MXPA99009082A - Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacarido acido sialico n-glicolilado-galactosa-glucosa en tumores malignos y composicion que lo contiene. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con la rama de la inmunologia y la medicina humana, en particular con la generacion y seleccion de un anticuerpo monoclonal (AcM) que reconoce el oligosacarido Acido Sialico N-Glicolilado-Galactosa-Glucosa presente en tumores malignos. Uno de los objetos de esta invencion es proporcionar un AcM de tipo IgG1 que poseen la caracteristica de reconocer con alta especificidad la secuencia oligosacaridica, Acido Sialico N-Glicolilado-Galactosa-Glucosa presente en tejidos malignos de mama. Asi como en melanomas y tumores de higado, estomago, colon, recto y rinon. Tambien posee la capacidad de provocar catalisis directa en las celulas tumorales portadoras de esta secuencia oligosacaxidica, de aqui que pueda ser usado para el diagnostico y el tratamiento de ciertas enfermedades neoplasicas. Otro objeto de la presente invencion es proporcionar el hibridoma productor del AcM mencionado, asi como la composicion farmaceutica que lo contiene, para el tratamiento de enfermedades neoplasicas.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL QUE RECONOCE EL OLIGOSACARIDO ACIDO SIÁLICO N-GLICOLILADO-GALACTOSA-GLUCOSA EN TUMORES MALIGNOS Y COMPOSICIÓN QUE LO CONTIENE. Sector Técnico La presente invención se relaciona con la rama de la inmunología y la medicina humana, en particular con la generación y selección de anticuerpo monoclonal (AcM) contra la secuencia oligo sacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galactosa-Glucosa, que pueda ser usado para el diagnóstico y el tratamiento de ciertas enfermedades neoplásicas. Técnica Anterior Las estructuras oligosacarídicas pueden encontrarse formando parte de glicoproteínas y glicolípidos, indistintamente están presentes en tejidos normales y patológicos. La glicosidación aberrante ha sido descrita para aproximadamente el 100% de las neoplasias malignas. Cambios frecuentes en la glicosidación aberrante son: la expresión de neo-antígenos, variaciones en la composición de las secuencias oligosacarídicas, aumento o disminución de las moléculas de ácido siálico en los oligo sácaridos y aumento de la densidad de moléculas en la superficie celular, entre otros (Hakomori S. H. et al. Curr. Opin. in Immunol. 1991,(3) 646-653.) Además, de los cambios en los mecanismos de las sialil-tranferasas que pueden encontrarse, también hay variaciones en las hidroxilasas dependientes del ácido siálico N-acetilado activado. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico en su estructura y se caracterizan por estar presentes en la mayoría de las células de vertebrados. Estas moléculas se encuentran en los tejidos normales y pueden tener mayor expresión en los tumores, con una organización y conformación diferente en la superficie de células malignas (Hakomori, SH., 1985, Cáncer Res. 45, 2405-2414; Miraldi, F., 1989, Seminars in Nuclear Medicine, XIX, 282-294). La respuesta inmune humoral contra antígenos carbohidratos es generalmente de isotipo IgM. Las secuencias oligosacarídicas acopladas a lípidos, por lo general son menos inmunogénicas que las glicoproteínas. La utilización de glicolípidos como inmunógenos requiere por lo tanto de sµ acoplamiento a proteínas transportadoras o su incorporación a liposomas o a cepas bacterianas como el Microbacterium tuberculosis o la cepa R595 de Salmonella minnesota.

