MXPA99009930A - Preparacion de isoflavonas a partir de leguminosas - Google Patents

Abstract

La presente invención se describe un proceso para la producción de soílavonas en donde el matrial de planta a partir de plantas de los géneros leguminosas hacen contacto con agua, un solvente orgánico de C1-C10 y opcionalmente una enzima que divide los glicósidos de isoflavona a la forma de aglucona a fin de formar una combinación, que incuba la combinación por un tiempo suficiente para permitir a las isoflavonas de la aglucona formar la separación dentro del solvente orgánico y después recubrir las isoflavonas a partir del solvente orgánico.

Description

PREPARACIÓN DE ISOFLAVONAS A PARTIR DE LEGUMINOSAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las isoflavonas son químicos vegetales que ocurren ampliamente en miembros de la familia vegetal Legumin osa e . Se basan en una estructura de anillo difenólico simple, como se describe por ejemplo por Carlson et al (1980) , Journal of Chromotography , 198, 193-197 (incorporado en la presente para referencia) . Se describen más de 700 isoflavonas diferentes y estas muestran un rango de funciones biológicas tanto dentro de la planta como dentro de animales incluyendo humanos, los cuales comen las plantas que contienen isoflavona. Un pequeño sub-grupo de isoflavonas (daidzeina, genisteina, biocanina, formononet ina y gliciteina) , se distingue por su habilidad para aglutinarse a receptores de estrógeno en células animales (incluyendo humanas) . Esto se debe a la similitud próxima de la estructura esférica de los anillos difenólicos de isoflavonas con la estructura de anillo esferoidal de estrógenos tales como, estradiol, estrona y estriol . Aunque tienen una afinidad de aglutinamiento substancialmente inferior al receptor en comparación con los estrogénos esferoidales, las isoflavonas estrogénicas son débilmente estrogénicas. Este grupo también muestra un rango de funciones biológicas en células animales que parecen ser independientes del receptor de estrógeno y estas incluyen efectos ant i -oxidantes , diuréticos, ant i -espasmolí t icos y ant i - canéerígenos . Estas interesantes funciones con sus beneficios terapéuticos potenciales han conducido este grupo particular de isoflavonas a la atención de los investigadores médicos en años recientes. En la planta, las isoflavonas pueden ocurrir en una variedad de formas - (i) en la forma de aglucona básica, (ii) como una glucona, aglutinándose a una molécula de azúcar tal como glucosa a través de un enlace ß -glucosí dico (la forma glucosídica) , (iii) la forma de glucona + una molécula de malonilo, y (iv) la forma de glucona + una molécula de acetilo según se describe por ejemplo, por Carlson et al (1980) como se refiere arriba. La forma glucosídica (ya sea sola en las formas de malonilo o acetilo) , es soluble en agua y es la forma predominante para las isoflavonas en muchas leguminosas para facilitar su transporte y almacenamiento. La forma glucosídica proporciona estabilidad mejorada para factores degradantes tales como calor, oxidación e irradiación ultravioleta. En el sitio intra - celular de función bioquímica de la isoflavona, una enzima de ß -glucosidasa intra-celular divide la molécula de azúcar donde se encuentra presente, dejando la forma de aglucona más biológicamente activa, pero substancialmente insoluble en agua. Las isoflavonas se distribuyen completamente de manera más amplia dentro del reino vegetal aunque se encuentran predominantemente en miembros de la familia Legumin osa e . Las isoflavonas estrogénicas (genisteina, biocanina, formononet ina , daidzeina, gliciteina) siguen esta regla general en restringirse grandemente al género Le gum i n osa e . Se ha encontrado que la mayoría de las leguminosas investigadas contienen al menos niveles perceptibles de una o más de estas cinco isoflavonas pero las fuentes más ricas son las leguminosas, soya, lentejas, garbanzos, alholva, tréboles, alfalfa y varias variedades de semillas. Las fuentes más ricas de estos compuestos son , los tréboles (incluyendo Tri fol i um pra t en s e , Tri fol i um s ub-t errea n ) y soya (ya sea soya completa o soya desgrasada o cualquier material resultante como producto del procesamiento de soya incluyendo sémola. ^ de soya, hipocótilos de soya y melazas de soya) . Los niveles de estos compuestos en tréboles y soya varían de acuerdo a la variedad o cultivo y de los 5 factores, estacional, ambiental y edad de la planta. Los niveles en tréboles varían entre aproximadamente 0.5 y 3.5% (en base de peso en seco) y en semillas de soya entre aproximadamente 0.05 y 0.3% (peso en seco ) . 10 Las isoflavonas pueden utilizarse como terapéuticos para síndrome pre -menstrual y síndrome menopáusico (Patentes de E.U. 5569459, 5516528, 5498631) y osteoporosis (Patente de E.U. 5424331) y como aditivos alimenticios (Patentes de E.U. 4366082, 4390559) . Teniendo en cuenta estos usos importantes, es ventajoso aislar o concentrar isoflavonas de plantas. Se han propuesto varias técnicas para llevar a cabo el aislamiento de isoflavonas, pero esencialmente existen dos métodos distintos. El primer método incluye la conversión de la forma de glucona soluble en agua a la forma de aglucona insoluble en agua para facilitar la extracción subsecuente de las agluconas en un solvente orgánico adecuado tal como alcohol. Esta etapa de conversión se describe como llevándose a cabo en una de dos maneras: ya sea (a) a través de hidrólisis mediante '• la exposición a calentamiento vigoroso (típicamente 80-100°C) en pH bajo {Wang K, Kuan SS, Francis OJ, 5 Ware KM, Carman AS. "A simplified HPLC method for the determina t ion of phytoestrogens m soybean and lts processed products " , J. Agrie. Food Chem. 38:185-190, 1990) ; o (b) mediante la exposición a • una enzima (glucosa hidrolasa, ß -gl icosidasa o ß- 10 glucuronidasa) , que divide específicamente el enlace ß -gl icosídico con la molécula de azúcar. Ya sea que la enzima se agregue a la reacción o pueda utilizarse la ß -glucosidasa que ocurre naturalmente • dentro de la planta. En respecto a lo último, se describe un método (JP 89-345164/47), mediante el cual la actividad enzimática natural dentro de semillas de soya se utiliza mediante el calentamiento de la harina de soya a 45-55cC por varias horas, aunque la cantidad de actividad enzimática que ocurre naturalmente en muestras de harina de soya comercialmente disponibles es altamente variable y aún cuando en su máximo es insuficiente para obtener hidrólisis de más de aproximadamente 50-60% de las gluconas presentes.

