het endogene RNA en/of eiwit te bewerkstelligen of 20 overexpressie van een functioneel deel van een FtsZ gen te bewerkstelligen. Dergelijke strategieën kunnen worden geïmplementeerd door expressiecassettes voor productie van de nucleizuren in de cel in te brengen of door de nucleinezuren op zich in te brengen. Er zijn natuurlijk nog veel meer methoden om expressie van endogeen FtsZ eiwit te verlagen of te verhogen, en 25 deze zijn ook onderdeel van de onderhavige uitvinding. Een functioneel deel heeft typisch een lengte van minimaal 19 baseparen en kan een coderend en/of een niet coderend deel van het gen betreffen. Het heeft de voorkeur een nucleïnezuur te gebruiken dat volledig identiek is aan het FtsZ gen of een functioneel deel daarvan. Het moge echter duidelijk zijn dat kleine 30 veranderingen die de specifieke hybridisatie mogelijkheden met IFtsZnucleïnezuur in de plantencel niet dramatisch veranderen, ook getolereerd worden. Het is niet goed mogelijk de exacte grenzen van de maximaal toelaatbare afwijkingen te geven, maar een vakman is in staat deze afdoende te beoordelen en te ontwerpen. Dergelijke afgeleiden van een 5 nucleïnezuur van een FtsZ gen zijn daarom ook onderdeel van de onderhavige uitvinding. Nucleïnezuren kunnen verschillende soorten modificaties ondergaan en toch nog functioneel hybridiseren met hun doelsequentie. Dergelijke analogen zijn natuurlijk ook onderdeel van de uitvinding. Ook kunnen tegenwoordig peptiden gemaakt worden die op een 10 nucle'inezuurachtige wijze met een doelsequentie kunnen hybridiseren.

Dergelijke peptiden met als voorbeeld PNA en morpholino achtige peptiden zijn ook geschikte analogen van een nucleizuur sequentie van een (functioneel deel van) een FtsZ gen. Ook kunnen peptiden of antilichamen toegepast worden die de functie beïnvloeden van het FtsZ eiwit of het plastiden 15 insnoerings complex zonder dat de hoeveelheden van deze componenten zoals FtsZ worden veranderd.

Een expressiecassette zoals hierboven genoemd is Stand van de Techniek voor de vakman. Behalve dat expressie cassettes met een constitutieve promoter kunnen worden gebruikt (b.v 35S CaMV promoter) die 20 in de gehele plant tot expressie komen, worden bij voorkeur expressiecassettes gebruikt die bijvoorbeeld specifiek expressie geven in een deel van een plant. Bij voorkeur wordt een knol· of zaad-specifieke promoter gebruikt. Het voordeel van een dergelijke promoter is de beperking van de invloed op plastidendeling tot die cellen die belangrijk zijn voor een groot deel van de 25 zetmeelproductie in een plant. Er zijn diverse knol· en zaadspecifieke promotoren verkrijgbaar en het is waarschijnlijk dat nog meer zullen volgen.

De verzameling amyloplast bevattende plantencellen is bij voorkeur een transgene plant. In deze uitvoeringvorm wordt het genoom van de plant 30 voorzien van een recombinant nucleïnezuur voor het moduleren van het proces I» ' van plastidendeling in genoemde plant of een amyloplast bevattend deel daarvan. Bij voorkeur wordt het nucleïnezuur ingebracht in de vorm van een expressiecassette die het nucleïnezuur tot expressie brengt. De transgene plant of de genetische veranderde cel is natuurlijk onderdeel van de 5 uitvinding. Bij voorkeur behoort de plant tot de knol-, wortel- of zaadgewassen, of tot de granen en van deze bij voorkeur tot de aardappelplanten, cassaveplanten, tarwe, rijst, gerst en maïs. Dergelijke planten of plantencellen mogen nog verdere genetische modificaties hebben ondergaan. Geprefereerde modificaties omvatten modificaties die tot gevolg hebben dat amylosevrije 10 zetmeelrijke plantendelen worden aangemaakt. Dit is bijvoorbeeld bekend uit de aardappel-industrie.

De uitvinding voorziet met name in het zetmeelrijke deel van een plant van de uitvinding. Hieruit kan op eenvoudige wijze 15 zetmeelsamenstelling met de aangepaste gemiddelde korrelgrootte of spreiding daarin worden gewonnen. Zetmeelrijke delen zijn onder andere knollen, zaden en sommige wortels. De uitvinding omvat ook een werkwijze voor het maken van een dergelijke zetmeelsamenstelling met het kenmerk dat een plantencel of een plant of amyloplast bevattend deel daarvan volgens de uitvinding wordt 20 gebruikt. Ook in een aldus verkregen zetmeelsamenstelling wordt voorzien. Ook wordt voorzien in een zetmeelsamenstelling die althans voor een deel een dergelijke zetmeelsamenstelling omvat. Zetmeelsamenstellingen worden vaak chemische of fysisch gemodificeerd, deze en andere afgeleiden van zetmeelsamenstelling behoren natuurlijk ook tot de uitvinding.

25 Zetmeel of zetmeelsamenstellingen worden gebruikt in een grote variëteit aan producten. Dergelijke producten vallen ook onder de onderhavige uitvinding. Geprefereerde producten zijn voedselproducten, fysisch en/of chemisch bewerkte (bio)grondstoffen voor de fabricage van een voedselproduct of gebruiksvoorwerp zoals b.v. boorvloeistoffen en verpakkingsmaterialen.