La respuesta generada contra gangliósidos es timo -independiente y este aspecto ha sido reportado por Livingston y colaboradores en reiteradas ocasiones (Livingston, P.O. et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. 84, 2911-2915; Livingston, P.O. et al, 1989, Cáncer Res. 49, 7045-7050). Los anticuerpos generados contra gangliósidos específicamente, cuando han sido estudiados en los sueros de las diferentes especies, poseen como características fundamentales baja afinidad, considerable reactividad cruzada y corta vida (Livingston, P.O., 1991, Immunology and Allergy Clinics of North America, 11, 401-423; Portoukalian, J. et al, 1991, Int. J. Cáncer, 49, 893-899). La expresión de la forma N-glicolilada en los oligosacáridos es común en tejidos normales y patológicos de todas las especies de vertebrados, con excepción de los pollos y los humanos, donde sólo se encuentran en los tejidos tumorales y fetales. Los tejidos normales de estas dos últimas especies poseen únicamente la variante N-acetilada (Nishimakit et al, 1979, J. Immunology, 122, 2314; Higashi H. et al, 1985, Cáncer Res., 45, 3796). Estudios de la composición de oligosacáridos en algunos tumores humanos arrojaron la presencia de la forma N-glicolilada tanto en glicolípidos como en glicoproteínas de células tumorales procedentes de melanoma (Hirabayashi, Y, et al. 1987, J. Cáncer Res., 78, 614 -620; Saida T. et al. 1991 Arch. Dermatol. Res. 282 (3) 179-182; Kawashima I. et al. 1993, J. Biochem (Tokio) (2) 186-193; Kawachi S. et al., 1992, J. Dermatol (11) 827-830), así como en tumores de colon, especialmente en glicolípidos (Miyoshi, I., et al, 1986, Mol. Immunol., 23 (6), 631; Higashi H., et al, 1985, Cáncer Research, 45, 3796-3802). Adicionalmente, se han realizado estudios para comprobar la presencia de la forma N-glicolilada del gangliósido en algunas muestras tumorales de hígado, teratoma, linfomas, etc, (Kawai T. et al. 1991 Cáncer. Res. (51) 1242-1246). Si bien en todos los casos anteriores la concentración de la variante N-glicolilada de glicolípidos fue menor del 0,05% del total de ácido siálico, Marquina y colaboradores encontraron en los tumores de mamas valores alrededor del 10% del total de ácido siálico unido a lípido (Marquina, G. et al, 1996, Cáncer Res. 56, 5165). La generación de anticuerpos monoclonales contra la variante N-glicolilada de gangliósidos ha proporcionado hasta el momento, anticuerpos de isotipo IgM que reconocen generalmente más de una molécula de gangliósidos, por ejemplo los anticuerpos monoclonales humanos 2-39M y 32-27M (Furukawa K., et al, 1988, J. Biological Chemistry, 263, 18507) y los anticuerpos murinos GMR8 y GMR3 (Ozawa H. et al, 1992, Biochem. Biophys., Vol. 294, 2, 427). Otros autores han reportado la generación de alguna especie específica de anticuerpos contra gangliósidos N-glicolilados, siempre de isotipo IgM, entre ellos se encuentran, el anticuerpo monoclonal Y-2-HD1, contra NGcGM2 (Samai Y. et al, 1988, Bioch Biophys. Act., 958, 368) y el anticuerpo monoclonal MK2-34 contra la misma molécula (Miyake, M. et al, 1990, Cáncer Res. 48, 6154). Sin embargo, Watarai (Watarai, S. et al. 1995. J. Biochem. 117, 1062) generó el anticuerpo monoclonal SHS-1 contra el gangliósido i-activo N-glicolilado y Nakumara obtuvo el anticuerpo monoclonal YK-3 contra el (NGc-NGc) GDlc (Nakumara et al, 1995, J. of Biolog. Chemist., Vol 270, 8, 3876). Recientemente Vázquez y colaboradores (Vázquez, A. M. et al, 1995, Hybridoma, Vol. 14, 6, 551) reportaron la generación del anticuerpo monoclonal P3, que reconoce a la mayoría de las moléculas de gangliósidos que contengan la forma N-glicolilada de ácido siálico, así como a glicolípidos sulfatados. AcMs contra gangliósidos han sido generados como el HMA1 por Nagai y colaboradores (Nagai Y. et al. Patente US 4,965, 198), los cuales obtuvieron un anticuerpo monoclonal específico contra el gangliósido NGcGM2 a partir de ratones que tenían una enfermedad autoinmune, aunque además reportaron varios de estos anticuerpos que adicionalmente reconocían otros gangliósidos N-glicolilados, designados como PyK, YH02, YH03, YH04, YH05, YH06 y YH07. Por otra parte en la patente US 4,942, 131 de Yamasaki, M. et