CN104725493A - 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用 - Google Patents

胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104725493A
CN104725493A CN201310705310.9A CN201310705310A CN104725493A CN 104725493 A CN104725493 A CN 104725493A CN 201310705310 A CN201310705310 A CN 201310705310A CN 104725493 A CN104725493 A CN 104725493A
Authority
CN
China
Prior art keywords
osbzip34
grass
seed
albumen
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310705310.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104725493B (zh
Inventor
蔡秀玲
王婕琛
张科
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CN201310705310.9A priority Critical patent/CN104725493B/zh
Publication of CN104725493A publication Critical patent/CN104725493A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104725493B publication Critical patent/CN104725493B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用。首次揭示一种转录因子OsbZIP34可应用于改良禾本科植物的产量性状或禾本科植物种子的淀粉性状，获得高产及种子淀粉含量提高的植物。

Description

胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用
技术领域
本发明属于植物学和生物技术领域；更具体地，本发明涉及胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L)是我国主要的粮食作物之一。稻米中淀粉含量62～86%，是人们食用的主要成分。水稻中的淀粉主要以淀粉粒的形式储藏于种子的胚乳中。胚乳中淀粉的含量和结构直接影响着水稻的产量和稻米的质量，如垩白是由于胚乳淀粉和蛋白质颗粒排列不够紧密而产生的不透明部分，又如稻米的直链淀粉含量的高低与米饭的黏性、柔软性、光泽和食味品质密切相关。水稻胚乳中的淀粉合成涉及到细胞质、造粉体两个细胞器，ADPG焦磷酸化酶、颗粒性结合型淀粉合成酶、可溶性淀粉合成酶、淀粉分支酶、去分支酶、淀粉磷酸化酶六类酶，α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷两类化学键的形成。淀粉合成过程是一系列酶在时间和空间协同作用的庞大而复杂的过程。
多项研究表明，水稻中的淀粉合成酶类基因从表达的组织部位和时期来区分，可以分为相对独立的两类，叶片高表达和胚乳中高表达。其中14个淀粉合成酶类基因在水稻开花后7天胚乳高表达，与胚乳中的淀粉合成密切相关。这14个基因具有相似的表达特征，推测水稻胚乳中存在一个调控网络，特异调控这些基因的表达，使其协同参与胚乳中的淀粉合成。
本发明人以前的研究发现，水稻未成熟种子核蛋白可以结合淀粉分支酶基因SBE1的启动子片段C53，而且这种结合可以被颗粒性结合型淀粉合成酶基因Wx的启动子片段Ha所竞争。这两个启动子片段中含有数个ACGT核心元件，通过突变实验证明了ACGT元件是水稻未成熟种子核蛋白的结合位点，而体外表达的水稻bZIP类转录因子REB也可以结合于这两个启动子片段。
本发明人进一步找到了一些OsbZIP类转录因子，可以特异结合SBE1的启动子片段C53(LOC_Os06g51084，-116～-42)，以及Wx的启动子片段Ha(LOCOs06g04200，-1651～-1399)。并对OsbZIP58/RISBZ1的功能进行了深入分析，发现OsbZIP58通过结合于水稻胚乳高表达的淀粉合成酶类基因启动子中富含ACGT元件的片段，调控若干淀粉合成酶类基因的表达，最终影响了水稻胚乳的淀粉合成。
发明内容
本发明的目的在于提供胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种改良禾本科植物的方法，包括：提高禾本科植物中OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达。
在一个优选例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物的产量性状；较佳地，包括：提高禾本科植物的产量；或增加禾本科植物种子的千粒重。
在另一优选例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物种子的性状；较佳地，包括：
增加禾本科植物种子的总淀粉含量；
增加禾本科植物种子直链淀粉含量；或
降低禾本科植物种子中的可溶性糖含量。
在另一优选例中，所述的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白通过结合SBE1基因启动子和/或Wx基因启动子发挥调节作用，改良禾本科植物。
在另一优选例中，所述的提高禾本科植物中OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达包括：
(1)将外源的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因；