Los diversos procedimientos de reacción de hidrólisis (ya sea enzimático o calent amient o/pH ba]o) , se describen como aplicándose a una mezcla de material vegetal de tierra en agua. En la conclusión del proceso de hidrólisis, la fase acuosa se separa del material vegetal sin disolver para facilitar la siguiente etapa. Una vez que se lleva a cabo la conversión de la glucona a la forma de aglucona, la mezcla acuosa se pone en contacto entonces con un solvente orgánico (e hidroinmiscible ) . Las agluconas, debido a su insolubilidad substancial en agua, se extraen en la fase solvente orgánica y se recuperan subsecuentemente . Los métodos previamente propuestos incluyen la extracción inicial en agua de las isoflavonas en su forma glucosídica a fin de que ya sea, se retengan en su forma o puedan convertirse subsecuentemente a su forma de aglucona. Las técnicas descritas para este planteamiento incluyen agregar el material vegetal de tierra al agua y por un periodo de tiempo (de varias horas a varios días) las formas glicosídicas que ocurren naturalmente de las isoflavonas se disuelven en la fase acuosa. Después de separar el material vegetal sin disolver de la fase acuosa, las isofjavonas en la fase acuosa • se convierten a la forma de aglucona mediante cualquiera de los métodos señalados arriba y se recuperan subsecuentemente. Una variante de este 5 planteamiento incluye el retiro selectivo de las formas de aglucona de la mezcla acuosa, mediante la absorción a una resina de intercambio iónico apropiada. Las isoflavonas se eluyen • subsecuentemente de esa resina utilizando una mezcla de agua : solvente orgánico, concentrada mediante evaporación giratoria, y se hidrolizan entonces a la forma de aglucona mediante digestión enzimática o tratamiento de calor/ácido (JP 95-272884/36) . Las desventajas de las técnicas anteriores incluyen (a) una multiplicidad de etapas, (b) el uso' de tratamientos vigorosos tales como calentamiento y/o ácido fuerte y/o álcali fuerte, (c) las producciones comparativamente bajas de isoflavonas, (d) el costo muy elevado de hidrolizar enzimas, y (e) los costos de instalación elevados y los costos variables elevados asociados con la extracción de múltiples etapas a gran escala de isoflavonas en cantidades comerciales. Todos los procedimientos de extracción de isoflavona conocidos, actuales se afectan por una o más de estas desventajas y sirven para reducir mucho la viabilidad comercial del • proceso. Si los beneficios de salud de la comunidad supuestos de las isoflavonas estrogénicas están por realizarse, entonces deben ser económicamente 5 accesibles para la comunidad general. Para que esto suceda, debe encontrarse un método de extracción mejorado y más efectivo en costo. SUMARIO DE LA INVENCIÓN • En el aspecto más amplio de esta invención- 10 se proporcionan procesos para la producción de isoflavonas a partir de plantas del género Legum i n osa e , que comprenden el contacto del material vegetal con agua, un solvente orgánico de C?-C10 y opcionalment e una enzima que divide los glicósidos de isoflavona a la forma de aglucona, para formar una combinación e incubar la combinación por un tiempo suficiente para permitir que las isoflavonas de la forma de aglucona se separen en el solvente orgánico, y después de esto recuperar las isoflavonas del solvente orgánico. La combinación de los componentes arriba mencionados puede comprender una fase acuosa que contiene enzima y material vegetal y una fase orgánica, en la cual se separan las isoflavonas. La combinación puede comprender una emulsión formada mediante el mezclado vigoroso del solvente orgánico • y agua, o si se utiliza un solvente orgánico hidromiscible la combinación es una mezcla de agua y solvente orgánico. 5 Cuando el solvente orgánico no es hidromiscible , puede retirarse el solvente orgánico que contiene isoflavonas disueltas, por ejemplo mediante evaporación, para dar una isoflavona que contiene residuos. Los residuos pueden mezclarse entonces con un solvente orgánico de Ci-Cio en el cual las isoflavonas son substancialmente insolubles, de tal manera que las isoflavonas se precipitan y se recuperan subsecuentemente. Cuando el solvente orgánico es miscible con agua, puede retirarse el solvente orgánico en la combinación, por ejemplo mediante evaporación, para dar una isoflavona que contiene residuos y agua, que después de esto puede mezclarse con un solvente orgánico de Ci-Cio no hidromiscible que solubíliza la isoflavona para dar una fase acuosa y una orgánica. La fase solvente orgánica que contiene isoflavonas disueltas puede recolectarse y recuperarse las isoflavonas a partir de la misma. El solvente orgánico puede evaporarse con adición de agua, después de lo cual las isoflavonas forman un floculato insoluble en agua, el cual se recupera • subsecuentemente . Cuando se utiliza una enzima para dividir los glicósidos de isoflavona a la forma aglucona, incluye preferentemente una ß-glucanasa. Más preferentemente, la enzima es una mezcla (o combinación) de ß-glucanasa y ß-xilanasa. • En otro aspecto se proporciona una composición que comprende