al., se reporta la generación de los AcMs YH08, YH09, YH 10 e YHl l contra el gangliósido 4-O-Acetil-NGcGM3, igualmente en ratones con enfermedad autoinmune. También se han obtenido anticuerpos monoclonales contra gangliósidos utilizando estas moléculas en forma de lactonas o a partir de líneas celulares que contiene gangliósidos (Patentes US 5,308,614; 5,240,833; 5,389,530 y 5,500,215). De igual forma diferentes anticuerpos monoclonales, tanto murinos como humanos, se han obtenido contra los gangliósidos GD3, GD2 y GM2, todos de la forma N-acetilada, la mayoría de ellos pertenecientes a las subclases IgM e IgG3 (Pukel, C.S. et al, 1982, J. Exp. Med., 1 15, 1133-1147; Hirabayashi, Y. et al, 1985, J. Biol. Chem., 260, 13328-13333; Solicitud de Patente WO 86/00909; Miyake, M. et al, 1988, Cáncer Res., 48, 6154-6160; Kawashima, I. et al, 1992, Molecular Immunology, 29, 625-632; Kotani, M. et al, 1992, Biochimica et Biophysica Acta, 1 1 17, 97-103). La inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales contra gangliósidos se ha usado en ensayos clínicos para el tratamiento de algunos tumores como melanomas y neuroblastomas. Los tratamientos en melanomas han sido intralesión o sistémicos, y aunque los resultados parecen ser prometedores, sólo un reducido número de pacientes tuvieron remisiones totales o parciales (Houghton, A.N. et al, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci., 82, 1242; Dippold, W.G. et al, 1988, J. Cáncer Cli. Oncol., 24, 865; Vadhan-Raj, S. et al, 1988, J. Clin. Oncol., 6, 1636; Saleh M.N. et al, 1992, Cáncer Res., 52, 4332-4347).

Estos anticuerpos mostraron efectos en estudios de citotoxicidad, mediada por complemento o mediada por células (Ravindramath M.H. et al, 1991, ínter. Rev. Immunol., 7, 303). Hasta el momento, todos los anticuerpos monoclonales obtenidos contra gangliósidos N-glicolilados son de isotipo IgM y la toxicidad que provocan es mediada por complemento. Las IgM poseen generalmente baja afinidad por el antígeno y es difícil utilizarlas para propósitos de diagnóstico o terapia, cuando se pretende unirlas con isótopos radiactivos. Aunque son buenas fijadoras de complementos y garantizan una buena citotoxicidad, la posibilidad de purificación se hace bastante engorrosa en comparación con las IgG, cuando esto se realiza a gran escala. Por otra parte anticuerpos monoclonales contra glicoproteínas N-glicoliladas han sido poco reportados y su objetivo de trabajo ha sido dirigido fundamentalmente con fines de diagnóstico. Un anticuerpo monoclonal designado como 3E1.2, fue descrito por Devine y colaboradores, el cual reconoce a una mucina (glicoproteica) N-glicolilada expresada en el 90% de los tumores de mama estudiados por inmunohistoquímica (Devine, P.L., et al. 1991 , Cáncer Res. 51 (21), 5826-36). Igualmente se ha publicado un anticuerpo monoclonal designado como JAM3, que reconoce las formas N-acetilada y N-glicolilada de una proteína de 250 kD presente en la superficie de los quistes provocados por la invasión de Entamoeba (Avron, B., et al. Mol Biochem Parasitol. 1987 (3): 257-266). Divulgación de la Invención La novedad de la presente invención consiste en la obtención de un anticuerpo monodanal altamente específico contra la secuencia oligosacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galact-Dsa-Glucosa, presente tanto en gangüósidos como en glicoproteínas. Además, el hecho de ser una inmunogtobulina de isotipo IgGl, le da la ventaja que al ser más específica presenta más afinidad por las moléculas que reconoce, to cual fevoreoe su actividad biológica Inesperadamente este anticuerpo mostró la capacidad de provocar la muerte celular de forma directa en las células tumorales que portan dicho secuencia oligosacarídica. Descripción detallada de la Invención OBTENCIÓN DEL GANGLIÓSIDO NGcGM3. Para la obtención del gangliósido NGcGM3 se utiliza una modificación de la técnica de Hakomori y colaboradores. (Hakomori, S. et al. 1974, Methods in Enzimology, Vol 32, Part B, pág. 350), a partir de fuentes naturales conocidas como por ejemplo eritrocitos de caballos. El rendimiento de la extracción del gangliósido NGcGM3 estuvo entre 180 y 300 mg por litro de eritrocitos de caballo, con una pureza superior al 90% que pudo corroborarse utilizando cromatografía líquida de alta eficiencia, según el método de Gazzotti (Gazzotti, G. et al. 1985, J. of Chromatography, 348, 371-378). OBTENCIÓN DEL INMUNÓGENO. Para la obtención del inmunógeno, el gangliósido NGcGM3 se acopla hidrofóbicamente a las lipoproteínas humanas de muy baja densidad (VLDL), las cuales fueron obtenidas según lo descrito por Dumontet y colaboradores (Dumontet, C. et al. 1994. Cáncer Immunol Immunother. 