I 7 I Het is gebleken dat veranderingen in de gemiddelde grootte van I zetmeelkorrels een duidelijk effect hebben op het mondgevoel van I voedselproducten waar deze samenstellingen in zijn verwerkt. Een grotere I gemiddelde korrelgrootte resulteert in een rullere smaaksensatie. Terwijl een I 5 kleinere gemiddelde korrelgrootte resulteert in een zalvigere smaaksensatie.

I Dit is met name het geval bij sauzen, spreads, vla en andere verdikte min of I meer vloeibare voedselproducten die direct voor gebruik zijn bestemd. De I onderhavige uitvinding omvat aldus ook de toepassing van een I zetmeelsamenstelling of een product volgens de uitvinding voor het I 10 veranderen van het mondgevoel van een voedselproduct, bij voorkeur een I verdikt min of meer vloeibaar voedselproduct dat voor directe consumptie is I bedoelt en hiervan bij voorkeur de sauzen, spreads en vla producten. Een I voorbeeld van een min of meer vloeibaar product is een custard of een pudding.

I De uitvinding omvat ook de toepassing in granen. Middels de vinding kan de I 15 zetmeelkorrel grootte verdeling in meelproducten van granen worden I gemoduleerd hetgeen kan worden gebruik om de toepasbaarheid in I meelproducten zoals brood, koek of pasta’s te veranderen, te verbreden of te I verbeteren. Hetzelfde geldt natuurlijk voor andere gewassen waarvan de I zetmeelhoudende delen worden gebruikt voor de productie van (gebakken) I 20 meelproducten. 1

In een verdere uitvoeringsvorm voorziet de uitvinding in de I toepassing van een middel voor het beïnvloeden van de plastidendeling in een plantencel ten behoeve van het beïnvloeden van de grootte van zetmeelkorrels I 25 in genoemde plantencel. Dit effect geldt in het bijzonder voor plantencellen die amyloplasten bevatten met gemiddeld één zetmeelkern per amyloplast.

Voorbeelden H Voorbeeld 1 Η 5 Het Fts-Zl-gen werd geïsoleerd uit aardappels. Door middel van een constitutieve of weefselspecifieke promotor werden er constructen gemaakt voor overexpressie of antisenseonderdrukking in inde gehele plant (35S- promoter) of alleen in de zetmeelproducerende organen (GBSS-promoter).

H Aardappelplanten werden getransformeerd door middel van Agrobacterium- I 10 transformatie. Middels een PCR-analyse werden transgene planten geïdentificeerd die de desbetreffende plant-vreemde promoter-FtsZl cassette bevatten. De effecten op chloroplastendeling in de huidmondjes werden geanalyseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. Zetmeelkorrels uit H knollen van transgene planten werden geanalyseerd met behulp van een I 15 coulter counter.

I Materiaal en methoden

I Het klonen van aardappel-FtsZ

I 20 Aardappel-FtsZ-1-cDNA werd gekloneerd met behulp van de Clontech SMART1® RACE cDNA amplification kit volgens de aanbevelingen van de I producenten. Er werd een aardappel-EST-sequentie (dbEST ld 53498s38) gebruikt om de ö'-primer te construeren (SP 107, tabel 1). Teneinde PCR-

I fragmenten te verkrijgen die zichtbaar zijn op gei, werd de touchdown-PCR

I 25 uitgevoerd met 30 cycli. De PCR-producten werden gekloond in pGEM®-T easy I (Promega). De klonen werden getest op de aanwezigheid van FtsZ met behulp I van nested PCR door middel van de primers SP102 en SP 103. Van één kloon I werd de complete sequentie bepaald (BaseClear). 2 2 30 I 1 I 9 I Vectorconstructie I Teneinde het FtsZ coderend gebied te kunnen kloneren in expressie vectoren I werd het pGEM®-T easy plasmide welke het FtsZ-PCR-fragment bevatte, I geknipt met het restrictie-enzym EcoRI. De overhangende uiteinden van het I 5 FtsZ fragment werden verwijderd met Klenov DNA polymerase hetgeen I resulteert in een stomp EcoRI-FtsZ-fragment. Het stompe EcoRI-FteZ- I fragment werd in twee oriëntaties gekloneerd tussen de stompe uiteindes van I een met Smal-geopend pBluescript SK+ plasmide waardoor het FtsZ fragment I omsloten wordt door unieke polyklonering knipplaatsen die het mogelijk I 10 maken het FtsZ fragment makkelijk naar andere plasmiden over te kloneren.

I Om het 35S-FtsZ-sense-construct te genereren, werd het GFP-gen in pMP2164 I (bevattende een 35S-promotor) vervangen door FtsZ. met behulp van Ncol- en I Pstl-knipplaatsen. Voor constructie van de antisense oriëntatie (35S-antisense I FtsZ) werd het GFP-gen in pMP2164 verwijderd door knippen met Ncol en I 15 Notl en stomp maken met Klenov. Na ligatie van het boven beschreven stompe I EcoRI-FtsZ-fragment in plaats van het GFP-gen werd de anti-sense FtsZ- I oriëntatie gecontroleerd via restrictie enzym analyse. De EcoRl-fragmenten I van de ontstane plasmiden met de expressie cassettes voor 35S-FtsZ en 35S- I antisense-FtsZ werden gekloneerd in de plantvector pMOG402.

I 20 Voor de constructie van weefselspecifieke promotor-FtsZ-fusies werd de I plantvector pPGB121S [Kuipers et al., 1995] gebruikt, die de GBSS-promotor bevat. FtsZ werd gekloneerd als BamHl-SalI-fragmenten in beide richtingen.