isoflavonas cuando se produce de acuerdo al proceso de esta invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona en su aspecto más amplio un proceso para la producción de isoflavonas a partir de plantas del género Legum m osa e , que comprende el contacto del material vegetal con agua, un solvente orgánico de Ci-Cio y opcionalmente una enzima que divide los glicósidos de isoflavona a la forma de aglucona, para formar una combinación e incubar la combinación por un tiempo suficiente para permitir que las isoflavonas de la forma de aglucona se separen en el solvente orgánico, y después de esto recuperar las isoflavonas del solvente orgánico. La combinación que resulta de combinar material vegetal, agua, un solvente orgánico de Ci- Cío y opcionalmente una enzima que divide los glicósidos de isoflavona a la forma de aglucona, puede encontrarse en la forma de una mezcla de fase separada que comprende una fase acuosa que contiene la enzima y material vegetal y una fase orgánica en la cual se separan las isoflavonas en incubación siguiendo la división por la enzima. La combinación puede comprender una emulsión formada por el mezclado vigoroso del solvente orgánico y agua, o cuando el solvente orgánico es hidromiscible la combinación puede ser una mezcla de agua y solvente orgánico. Cuando la combinación comprende una emulsión se prefiere retirar material particulado de la emulsión, después de un periodo de tiempo suficiente para permitir que la forma de aglucona de la isoflavona se separe en el solvente orgánico, utilizando un proceso de separación estándar tal como filtración o centrifugación. Después ocurre la separación de fase, permitiendo esto subsecuentemente la recuperación de isoflavonas del componente de solvente orgánico. Cuando el solvente orgánico no es hidromiscible , puede retirarse el solvente orgánico que contiene isoflavonas dísueltas, por ejemplo mediante evaporación, para dar una isoflavona que contiene residuos. Los residuos pueden mezclarse • entonces con un solvente orgánico de C?-C?o en el cual las isoflavonas son substancialmente insolubles, de tal manera que las isoflavonas se 5 precipitan y se recuperan subsecuentemente. Cuando el solvente orgánico es miscible con agua, puede retirarse el solvente orgánico en la combinación, por ejemplo mediante evaporación, para • dar una isoflavona que contiene residuos y agua, que después de esto puede mezclarse con un solvente orgánico de Ci-Cio no hidromiscible que solubiliza la isoflavona para dar una fase acuosa y una orgánica. La fase solvente orgánica que contiene isoflavonas disueltas puede recolectarse y recuperarse las isoflavonas a partir de la misma. El solvente orgánico puede evaporarse con adición de agua, después de lo cual las isoflavonas forman un floculato insoluble en agua, el cual se recupera subsecuentemente . 20 Se requiere específicamente que la enzima opcionalmente utilizada para dividir el glicósido de isoflavona a la forma de aglucona (de aquí en adelante referida como isoflavona) , divida el enlace ß -gl icosí dico que se describe como el enlace dominante entre la isoflavona y su molécula de carbohidrato (normalmente glucosa) . Una persona experta en el campo de química de carbohidratos deduciría que la enzima más apropiada para lograr esto sería una ß -glucosidasa y posiblemente una ß-glucanasa. Como lo muestra la Tabla 1, en un experimento para comparar las potencias relativas de diferentes enzimas de carbohidrato en su habilidad para dividir en enlace glicosídico de isoflavonas de soya, se encontró que la ß -glucosidasa es altamente efectiva; se encontró de manera inesperada que la ß-glucuronidasa también es. altamente efectiva; se encontró de manera inesperada que la ß-glucanasa tiene potencia relativamente baja y requiere un tiempo de reacción considerablemente más largo. En algunas plantas que contienen isoflavona tales como tréboles, la actividad enzimática de ß -gl icosidasa endógena es generalmente suficiente para efectuar la división de la forma de glucona sin la necesidad de enzimas de división adicionales. Por lo tanto, la adición de enzimas, en el proceso de esta invención, puede considerarse como opcional. Tabla 1 Acciones comparativas de diferentes enzimas de accionamiento de carbohidrato en convertir las isoflavonas de soya en sus formas glicosídicas • (daidz a, genistina) a las formas de aglucona (daidzeina, geniste a) . Tipo de enzima* Actividad Relativa (% de conversión) ß-glucosi asa 90 ß-glucuronidasa 98 ß - glucanasa 40 1,4-bD-glucan hidrolasa 1 , 4 -a-D-glucan hidrolasa • ß -xilanasa . b- glucanasa (10:1! 85 ß -xilanasa . b- glucanasa (1:1) 87 * Todas las enzimas agregadas en la misma concentración a una cantidad estándar de isoflavona. Se encontró por lo inventores que una mezcla enzimática de ß -glucanasa/ß -xilanasa es relativamente efectiva en dividir el glicósido de enzima a la forma de aglucona. Esto fue completamente inesperado teniendo en cuenta que no había razón en esperar que una ß-xilanasa tuviera cualquier efecto en la forma descrita de enlace glicosídico en la forma de glucona de isoflavona.