38: 311-318) ESQUEMA DE INMUNIZACIÓN. Para la obtención de AcMs de tipo IgG contra gangliósidos se utiliza la siguiente metodología de inmunización. Los ratones u otra especie de mamíferos se inmunizaron con preparaciones vacunales que contienen entre 0.03 y 0.5 mg del gangliósido NGcGM3 acoplado a VLDL por dosis y un adyuvante, entre los que se puede seleccionar alúmina, adyuvante completo e incompleto de Freund o Montanide ISA 51. Antes y durante el período de inmunización se toman muestras de sangre de los animales para la obtención de sueros, con el objetivo de monitorear los anticuerpos generados en los animales contra el gangliósido usado como antígeno, utilizando cualquiera de los métodos de inmunoensayo conocidos para la detección de la reacción antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). Los ardiñales se inmunizan con varias dosis, entre 2 y 8, a intervalos de tiempo que pueden variar entre 7 y 14 días. La administración es realizada por vía subcutánea o intramuscular con volúmenes entre 0.1 y 0.2 ml. Otras vías de inmunización posible a usarse son la endovenosa y la intraperitoneal. Los animales que recibieron este rango de dosis muestran una respuesta específica contra el gangliósido con el que se inmunizaron. Como consecuencia de esta inmunización, entre el 70 y el 100% de los animales tuvieron respuesta IgG específica contra el gangliósido NGcGM3. OBTENCIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES. Para la producción de los AcMs específicos contra el gangliósido NGcGM3, los ratones con títulos de anticuerpos séricos contra el mismo recibieron una nueva inmunización con el preparado vacunal, 3 días antes de ser obtenidas las células formadoras de anticuerpos. Deben elegirse preferiblemente las células del bazo aunque otras pueden usarse también. Estas células se fusionan con las células de mieloma y le proporcionan a las células híbridas o hibridomas la capacidad de expandirse infinitamente "in vivo" e "in vitro". Para ello, cualquiera de los métodos conocidos para la fusión celular pueden ser utilizados. Para determinar los anticuerpos producidos por los hibridomas, preferiblemente se utiliza un ensayo inmunoenzimático, aunque otros métodos de inmunoensayo también pueden ser usados. El procedimiento de este ensayo es el reconocimiento de los sobrenadantes de los hibridomas por los gangliósidos y la unión Antígeno-Anticuerpo puede visualizarse al usar un segundo anticuerpo marcado por una enzima, que se une al anticuerpo producido por el hibridoma en condiciones apropiadas y es, a su vez, detectado. El hibridoma, una vez seleccionado, es clonado al menos 2 veces (por ejemplo, por dilución limitante). El AcM obtenido puede ser producido "in vitro" en un medio de cultivo adecuado, cualquiera de los que se encuentran descritos en el estado de la técnica y posteriormente purificado a partir del sobrenadante de dicho cultivo. En este caso, entre el 1 y el 8% de los clones secretores fueron específicos contra el gangliósido N-Glicolil GM3. Otro método de producción de anticuerpos, consiste en la inyección del hibridoma en animales (por ejemplo, animales singénicos). El hibridoma provoca la formación de tumores no sólidos que proporcionan una gran concentración del anticuerpo deseado, a nivel sanguíneo y en el exudado peritoneal del animal huésped. PURIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES. La purificación de los anticuerpos monoclonales se hace a partir del líquido ascítico, que se obtiene por la inoculación de 0,2 x 106 células del hibridoma productor de los anticuerpos monoclonales, en la cavidad peritoneal de ratones Balb/C, previamente tratados con adyuvante incompleto de Freund, como agente