(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
在另一优选例中，所述的OsbZIP34蛋白是：
(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；
(c)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的序列相同性高于70%(较佳地高于80%；更佳地高于90%；更佳地高于95%；更佳地高于98%；更佳地高于99%)，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；或
(d)具有(a)限定的蛋白功能的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的活性片段。
在另一优选例中，所述的禾本科植物是水稻。
在本发明的另一方面，提供一种OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的用途，用于改良禾本科植物。
在一个优选例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物的产量性状；较佳地，包括：
提高禾本科植物的产量；或
增加禾本科植物种子的千粒重。
在另一优选例中，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物种子的性状；较佳地，包括：
增加禾本科植物种子的总淀粉含量；
增加禾本科植物种子直链淀粉含量；或
降低禾本科植物种子中的可溶性糖含量。
在另一优选例中，所述的禾本科植物是水稻。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、OsbZIP34基因结构示意图。
A.OsbZIP34两个转录本基因结构示意图。
B.OsbZIP34蛋白保守结构域预测。
C.OsbZIP34与玉米的ZmEmbp-1a、拟南芥的AtGBF1蛋白质序列的多重比较。
图2、OsbZIP34的蛋白生化功能。
A.OsbZIP34定位于细胞核。
B.酵母载体示意图。
C.OsbZIP34结合Wx基因和SBE1基因启动子片段。
图3、OsbZIP34的时空表达模式。
A.半定量RT-PCR检测OsbZIP34在各组织部位的表达模式。叶片1：4周小苗完全展开第一叶叶片；叶鞘1：4周小苗完全展开第一叶叶鞘；叶片2：抽穗前倒一叶叶片；叶鞘2：抽穗前倒一叶叶鞘；根：抽穗期水稻根；茎：抽穗期水稻茎。幼穗：长3cm左右幼穗。种子：开花后第7天未成熟种子。
B.qRT-PCR检测OsbZIP34在水稻种子发育过程中的表达模式。DAF(Dayafter flower)。
图4、OsbZIP34::GUS转基因植株中GUS活性的检测。标尺=1cm(A-B)或1mm(C-G)。
A.节与节间。B.幼穗。C.叶枕。D.1DAF未成熟种子。E.开花前小花。F.5DAF未成熟种子。G.10DAF未成熟种子。
图5、OsbZIP34过表达转基因植株分析。
A.以OsActin-11(AK100267)基因为内参基因，通过半定量RT-PCR检测OsbZIP34过表达转基因植株种子中OsbZIP34的表达情况，1为野生型的中花11，2～10为T3代纯合的OsbZIP34过表达转基因植株。
B.OsbZIP34过表达和OsbZIP34RNAi转基因植株种子，标尺为1cm。
图6、OsbZIP34RNAi转基因植株未成熟种子下游基因检测。
A.OsbZIP34RNAi转基因植株未成熟种子中淀粉合成基因表达下调。
B.糖转运基因表达下调。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种转录因子OsbZIP34可应用于改良禾本科植物的产量性状或禾本科植物种子的淀粉性状。
如本文所用，所述的“植物”为适合进行基因的转化操作的植物。较佳的，所述的植物是禾本科植物，如水稻、小麦、大麦、黑麦、玉米、高梁。
淀粉分支酶Ⅰ(starch-branching enzymeⅠ；SBE1)和蜡质基因(waxy；Wx)；是本领域公知的参与水稻胚乳中淀粉合成的基因。本发明人发现，OsbZIP34可以结合SBE1基因启动子C53片段和Wx基因启动子Ha片段，发挥调控的作用。
所述的OsbZIP34转录因子(蛋白)的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:2的序列基本上相同；其核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白或它们的生物活性片段的氨基酸序列也包括在本发明中。OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一种OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的OsbZIP34蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长OsbZIP34蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长OsbZIP34蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
在多种植物、特别是禾本科植物中，存在OsbZIP34蛋白的同源蛋白。因此，可以理解，来源于不同植物的OsbZIP34的同源蛋白均包含于本发明中。较佳地，它们是与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列相比，序列相同性(同一性、一致性)高于30%；更佳地高于40%；更佳地高于50%；更佳地高于60%，更佳地是高于70%，更佳地是高于80%，更佳地是高于85%，更佳地是高于88%，更佳地是高于90%，更佳地是高于95%，更佳地是高于98%的蛋白。