Venta osamente, esta mezcla enzimática derivada de hongos se encuentra disponible en grandes cantidades comerciales a un costo ventajoso. Aunque solamente son ligeramente menos eficientes que las enzimas b-glucosidasa y ß -glucuromdasa más específicas, las últimas enzimas no se encuentran disponibles en volumen, en cantidades comerciales o a precios efectivos en costo. Además, el bajo costo de la mezcla enzimática de ß-glucanasa/ß -xilanasa permitió que la dosis por unidad de isoflavona se incrementará más que compensar la eficiencia ligeramente disminuida. En una modalidad del proceso que incluye una enzima, el solvente orgánico no causa inactivación significativa de la enzima ut íli zada . El material vegetal se deriva de plantas del género Le gum m os a e y puede obtenerse de plantes tales como, soya, trébol (incluyendo trébol subterráneo, trébol ro o y otros tréboles que contienen isoflavona) , garbanzos, lentejas, semillas (tales como, haba, alubia, habichuela, frijol y frijol blanco) , las cuales generalmente contienen niveles elevados de isoflavonas que otras plantas del género Legum m o sa e . Se prefiere que el material vegetal se derive de soya o trébol aunque esto no quiere decir que otras plantas que contienen isoflavona del género Legum m osa e no puedan utilizarse en el proceso de esta invención. Cuando las isoflavonas se extraen de tréboles, no es - 1( necesario el uso de una enzima que divida los • glicósidos de isoflavona. El material vegetal se encuentra preferentemente en la forma de partículas finas, tal 5 como una harina producida al moler o de otra manera procesar el material vegetal tal como trébol, semillas de soya, otras semillas, garbanzos y lentejas. El material vegetal preferido es soya • { Glyci n e ma x ) o trébol, tal como trébol rojo. Sin limitar la presente invención, se prefiere retirar tanto como sea posible partes de la planta que no contienen isoflavonas a cualquier grado considerable, con el objeto de reducir el volumen de material a exponerse al proceso de extracción. Por ejemplo, aproximadamente el 90% de las isoflavonas contenidas en tréboles cultivados ocurre en las hojas y aproximadamente el 10% en los tallos y pecíolos, por lo que es ventajoso separar las hojas de los tallos, lo cual puede llevarse a cabo al exponer primero la planta seca a una acción de trillación seguida por el cribado diferencial para separar las hojas más pequeñas de los tallos más grandes. En otro ejemplo, las semillas de soya pueden descascararse y/o desgrasarse y descascararse. La harina de soya desgrasada se encuentra fácilmente disponible en cantidades fl comerciales. En otro ejemplo, el hipocótilo de soya que con frecuencia se separa de los cotiledones de soya durante los procesos de descascarado regulares 5 y se recolecta fácilmente mediante métodos estándar tal como el cribado, contiene típicamente niveles de isoflavona elevados (entre aproximadamente 0.5 y 1.5%) en comparación con la semilla de soya completa • (entre aproximadamente 0.05 y 0.3%) . 10 Los solventes orgánicos utilizados en las diversas modalidades de esta invención comprenden de 1 a 10 carbonos (C?-C?0) e incluyen solventes orgánicos hidroinmiscibles e hidromi scibles . Los solventes orgánicos hidromi scibles incluyen alcoholes de Ci-Cio tales como metanol, etanol, propanol e isopropanol, ácido acético, acetona, acetonitrilo, formamida de dimetilo, sulfóxido de dimetilo, n-propanol, isopropanol, tetrahidrofurano y mezclas de cualquiera de tales solventes. Los solventes de C?-C?0 hidroinmiscibles que son solubilizantes de isoflavona incluyen alcoholes de Ci-Cio (tales como butanol, hexanol y pentanol) , solventes de alcoxi de C?-C?0 (tales como etil metil cetona, metil fenil cetona, hexano - 2 , 4 - diona y lo similar) ; ácidos est eri f icados de C2-C?o (tales como - lí acetato de etilo, etil metil malonato, fosfonato de fl dimetilo) ; aldehidos de C?-C8 (incluyendo butanona, pentanona, hexanedial, carbaldehído de ciciohexano y butano- 1 , 2 , 4 - tricarbaldehí do ; éteres de C2-C10, 5 alquenos de C2-C3, fenol o alquenos de C2-C4 y sus derivados (tales como benzeno 1,2,4-t?ol) y mezclas de cualquiera de tales solventes . Los solventes orgánicos en los cuales las isoflavonas son • substancialmente insolubles incluyen alcanos C5-C?0 (tales como hexano, ciciohexano, heptano y octano) y alcanos de C -C?0 y mezclas de cualquiera de tales solventes. El solvente orgánico utilizado se selecciona preferentemente por tener una volatilidad para permitir que el solvente orgánico se retire mediante evaporación (por ejemplo, mediante destilación, evaporación giratoria y lo similar) de tal manera que los compuestos de isoflavona disueltos en el solvente orgánico pueden recuperarse subsecuentemente . 20 El agua utilizada en el proceso puede ser de cualquier fuente de agua convencional, agua destilada, agua desionizada y destilada o lo similar. El agua puede contener preservativos para retardar el crecimiento microbial y/u otros aditivos como se conocen bien en la materia. Las proporciones respectivas de agua y solvente orgánico no se limitan en esta invención. Generalmente, se utilizan proporciones iguales de agua y solvente orgánico, aunque puede variar la proporción de agua 5 a solvente orgánico, por ejemplo desde 1:10 a 10:1. Cuando la combinación que resulta de la mezcla de agua y solvente orgánico comprende una fase orgánica y una fase acuosa, las fases • respectivas pueden mezclarse o agitarse suavemente.