ascitogénico. El líquido ascítico se diluye a la mitad en tampón glicina 1,5 M, NaCl, 3M, pH, 8,9 y se aplica a una matriz de proteína A-sefarosa, a una velocidad de flujo de 60 ml/h. La elución de los AcMs se realiza utilizando tampón citrato 0, 14 M, pH 6. La concentración de los AcMs purificados se estima por el Método de Lowry (Lowiy, G. H., 1951, J. Biol. Chem., 193, 256) y utilizando el coeficiente de absorción de las IgGl murinas a 280 nm. La especificidad se confirma por la técnica ELISA. Se obtuvieron entre 2 y 5 mg de anticuerpos por ml de ascitis, con un porciento (%) de pureza mayor de un 95%, lo que fue corroborado por cromatografía líquida de baja presión. ESTUDIOS DE ESPECIFICIDAD. Para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales obtenidos se realizan estudios inmunoenzimáticos en placas ELISA y en cromatografía en capa fina de los AcMs producidos, empleando los gangliósidos N-acetílados (GM l, GM2, GM3, GMl, GD I a, GD lb, GD3 y GTlb) y N-glicolilados (GM3, GM2, GM l a, GMlb, GD lc y GD3). Para la corrida de los glicolípidos en la cromatografía de capa fina con alta resolución se utiliza el sistema de solventes (Cloroformo: Metanol : KCl 0,25% y 2,5 M NH3 ) (5:4: 1) (vol:vol). La visualización de las bandas se realizó por revelado químico con Orcinol. Las placas se plastican con una solución de poliisobutilmetacrilato y se secan a temperatura ambiente toda la noche. Los bloqueos duran alrededor de 30 minutos, con una solución de albúmina de suero bovino al 1%, disuelta en tampón fosfato salino (TFS), pH 7, 4. A continuación los anticuerpos monoclonales se incuban en la solución de bloqueo. Al terminar se lava con TFS y se añade el conjugado anti-inmunoglobulina de ratón acoplado a peroxidasa durante 1 hora. Seguidamente se procede a realizar un nuevo lavado y entonces se adiciona la solución con el substrato de la enzima, hasta visualizar las bandas. Finalmente se compara el revelado químico con el inmunológico. Se obtuvo como resultado que la IgG reconoció únicamente al gangliósido NGcGM3. DETERMINACIÓN DE CITOTOXICIDAD. Para determinar si los anticuerpos generados provocan la muerte celular directa o por alguna de las otras formas de citotoxicidad, 107 células/ml del mieloma murino P3X63, que contiene NGcGM3 se incuban a 4°C y 37°C respectivamente con el anticuerpo monoclonal entre 0,01 y 1 mg/ml, durante 30 minutos. Entonces se realizan estudios de viabilidad celular, utilizando el método de Tripán Azul. Pueden contarse las células muertas por el efecto del anticuerpo o añadiendo ioduro de propidium u otro marcador de viabilidad, esta vez en el citómetro de flujo por aumento de la fluorescencia en la región del rojo. Para estudiar la citotoxicidad mediada por complemento se utilizaron 107 células/ml y se añaden los anticuerpos monoclonales en concentraciones entre 0,01 y 0,5 mg/ml. Diluciones desde 1/20 hasta 1/2 del suero de conejo que posee altas concentraciones de las proteínas del complemento se adicionan y se incuban durante 1 hora a 37°C. Los conteos de viabilidad celular, según lo descrito en el párrafo anterior, se realizaron para determinar citotoxicidad directa o el método de estudio de la viabilidad celular utilizando la liberación de Cr51 en el sobrenadante de cultivo procedente de las células de Mieloma P3X63 marcadas previamente con el isótopo radiactivo. La citoxicidad directa fue medida empleando diferentes métodos, los que revelaron valores entre 50 y 85% de células muertas, respecto al total de células estudiadas. DETERMINACIÓN DE LA BIODISTRIBUCIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES. Los AcMs generados pueden ser usados tanto para el diagnóstico como para la terapia, mediante el mareaje con algún isótopo radiactivo, por ejemplo, Tc99, Rel86 y Rel88. El procedimiento de mareaje de los anticuerpos mediante isótopos ha sido previamente descrito por Schwarzn y Steinstrasser (Schwarzn A., and Steinstrasser, A. 1987, J. Nucí. Med. 28, 721) y modificado por Mather y Ellison (Mather S. J. and Ellison D, (1990, J. Nucí. Med. 31, 692-697). El control de calidad del mareaje es realizado en cromatografía de papel Whatmann 3MM y el % de mareaje estuvo entre 98 y 100%. Para