本发明还提供了编码OsbZIP34蛋白或其同源蛋白或它们的保守性变异多肽的多核苷酸，该多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列的蛋白，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与OsbZIP34蛋白或其同源蛋白或蛋白片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明人克隆了OsbZIP34基因的cDNA全长，并在洋葱表皮系统中证明了该蛋白定位于细胞核。通过该酵母单杂交实验证明该基因也能结合SBE1的启动子片段C53以及Wx的启动子片段Ha。本发明人进一步获得了OsbZIP34的过量表达转基因植株和RNAi转基因植株，发现过表达OsbZIP34可以提高水稻种子千粒重，千粒重的增加可能是由于水稻种子中淀粉合成更为活跃带来的结果，表现为过表达转基因植株的成熟种子中：总淀粉含量增加，直链淀粉含量增加。而OsbZIP34的RNAi转基因植株呈现种子千粒重减小，胚乳中的直链淀粉和总淀粉含量减少。
基于本发明的上述新发现，提供了所述的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因的用途，用于改良禾本科植物；所述的改良禾本科植物包括：改良禾本科植物的产量性状；更佳地，包括：提高禾本科植物的产量；或增加禾本科植物种子的千粒重。所述的改良禾本科植物还包括：改良禾本科植物种子的性状；较佳地，包括：增加禾本科植物种子的总淀粉含量；增加禾本科植物种子直链淀粉含量；或降低禾本科植物种子中的可溶性糖含量。
一些可通过对OsbZIP34或其同源蛋白的影响来调节禾本科植物性状，从而达到改良植物的目的的调节剂(如促进剂)也可被应用于本发明中。
任何可提高OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的活性、提高OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的稳定性、促进OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达、延长OsbZIP34蛋白或其同源蛋白有效作用时间、或促进OsbZIP34或其同源基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于改良禾本科植物性状的物质。
此外，本发明还涉及利用OsbZIP34蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用OsbZIP34蛋白或其同源蛋白或它们的编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达情况，鉴定禾本科植物的产量性状、淀粉性状或可溶性糖性状。
在得知了所述的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带OsbZIP34基因或其同源基因的表达单位(比如表达载体)转化入植物中，并使之表达活性的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白。
本发明还提供了一种改良禾本科植物的方法，包括：提高植物中OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达。作为本发明的一种实施方式，将编码OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达OsbZIP34蛋白或其同源蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的植物。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。
优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因；
(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及
(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。
其它增加OsbZIP34基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强OsbZIP34基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻Wx基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该OsbZIP34基因或其同源基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
本发明将有助于对水稻胚乳中淀粉合成调控机制的进一步研究，增加了水稻育种中可利用的基因资源，在选育优质水稻品种中具有很好的应用价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
植物材料
用于本研究的水稻材料为粳稻品种中花11(Oryza sativa L.subsp.Japonica.cv Zhonghua No.11)，分别种植于中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所人工气候室和上海市松江区栽培基地，人工气候室生长环境为温度29℃±1℃，湿度50-70%，光照时间12h。
克隆OsbZIP34序列
根据MSU网站预测的OsbZIP34(LOC_Os03g59460)基因ORF区引物GE0123(ATGGCATCCTCGGCCGCCT(SEQ ID NO:3))和GE0124(CTACCCTTTGCTGTCATCATTTGTG(SEQ ID NO:4))扩增CDS序列。以水稻ZH11未成熟种子cDNA为模板，扩增反应条件：KOD-plus(TOYOBA)，94℃下预变性4min；94℃30s，60℃30s，68℃1min，循环30次；68℃延伸5min。扩增产物经胶回收后，连接至pBluescript SK载体的EcoRV位点，用PCR与酶切鉴定阳性克隆，送Invitrogen公司测序。3’-RACE和5’-RACE实验使用的是Clontech公司的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit，实验步骤参照其手册。扩增的PCR产物连接到pMD18载体上然后测序。