I Alle plantvectoren werden geïntroduceerd in Agrobacterium tumefaciens I MOG101 [Hood et al., 1993] door middel van 3-punts kruisingen.

I 25 I Aardappeltransformatie I Er werden in vitro aardappelplanten (cultivar Kardal, geleverd door Avebe) gebruikt om transgene planten te verkrijgen via de stengeltransformatiemethode van Visser (1991) met gebruikmaking van 30 bovengenoemde transgene Agrobacterium tumefaciens MOGlOl stammen met Η Η de 4 verschillende FtsZ genconstructen (35S-FtsZ-sense, 35S-FtsZ-antisense, H GBSS-FtsZ-sense en GBSS-FtsZ-antisense). Planten die groeien op H selectiemedium dat kanamycine bevat, werden door middel van PCR-analyse getest op de aanwezigheid van het FtsZ-construct. 1-2 cm2 blad werd gemalen H 5 met een potter in 200 μΐ CTAB extractiebuffer (2% CTAB (N-cetyl-NNN-

trimethylammoniumbromide), 1,4 M NaCL, 20 mM EDTA, 100 mM Tris, pH

8,0) op kamertemperatuur. Na het wassen van de potter met 300 μΐ CTAB en het samenvoegen van het monster en de wasoplossing, werd het monster gedurende 10 min op 37°C geïncubeerd met 10 μΐ RNAse (10 mg/ml).

10 Vervolgens werd het monster geïncubeerd met 100 μΐ chloroform op 65°C en twee maal geëxtraheerd met fenol/chloroform/isoamylalcohol (24/24/1) en één maal met chloroform bij kamertemperatuur. Het DNA werd geprecipiteerd met 10 μΐ NaAC (pH 4,8) en 1 ml ethanol. Het DNA werd gewassen, gedroogd I en opgelost in 50-200 μΐ 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8,0). Één μΐ werd I 15 gebruikt voor PCR-reacties in een eindvolume van 25 μΐ. De voorwaartse PCR- primer werd gekozen in het promoter gebied : primer as-lb voor 35S- I promotorconstructen en primer GBSSl voor GBSS-promotorconstructen. Voor I senseconstructen werd SP103 gebruikt als achterwaartse PCR-primer en voor I antisenseconstructen werd SP108 gebruikt als achterwaartse PCR-primer.

I 20 Om ze in aarde te kunnen potten, werden in vitro planten gekweekt in een medium zonder kanamycine. De planten werden gedurende een aantal weken I gekweekt in potten van voldoende grootte in een kas (Karna).

Chloroplastvisualisatie I 25 Chloroplasten in huidmondjes van het epidermis van de lagere bladeren I werden onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie (Biorad I MRC1024ES; excitatie 488 nm; emissie 680 DF 32 nm).

11

Resultaten

Het kloneren van aardappel-FtsZ-1

Aardappel-FtsZ-1 werd gekloneerd met behulp van de Clontech SMARTtm 5 RACE cDNA amplification kit. Als 5’ primer werd de sequentie die aanwezig was in de database gebruikt (SP107, tabel 1) en als 3’ primer de 3’RACE primer. Het PCR-product werd gekloneerd in pGEM®-T easy (Promega). Vierentwintig klonen werden getest met een tweede PCR-reactie met nested primers (SP102 en SP103, tabel 1). Twee inserties met een lengte van 10 ongeveer 1500 bp waren positief. Van één kloon werd de sequentie bepaald (pFtsZ-1). De nucleotidensequentie en de afgeleide eiwitsequentie zijn te vinden in figuur 1. De eiwitsequentie was voor 79% identiek (86% overeenkomst) aan FtsZ uit Arabidopsis (figuur 2).

15 Agrobacterium-stammen

De FtsZ-l-insertie (ifcoRI-blunt-fragment) werd overgebracht in pBluescript SK+ (Smal) in beide richtingen. Vervolgens werden de FtsZ-coderende gebieden gekloond in de plantvector pPGB121S, waardoor er sense- en anti-senseconstructen ontstonden, aangestuurd door de knolspecifieke GBSS-20 promotor.

Voor de constructen die de constitutieve CaMV 35S promotor bevatten, werd het voor FtsZ coderende gebied gekloond in pMP2164 tussen de 35S promotor en de NOS terminator in beide richtingen. De ontstane constructen werden gekloond als .EIcoRI-fragment in de plantvector pMOG402.

25 De binaire vectoren werden door 3-punts kruisingen in de Agrobacterium tumefaxiiens-stam MOGlOlgeïntroduceerd.

Planttransformatie

Steriele aardappelplanten (cultivar Kardal) werden genetisch gemodificeerd 30 door middel van de stamtransformatiemethode [Visser, 1991] met behulp van 1 n 9 33 na I 12 I de hierboven beschreven Agrobacterium-stammen. Onafhankelijk I getransformeerde uitlopers werden gekweekt op selectiemedium en voor elk I van de 4 constructen werden er 25 tot 30 plantjes gekweekt in bakken van 10 I cm hoog. Van elke transformant werd DNA geïsoleerd uit het blad en gebruikt I 5 voor PCR-reacties. De voorwaartsePCR-primers waren in de 35S- (As-lb) of GBSS- (GBSS1) promotor gelegen en de achterwaartse PCRprimers in het I FtsZ-coderende gebied (SP103 of SP108) (tabel 1). De resultaten zijn te vinden I in tabel 2. De meeste transformanten bevatten het juiste PCR-fragment indicatief voor de aanwezigheid van de gewenste expressie cassette in het I 10 genoom van de plant.