determinar la posible utilidad del AcM, a 10 ratones les fue inoculado el tumor P3X63 y otros 10 ratones fueron utilizados control normal, a los cuales no se les inoculó el tumor. Se esperó el tiempo suficiente para que el tumor hubiera crecido, entonces se inyectó por vía intravenosa el AcM 14F7 marcado con Tc99 en los 20 ratones. El monitoreo de la biodistribución del AcM obtenido contra la secuencia oligo sacarídica se hace a las 4 y 24 horas post-inyección a grupos de 5 animales (5 sanos y 5 con tumor), los cuales son sacrificados tomándose a partir de ellos los órganos principales y el tumor, los que son pesados y cuya emisión gamma es cuantificada por separado al final del experimento. Los anticuerpos monoclonales se distribuyeron en los animales sanos preferiblemente en sangre, hígado y riñon, mientras que en los animales que poseían tumor, se encontró en los órganos anteriores y preferiblemente en el tumor a las 24h. RECONOCIMIENTO DE TEJIDOS TUMORALES Y FETALES POR EL AcM. Los AcMs marcados con isótopos radiactivos, según lo descrito en estado del arte, pueden ser empleados para detectar tumores donde se encuentra expresada la secuencia oligosacarídica La radiactividad puede ser estudiada en todo el cuerpo con la cámara gamma. Las imágenes son adquiridas a los 5 minutos, y 1, 3, 5, 24 y 48 horas después de la inyección, apreciándose la localización del AcM sólo en el tumor y en los órganos de excreción. Los AcMs también pueden ser acoplados directa o indirectamente a agentes terapéuticos tales como drogas, radioisótopos, inmunomoduladores, lectinas y toxinas. Dentro de los modificadores de la respuesta biológica (inmunomoduladores) que de alguna forma pueden aumentar la destrucción del tumor por los AcMs de la invención se incluyen linfoquinas como: Factor de Necrosis Tumoral, Factor Activador de Macrófagos, Factor Estimulante de Colonias, Interferones, etc. Con fines de diagnóstico, estudios inmunohistoquímicos se llevaron a cabo. Para ello los tejidos fueron fijados en una solución de formalina tamponada al 10% y se deshidrataron, clarificaron y se incluyeron en parafina. La histopatología se evaluó en cortes teñidos con hematoxilina eosina. Cortes consecutivos confeccionados a partir de los bloques evaluados histológicamente fueron usados para realizar el inmunomarcaje por el método del complejo biotina estreptavidina peroxidasa descrito previamente ( Hsu, S. M. y Raine, L. 1981. J. Histochem Cytochem. 29; 1349-1353 ). Los cortes desparafinados y rehidratados se trataron con 3% de peróxido de hidrógeno (solución de metanol) durante 30 minutos, para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Los cortes se incubaron con los AcMs purificados. Posteriormente se añade suero anti-ratón biotinilado y complejo estreptavidina peroxidasa (Dakopatts) a temperatura ambiente. Entre las incubaciones, los cortes se lavaron con una solución salina tamponada con Tris-HCl. La reacción de la Peroxidasa (POD) se reveló con H2O2 al 30 % y 3-3 diaminobencidina. Las láminas se lavan con agua corriente contrastadas con hematoxilina de Mayer, recubiertas con un medio de montaje que contiene bálsamo y tapadas con cubreobjetos. La reacción con la enzima produce una coloración carmelita-marrón. Se realizaron estudios en tejidos tumorales humanos de mama, pulmón, piel y sistema nervioso central, así como en tejidos fetales y normales de adultos. Los fragmentos de biopsias frescas de tejido patológico se obtuvieron dentro de la hora posterior a la exéresis quirúrgica, los cuales fueron congelados y cortados posteriormente, manteniéndose en congelación hasta su estudio. La utilización de tejidos fetales para los estudios se debe a que la asociación de los gangliósidos como antígenos oncofetales, ha sido reportada reiteradamente, así como la similitud de la expresión de estas moléculas en el tejido fetal y tumoral humano (Cahan, L. et al. 1982 Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 79:7629-7633) Los cortes de tejidos fetales se obtuvieron de fetos entre 12 y 18 semanas. Los fragmentos de tejidos normales de adultos se obtienen a partir de fallecidos por accidentes y/ o muerte encefálica dentro de la hora posterior al exitus letalis.