Esto puede lograrse fácilmente mediante un agitador colocado verticalmente que permite el mezclado de las fases respectivas sin intermezclar las fases como tales . El proceso de la invención no requiere • 15 temperaturas elevadas y puede conducirse bajo condiciones de temperatura ambiente, por ejemplo de 5°C a 35°C. Por lo tanto, las condiciones de temperatura ambiente pueden bastar sin la necesidad de control sofisticado de temperatura, como se requiere en los procesos de la técnica anterior en donde son necesarias temperaturas de extracción elevadas . En una modalidad el proceso de extracción de la presente invención es una reacción monoetápica, de un recipiente que confiere beneficios substanciales tales como ahorros en el '• costo en gastos de equipo esencial y en el tiempo. La eficiencia de la digestión enzimática y la extracción del solvente en una etapa, de acuerdo a 5 una modalidad de esta invención, es muy eficiente y da producción elevada de productos de isoflavona, la cual es generalmente en contraste a los procedimientos de la técnica anterior. • Los compuestos de isoflavona se recuperan del componente de solvente orgánico generalmente mediante vaporización (evaporación) de la fase orgánica tal como evaporación giratoria, destilación o lo similar. Se encuentra que una cantidad pequeña de aceite que contiene las isoflavonas de aglucona permanece siguiendo el retiro de la fase orgánica. Este aceite enriquecido con isoflavona puede considerarse como el producto final deseado y utilizarse como tal, aunque es preferible continuar el proceso de extracción para concentrar más las isoflavonas. El aceite que contiene isoflavonas puede retirarse entonces por la adición de un solvente orgánico adecuado tal como hexano, heptano y octano, los cuales son altamente solubles para aceites pero de solubilidad muy baja para isoflavonas; se utiliza preferentemente hexano debido a su costo relativamente bajo. El solvente '• (tal como hexano) se agrega en una proporción al aceite de entre aproximadamente 1:1 y 50:1, preferentemente 10:1. Se encuentra que el aceite se 5 separa fácilmente en la fase solvente orgánica y que este se asocia con las isoflavonas que caen fuera de la solución y que se asienten en la parte inferior del recipiente. La fase de hexano : aceite se retira • entonces dejando el residuo que contiene isoflavona.

Este puede recuperarse y secarse, tal como en un horno a una temperatura de entre aproximadamente 50°C a 120°C, para producir un polvo fino que se formula subsecuentemente para su uso terapéutico, como se describe en lo sucesivo. Preferentemente, sin embargo, la etapa de extracción de hexano se repite 1-3 veces más para efectuar el retiro completo del aceite. Alternativamente, el aceite que contiene puede someterse a fraccionación HPLC, intercambio iónico, cromatografía u otras técnicas bien conocidas en la materia para el enriquecimiento/purificación de la isoflavona. Cuando el solvente orgánico de C?-C?0 utilizado para extraer material vegetal es miscible con agua (por ejemplo un alcohol tal como etanol) , el solvente orgánico puede retirarse mediante evaporación (tal como evaporación giratoria o destilación) para dar un concentrado que contiene un aceite que contiene isoflavona en agua. Este concentrado puede mezclarse con un solvente orgánico de C1-C10 que solubiliza la isoflavona, por ejemplo, acetato de etilo para dar una fase acuosa y una fase orgánica que contienen isoflavona. La fase orgánica puede recolectarse y recuperarse las isoflavonas a partir de la misma. Por ejemplo, el solvente orgánico puede evaporarse con adición de agua, por ejemplo utilizando un destilador, después de lo cual las isoflavonas forman un floculato insoluble en agua, el cual se recupera subsecuentemente y se formula en una composición farmacéutica/médica. En esta etapa el material extraído es de contenido elevado de isoflavona, tal como desde 36 a 70% de isoflavonas, y generalmente es comparable a la proporción de isoflavonas del material inicial. Como una consecuencia las producciones de material son típicamente muy elevadas. El material puede utilizarse para propósitos terapéuticos en este punto, por ejemplo secándose y formulándose subsecuentemente, o puede someterse a procesamiento adicional como se sabe en la materia para purificar más la isoflavona. La purificación adicional puede comprender fraccionación HPLC, cromatografía de intercambio iónico u otras técnicas como se conocen bien en la material. Por ejemplo, medíante fraccionación PLC puede retirarse daidzeina o 5 geni steina . Cuando la soya es el material inicial, las isoflavonas extraídas son daidzeina, genisteina y gliciteina; el material restante se compone de un rango de compuestos que incluyen fitosteroles y 10 otros compuestos insolubles en agua. Cuando el trébol es el material inicial, las isoflavonas extraídas son daidzeina, genisteina, formononet ina y biocanina; varios flavonoides incluyendo clorofila así como f i stost eróles integran el volumen del 15 restante del aislado. Las isoflavonas producidas de acuerdo al proceso de esta invención pueden purificarse individualmente. Por ejemplo, daidzeina y genisteina pueden purificarse por HPLC u otras 20 técnicas cromatográf icas o métodos estándar para purificar estos compuestos conocidos en la materia". Las isoflavonas pueden formarse en composiciones farmacéuticas o composiciones médicas, bebidas, alimentos