GFP融合蛋白在洋葱细胞表皮的亚细胞定位
扩增OsbZIP34-1基因CDS区，去除终止密码子TAG，两端加上SalI位点，连接至pA7-GFP载体的SalI位点，选择正向插入质粒，完成35S::OsbZIP34-1:GFP构建(pA7-GFP质粒，以pJH-GFP双元载体为基础加入pUC19质粒的多克隆位点(Sohlenkamp等(2002)Plant Physiol.130:1788-1796)。
洋葱选择里面新鲜的鳞叶切成小块(2cm长宽)，置于MS培养基上。使洋葱鳞叶的内表面(要轰击的一面)朝上。放黑暗培养过夜。取适量金粉用50μl无菌水洗两次。用50μl无菌水重悬。依次加入5μl质粒DNA(1μg/μl)，15μl2.5M CaCl2和7μl0.1M亚精胺(每加完一样，可振荡2-3sec)。亚精胺一般现配现用，如经常使用，可配成1mol/L的母液，分装于离心管中，可于-20℃保存1～2个月，振荡3min，冰上10min，10000rpm离心10～20sec，弃上清，加80μl无水乙醇，振荡重悬，10000rpm离心10～20sec，弃上清，加入10μl无水乙醇重悬待用。把包裹好的DNA轰击进洋葱表皮细胞后，继续放黑暗培养过夜。用荧光显微镜观察洋葱表皮细胞。
酵母单杂交分析
实验所用酵母菌株为EGY48(MATα，his3-，trp1-，leu-，ura-)(购自Invitrogen公司)。SBE1基因启动子C53片段(LOC_Os06g51084，-116～-42)和Wx基因启动子Ha片段(LOC Os06g04200，-1651～-1399)分别串联成双拷贝克隆至鱼饵质粒p178(以质粒pLGD-265UP1为基础进行改造(陈丽等(1996)植物生理学报25(2):110～114)的XhoI位点，p178含Pcyc1最小启动子，插入启动子片段位于Pcyc1上游，此杂合启动子将驱动LacZ报告基因的表达(Wang JC等(2013)Journal of experimental botany64:3453-3466)。将pBluescript SK质粒中的OsbZIP34的读码框融合同框连接至表达载体pPC86(购自Invitrogen公司)中的GAL4AD区EcoRI-SacI位点之间。
先将诱饵质粒p178-C53，p178-Ha转化至EGY48菌株，再将pPC86-OsbZIP34质粒转入，在双缺显色培养基上进行显色(SD-ura-trp+x-gal)，检测LacZ基因的表达。以CPRG为底物，按照Clontech Yeast ProtocolsHandbook标准方法定量检测pPC86-OsbZIP58对启动子的结合能力。
半定量RT-PCR和qRT-PCR检测
按照TRNzol总RNA提取试剂说明书的方法，提取总RNA，用DNaseI(TaKaRa)对总RNA进行消化，经琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量后，以Oligo(d T)18为引物，ImProm-IITM逆转录酶(Promega)进行反转录合成cDNA。以OsUBQ10为内参基因，OsbZIP34RT引物GE0344(ATATCGGGATGGATATTTGGAG(SEQ ID NO:5))；GE0345(GTGCTTATTTAGCTGGCTACTGC(SEQ ID NO:6))，扩增35个循环。
定量PCR扩增使用SYBR ExScript TM RT-PCR Kit(Takara，Japan)，用MyIQ定量PCR仪(Bio-RAD)进行反应，用IQ5软件将所有反应设置一致的基线后读得Ct值，用水稻基因OsUBQ10(AK101547)做内标，根据公式Ratio=[(Etarget)△Ct,target(calibrator-test)]/[E(ref)△Ct,ref(calibrator-test)]计算得到上下调数值。定量PCR引物根据文献合成(Hirose T等(2010)；Journal of experimental botany61:3639-3646；Ohdan T等(2005)；Journal of experimental botany56:3229-3244)。
构建OsbZIP34::GUS植物载体
以水稻中花11DNA为模板，引物GE0493(TGCGGCGAACGAGCGATACC(SEQ ID NO:7))和引物GE0494(TGGCACCCTTGCATCCGTCG(SEQ ID NO:8))扩增OsbZIP34CDS区5’端启动子序列2000bp，构建至pCAMBIA1301多克隆位点PstI/BamHI处，并去除原先的35S启动子，驱动GUS基因的表达。GUS组织化学染色法，根据文献(Chen SY等(2007)，Cell research17:713-721)。
农杆菌介导的水稻转化
参见刘巧泉等(刘巧泉等，1998)的方法。
水稻胚乳淀粉品质检测
水稻的种子去壳(台州粮仪厂JIGJ4.5型检验砻谷机)，脱糙(Kett Pearlest)，再用旋风式磨粉机(Cyclotec1093，FOSS，USA)将精米磨成米粉，过150目筛，所得样品供检测用(总淀粉含量测定，直链淀粉含量测定，可溶性糖测定，DSC测定)。总淀粉相对含量测定，使用Megazyme公司Total Starch AssayKit(K-TSTA)。直链淀粉相对含量测定，国标碘蓝法测定。可溶性总糖测定，硫酸-蒽酮比色法。
OsbZIP34的过量表达载体构建