I Chloroplasten I De planten met het FtsZ-gen (sense of antisense) dat wordt aangestuurd door I de 35S CaMV promotor werden geanalyseerd door middel van 15 fluorescentiemicroscopie om het aantal en de grootte van de chloroplasten in I huidmondjes te onderzoeken, aangezien verwacht wordt dat een verandering in FtsZ de plastidendeling beïnvloedt. In figuur 3 zijn representatieve gebieden van het epidermis van de lagere bladeren afgebeeld. Sommige transformanten I hebben minder en grotere chloroplasten in hun huidmondjes (S4, S10, Sll, A5, 20 A6, A8, All) en één plant heeft duidelijk kleinere chloroplasten (SI).

I Knolinductie en zetmeelanalyse I Alle planten met het correcte PCR-fragment werden in vitro verder gekweekt I en van elke transformant werd er één plant in aarde gepoot bij Avebe (Karna).

I 25 I Deelconclusie

Er werden aardappelplanten geproduceerd die in het genoom het aardappel- I FtsZ coderende gebied bevatten in sense of antisenserichting onder controle 30 van de constitutieve 35S-promotor of de knolspecifieke GBSS-promotor. De 13 chloroplasten in de huidmondjes van de 35S-transformanten werden geanalyseerd door middel van fluorescentie. Bij sommige planten wijkt het aantal of de grootte van de plastiden af, wat aangeeft dat de expressie van FtsZ interfereerde met de plastidendeling.

5

Voorbeeld 2

In het eerste voorbeeld werd alleen de plastiden deling in de huidmondjes bestudeerd van de transgene aardappel planten met 35S-10 promoter constructen. In voorbeeld 2 werd ook de zetmeel korrelgrootte verdeling van het zetmeel in de transgene aardappel planten bestudeerd die de 4 verschillende FtsZ contructen bevatten.

De eerste generatie Kardal-planten met overexpressie (GS) of onderdrukking (35S-AS) van de expressie van het FtsZl-gen bevat een aantal 15 planten met zetmeelkorrelgroottes tussen 40 and 54 pm, terwijl de zetmeelkorrelgrootte van de controleplanten rond de 30 pm ligt (Caspers et al). Een selectie van deze planten werd in kassen gekweekt op grotere percelen.

Uit deze planten werd zetmeel geïsoleerd en de deeltjesgrootteverdelingen van het zetmeel van deze planten werd bepaald met een coulter counter.

20

Materiaal en methode

Er werden vijf planten uit elke geselecteerde controle klonen (4 stuks), GBSS-FtsZ (GS)-klonen (4 stuks) en 35S-asFtsZ (35S-AS)-klonen (2 25 stuks) onder kascondities gekweekt in potten bij een kweekstation.

Er werd zetmeel geïsoleerd uit de grootste geoogste knollen (ca. 20-30 g / knol). Voor de zetmeelisolatie werd ongeveer 100 gram knol (de vijf grootste knollen) vermalen in een Wearing-blender. Er werd een hoeveelheid demiwater toegevoegd, met een verhouding tussen het gewicht van de knollen 30 en het gewicht van het demiwater van 2 staat tot 1. Om bruine verkleuring te H voorkomen, werd 1000 ppm natriumwaterstofsulfiet (natriumbisulfiet) toegevoegd en de knollen werden gedurende 1 minuut gemalen. Vervolgens werd de slurry gefiltreerd door een kaasdoek en werd het zetmeel geprecipiteerd. Het bovenstaande vocht werd afgegoten en vervangen door 150 5 ml demiwater. Na bezinking van het zetmeel werd de bovenstaande vloeistof afgegoten en werd het zetmeel overgebracht naar een aluminium schotel. Het zetmeel werd één nacht gedroogd in een incubator bij 37°C.

10 Voor de bepaling van de deeltjesgrootteverdelingen werd de

Sympatec laserdiffractiemethode gebruikt met de volgende specificaties: I Sympatec HELOS (H1140), meetcondities: 10 s (QUIXEL) geen focus ref.

I opt.<l%, meetbereik: R4: 0.5 /1.8...350 μm, meetduur: 10 s, QUIXEL (HD23xx model): Quix sp20%, noclean lowl. 60 s ultrasoon. De resultaten werden I 15 geanalyseerd als volume-grootteverdeling.

I Resultaten 20 De deeltjesgrootteverdeling werd gemeten in 4 geselecteerde klonen I van de niet-getransformeerde Kardal controlegroep, 4 klonen van GS met I FtsZl -overexpressie en 2 klonen van 35S-AS met repressie van FtsZl- I expressie . Volume-deeltjesgrootteverdelingen voor elke aardappellijn zijn te I vinden in tabel 3. De 4 Kardal klonen uit de controlegroep hebben een I 25 gemiddelde volume-mediane diameter van 42.0 pm met waarden die variëren I tussen 38.2 pm en 43.8 pm. De volume-mediane diameter van de 35S-AS- klonen is over het algemeen gelijk aan of iets groter (tot 23% toename) dan de

Kardal controlegroep , met waarden van respectievelijk 45.3 pm en 51.8 pm.

I De volume-mediane diameter van de GS-klonen is veel hoger dan de diameter I 30 die werd gevonden voor de Kardal planten uit de controlegroep, met waarden 15 tot 73.7 μιη. De significantie van de gemeten diameter toenames bij de 35S-AS en GS klonen wordt onderstreept door de geringe variatie in de diameter metingen aan de 4 onafhankelijke controle plant groepen.