De los tumores estudiados, los de pulmón y sistema nervioso central con diversas etiologías fueron negativos, al igual que los cortes de los tejidos humanos normales, mientras que los de melanoma y mama resultaron todos positivos, así como los tejidos fetales del sistema digestivo (hígado, estómago, intestino delgado y grueso) y sistema renal.

EFECTO ANTITUMORAL. Para demostrar el efecto antitumoral de los anticuerpos monoclonales contra el gangliósido NGcGM3, animales a los cuales se les inocula el tumor que posee el gangliósido blanco (Mieloma P3X63), son tratados con los anticuerpos obtenidos. Las dosis pueden variar de 0,01 mg/kg. de peso a 200 mg/kg. de peso en una o más administraciones diariamente, por uno o varios días. Los AcMs generados pueden ser administrados parenteralmente por inyección (intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad o transdérmica). En un experimento tipo, los ratones tratados con los anticuerpos, tienen un índice de sobrevida entre un 30 y un 80% comparado con los ratones del grupo control, lo cual se corrobora con el test de Log Ram (Cox and Oakes (1984) Analysis of survival Data edits.Chapman Hall), donde se encontraron diferencias significativas entre el grupo tratado con el AcM y el control, menor del 0.05%. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN: EJEMPLO 1: Respuesta IgG específica contra NGcGM3, de los ratones inmunizados con el preparado vacunal NGcGM3/VLDL/ Adyuvante Completo de Freund, medida por una técnica inmunoenzimática. Ratones Balb/C hembras entre 6-8 semanas fueron inyectados por vía intramuscular con 0,2 mg del preparado vacunal NGcGM3/VLDL humana, con el adyuvante completo de Freund en la primera dosis y el incompleto de Freund las siguientes (producidos por la firma SIGMA) mezclados en igual volumen. Cada animal recibió 6 dosis, las primeras 4 semanalmente y las 2 sucesivas cada 14 días. Se realizaron extracciones de sangre previo a la primera dosis y cada 2 semanas. Los niveles de anticuerpos fueron medidos en el suero de los animales, utilizando un ELISA indirecto en placas de Polysorp (de la firma Nunc), donde se inmovilizaron los gangliósidos siguiendo la metodología que a continuación se describe: Los gangliósidos NAcGM3 y NGcGM3 se disolvieron por separado en metanol (4µg/ml) y se añadieron 50 µl/pozo. Se colocó la placa a 37°C durante una hora y media para evaporar el metanol. Posteriormente se añadieron 100 ml/pozo de tampón TRIS-HC1 0,05M, pH 7.8, que contenía 2% de seroalbúmina bovina (SAB) y durante una hora se incubó a temperatura ambiente. A continuación 50 µl de los sueros fueron diluidos en el mismo tampón y se incubaron toda la noche a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron 4 veces con 200 µl de solución salina de tampón fosfato (SSTF) y se añadieron 50 µl de un antisuero antiinmunoglobulinas de ratón conjugado con biotina a la dilución adecuada, 1 hora y media a 37°C. Posteriormente se repitió el lavado con SSTF y se adicionaron 50 µl de una dilución de estreptavidina fosfatasa alcalina con una dilución acorde. Finalmente se realizó el último lavado y 100 µl del sustrato p-nitrofenilfosfato disuelto en tampón dietanolamina, pH 9.8 (1 mg/ml). La absorbancia se midió en un lector de ELISA a 405 nm. En el Figura 1 se muestran los resultados de D.O. a 405 nm de los sueros de cada animal diluidos 1/80 el día 56 del experimento. La respuesta contra NGcGM3 y contra GM3 fue determinada a través de un ELISA donde se usó un conjugado anti-lgG de ratón biotinilado y estreptavidina-fosfatasa alcalina procedentes de la firma Jackson. De los ratones inmunizados con el preparado vacunal más del 70% tuvieron valores de D.O. a 405 nm superiores a 0,5 contra NGcGM3, aunque todos los animales inmunizados mostraron