JPH10510140A

JPH10510140A - Ｄｎａ、構築物、細胞およびそれから誘導された植物

Info

Publication number: JPH10510140A
Application number: JP8504784A
Authority: JP
Inventors: カーヴォウニ，ゾイ; ジョン，アイザック; テイラー，ジェーン; ワトソン，コリン; ターナー，アンドリュー; グリーソン，ドナルド
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1994-07-18
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 1998-10-06
Also published as: WO1996002650A3; CA2190760A1; AU2805395A; EP0771353A1; WO1996002650A2

Abstract

(57)【要約】メロンのフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ、構築物、細胞およびそれから誘導された植物本出願は、新規のＤＮＡ構築物、構築物を含む植物細胞、およびそれから誘導された植物に関する。特に、本出願は、植物のカロテノイド代謝修飾の原因となる植物遺伝子発現の修飾に関する。植物遺伝子発現の修飾は、様々な方法で行われてきた。分子生物学者は、遺伝子発現を減少させたり増加させたり、または特定の遺伝子の位置的または時間的発現を変化させたりする方法を、既知の範囲から選択することができる。例えば、特定のアンチセンスＲＮＡまたは部分（先端切除された）センスＲＮＡのいずれかの発現は、植物の様々な標的遺伝子の発現を減少させるために利用されている（ＢｉｒｄおよびＲａｙ、１９９１、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｖｉｅｗｓ９：２０７−２２７に論評されている）。これらの技術は、アンチセンスＲＮＡまたはセンスＲＮＡのいずれかを発現するように設計した合成遺伝子を植物ゲノム内に取り込むことを伴う。これらの技術を用いて、トマト果実の発育および熟成に関わる範囲の個々の遺伝子の発現をダウンレギュレーションすることに成功した（Ｇｒａｙら、１９９２、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９：６９− ８７）。標的遺伝子の発現を増加させる方法もまた、開発されている。例えば、標的遺伝子のコード領域全体を含むＲＮＡを発現させるように設計したさらなる遺伝子を植物ゲノム内に取り込ませると、遺伝子生成物を「過剰発現（ｏｖｅｒ −ｅｘｐｒｅｓｓ）」させることができる。遺伝子発現を修飾する様々なその他の方法；例えば、代わりの制御配列を用いること；が知られている。カロテノイドには、カロテン、ルテイン、キサントフィル、およびリコペンのような色素などのような範囲の生化学物質が含まれる。高等植物および微生物のカロテノイド生合成は、数多くの研究の主題であった。カロテノイドの生合成経路は、生物の範囲を超えて、多くの共通の特徴を共有している（ＢｒａｍｌｅｙおよびＭａｃｋｅｎｚｉｅ、１９８８）。カロテノイド生合成の生化学的経路を図１に示す。カロテノイド合成のための経路への分岐点は、ゲラニルゲラニルジホスフェート（ＧＧＤＰ−以前はゲラニルゲラニルピロホスフェートＧＧＰＰとして知られていた）の形成の後である。カロテノイド形成の最初の独特な段階は、２分子のＧＧＤＰが頭対頭（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）で縮合し、第一のＣ₄₀カロテノイド、フィトエンを形成することである。ＧＧＤＰからのフィトエンの合成は、中間体としてプレフィトエンジホスフェート（ＰＰＤＰ−以前はプレフィトエンピロホスフェートＰＰＰＰとして知られていた）を伴う２段階の反応を含むが、植物および微生物内では、両反応ともに、一つの酵素によって触媒される。この酵素は、ＧＧＤＰのフィトエンへの転換を触媒し、フィトエンシンターゼとして知られている（Ｂｒａｍｌｅｙら、１９９２、ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２：３４３−３４９）。フィトエンシンターゼ活性は、トマト、胡椒、トウモロコシ、人参、ほうれん草およびタバコを含む広範囲の植物種で検出されている。異なる種の酵素の間には、多くの類似点がある。酵素は、色素体ストロマに位置し、同じフィトエン立体異性体（１５−ｃｉｓフィトエン）を合成する。酵素はすべて、補助因子としてＭｎ⁺⁺を要求するが、ＡＴＰの要求性は明らかではない。フィトエンシンターゼ酵素をコードするＤＮＡ配列は知られている。例えば、フィトエンシンターゼ酵素として同定されたＴＯＭ５遺伝子（国際特許出願ＷＯ９１／０９１２８として公開、国際特許出願ＷＯ９２／１６６３５として公開）は、トマトの熟成に関する酵素をコードする（Ｒａｙら、１９８７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１５：１０５８７）。フィトエンシンターゼ酵素は、配列類似性を示す。精製された胡椒（カプシカムアンヌウム）（Ｃａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍ）のフィトエンシンターゼの分子量（４８ｋＤ）（Ｄｏｇｂｏら、１９８８に記載）は、ＴＯＭ５によってコードされる成熟型のフィトエンシンターゼタンパク質の予想分子量（４７．