Met name twee GS-klonen (GS04 and GS25) hebben een aanzienlijk 5 hogere volume-mediane diameter dan de controlegroep. Vergeleken met het gemiddelde van de Kardal controlegroep, is de toename in de volume-mediane diameter van kloon GS04 75% en van kloon GS25 45%. De differentiële deeltjesgrootteverdelingen van iedere aardappelkloon staan in figuur 4 en tabel 4.

10

Deelconclusies

Kardal die genetisch gemodificeerd is met een 35S-antisense-FtsZ-genconstruct dat FtsZ-expressie onderdrukt, heeft over het algemeen een 15 gering effect op de volume-mediane diameter (tot 23% toename) vergeleken met de Kardal controlegroep.

Kardal die genetisch gemodificeerd is met een GBSS-FtsZ-genconstruct dat overexpressie van FtsZ veroorzaakt, leidt tot een toename 20 van de volume-mediane diameter tot 75%.

^ λ o o o η n I Literatuur I 1. Colleti KS, Tattersall EA, Pyke KA, Froelich JE, Stokes KD, Osteryoung 5 KW (2000). A homologue of the bacterial cell division site-determining factor MinD mediates placement of the chloroplast division apparatus.

I Current Biol 10, 507-516.

2. Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A (1993). New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgen Res 2, 208-218.

I 10 3. Kuipers AGJ, Soppe WJJ, Jacobseb E Visser RGF (1995). Factors affecting I the inhibition by antisense RNA of korrel-bound zetmeel synthase gene I expression in potato. Mol Gen Genet 246, 745-755.

4. Osteryoung KW (2000). Organelle fission. Crossing the evolutionary divide.

I Plant Phys 123, 1213-1216.

I 15 5. Osteryoung KW, Stokes KD, Rutherford SM, Percival AL Lee WY (1998).

I Chloroplast division in higher plants requires members of two functional I divergent gene families with homology to bacterial ftsZ. Plant Cell 10, I 1991-2004.

I 6. Visser RGF (1991). Regeneration and transformation of potato by 20 Agrobacterium tumefiens. In: Lindsay K (ed) Plant Tissue Culture

Manual, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Vol B5, pp 1-9.

7. Caspers M.P.M., Brunt K. (2001), TNO rapportage zetmeelkorrel analyse transgene aardappellijnen, TNO Nutrition and Food Research.

25 17

Tabel 1. Gebruikte primers voor PCR-reacties._

Naam__Sequentie_

SP 102__GCGCCTCGAGCTTCTATGCTATAAACACGG

SP103__GGCCGAGCTCCGTCCTTCAAAGCTGAAAGG

SP 107__TTCACTAGTGATTCCATGGCGATTTTAGGG

SP108__GGAGCAAAGCTACTTGAGAAGGGC _

As-lb__CCACTGACGTAAGGGATGAC_

GBSSl GAGGGAGITGGTTTAGTTTTTAGA I

1 n O O o η λ I 18 I Tabel 2. Transgene aardappelplanten.

Tabel 2A. 35S senseplanten ____ I DNA- PCR- 35S-ftsz Micro- Grote Kleine isolatie analyses aanwezig scopische plastiden plastiden waarnemin _____g___ I ι + + + +__+_ I 2 + + + +__ I _3__+_ + ~+ +___ I _4__+__+__+__+__+___ I _5__+___+__+__+___ I _6__+__+__+__+___ _7__+__+__+ ___+___ _8__+__+__+__+___ I _9__+__+__+__+___ JO__+__+__+__+__+__ I _n__+__+__+__+__+__ I _12__+__+__+__+___ I _13__+__+__:__;___ I 14 +__+__-____ _15__+__+__+__+___+/ veel _16__+__+__+__+___ I 17 +__+__-____ I 18 +__+__-____ I _19__+__+ ,____ I _20__+__+__-_____ I 21__+__+__-____ I 22 +__+__-____ I _23__+__+__+__+__+__ I _24__+__+__+__+___ I _25__+__+__+__+___ I _26__+__+__+__+___ I _27__+__+__-____ I _28___+__+__-____ I 29__+__+__+__+___ i3o 1+ 1+ 1+ 1+ /.--5. .Λ Ztt _ 19

Tabel 2B. 35S antisenseplanten____ DNA- PCR- Ftsz-35S Micro- Grote Kleine isolatie analyses aanwezig scopische plastiden plastiden _____observatie___ _1__+__+__-__+___ _2__+__+__+___ _3__+__+__-__+___ _4__+__+__+__+___ _5__+__+__+__+__+/vreemd__ _6__+__+__+__+__+/vreemd__ _7__+__+__+__+___ 8 + + + 4- + _9__+__+__+__+___ 10__+__+__+__+___ 11__+__+__+__+__+__ 12__+__+__+__+___ 13 __+__+__+__+__+__ 14 __+__+__+__+__+__ 15 _ + + + + _+__ 16 __+_ + ~+ +___ 17 __+__+__+__+___ 18 __+__+_ + _+___ in i i i ontbreken by sommige ________________________huidmondjes _ 20__+__+__+__+_ 21__+__+__+__+___ . _22__+__+__-_____ 23 __+__+__+__+___ 24 __+__+__+___+___ 25 __+__+_ + + _+__ 26 __+_ + + ~+ + 27 __+__+__+__+___ 28 __+__+__+__+__+__ 29__+__+__+__+__+/veel__ 1023309 I 20 I Tabel 2C. GBSS sense-planten_ I DNA- PCR- GBSS-ftsz I __isolatie__analyses aanwezig I _1__+__+__+_ I _2__+__+__+_ I _3__+__+__+_ I _4__+__+__+_ I _5__+__+__+_ _6__+__+__+ I _7__+__+__+_ I _8__+__+__+_ I _9__+__+__+_ I JO__+__+__+_ I 11 +__+__+_ I 12 +__+__+_ I 13 +__+__+_ I J4__+__+__+_ I J5__+__+__+_ I J6__+__+__+_ I J7__+__+__+_ I J8__+__+__+_ I 19 +__+__+_ _20__+__+__+_ I 21 +__+__+_ I _22__+__+__+_ I 23 + + _+__ _24__+__+__+_ I _25__+__+__+_ 21