y lo similar, en combinación con portadores, excipientes apropiados y lo similar como se conocen bien en la materia, por ejemplo como se • describe en Handbook of Pha rma ce u t i ca l Excipi en te , Segunda Edición, American Pharmaceutical Association, 1994 (incorporada en la presente para 5 referencia) . Las composiciones farmacéuticas o composiciones médicas pueden comprender tabletas, cápsulas, polvos para reconstitución, jarabes y lo similar. Los portadores/excipientes estándar • utilizados en tales formulaciones incluyen celulosa microcristalina, fosfato de hidrógeno calcico, estearato magnésico y sílice coloidal. Los alimentos que contienen isoflavonas pueden comprender barras de alimentos, galletas, bocadillos y otras formas de alimentos estándar bien conocidas en la materia. Las bebidas pueden contener saborizantes, reguladores y lo similar. En otro aspecto se proporciona una composición que contienen isoflavonas cuando se prepara de acuerdo al proceso de esta invención, opcionalmente en asociación con un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede encontrarse en asociación con componentes alimenticios, por ejemplo en barras de musli o alimentos, galletas, bebidas y lo similar. 25 Parecería que la técnica anterior no ha contemplado el uso de un proceso de un recipiente para convertir las isoflavonas de la forma de glucona a la forma de aglucona al mismo tiempo que la recuperación de las isoflavonas de aglucona en un solvente orgánico por un número de razones. Pudo creerse necesario retirar el material vegetal de leguminosa residual del proceso, después de la división de la forma de glicósido. También pudo haberse considerado que el solvente orgánico inactivaría las enzimas que efectúan la formación de la forma de aglucona. Como una consecuencia, en la técnica anterior la conversión de la forma de glucona soluble en agua a la forma de aglucona insoluble en agua puede llevarse a cabo en múltiples etapas, seguidas por una etapa subsecuente de extracción de las agluconas en un solvente orgánico adecuado . Las modalidades de la presente invención se describirán ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Ejemplo 1 2000 kg . de harina de soya desgrasada se colocan en un recipiente de 10,000 L, como se representa en la figura 1, que contiene 5,000 L de agua desionizada y 10 kg . de ß -glucanasa/b-xilanasa (Bio-Feed Beta CT ; Novo Nordisk, Dinamarca) . 1000 L • de acetato de etilo se ponen sobre la parte superior de la suspensión acuosa para dar una combinación de dos fases. Tanto la fase acuosa como la fase 5 solvente se mezclan suavemente mediante agitación continua utilizando un agitador de paletas, vertical (figura 1) . Se encuentra que en el punto de contacto entre las fases acuosa y solvente orgánica, • las isoflavonas de aglucona se mueven fácilmente desde la fase acuosa hacia la fase solvente orgánica. La agitación constante de la fase acuosa se diseña para asegurar la exposición máxima de las isoflavonas hidrolizadas al acetato de etilo; la agitación constante del acetato de etilo ayuda a asegurar un gradiente de concentración de isoflavona elevado entre las dos fases, aumentado así la velocidad de disolución de la forma de aglucona insoluble en agua en el acetato de etilo. Un contacto adicional opcional entre las dos fases puede proporcionarse mediante la circulación de la suspensión acuosa inferior a través de la fase de acetato de etilo. Después de aproximadamente 4 a aproximadamente 48 horas, pero preferentemente alrededor de 18 horas, se detienen los procesos de agitación y recirculación y se permite a las dos fases separarse de manera máxima. El acetato de etilo se retira y evapora utilizando un destilador. Aproximadamente 20 L de aceite permanece sin evaporar. Se agregan 200 L de hexano al aceite y se mezcla vigorosamente mediante agitación por aproximadamente 5 minutos. Esta se deja estancar durante la noche (aproximadamente 18 horas) sin agitar y se encuentra que el material particulado que contiene las isoflavonas de aglucona se asienta en la parte inferior del recipiente de reacción. La fase de hexano : aceite se decanta dejando un sedimento. Se agregan 5 1 más de hexano al sedimento para efectuar el retiro del aceite residual. Esta mezcla se deja estancar por 1 hora, tiempo por el cual el material particulado se ha asentado fuera de nuevo. La fase de hexano : aceite se decanta, dejando un sedimento semi-sólido que se recolecta y seca en un horno a una temperatura de aproximadamente 85CC. Mediante el análisis HPLC se encontró que este material contiene entre aproximadamente 36-70% (típicamente aproximadamente 60%) de isoflavonas. De manera importante, la proporción de las isoflavonas en el extracto es comparable a aquella del material inicial y las producciones de isoflavona típicamente son muy elevadas (Tabla 2) . Este material puede utilizarse para el propósito como está, o puede someterse a procesamiento adicional con objeto de purificar más las isoflavonas. Tabla 2 Recuperación de isoflavonas de la harina de soya total utilizando el método de extracción descrito en el Ej emplo 1. Isof lavona % de recuperación del material inicial daidze ma 8 0 3 geni s t e ina 7 6 3 gl íc i tema 7 5 0 E j emplo 2 El material inicial son 200 kg . de sémola de soya que contienen una mezcla de hipocótilos de soya y piezas de cotiledones de soya y que representan una fuete más enriquecida de isoflavonas (aproximadamente 10% en comparación con aproximadamente 0.2% en harina de soya total) . 