６ｋＤ）と非常によく似ている。アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）および胡椒のｃＤＮＡクローンから予想されるフィトエンシンターゼタンパク質配列を、ＴＯＭ５によってコードされるトマトフィトエンシンターゼの予想されるタンパク質配列と並べて比較すると、それぞれ７５％および９０．６％の同一性を示す。トマトのＴＯＭ５ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質はまた、ロドバクターカプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）（グラム陰性の紫色細菌）からのＣｒｔＢタンパク質とも、有意な相同性（３２％の同一性；５６，５％の類似性）を示す（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、１９９０，ＪＢＣ，２６５：８３２９−８３３８）。ＣｒｔＢタンパク質は、ＧＧＤＰのフィトエンへの転換を触媒する（ＢａｒｔｌｅｙＧＥら、１９９２，ＪＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍ，２６７：５０３６−５０３９）。植物のフィトエンシンターゼＤＮＡ配列の間には相同性が存在する。トマトは、ＴＯＭ５と相同性を持つ少なくとも一つの他の遺伝子座を含む。ＴＯＭ５ｃＤＮＡは、二つのクローン：クローンＦとして既知のゲノムクローン（Ｒａｙら、１９９２，ＰＭＢ，１９：４０１−４０４）およびＰｓｙ２として既知のｃＤＮＡクローン（ＢａｒｔｌｅｙおよびＳｃｏｌｎｉｋ、１９９３，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２６８：２５７１８−２５７２１）：とクロスハイブリダイズするであろう。Ｐｓｙ２は、ＴＯＭ５ｃＤＮＡと全体で８０％のヌクレオチド相同性を持つ。ＴＯＭ５ｃＤＮＡ配列はまた、全体で８３％の相同性を持つカプシカムアンヌウム（Ｒｏｍｅｒら、１９９３，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９６：１４１４−１４２１）および全体で６５％の相同性を持つアラビドプシスサリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）（ＳｃｏｌｎｉｋおよびＢａｒｔｌｅｙ、１９９４，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１０４：１４７１−１４７２）を含む、その他の種のフィトエンシンターゼクローンを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても用いられている。国際特許出願ＷＯ９１／０９１２８（ＥＰ−Ａ−５０５４０５）は、植物内でのカロテノイド化合物の合成を修飾するための、フィトエンシンターゼをコードする「アンチセンス」および「センス」ＤＮＡ構築物ならびにそれらの使用法について記載している。これらのＤＮＡ構築物は、ＴＯＭ５遺伝子のいくらかまたは全体に相同性のＤＮＡ配列を含み、植物内で機能する転写開始領域を前に配置し、それ故、構築物は植物細胞中でｍＲＮＡを生成することができる。ＤＮＡ構築物は、翻訳されてＴＯＭ５遺伝子によって生成される酵素を生ずることのできる、ｍＲＮＡをコードするであろう。国際特許出願ＷＯ９１／０９１２８は、前述のＤＮＡ構築物で植物を形質転換することによって、植物でのカロテノイド生成を修飾（阻害または促進）する方法について記載しており、また、カロテノイド含有量を変化させた形質転換植物（およびその子孫）についても記載している。一般的に、植物内でのＴＯＭ５酵素（フィトエンシンターゼ）の生成は、実質的に完全な遺伝子と相同なＤＮＡを含む構築物によって強化される。例えば、リコペン生成の促進は、ＴＯＭ５ｃＤＮＡまたは全長のＴＯＭ５遺伝子の機能性コピーの一つまたはそれより多くを、機能性植物プロモーターの調節下、トマト植物中に挿入することによって成し遂げられ、深紅色の果実を生じるであろう。ＦｒａｙおよびＧｒｉｅｒｓｏｎ（１９９３，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ．２２：５８９−６０２）は、トマト内での植物フィトエンシンターゼ遺伝子の過剰発現および着色への影響について考察している。要約すると、国際特許出願ＷＯ９１／０９１２８は、（組換えＤＮＡ技術を用いて）植物中でのＴＯＭ５遺伝子発現を調節して、（植物部分の全カロテノイド含有量を増加あるいは減少させるか、または個々のカロテノイドのレベルを増加／減少させることによって）カロテノイドの代謝を修飾することについて記載している。特に、これは、色素の生成および他のある種の関連機能（β−カロテンおよびビタミンＡの生成；高い光強度損傷に対する防御；スポロポレニンの合成および花粉の形成／成熟の調節）の修飾について記載している。本発明につながる研究において、我々は、植物中のカロテノイド代謝の修飾に有用なフィトエンシンターゼ（ｐｈｙｔｏｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードするＤＮＡ配列代替物を同定した。本発明によれば、メロンのフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列が提供される。ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡから誘導することができ、最初から（ａｂｉｎｉｔｉｏ）合成することもできる。メロンのフィトエンシンターゼをコードするｃＤＮＡクローンは、メロンのｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。対応する遺伝子によって生成したｍＲＮＡの全体または実質的に全体をコードする配列は、このようにして得られる。そのようにして得られたｃＤＮＡは、既知の方法に従って配列決定することができる。フィトエンシンターゼをコードするｃＤＮＡクローンをメロンから単離した。クローン（本明細書中以後ＭＥＬ５と呼ばれる）は、ほぼ全長であり、その核酸配列を、（誘導されるアミノ酸配列と共に、）配列ＩＤ−１に示す。ＤＮＡ配列の代替源は、メロンのフィトエンシンターゼをコードする適切な遺伝子である。この遺伝子は、内にイントロンを有する場合がある対応ｃＤＮＡとは異なる場合がある。イントロンは、ｍＲＮＡ内に転写されない（あるいは、転写された場合、後に切断される）。オリゴヌクレオチドプローブまたはｃＤＮＡクローンを用いて、メロンのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、実際のフィトエンシンターゼ遺伝子（単数または複数）を単離することもできる。そのようなゲノムクローンは、植物ゲノム中で機能する調節配列を含む場合がある。それ故、酵素または任意の他のタンパク質の発現を駆動するために用いることのできるプロモーター配列を単離することも可能である。これらのプロモーターは、特に、ある種の発育上での出来事および環境条件に応答するであろう。メロンのフィトエンシンターゼ遺伝子のプロモーターを用いて、任意の標的遺伝子の発現を駆動することもできる。メロンのフィトエンシンターゼＤＮＡ配列を得るためのさらに別の方法は、適当な塩基から、例えば指針として適当なｃＤＮＡ配列を用いて、最初から（ａｂｉｎｉｔｉｏ）それを合成することである。メロンのフィトエンシンターゼ配列のいくらかまたは全体を、植物の形質転換に適切なＤＮＡ構築物内に取り込むことができる。さらに、これらのＤＮＡ構築物を用いて、植物中の遺伝子発現を修飾することもできる。「アンチセンス」または「部分的センス」またはその他の技術を用いて、植物組織内のフィトエンシンターゼの発現を減少させることもできる。また、例えば、追加の酵素遺伝子を取り込むことによって、フィトエンシンターゼのレベルを増加させることもできる。追加の遺伝子は、植物中で、位置的かつ時間的に同一または相違するいずれかの発現パターンを生ずるように設計することができる。本発明のさらに別の態様によれば、植物内で機能する転写開始領域の制御下で、メロンのフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列のいくらかまたは全体を含むＤＮＡ構築物が提供され、その結果、構築物は植物細胞中でＲＮＡを生成できる。本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することによって、植物の部分（特に果実）のカロテノイド含有量および関連する特徴を修飾することもできる。また、本発明は、そのような構築物を含む植物細胞；修飾されたカロテノイド含有量を示すそれから誘導された植物；およびそのような植物の種子；を提供する。本発明のＤＮＡ構築物は、「アンチセンス」ＲＮＡを生成する「アンチセンス」構築物または「センス」ＲＮＡを生成する「センス」構築物（機能酵素の少なくとも一部をコードする）でもよい。「アンチセンスＲＮＡ」は、対応するｍＲＮＡ中の塩基配列に相補的である：（３’から５’にセンス配列を読んだ）アンチセンス配列の個々の塩基（または大多数の塩基）は、５’から３’にセンス配列を読んだｍＲＮＡ配列の対応する塩基（ＧとＣ、ＡとＵ）と対合する能力を持つという意味において、相補的である：ＲＮＡ配列である。そのようなアンチセンスＲＮＡは、関連遺伝子のコード鎖（または、それと実質的な相同性を示すＤＮＡ配列）の少なくとも部分に相補的なその配列の少なくとも一部を持つ転写物を生成するように配列した適当なＤＮＡ構築物で形質転換することによって、細胞内で生成されるであろう。「センスＲＮＡ」は、対応するｍＲＮＡ配列の少なくとも一部と実質的に相同なＲＮＡ配列である。そのようなセンスＲＮＡは、関連遺伝子のコード鎖（または、それと実質的な相同性を示すＤＮＡ配列）の少なくとも一部と同一の配列を持つ転写物を生成するように正常方向に配列した適当なＤＮＡ構築物で形質転換することによって、細胞内で生成されるであろう。適当なセンス構築物を用いて、遺伝子発現を阻害することができ（国際特許公開ＷＯ９１／０８２９９に記載されている）、また、機能性酵素をコードし発現するセンス構築物を植物内に形質転換して、酵素を過剰発現させることもできる。本発明によるＤＮＡ構築物は、ＲＮＡへの転写のための長さが少なくとも１０塩基（好ましくは少なくとも３５塩基）の塩基配列を含むことができる。塩基配列の理論上の上限はない（細胞によって生成される関連ｍＲＮＡと同等の長さであって良い）が、便宜上、一般的には、ダウンレギュレーションの目的には長さ１００から１０００塩基の配列を用いるのが適当であるが、過剰発現させるには約１５００塩基を越えることが好ましいことが分かるであろう。そのような構築物の調製については、以下により詳細に記載する。