Tabel 2D. GBSS antisense-planten

DNA- PCR- Ftsz-GBSS

__isolatie__analyses aanwezig _1__+__+__+_ _2__+__+__+_ _3__+__+__+_ 4 + + + _5___+__+__+_ 6 + + + 7 ~+ + _8__+__+__+_ _9__+__+__+_ 10__+__+__+_ 11__+__+__+_ 12__+__+__+_ 13 __+__+__+_ 14 __+__+__+_ 15 __+__+__+_ 16 __+__+__+_ 17 __+__+__+_ ' 18 __+__+__+_ _19__+__+__:_ 20__+__+__±_ 21__+__+__+_ 22 +__+__+/- 23 __+__+__+_ 24 __+__+__+_ 25 __+__+__+__ 26 __+__+__+_ 1 27 + + 1 + 1 0233 no 22

Tabel 3.Volume-deeltjesgrootteverdeling in zetmeelmonsters zoals gemeten door middel van laserdiffraetie 5 ______ ^^Monste^^ ^dlMuiO^^

Controle 1__38.2__13.4__36.1__59.1

Controle 2__42 ;6__14.0__37.1__64.2

Controle 3__43.5__10.1__31.0__78.4

Controle 4 43.8__12.7 34.9__67.4

Gemiddelde 42.0 12.6 34.8 67.3 van controlegroep GS04__73/7__19.8__56Λ__166.2 GS12__56/7__15,7__401__96.0 GS14 47.3__14/3__4L0__75.6 GS25__609__16/7__44J)__103.5 35S-AS15__5L8__102__44J3__80,8 35S-AS28 45.3 13.4 35.1 70.9 1 •voluxne-mediane diameter (μηα) 210% van de zetmeeldeeltjesdiameter is kleiner dan de waarde in μηα (m.a.w. 90% van de zetmeeldeeltjesdiameter is groter dan de waarde) 10 350% van de zetmeeldeeltjesdiameter is kleiner dan de waarde in μηα (m.a.w. 50% van de zetmeeldeeltjesdiameter is groter dan de waarde) 490% van de zetmeeldeeltjesdiameter is kleiner dan de waarde in μηα (m.a.w. 10% van de zetmeeldeeltjesdiameter is groter dan de waarde) λ oooQfin 23

Tabel 4

Partikel _ Differentiële frequentie (%)__ diameter Controle G- G- G- G- 35S- 35S- (μιη) Gemiddelde S04 S12 S14 S25 AS15 AS28 1.8__0.06 0.04 0.05 0.06 0.05 0.05 0.07 2.2 __0.08 0.05 0.06 0.07 0.07 0.07 0.08 2.6 __0.08 0.05 0.06 0.06 0.06 0.06 0.07 3.0 __0.07 0.04 0.05 0.05 0.05 0.05 0.06 3.6 __ 0.06 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.05 4.4 __0.05 0.03 0.04 0.03 0.03 0.03 0.03 5.2 __0.04 0.02 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 6.2 __0.04 0.02 0.03 0.02 0.02 0.02 0.02 7.4 __0.04 0.02 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02 8.6 0.06 0.03 0.05 0.04 0.03 0.03 0.04 10.0 __0.10 0.05 0.08 0.07 0.05 0.05 0.07 12.0 __0.17 0.08 0.13 0.12 0.10 0.10 0.15 15.0 __0.32 0.14 0.22 0.23 0.19 0.20 0.30 18.0 __0.50 0.22 0.32 0.38 0.31 0.32 0.51 21.0 __0.71 0.30 0.42 0.53 0.44 0.45 0.73 25.0 __0.97 0.41 0.55 0.72 0.62 0.61 1.00 30.0 __1.32 0.57 0.72 1.00 0.88 0.85 1.34 36.0 __1,68 0.78 0.95 1.35 1.20 1.17 1.67 42.0 1,86 1.05 1.20 1.64 1.49 1.53 1.80 50.0 1.75 1.36 1.45 1.81 1.70 1.83 1.65 60.0 __1.25 1.66 1.65 1.70 1.68 1.90 1.16 72.0 __0.61 1.72 1.62 1.23 1.31 1.49 0.58 86.0 __0.20 1.34 1.25 0.64 0.74 0.78 0.23 102.0 __0.08 0.73 0.71 0.24 0.31 0.28 0.10 122.0 __0.06 0.33 0.31 0.09 0.13 0.09 0.09 146.0 __0,08 0.20 0.15 0.06 0.10 0.07 0.12 174.0 __0,12 0.24 0.13 0.09 0.13 0.10 0.18 206.0 __0,14 0.31 0.15 0.13 0.19 0.15 0.21 246.0 __0.13 0,34 0.17 0.13 0.23 0.18 0.19 294.0 __0.11 0.33 0.14 0.09 0.26 0.15 0.13 1 350.0 0.00 0.27 0.00 0.00 0.27 0.00 0.00 a η o o o η n

Claims

1. Een werkwijze voor het veranderen van de gemiddelde I zetmeelkorrelgrootte of de spreiding van de zetmeelkorrelgrootte in een verzameling amyloplast bevattende plantencellen waarbij de genoemde plantencellen worden voorzien van een middel voor het moduleren van een I 5 proces van plastidendeling I .

2. . Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het middel een nucleïnezuur I is van een FtsZ gen of een functioneel deel, afgeleide of analoog daarvan.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het middel een nucleïnezuur I is van een FtsZl gen of een functioneel deel, afgeleide of analoog daarvan. I 10

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, waarin de verzameling plantencellen een plant is die transgeen is gemaakt door het genoom te I voorzien van een recombinant nucleïnezuur voor het moduleren van het proces I van plastidendeling in genoemde plant of een amyloplast bevattend deel I daarvan.

5. Een amyloplast bevattende plantencel omvattende een middel voor I het veranderen van het proces van plastidendeling in genoemde cel.

6. Een transgene plant die in het genoom een recombinant nucleïnezuur bevat voor het moduleren van een proces van plastidendeling in I genoemde plant of een amyloplast bevattend deel daarvan I 20

7. Een transgene plant volgens conclusie 6, waarbij de plant behoort tot de knol- of zaadgewassen, of tot de granen.

8. Een aardappelplant, een graanplant of een cassaveplant volgens I conclusie 7.

9. Een zetmeelrijk deel van een plant volgens een der conclusies 6-8. I 25

10. Een zetmeelrijk deel van een plant volgens conclusie 9, waarbij het I deel een knol, een wortel of een zaad omvat. m

11. Een werkwijze voor het maken van een zetmeelsamenstelling met het kenmerk dat een plantencel volgens conclusie 5, of een plant of amyloplast bevattend deel daarvan volgens een der conclusies 6-10, wordt gebruikt.

12. Een zetmeelsamenstelling met het kenmerk dat althans een deel 5 daarvan verkregen is volgens conclusie 11, of een afgeleide van een dergelijke zetmeelsamenstelling.

13. Een product omvattende een zetmeelsamenstelling of een afgeleide daarvan volgens conclusie 12.

14. Een product volgens conclusie 13 waarbij het product een 10 voedselproduct is.

15. Een product volgens conclusie 13, waarbij het product een fysisch en/of chemisch bewerkte (bio)grondstof is voor de fabricage van een voedselproduct of gebruiksvoorwerp.

16. De toepassing van een zetmeelsamenstelling volgens conclusie 12 of 15 een product volgens conclusie 13, voor het veranderen van het mondgevoel van een voedselproduct.