200 kg . de sémola de soya se colocan en un recipiente de 3000 L que contiene 1000 L de agua desiomzada y 2.5 k . de glucan hidrolasa (Bio-Feed Beta CT; Novo Nordisk, Dinamarca) . Se agregan entonces 1000 L de acetato de etilo y las fases acuosa y solvente se mezclan entonces juntas vigorosamente utilizando una bomba con una capacidad de aproximadamente 200 L por minuto para asegurar el contacto efectivo entre las dos fases, es decir, formar una emulsión. La mezcla continua a temperatura ambiente por un periodo de entre 1-24 horas, pero preferentemente 4 horas. El material particulado en esta combinación se separa entonces de la fase líquida mediante un proceso estándar tal como filtración o centrifugación. El retiro del material particulado destruye la emulsión, y al permitir que la fase líquida resultante se estanque por aproximadamente 30 minutos existe separación efectuada entre las fases acuosa y de acetato de etilo. El acetato de etilo que contienen las isoflavonas se retirar entonces y se expone a la destilación. El aceite residual que permanece después de la destilación del acetato de etilo, se trata entonces de acuerdo a las etapas subrayadas en el Ejemplo 1 anterior para aislar el material enriquecido con isoflavona. Ejemplo 3 500 kg . de trébol se alimentan hacia una unidad de extracción contracorriente y se mezclan con 5000 L de 50% de etanol por un periodo de tiempo de 6 horas. El extracto solvente se bombea entonces para almacenarse y se desecha el trébol . El etanol se recupera entonces mediante evaporación giratoria bajo presión (-80kPa) y a 80°C, dando como resultado 500 L de concentrado extraído (un aceite que contiene isoflavona en agua) y la recuperación de 4000 L de la mezcla de etanol/agua. El concentrado se mezcla con acetato de etilo a una proporción de 1:4 (es decir, 2000 L de acetato de etilo) y la mezclo se dejo asentarse en una capa de agua y una capa de acetato de etilo. Las isoflavonas se solubilizan en la capa de acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se bombea hacia un destilador, y el solvente se evapora bajo vacío con adición de agua. El grumo húmedo (componente activo) se bombea entonces hacia un depósito de almacenamiento. 50% del grumo húmedo se mezcla entonces con un agente de deshidratación por aspersión, se recuperan las isoflavonas activas y deshidratas por aspersión (25%) . El 50% restante se enjuaga con hexano, se deshidrata, se seca a 90°C, se muele y mezcla con portadores/excipientes para su formación en tabletas . Ejemplo 4 El producto final seco de los Ejemplos 1 a 3 anteriores (Muestra 1) puede utilizarse como un material inicial para concentrar gen steina o • daidzeina con/sin gliciteina. La purificación se establece mediante procedimientos estándar incluyendo HPLC, cromatografía de intercambio iónico 5 y otra separación cromatográf ica . En una serie de experimentos, se separan 3 kg . del producto final seco de los Ejemplos 1 a 3, permitiendo la separación de daidzeina y genisteina. Se asila la • daidzeina, de pureza entre aproximadamente 95-99% 10 (típicamente 98.5% de pureza) . Se recupera la genisteina de pureza similar. Ejemplo 5 Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse a partir de los productos extraídos de 15 acuerdo a los ejemplos anteriores. 1. La siguiente composición se prepara en la forma de una tableta: Utilizar extracto de harina de soya preparado de acuerdo al Ejemplo 1 y que 20 contiene (35% de genisteina y 38% de daidzeina en peso) 65 mg . de extracto 340 mg . del portador inerte de tableta estándar . 25 Esta composición se forma en tableta para - proporcionar una tableta de 400 mg . que contiene 20 mg . de genisteina y 17 mg . de daidzeina. 2. La siguiente composición se prepara en la forma de una cápsula: Utilizar extracto de hipocótilo de soya preparado de acuerdo al Ejemplo 2 y que contiene (18% de genisteina , 35% de daidzeina y 18% de gliciteina en peso) 65 mg . de extracto 190 mg . del portador inerte farmacéuticamente estándar. Todo se contiene en una cápsula de gelatina no tóxica y proporciona 200 mg . que contienen aproximadamente 11 m . de genisteina, 21 mg . de daidzeina y 11 mg de gliciteina. 3. La siguiente composición se prepara en la forma de una tableta: Utilizar un extracto de genisteina preparado de acuerdo al Ejemplo 4 y que contiene (99.5% de genisteina en peso) 50 mg . de extracto 150 mg . de un portador inerte de tableta estándar . Esta composición se forma en tableta para proporcionar una tableta de 200 mg . que contiene 50 mg . de genisteina. • 4. La siguiente composición se prepara en la forma de una tableta: Una tableta de 500 mg . que contiene 40 mg. de 5 isoflavonas preparada de acuerdo al Ejemplo 3 y 460 mg. de excipientes /portadores inertes . Los portadores referidos arriba incluyen • celulosa (microcristalina) , fosfato de hidrógeno 10 calcico, polisacárido de soya, estearato magnésico y sílice coloidal (anhidroso) . A través de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, al menos que el • contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que 15 la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", implica la inclusión de una etapa o entero establecido o grupo de enteros o etapas, pero no la inclusión de cualquier otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas .

Claims (22)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. 1. Un proceso para la producción de isoflavonas a partir de plantas del género l egum m osa e , caracterizado porque comprende el contacto del material vegetal con agua, un solvente orgánico de C?-C?0 y una enzima que divide los glicósidos de isoflavona a la forma de aglucona, para formar una combinación, incubar la combinación por un tiempo suficiente para permitir que las isoflavonas de la forma de aglucona se separen en el solvente orgánico, y después recuperar las isoflavonas del solvente orgánico.
2. 2. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se recupera el solvente orgánico, el solvente orgánico se retira para dar un residuo de isoflavona, y el residuo se mezcla con un solvente orgánico en el cual las isoflavonas son substancialmente insolubles, de tal manera que las isoflavonas se precipitan y se recuperan subsecuentemente .
3. 3. Un proceso según la reivindicación 1, « „ caracterizado porque el solvente orgánico en la combinación que contiene isoflavonas disueltas en el mismo es hidromiscible y se retira para dar un residuo que contiene isoflavona y agua, el cual se 5 mezcla después con un solvente orgánico de C1-C10 no hidromiscible que solubiliza la isoflavona para dar una fase acuosa y una orgánica, conteniendo la fase solvente orgánica isoflavonas disueltas recolectadas e isoflavonas recuperadas a partir de la misma. 10
4. 4. Un proceso según la reivindicación 3, caracterizado porque la fase solvente orgánica se evapora con adición de agua, después de lo cual las isoflavonas forman un floculato soluble en agua.
5. 5. Un proceso según la reivindicación 1, 15 caracterizado porque la combinación comprende una fase acuosa que contiene una enzima y material vegetal y una fase orgánica en la cual se dividen las isoflavonas.
6. 6. Un proceso según la reivindicación 1, 20 caracterizado porque la combinación comprende una emulsión formada mediante el mezclado vigoroso del solvente orgánico y agua.
7. 7. Un proceso según la reivindicación 5, caracterizado porque la enzima es una mezcla de ß- 25 glucanasa y ß-xilanasa.
8. 8. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el material vegetal se mezcla con agua y una enzima, después de lo cual se agrega el solvente orgánico para formar una fase orgánica y una fase acuosa, o una emulsión formada mediante el mezclado vigoroso del solvente orgánico y agua.
9. 9. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el material vegetal se mezcla con agua, después de lo cual se agrega una enzima con el solvente orgánico.
10. 10. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el material vegetal es de soya o trébol .
11. 11. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se lleva a cabo a desde 10°C a 30°C .
12. 12. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque el material vegetal se encuentra en forma particulada.
13. 13. Un proceso según la reivindicación 12, caracterizado porque el material vegetal es harina de soya .
14. 14. Un proceso según la reivindicación 12, caracterizado porque el material vegetal es una mezcla variable de hipocótilos de soya y cotiledones * * de soya .
15. 15. Un proceso según la reivindicación 1; caracterizado porque el material vegetal es trébol.
16. 16. Una composición que comprende 5 isoflavonas producidas de acuerdo a la reivindicación 1 y opcionalmente en asociación con un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable .
17. 17. Una composición alimenticia que 10 comprende isoflavonas producidas de acuerdo a la reivindicación 1 en asociación con componentes al iment icios .
18. 18. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se purifica daidzeina a partir 15 de las isoflavonas recuperadas.
19. 19. Las isoflavonas cuando se preparan de acuerdo al proceso de la reivindicación 1.
20. 20. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado porque se purifica genisteina a partir 20 de las isoflavonas recuperadas.
21. 21. Daidzeina cuando se prepara de acuerdo al proceso de la reivindicación 18.
22. 22. Genisteina cuando se prepara de acuerdo al proceso de la reivindicación 20.