転写用ＤＮＡ塩基配列の源として、適当なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドを用いることができる。適当なメロンのフィトエンシンターゼコード配列の単離法は、上記の通りである。このようにして、酵素の全体または実質的に全体をコードする配列を得ることができる。適当な長さのこのＤＮＡ配列は、制限酵素を用いることによって使用のために切り出すことができる。ゲノムＤＮＡを転写用部分塩基配列の源として用いる場合には、イントロンあるいはエキソン領域のいずれか、またはその両方を組み合わせて用いることが可能である。メロンのフィトエンシンターゼの植物細胞内での発現に適切な構築物を得るために、酵素のｃＤＮＡ内に認められるようなｃＤＮＡ配列または植物の染色体内に認められるような遺伝子配列を用いることができる。標準的な技術を用いて、組換えＤＮＡ構築物を作製することができる。例えば、転写用ＤＮＡ配列は、当該配列を含むベクターを制限酵素で処理して、適切なセグメントを切り出すことによって得ることができる。転写用ＤＮＡ配列はまた、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングし結合することによって、またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）中で合成オリゴヌクレオチドを用いることによって生成することができ、それぞれの末端に適当な制限サイトを付与できる。次に、ＤＮＡ配列を、上流にプロモーター、下流に終止配列を含むベクター内にクローン化する。アンチセンスＤＮＡを所望するのであれば、切断ＤＮＡ配列が切断された鎖内でその方向に関して逆になるように、クローニングを行う。アンチセンスＲＮＡを発現する構築物では、元々は鋳型の鎖であった鎖がコード鎖になり、その逆も同じである。それ故、構築物は、酵素のｍＲＮＡ配列の部分または全体と相補的なＲＮＡを塩基配列内にコードするであろう。このように、二つのＲＮＡ鎖は、それらの塩基配列のみならずそれらの方向性(５’から３ ’)に於いても相補的である。センスＲＮＡを発現する構築物では、鋳型およびコード鎖は、起源の植物遺伝子の割当および方向をそのまま残している。センスＲＮＡを発現する構築物は、ｍＲＮＡの配列の部分または全体に相同な塩基配列を持つＲＮＡをコードする。機能性酵素を発現する構築物では、遺伝子の全コード領域が、植物内で発現する能力を持つ転写調節配列に結合している。例えば、本発明による構築物は、以下の方法に従って作製することができる。所望する塩基配列を含む適切な（ＭＥＬ５−ｃＤＮＡクローンのような）転写用ベクターを制限酵素で処理して、配列を切り出す。そのようにして得られたＤＮＡ鎖を、所望のプロモーター配列および所望の終止配列を含む第二のベクター内に、（所望するならば、逆方向に）クローン化する。適当なプロモーターには、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターおよびトマトポリガラクツロナーゼ遺伝子プロモーター配列（Ｂｉｒｄら、１９８８，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１１：６５１−６６２）またはその他の発育を調節する果実プロモーターが含まれる。適当な終止配列には、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ３’末端）のそれが含まれる。本発明によるＤＮＡ構築物では、転写開始領域を、植物で機能的に作用する任意のプロモーターから誘導することができる。転写開始領域は、フィトエンシンターゼをコードするｍＲＮＡ内に実質的に内在する塩基と相補的なＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の転写のために配置することができる（ＤＮＡ構築物を全体または部分アンチセンス構築物とする）。植物内で機能する転写開始領域（またはプロモーター）は、（３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーターのように）構造的なプロモーターであっても、または環境が要求する場合に（果実特異的プロモーターのように）誘導可能なあるいは発育段階によって調節されるプロモーターであっても良い。例えば、果実の発育および／または熟成期間中のみ酵素活性を修飾することが望ましい場合がある。構造的プロモーターを用いると、植物のすべての部分で酵素のレベルおよび機能に影響を及ぼすであろうが、組織特異的プロモーターを用いると、遺伝子発現および影響を受ける機能（例えば、果実の着色）をより選択的に調節できる。このように、本発明の適用するにあたっては、果実の発育および／または熟成期間中に発現するであろうプロモーターを用いると便利であることが分かるであろう。そうすることによって、アンチセンスまたはセンスＲＮＡは、その作用が必要とされる器官でのみ生成される。使用することのできた果実の発育および／または熟成に特異的なプロモーターには、熟成強化ポリガラクツロナーゼプロモーター（国際特許公開ＷＯ９２／０８７９８）、Ｅ８プロモーター（Ｄｉｅｋｍａｎ＆Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９８８，ＥＭＢ０．７：３３１５−３３２０）および果実特異的２Ａ１１プロモーター（Ｐｅａｒら、１９８９，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１３：６３９−６５１）が含まれる。