17. In nucleïnezuur volgens figuur 1 of een functioneel deel daarvan.

18. Een eiwitmolecuul volgens figuur 1 of een functioneel deel daarvan. 1 Π 9 QQ η n ( I Figuur 1. DNA- sequentie en afgeleide eiwitsequentie van aardappel-FtsZl. ATGGCGATTTTAGGGCTCTCAAATCCAGCAGAATTAGCTTCTTCTCCTTCTTCTTCCTTA MAÏLGLSNPAELASSPSSSL ACTTTTTCCCACAGGCTACATACTTCCTTCATTCCTAAACAATGCTTCTTCACCGGAGTT TFSHRLHTSFIPKQCFFTGV CGCCGGAAAAGTTTTTGCCGGCCTCAACGTTTCAGCATTTCAAGTTCATTTACTCCGATG RRKSFCRPQRFSISSSFTPM GATTCTGCTAAGATTAAGGTCGTCGGCGTCGGTGGAGGTGGAAACAATGCCGTTAACCGT DSAKI KVVGVGGGGNNAVNR ATGATTGGTAGTGGCTTACAGGGTGTTGACTTCTATGCTATAAACACGGATGCTCAAGCA MIGSGLQGVDFYAI NTD AQA CTGGTACAGTCTGCTGCCGAGAACCCACTTCAAATTGGAGAACTTCTGACTCGTGGGCTT LVQSAAENPLQIGELLTRGL GGTACTGGTGGCAATCCTCTTTTAGGGGAACAGGCAGCGGAGGAGTCAAAGGAAGCTATT LVQSAAENPLQIGELLTRGL GCAAATTCTCTAAAAGGTTCAGATATGGTTTTCATAACAGCAGGAATGGGTGGAGGTACA ANSLKGSDMVFITAGMGGGT GGATCTGGTGCGGCTCCTGTTGTGGCTCAAATAGCAAAAGAAGCAGGTTATTTGACTGTT GSGAAPVVAQIAKEAGYLTV GGTGTTGTTACATATCCTTTCAGCTTTGAAGGACGTAAAAGATCTGTGCAGGCTCTGGAA GVVTYPFSFEGRKRSVQALE GCAATTGAAAAACTTCAGAGAAATGTTGACACTCTTATAGTAATTCCCAATGATCGTCTA AIEKLQRNVDTLIVIPNDRL CTAGATATTGCCGATGAGCAGACACCACTTCAAGATGCTTTCCTTCTTGCAGATGATGTA LDIADEQTPLQDAFLLADDV TTACGTCAAGGTGTCCAAGGAATATCTGATATAATCACTATTCCTGGGCTTGTGAATGTG LRQGVQGISDIITIPGLVNV GATTTTGCCGATGTAAAGGCAGTGATGAAAGACTCTGGAACTGCTATGCTCGGAGTGGGG DFADVKAVMKDSGTAMLGVG GTTTCATCAAGCAAGGACCGAGCTGAAGAAGCAGCCGAACAAGCAACTCTGGCCCCTCTA VSSSKDRAEEAAEQATLAPL ATTGGGTCGTCAATTCAATCTGCAACTGGGGTAGTTTATAACATTACAGGAGGAAAAGAC IGSSIQSATGVVYNITGGKD ATAACTTTGCAAGAAGTGAATAGGGTGTCCCAGGTTGTTACCAGTCTGGCTGATCCCTCT ITLQEVNRVSQVVTSLADPS GCTAACATCATATTTGGTGCTGTTGTTGATGAGCGTTACAATGGTGAAATACACGTGACA ANIIFGAVVDERYNGEIHVT ATAATTGCAACTGGTTTCACCCAGTCGTTTCAGAAGACACTTCTATCTGACCCACGAGGA IIATGFTQSFQKTLLSDPRG GCAAAGCTACTTGAGAAGGGCTCTGGAATCAAAGAAAGCATGGCATCACCTGTTACCCTG AKLLEKGSGI KESMASPVTL AGATCATCAAACTCACCTTCAACAACCTCACGGACACCTACTCGAAGGCTGTTCTTTTAG RSSNSPSTTSRTPTRRLFF* CTCCTTCATATTGTCTTTTTTACAGCTTCATTACTCTCCTTTTTAGTTTCTTCCTTTGTA TTTAACATGTTTTGCTGAAGGGAACTGATTGGTGTTTGCATGTGGCTGTAGAGATAGTGA TTATTCTTTATCAGATGCATACTCAGCTGTGCTCTCTTGTGACAGCACGTTTTTACGCAT GTAAAATATTGATACTTGTTTATTAGA31 λ λ o o o η λ Figuur 2. Sequentievergelijking van FtsZ uit Arabidopsis (AtFtsZ-1) en aardappel (StFtsZ-1). AtFtsZ-1: 1 MAIIPLAQLNELTISSSSSSFLTKSISSHSLHSSCICASSRISQFRGGFSKRRSDSTRSK MAI+ L+ N ++SS SS LT SH LH+S I + F G RR R + StFtsZ-1: 1 MAILGLS—NPAELASSPSSSLT---FSHRLHTSFI PKQCFFTG---VRRKSFCRPQ AtFtsZ-1: 61 SMRLRCSFSPMESARIKVIGVGGGGNNAVNRMISSGLQSVDFYAINTDSQALLQFSAENP + SF+ PM+S A+IKV+GVGGGGNNAVNRMI SGLQ VDFYAINTD+QAL+Q +AENP StFtsZ-1: 50 RFSISSSFTPMDSAKIKWGVGGGGNNAVNRMIGSGLQGVDFYAINTDAQALVQSAAENP AtFtsZ-1: 121 LQIGELLTRGLGTGGNPLLGEQAAEESKDAIANALKGSDLVFITAGMGGGTGSGAAPWA lqigelltrglgtggnpllgeqaaeesk+aian+lkgsd+vfitagmgggtgsgaapwa StFtsZ-1: 110 lqigelltrglgtggnpllgeqaaeeskeaianslkgsdmvfitagmgggtgsgaapwa AtFtsZ-1: 181 QISKDAGYLTVGWTYPFSFEGRKRSLQALEAXEKLQKNVDTLIVIPNDRLliDIADEQTP QI+K+AGYLTVGVVTYPFSFEGRKRS+QALEAIEKLQ+NVDTLIVIPNDRLLDIAOEQTP StFtsZ-1: 170 QIAKEAGYLTVGWTYPFSFEGRKRSVQALEAIEKLQRNVDTLIVIPNDRLLDXADEQTP AtFtsZ-1: 241 LQDAFLLADDVLRQGVQGISDIITIPGLVNVDFADVKAVMKDSGTAMLGVGVSSSKNRAE LQDAFLLADDVLRQGVQGXSDIITIPGLVNVDFADVKAVMKDSGTAMLGVGVSSSK+RAE StFtsZ-1: 230 LQDAFLLADDVLRQGVQGISDlITIPGLVNVDFADVKAVMKDSGTAMLGVGVSSSKDRAE AtFtsZ-1: 301 EAAEQATLAPLIGSSIQSATGWYNITGGKDITLQEVNRVSQWTSLADPSANIXFGAW EAAEQATLAPLIGSSIQSATGVVYNITGGKDITI.QEVNRVSQWTSLADPSANIIFGAW StFtsZ-1: 290 EAAEQATLAPLIGSSIQSATGWYNITGGKDITLQEVMRVSQWTSLADPSANIIFGAW AtFtsZ-1: 361 DDRYTGEIHVTIIATGFSQSFQKTLI/rDPRAAKLLDKMGSSGQQENKGMSIiPHQKQSPST D+RY GEIHVTIIATGF+QSFQKTLL+DPR AKLL+K SG +E+ M+ P +S ++ StFtsZ-1: 350 DERYNGEIHVTIIATGFTQSFQKTLLSDPRGAKLLEK—GSGIKES—MASPVTLRSSNS AtFtsZ-1: 421 ISTKSSSP-RRLFF 433 ST S +P RRLFF StFtsZ-1: 406 PSTTSRTPTRRLFF 419 in?33no