pCAMBIA1301-35S-HA改造自pCAMBIA1301，插入CaMV35S启动子在pCAMBIA1301载体的EcoRI位点和SacI位点之间；插入T7终止子在pCAMBIA1301载体PstI和SphI之间；插入HA标签在BamHI/XbaI之间。扩增OsbZIP34-1的CDS序列，两端加入PacI位点，插入HA标签碳端，构建完成35S::HA:OsbZIP34。
OsbZIP34的RNAi载体构建
分析OsbZIP34DNA序列，选取基因特异区段设计引物GE0283(GCGAGCTC CGTCGATGCAGGCGTACTA(SEQ ID NO:9))和GE0284(GCGGATCC ACTTTGCAGGTGACAAACCC(SEQ ID NO:10))扩增得到正向片段，引物GE0285(GC gtcgac CGTCGATGCAGGCGTACTA(SEQ ID NO:11))和GE0286(GCctgcagACTTTGCAGGTGACAAACCC(SEQ ID NO:12))扩增得到反向片段，扩增产物(其中包括OsbZIP34基因中+140～+487)正向片段SacI/BamHI酶切后连入转化载体pCAMBIA1301-35S-int的外源Intron前SacI/BamHI位点；反向片段SalI/PstI酶切后连入转化载体pCAMBIA1301-35S-int的外源Intron后SalI/PstI位点形成RNAi发夹结构。
pCAMBIA1301-35S-int改造自pCAMBIA1301，插入CaMV35S启动子在pCAMBIA1301载体的EcoRI位点和SacI位点之间；插入T7终止子在pCAMBIA1301载体PstI和SphI之间；外源Intron序列插入到BamHI/XbaI位点，该外源Intron来自拟南芥基因actin-11(ATU27981)，Intron序列为GATTACGTAAGTAGAACTTAAACACCTACACCATTTTTTTAATCACTACTACCCATTGCATTGAACAAACTTCAAGTTCTTCTTAGCTTCAGATTAAGAAAGTACCCTTCCTTGGCTTTGTTGATGTGGTACCATTGTCTTGTGTGTTTGCAGG(SEQ ID NO:13)。
实施例1、OsbZIP34基因的cDNA全长克隆
本发明人选择了水稻未成熟种子高表达的基因OsbZIP34(LOC_Os03g59460)进行克隆。根据MSU网站水稻基因组预测信息(http://rice.plantbiology.msu.edu)本发明人设计了引物克隆OsbZIP34的ORF区。以水稻ZH11未成熟种子cDNA为模板，PCR产物克隆测序得到了OsbZIP34两个转录本(见图1A，OsbZIP34-1、OsbZIP34-2)。OsbZIP34-1含有9个外显子，包含一个1020bp的开放读码框，与MSU预测的Os03g59460CDS相比，多96bp的第2号外显子，少63bp的第8号外显子。OsbZIP34-2含有8个外显子，包含一个924bp的开放读码框，与TIGR预测的Os03g59460CDS相比，少63bp的第8号外显子。从得到的OsbZIP34cDNA克隆数目来看，15个克隆中有14个为OsbZIP34-1，1个为OsbZIP34-2，转录本OsbZIP34-1可能在水稻胚乳转录产物中占主要地位，本发明人以下的研究以OsbZIP34-1为主，简称OsbZIP34，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
OsbZIP34基因的cDNA全长尚未见报道，本发明人通过3’-RACE和5’-RACE得到其全长cDNA(OsbZIP34-1cDNA)，其cDNA全长1510个碱基，5’UTR由96个碱基组成，3’UTR包含394个碱基，开放阅读框长1023个碱基，编码340个氨基酸(图1A，C)，分子质量36KDa。
对其蛋白结构域进行分析发现，bZIP结构域位于其碳端，OsbZIP34的亮氨酸拉链与多数bZIP类转录因子相比更长，由30个氨基酸残基组成，在bZIP结构域中存在一段典型的核定位信号(NLS；RRSRLRKQ)。OsbZIP34除了拥有bZIP结构域外，还在其碳端存在9个氨基酸残基组成的GCB(GBF ConservedBox，GCB；NLNIGMDIW)结构域(图1B)。GCB存在于大多数GBF类的bZIP转录因子中，具有转录激活功能(Nijhawan A等(2008)；Plant physiology146:333-350)。
用OsbZIP34蛋白序列在NCBI上进行同源比对，发现玉米ZmEmbp-1a和拟南芥AtGBF1与其同源性较高，OsbZIP34与玉米的ZmEmbp-1a相似性56%，与拟南芥的AtGBF1相似性45%。它们在bZIP结构域上的相似性更高，尤其是OsbZIP34的bZIP结构域与玉米的ZmEmbp-1a的相似性高达78%(图1C)。这表明OsbZIP34属于GBF类的bZIP转录因子。
实施例2、OsbZIP34定位于细胞核且具有DNA结合能力
通过对OsbZIP34蛋白质结构预测，发现其碳端拥有RRSRLRKQ典型的核定位信号。为了证实OsbZIP34是否定位于细胞核，本发明人构建了烟草花叶病毒35S启动子驱动的OsbZIP34碳端融合GFP的质粒。通过基因枪的方法将质粒转化到洋葱表皮细胞中，在荧光显微镜下观察到OsbZIP34:GFP融合蛋白定位于细胞核中(图2A)。这表明OsbZIP34可能在细胞核中行使其功能。
将OsbZIP34的读码框连接至酵母单杂系统的表达载体pPC86中的GAL4AD区(图2B)，然后将质粒分别转化到含SBE1基因启动子C53片段的酵母和含Wx基因启动子Ha片段的酵母(图2B)中。通过报告基因LacZ的表达来分析蛋白OsbZIP34与这两个启动子片段的结合能力，空载体pPC86为阴性对照。结果显示，在酵母系统中OsbZIP34蛋白可以结合SBE1基因启动子C53片段和Wx基因启动子Ha片段(图2C)。
实施例3、OsbZIP34的时空表达模式