本発明のＤＮＡ構築物を植物に挿入し、フィトエンシンターゼの生成を制御し、結果としてカロテノイド代謝を修飾することができる。構築物の性質によって、植物の生涯を通して、あるいは特定の段階のいずれかで、酵素の生成を増加または減少させることができる。一般的に、予想されるように、酵素の生成は、実質的に完全な内在性酵素のｍＲＮＡと相同なＲＮＡを発現する構築物によってのみ、強化される。全長のセンス構築物もまた、酵素の発現を阻害するであろう。完全な遺伝子に相当するＤＮＡより短い不完全なＤＮＡ配列を含む構築物は、それらがセンスまたはアンチセンスＲＮＡのいずれを発現するように配置されているにしても、通常、遺伝子の発現および酵素の生成を阻害する。本発明のＤＮＡ構築物は、標的となる植物細胞内に形質転換される。標的となる植物細胞は、完全な植物の部分であって良く、または完全な植物に再生できる単離細胞または組織の部分であっても良い。標的植物細胞は、単子葉または双子葉の任意の植物種から選択することができる。本発明による構築物は、任意の適当な形質転換技術を用いて任意の植物を形質転換し、本発明に従って植物を作り出すために、用いることができる。単子葉および双子葉の両植物細胞を、この技術分野で既知の様々な方法で形質転換できる。多くの場合、そのような植物細胞（特にそれらが双子葉植物の細胞である場合）を培養すると、後に再生して遺伝的に修飾された植物をうまく生成できる完全な植物を再生することができる。適当な任意の植物形質転換法を用いることができる。例えば、トマトおよびメロンのような双子葉植物は、例えば、Ｂｅｖａｎ、１９８４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１− ８７２１、またはＦｉｌｌａｔｔｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８７年７月、５：７２６−７３０に記載の方法に従って、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉプラスミド技術によって形質転換できる。そのような形質転換植物は、雄雌にまたは細胞培養あるいは組織培養によって、再生させることができる。本発明による遺伝学的に修飾される植物の例としては、(トマト、マンゴー、桃、リンゴ、なし、苺、バナナ、メロン、胡椒、チリ、パプリカのような）すべての結実植物が含まれる。例えば、そのような植物の果実を、その中の赤色を誘導または増強することによって、より魅惑的に（または少なくとも興味をそそるように）作ることができる。本発明の方法によって修飾できるその他の植物には、大根、カブおよびジャガイモのような塊茎、ならびにトウモロコシ（コーン）、小麦、大麦および米のような穀物が含まれる。また、花および装飾用の草を修飾することもできる。新規なメロンのフィトエンシンターゼ構築物を用いると、酵素活性が修飾され、その結果、カロテノイド生合成を修飾する方法が提供される。フィトエンシンターゼ活性の総レベルおよびカロテノイド経路の個々の酵素の比活性は、植物内のカロテノイド含有量の推移および最終形態に影響を及ぼし、それ故、植物部分の一定の特徴を決定する。それ故、フィトエンシンターゼ活性の修飾を利用して、植物（果実を含む）の特性の多様な側面を変えることができる。フィトエンシンターゼ酵素の活性レベルは、修飾された植物に所望される特性に依存して、発育期間中に増加させることも減少させることもできる。フィトエンシンターゼ発現の強化は、ある種のカロテノイドの生産を増加させる傾向にあり、発現の阻害は、生産を減少させる傾向にある。また、フィトエンシンターゼは、通常は酵素を生産しない細胞、組織および器官にも発現させることもできる。例えば、フィトエンシンターゼのダウンレギュレーションまたは過剰発現を用いると、色素レベルを変えることによって果実の色を修飾（変更または増強）できる。この事は、特に、果実および野菜の色を修飾するのに有効であるが、葉およびその他の器官にも等しく適用できる。植物細胞内でのセンスまたはアンチセンスｍＲＮＡ生成の程度を調節することによって、カロテノイド含有量（およびそれによる植物の特徴）を、より多量またはより少量に修飾することができる。この事は、プロモーター配列の適切な選択によって、または植物ゲノム内に導入されるＤＮＡ配列のコピー数または取り込み部位を選択することによって行うことができる。例えば、ＤＮＡ構築物は、フィトエンシンターゼをコードする一つより多くのＤＮＡ配列を含んで良く、一つより多くの組換え構築物を個々の植物細胞内に形質転換しても良い。また、一つまたはそれより多くのその他の酵素活性を修飾すると同時にフィトエンシンターゼの活性を修飾することも可能である。例えば、その他の酵素は、細胞代謝または果実の発育および熟成に関わるであろう。フィトエンシンターゼと組み合わせて修飾することができる細胞壁代謝酵素には、限定するわけではないが、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、β−ガラクタナーゼ、β −グルカナーゼが含まれる。フィトエンシンターゼと組み合わせて修飾することのできる、果実の発育および熟成に関わるその他の酵素には、限定するわけではないが、エチレン生合成酵素、その他のカロテノイド生合成酵素、インベルターゼを含む炭水化物代謝酵素が含まれる。その他の酵素と組み合わせてフィトエンシンターゼ活性を修飾するために、いくつかの方法を利用できる。例えば、第一の植物を、フィトエンシンターゼ構築物で個々に形質転換し、次いで、もう一つの酵素をコードする構築物で個々に形質転換された第二の植物と交雑することができる。さらなる例として、フィトエンシンターゼ構築物およびその他の酵素（単数または複数）の活性を修飾するための適当な構築物で、植物を連続的にまたは同時に（のいずれかで）形質転換することもできる。代わりの例としては、それ自身が他の酵素（単数または複数）の活性を修飾するための追加の遺伝子を含むフィトエンシンターゼ構築物で植物を形質転換することが挙げられる。フィトエンシンターゼ構築物は、フィトエンシンターゼ配列の近くに配置したその他の酵素（単数または複数）の発現を制御するためのＤＮＡ配列を含んでよい。このような追加の配列は、国際特許公開Ｗ０９３／２３５５１（異なる標的遺伝子と相補的な別個のＤＮＡ領域を持つ単一の構築物）に記載されているように、センスまたはアンチセンスのいずれかの方向であって良い。そのような方法を用いることによって、フィトエンシンターゼ活性を修飾することによって得られる恩恵を、その他の酵素活性を修飾することによって得られる恩恵と、結びつけることができる。本発明の第三の態様によれば、カロテノイドの生合成を修飾するように改良したＤＮＡで植物を形質転換し、そのようにして形質転換された植物またはそれらの子孫を育て、さらに、カロテノイド含有量の修飾された植物の部分（例えば、葉、花びらまたは果実）を持つ植物を選択することによって、植物中のカロテノイド生成を修飾する方法が提供される。適切なＤＮＡは、一つあるいはそれより多くのカロテノイドの生産を増強するか、または植物によるそのような生成を阻害するように適合させた本発明による構築物を含む。この方法では、カロテノイドの生合成経路の促進または阻害によって色を修飾した植物を生成することができる。特に、フィトエンシンターゼ構築物を用いて、リコペンに関連する赤色の生産を促進または阻害することができる。同様の色の修飾は、伝統的な植物育種技術を用いても可能であるが、本発明は、同時にその他の特性を変化させるかもしれない長期間の育種プログラムを用いずに、選ばれた系統に特性を移入する手段を提供する。（例えば、センスを過剰発現する構築物によって）リコペン生成を促進させると、消費者の食欲をよりそそるように見えるであろう、深紅色の果実を生産できる。また、本発明を、果実以外の植物の部分に赤色を導入するために用いることもできる。例えば、リコペン生産の促進は、植物内で機能するプロモーターの制御下で、遺伝子ｃＤＮＡまたは全長の遺伝子の一つあるいはそれより多くの機能性コピーを挿入することによって、成し遂げられるであろう。フィトエンシンターゼが植物内で自然に発現している場合には、自然のプロモーターによって与えられるより、より高い発現を与えるようなプロモーターを選択することもできる。本発明の方法によって、色素生成と共に、その他の重要な機能を修飾することができる。β−カロテン（ビタミンＡの前駆体）およびその他のカロテノイドは、ヒトの健康に重要であり、一定の病気に対して予防効果を持つと言われている。食用植物は、本発明の構築物で形質転換することによって修飾でき、その結果得られた植物は、そのような化合物の含有量がより高くなるか：または、他の植物をそのように修飾すると、その結果得られた植物はそのような化合物を抽出しうる源となることができる。また、カロテノイドは、高い光強度の損傷に対して植物を防御する働きを持つと考えられており、故に、より高い含有量のそのような化合物を持つ植物は、いかなる世界的気象変化の影響と戦うに有効であろう。既に考察したように、本発明の方法によって生成した植物はまた、その他の組換え構築物、例えば果実熟成上に他の影響を与える構築物を含むことができる。例えば、本発明に従って着色性を高めた果実はまた、ポリガラクツロナーゼおよびペクチンエステラーゼのような酵素の生産を阻害するか、またはエチレン生産を妨害する構築物を含むことができる。両タイプの組換え構築物を含む果実は、成功的な形質転換によって、またはそれぞれが構築物の一つを含む二種類の変種を交雑し、両方を含むものに関してそれらの子孫から選択することによって、作ることができる。本発明を、実施例により、図面を参照することにより説明する。図１は、カロテノイド生合成経路の図を示している；図２は、センス構築物を図解している；そして図３は、アンチセンス構築物を図解している。次の遺伝子配列が、これに添えて提供される：配列ＩＤ−１は、ＭＥＬ５のヌクレオチド配列である；配列ＩＤ−２は、トマトからの等価の配列であるＴＯＭ５配列である。実施例１メロンのフィトエンシンターゼをコードするｃＤＮＡクローンＭＥＬ５ｃＤＮＡクローンは、非相同のプローブとしてトマトのフィトエンシンターゼのｃＤＮＡ（ＴＯＭ５、Ｒａｙら、１９９２またはＥＰ−Ａ−５０５４０５を参照の事）を用いて、成熟しきったメロン果実から誘導された熟成に関連するｃＤＮＡライブラリーから単離した。ゲノムのサザン分析から、ＭＥＬ５クローンが単一コピーまたは少数の遺伝子によってコードされている（ゲノムのメロンＤＮＡを、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶで消化し、放射標識されたＭＥＬ５挿入物とハイブリダイズし、次に最大で０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで３０分間、４２℃または５０℃で洗浄した）ことが示された。熟成した一連の果実から、および根、葉および花ビラから抽出したＲＮＡのノーザン分析を用いて、このｍＲＮＡの発現パターンを試験した。