本发明人通过多种方法对OsbZIP34的时空表达模式进行了全面分析。首先运用了半定量-PCR方法，对OsbZIPC表达的组织部位进行了初步分析，发现其在抽穗前的叶鞘，茎，幼穗中有表达，未成熟种子中的表达量最高(见图3A)。为了精确分析OsbZIP34在水稻种子整个发育阶段的表达模式，以中花11开花后1-18(DAF)天的种子cDNA为模板，通过qRT-PCR检测OsbZIP34在种子发育过程中的表达情况。发现OsbZIP34表达量在种子发育过程中呈现为：1-2DAF表达很低，3-4DAF快速上升，5DAF达到顶峰，然后持续下降直至18DAF种子完全成熟(图3B)。
为了详细了解OsbZIP34在各组织器官的表达情况，进一步克隆了2000bp长度的OsbZIP34启动子片段，插入大肠杆菌β-葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因5’端，构建了植物转化载体OsbZIP34::GUS。采用农杆菌侵染法转化水稻中花11后，得到了OsbZIP34::GUS转基因植株。取转基因植株各组织部位进行GUS组织化学染色，发现在节间，幼穗，叶枕，开花前小花的颖壳等部位呈现蓝色GUS染色信号。未成熟种子发育前期，GUS信号主要出现在种子基部，10DAF未成熟种子中，GUS信号出现在种子的背部，可能与背部维管束位置重合(图4)。
OsbZIP34的时空表达模式与一些糖转运蛋白的表达模式类似，暗示其可能参与调控糖转运蛋白。OsbZIP34在水稻未成熟种子整个发育时期的表达模式和淀粉合成酶类基因的表达模式类似，暗示其也可能参与调控水稻胚乳淀粉合成酶类基因表达。
实施例4、过表达OsbZIP34增强种子淀粉合成使水稻千粒重增加
本发明人构建了烟草花叶病毒35S启动子驱动的OsbZIP34过表达载体，农杆菌侵染法转化中花11品种的水稻，通过PCR鉴定最终得到20个独立的转化株系。过表达植株连续种植，并加以潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，在T3代筛选到纯合植株。以T3代纯合株开花后7天的种子为材料，通过半定量RT-PCR方法检测OsbZIP34的表达情况。在T3代纯合植株中，OsbZIP34的表达水平均有不同程度上调(图5A)。OsbZIP34过表达转基因植株种子千粒重相对于中花11有显著增加(表1)，因此OsbZIP34过表达可以提高水稻产量。并且，种子长度略有增加，没有达到显著差异(表1，图5B)。
表1、OsbZIP34过表达和RNAi植株种子表型统计
*P<0.05，**P<0.01
OsbZIP34过表达转基因植株的种子千粒重显著增加，并且先前的实验表明OsbZIP34能结合SBE1和Wx基因的启动子区域，由此本发明人推测OsbZIP34过表达植株的种子千粒重的增加可能是由于胚乳中淀粉含量的增加造成的。为此本发明人检测了T3代纯合的OsbZIP34过表达转基因植株成熟种子的淀粉理化性状。在选取的两个OsbZIP34过表达株系OsbZIP34-OX-8、OsbZIP34-OX-6中，总淀粉含量、直链淀粉含量均显著性增加，可溶性糖含量显著降低(表2)。这显示了在OsbZIP34过表达植株的未成熟种子灌浆过程中，淀粉合成代谢增强，尤其是直链淀粉的合成代谢增强，最终增加了种子的重量。
表2、OsbZIP34过表达植株淀粉理化性状
*P<0.05，**P<0.01。
实施例5、OsbZIP34表达下调引起种子千粒重减小
为了研究OsbZIP34在水稻体内的生物学功能，本发明人构建了针对OsbZIP34基因的RNAi载体。将RNAi载体导入水稻中花11，得到14个T0代转基因株系。选择有表达下调的转基因株系种植T1代，并加以潮霉素抗性筛选和PCR鉴定，定量PCR鉴定插入拷贝数。选择插入纯合植株进行表型统计，下游基因表达检测，成熟种子理化性状检测。OsbZIP34RNAi转基因植株种子千粒重相对于中花11有显著减少(表1)，种子长度也显著减少，种子宽度和厚度没有显著差异(表1，图5B)。
取T1代2个株系开花后7天种子，通过qRT-PCR的方法检测OsbZIP34表达水平，以及其可能的下游基因的表达水平。由图6A可见，在OsbZIP34RNAi植株中OsbZIP34的表达量有不同程度的下调，千粒重下降较多的株系OsbZIP34-RNAi-10，OsbZIP34的表达量下调也较多，胚乳中高表达的淀粉合成酶类基因和糖转运相关基因的表达也大多下调。同时本发明人也检测了OsbZIP34RNAi转基因植株成熟种子的淀粉理化性状。在选取的三个OsbZIP34RNAi株系中，直链淀粉含量均显著性下降，表型最强株系OsbZIP34-RNAi-10总淀粉含量显著下降、可溶性糖含量显著下降(表3)。
表3、OsbZIP34RNAi植株淀粉理化性状
*P<0.05，**P<0.01。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种改良禾本科植物的方法，包括：提高禾本科植物中OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物的产量性状；较佳地，包括：
提高禾本科植物的产量；或
增加禾本科植物种子的千粒重。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物种子的性状；较佳地，包括：
增加禾本科植物种子的总淀粉含量；
增加禾本科植物种子直链淀粉含量；或
降低禾本科植物种子中的可溶性糖含量。
4.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的提高禾本科植物中OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的表达包括：
(1)将外源的OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
5.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的OsbZIP34蛋白是：
(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；
(c)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的序列相同性高于70%，且具有(a)限定的蛋白功能的蛋白；或