全ＲＮＡを、異なる熟成段階の果実（エチレンを生産していない緑色の果実；５−７ｎｌ／ｇ／ｈのエチレンを生産する緑色／橙色の果実；３−６ｎｌ／ｇ／ｈを生成する橙色の果実および約１ｎｌ／ｇ／ｈのエチレンを生産する橙色の果実）から抽出した。果実、葉、花びらおよび根から得られた全ＲＮＡおよびポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、放射標識したＭＥＬ５挿入物にハイブリダイズした。ＭＥＬ５は、果実熟成の全段階で、花びらに存在し、葉および根には微量存在する１．７ｋＢの転写物とハイブリダイズした。ｃＤＮＡは、サイズが１．３６ｋＢであり、最長のオープンリーディングフレームの配列分析では、トマトの果実フィトエンシンターゼとヌクレオチドレベルで６８％の同一性、およびアミノ酸レベルでは８３．１％の類似性を示した。ＭＥＬ５ｃＤＮＡクローンは全長ではなかったが、ＰＣＲ法を用いて５’末端を単離し、実質的に全体を配列決定した（配列ＩＤ−１）。実施例２ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを持つアンチセンスＲＮＡベクターの構築メロンのフィトエンシンターゼｃＤＮＡの挿入物のフラグメントに相当する配列を用いて、ベクターを構築した。このフラグメントは、合成プライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応によって合成される。フラグメントの末端を、Ｔ４ポリメラーゼでフラッシュエンドにし、それを、前もってＳｍａＩで切断しておいたベクターｐＪＲ１中にクローン化する。ｐＪＲ１（Ｓｍｉｔｈら、１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：７２４−７２６）は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でアンチセンスＲＮＡの発現を許す、Ｂｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ、１９８４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１−８７２１）を基にしたベクターである。このベクターは、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）３’ 末端終止配列を含んでいる。代わりの方法としては、メロンのフィトエンシンターゼｃＤＮＡから得られた制限フラグメントを用いてベクターを構築し、前もって適合する制限酵素（単数または複数）で切断した、ベクターＧＡ６４３（Ａｎら、１９８８，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌＡ３：１−１９）またはｐＤＨ５１（Ｐｉｅｔｒｚａｋら、１９８６，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅｒｃｈ，１４：５８７５−５８６９）内にクローン化する。プロモーター、フィトエンシンターゼフラグメントおよびその他のｐＤＨ５１配列を含むフィトエンシンターゼ／ｐＤＨ５１クローンからの制限フラグメントを、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でアンチセンスＲＮＡの発現を許す、ＳＬＪ４４０２６ＢまたはＳＬＪ４４０２４Ｂ（Ｊｏｎｅｓら、１９９０，ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，１）またはＢｉｎ１９（Ｂｅｖａｎ、１９８４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１−８７２１）内にクローン化される。この方法は、図２および３に図解している。ベクターの合成後、配列の構造および方向を、ＤＮＡ配列分析によって確認する。実施例３果実の増強されたプロモーターを持つアンチセンスＲＮＡベクターの構築図２および３に示すように、実施例２に記載したメロンのフィトエンシンターゼｃＤＮＡのフラグメントを、ベクターｐＪＲ３内にクローン化する。ｐＪＲ３は、Ｂｉｎ１９を基にしたベクターであり、トマトのポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）プロモーターの制御下で、アンチセンスＲＮＡの発現を許す。このベクターは、約５ｋｂのプロモーター配列および複数のクローニングサイトによって分割されたＰＧプロモーターからの１．８ｋｂの３’配列を含む。合成後、正しい方向性のフィトエンシンターゼ配列を持つベクターを、ＤＮＡ配列分析によって同定する。代わりに、果実の強化プロモーター（Ｅ８および２Ａ１１のような）を、ｐＪＲ３内のポリガラクツロナーゼプロモーターと置換すると、発現パターンが変化する。実施例４ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを持つ先端切除型のセンスＲＮＡベクターの構築また、実施例２に記載したフィトエンシンターゼｃＤＮＡのフラグメントを、実施例２に記載したベクター内にセンス方向にクローン化する。合成後、センス方向のフィトエンシンターゼ配列を持つベクターを、ＤＮＡ配列分析によって同定する。実施例５果実−強化プロモーターを持つ先端切除型のセンスＲＮＡベクターの構築また、実施例３に記載したフィトエンシンターゼｃＤＮＡのフラグメントを、実施例３に記載したベクター内にセンス方向にクローン化する。