(d)具有(a)限定的蛋白功能的SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的活性片段。
6.如权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的禾本科植物是水稻。
7.一种OsbZIP34蛋白或其同源蛋白的用途，用于改良禾本科植物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物的产量性状；较佳地，包括：
提高禾本科植物的产量；或
增加禾本科植物种子的千粒重。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的改良禾本科植物是改良禾本科植物种子的性状；较佳地，包括：
增加禾本科植物种子的总淀粉含量；
增加禾本科植物种子直链淀粉含量；或
降低禾本科植物种子中的可溶性糖含量。
10.如权利要求7-9任一所述的用途，其特征在于，所述的禾本科植物是水稻。
CN201310705310.9A 2013-12-19 2013-12-19 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用 Expired - Fee Related CN104725493B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310705310.9A CN104725493B (zh) 2013-12-19 2013-12-19 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310705310.9A CN104725493B (zh) 2013-12-19 2013-12-19 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104725493A true CN104725493A (zh) 2015-06-24
CN104725493B CN104725493B (zh) 2018-06-15

Family

ID=53449967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310705310.9A Expired - Fee Related CN104725493B (zh) 2013-12-19 2013-12-19 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104725493B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531645A (zh) * 2018-07-09 2018-09-14 江苏省农业科学院 低直链淀粉含量基因wx-C39的功能标记及其应用
CN110759979A (zh) * 2019-09-04 2020-02-07 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一个提高小麦籽粒淀粉合成的转录因子bZIP2及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006056590A2 (en) * 2004-11-25 2006-06-01 Cropdesign N.V. Plants having increased yield and a method for making the same
CN102206639A (zh) * 2010-03-30 2011-10-05 中国科学院上海生命科学研究院 调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用
CN103160541A (zh) * 2011-12-09 2013-06-19 中国科学院上海生命科学研究院 调节植物种子淀粉理化性状的转录因子

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006056590A2 (en) * 2004-11-25 2006-06-01 Cropdesign N.V. Plants having increased yield and a method for making the same
CN102206639A (zh) * 2010-03-30 2011-10-05 中国科学院上海生命科学研究院 调节植物种子淀粉合成代谢的基因及其应用
CN103160541A (zh) * 2011-12-09 2013-06-19 中国科学院上海生命科学研究院 调节植物种子淀粉理化性状的转录因子

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BUELL,C.R.,ET AL.: "Accession No.ABF99473.1,bZIP transcription factor family protein [Oryza sativa Japonica Group]", 《GENBANK DATABASE》 *
HUAIDE QIN,ET AL.: "Transcriptomics Analysis Identified Candidate Genes Colocalized with Seed Dormancy QTLs in Rice (Oryza sativa L.)", 《J. PLANT BIOL.》 *
JIE-CHEN WANG, ET AL.: "OsbZIP58, a basic leucine zipper transcription factor,regulates starch biosynthesis in rice endosperm", 《JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY》 *
蔡毅等: "水稻bZIP蛋白REB与水稻中sbe1和waxy基因5’上游区的相互作用", 《科学通报》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108531645A (zh) * 2018-07-09 2018-09-14 江苏省农业科学院 低直链淀粉含量基因wx-C39的功能标记及其应用
CN108531645B (zh) * 2018-07-09 2021-07-27 江苏省农业科学院 低直链淀粉含量基因wx-C39的功能标记及其应用
CN110759979A (zh) * 2019-09-04 2020-02-07 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一个提高小麦籽粒淀粉合成的转录因子bZIP2及其应用
CN110759979B (zh) * 2019-09-04 2021-09-03 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一个提高小麦籽粒淀粉合成的转录因子bZIP2及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104725493B (zh) 2018-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sun et al. Characterization and ectopic expression of CoWRI1, an AP2/EREBP domain-containing transcription factor from coconut (Cocos nucifera L.) endosperm, changes the seeds oil content in transgenic Arabidopsis thaliana and rice (Oryza sativa L.)
CN101970668A (zh) 淀粉代谢途径经过修饰的作物
CN112226455B (zh) 一种水稻籽粒粒长和粒重相关蛋白及其编码基因与应用
CN103160541B (zh) 调节植物种子淀粉理化性状的转录因子
Wang et al. Ectopic expression of OsMADS1 caused dwarfism and spikelet alteration in rice
CN107602681A (zh) 水稻粒宽基因gw5l及其应用
CN114032251A (zh) 根优先和胁迫诱导型启动子及其用途
CN105087633A (zh) 调节植物株高、分蘖数目及叶倾角的基因及其应用
Xu et al. Generation of selectable marker-free soft transgenic rice with transparent kernels by downregulation of SSSII-2
CN104725493A (zh) 胚乳淀粉合成相关的转录因子及其应用
CN110777150B (zh) 蛋白GmPLATZ在调控植物种子产量中的应用
CN104878006B (zh) 糊粉层特异表达的、调节植物种子大小及淀粉品质的基因及其应用
AU2017249365B2 (en) Seed- and funiculus-preferential promoters and uses thereof
CN104073512A (zh) 一种调控植物内源乙烯含量的方法
US11124802B2 (en) Modulating plant abiotic stress responses using the Kanghan gene family
CA3017921C (en) Modulating plant abiotic stress responses using the kanghan gene family
CN106939312A (zh) 一种粒重相关基因及其应用
RU2233332C2 (ru) Способ подавления образования побегов (варианты), днк-конструкция ( варианты) и способ скрининга библиотек нуклеиновых кислот
AU2017249663B2 (en) Seed-specific and endosperm-preferential promoters and uses thereof
CN116411018B (zh) TaVRT-A2蛋白及其相关生物材料在调控植物种子蛋白质含量中的应用
CN113861279B (zh) 大豆转录因子GmbHLH664及其编码基因在提高种子蛋白质含量中的应用
EP3443099B1 (en) Seed- and funiculus-preferential promoters and uses thereof
CN102070708B (zh) 与种子脂肪酸合成相关的蛋白BnL1L及其编码基因与应用
KR101555270B1 (ko) 식물의 바이오매스 생산성 또는 종자 수확량을 증가시키는 애기장대 유래 At3g52740 유전자 및 이의 용도
CN116515789A (zh) 一种水稻粒型相关基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200609

Address after: 200032 building 4, No. 300 Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai

Patentee after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No.

Patentee before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180615

Termination date: 20211219