合成後、センス方向のフィトエンシンターゼ配列を持つベクターを、ＤＮＡ配列分析によって同定する。実施例６ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いた過剰発現ベクターの構築全オープンリーディングフレームを含むメロンのフィトエンシンターゼｃＤＮＡの完全配列を、実施例２に記載したベクター内に挿入する。実施例７果実−強化プロモーターを用いた過剰発現ベクターの構築全オープンリーディングフレームを含むメロンのフィトエンシンターゼｃＤＮＡの完全配列を、実施例３に記載のベクター（ｐＪＲ３または異なるプロモーターを持つ代替物）に挿入する。実施例８形質転換植物の生成ベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４（植物バイオ技術者が広く入手できる微生物）に移入し、これを用いてトマト植物を形質転換する。トマトの茎切片の形質転換は、標準的プロトコール（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１１：６５１−６６２）に従って行われる。抗生物質カナマイシンを含む培地上で増殖する能力によって、形質転換された植物を同定する。植物を、再生させ、成熟するまで成長させる。熟成果実を、それらのカロテノイド含有量の修飾について分析する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１月３０日【補正内容】補正箇所：請求項１０から１３請求の範囲１０．ＤＮＡがＲＮＡへの転写のための少なくとも１０ヌクレオチドの配列を含む、請求項３から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。１１．ＤＮＡが少なくとも３５ヌクレオチドを含む、請求項１０記載のＤＮＡ構築物。１２．カロテノイドの生合成を修飾するのに適合した請求項１から１１のいずれかに記載のＤＮＡで植物を形質転換し、形質転換した植物またはその子孫を育て、さらに、カロテノイド含有量の修飾された植物の部分を持つ植物を選択することを含む、植物内でのカロテノイドの生産を修飾する方法。１３．植物が一つまたはそれより多くのカロテノイドの生産を強化するようにまたは植物によるそのような生産を阻害するように修飾される、請求項１２に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョン，アイザックイギリス国ラクバラエルイー12 ５アールディー，サットン・ボニントン，ユニバーシティ・オブ・ノッティンガム，ディパートメント・オブ・フィジオロジー・アンド・エンヴァイアランメンタル・サイエンス (72)発明者テイラー，ジェーンイギリス国ランカスターエルエイ１４ワイキュー，ランカスター・ユニバーシティ，インスティチュート・オブ・エンヴァイアランメンタル・アンド・バイオロジカル・サイエンシィズ，ディヴィジョン・オブ・バイオロジカル・サイエンシィズ (72)発明者ワトソン，コリンアメリカ合衆国アリゾナ州85721，ツーソン，ユニバーシティ・オブ・アリゾナ，ディパートメント・オブ・プラント・サイエンシィズ, (72)発明者ターナー，アンドリューイギリス国スコットランド，アバディーンエイビー９２ティーエヌ，リリードロン・アベニュー２，スコットゲン・リミテッド, (72)発明者グリーソン，ドナルドイギリス国ラクバラエルイー12 ５アールディー，サットン・ボニントン，ユニバーシティ・オブ・ノッティンガム，スクール・オブ・アグリカルチャー，ディパートメント・オブ・プラント・フィジオロジー

Claims

【特許請求の範囲】１．メロンのフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ。２．ヌクレオチド配列ＩＤ−１を持つメロンのフィトエンシンターゼをコードするｃＤＮＡ３．植物内で機能する転写開始領域の制御下でメロンのフィトエンシンターゼをコードするＤＮＡ配列のいくらかまたは全体を含むＤＮＡ構築物であって、結果として植物細胞中でＲＮＡを生成できるような前記構築物。４．ＤＮＡ配列がアンチセンス方向である、請求項３記載のＤＮＡ構築物。５．ＤＮＡがメロンフィトエンシンターゼ遺伝子の全長等価物である、請求項４記載のＤＮＡ構築物。６．ＤＮＡが、植物の内在性フィトエンシンターゼ遺伝子の発現を阻害するのに充分な数のヌクレオチドを含む部分配列である、請求項４記載のＤＮＡ構築物。７．ＤＮＡがセンス方向である、請求項３記載のＤＮＡ構築物。８．ＤＮＡがメロンフィトエンシンターゼ遺伝子の全長等価物である、請求項７記載のＤＮＡ構築物。９．ＤＮＡがメロンのフィトエンシンターゼ遺伝子の部分配列である、請求項７記載のＤＮＡ構築物。１０．ＤＮＡがＲＮＡへの転写のための少なくとも１０ヌクレオチドの配列を含む、請求項３から９のいずれかに記載のＤＮＡ構築物。１１．ＤＮＡが少なくとも３５ヌクレオチドを含む、請求項１０記載のＤＮＡ構築物。１２．カロテノイドの生合成を修飾するのに適合したＤＮＡで植物を形質転換し、形質転換した植物またはその子孫を育て、さらに、カロテノイド含有量の修飾された植物の部分を持つ植物を選択することを含む、植物内でのカロテノイドの生産を修飾する方法。１３．植物が一つまたはそれより多くのカロテノイドの生産を強化するようにまたは植物によるそのような生産を阻害するように修飾される、請求項１２に記載の方法。１４．カロテノイドを生産する能力を修飾した植物。