respuesta IgG contra NGcGM3, no apreciándose respuesta contra el NAcGM3, pese a la mínima diferencia existente entre estas dos moléculas. En la Figura 2 se muestra el mantenimiento de la respuesta de anticuerpos (isotipo IgG) específica contra el gangliósido NGcGM3, luego de tres meses de recibir la última dosis de inmunización, no apreciándose respuesta contra el NAcGM3. EJEMPLO 2: Obtención de anticuerpos monoclonales contra NGcGM3. Los anticuerpos fueron generados por la inmunización de ratones Balb/C utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Tres días antes de la fusión, los animales fueron reinmunizados con el inmunógeno NGcGM3/VLDL, empleando el adyuvante completo de Freund. Posteriormente se extirparon los bazos de los ratones y se preparó una suspensión celular, prensando el tejido a través de un tamiz de acero inoxidable o perfundiendo el bazo. La fusión celular se realizó según lo descrito por Kdhler y Milstein (Nature, 1975, No. 256, 495-497) con algunas modificaciones. Las células de mieloma murino no secretor P3/X63 Ag8 6.5.3, se fusionaron con los esplenocitos murinos, en una proporción 1: 10, en 0,5 ml de un medio de fusión que contenía 42% de polietilenglicol (3000-3600 Sigma) en medio RPMI 1640. Las células se cultivaron en medio selectivo HAT (hipoxantina/ aminopterina/ timidina) a 37°C, con una atmósfera húmeda de CO2 5%, después de la fusión celular. Entre los 10 y 15 días posteriores a la fusión, se inició el ensayo de detección de la presencia de anticuerpos en el sobrenadante de los cultivos del hibridoma, utilizando la técnica de ELISA del Ejemplo 1.

Se seleccionaron las células (hibridomas) en cultivo que reaccionaban con el gangliósido de interés y dos veces se clonaron por el método de dilución limitante, en presencia de células acondicionadoras.

La especificidad de los anticuerpos producidos por los hibridomas en cultivo seleccionados, se determinó usando la técnica de ELISA indirecta con una batería de glicolípidos. El número de clones específico contra el gangliósido NGcGM3 fue 5.5%. Uno de estos clones obtenidos fue denominado 14F7. EJEMPLO 3: Determinación de la subclase del anticuerpo monoclonal 14F7. Para la determinación de la clase de inmunoglobulinas a la que pertenece el anticuerpo monoclonal objeto de la invención, se utilizó la técnica de ELISA indirecto en placas recubiertas con NGcGM3, tal como se describió en el Ejemplo 1, aunque sustituyendo el suero por diluciones del sobrenadante de cultivo del híbrido o del anticuerpo monoclonal purificado. Se añadieron AcMs anti IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinos producidos en ratas y conjugados con biotina por la firma Pharmingen, diluidos en el tampón de incubación. Después de 1 hora a 37° C se realizaron lavados y se adicionó el conjugado Streptavidina- fosfatasa alcalina en el tampón de incubación. Como controles para cada subclase se utilizaron anticuerpos monoclonales murinos, previamente caracterizados. Finalmente se le añadió la solución substrato. La lectura de las absorbancias se efectuó de forma similar a la descrita anteriormente. En la Figura 3 se muestra que el anticuerpo monoclonal 14F7 pertenece a la subclase IgG 1. EJEMPLO 4: Estudio de especificidad del Anticuerpo monoclonal 14F7 utilizando la inmunotinción sobre cromatografía en placa delgada de alta resolución. La cromatografía sobre placa delgada de alta resolución se utilizó para separar los glicolípidos. El sistema de solventes empleado fue Cloroformo:Metanol:KCL 0,25% y 2,5 M de NH3 (5:4: 1) v:v y la visualización de las bandas se hizo mediante revelado químico con Orcinol (Svennerholm L. 1964, J. Lipid. Res., 5, 145), mientras que para la inmunotinción se utilizó el método de Kawashima Y. y col. 1993 (J. Biochem, 114, 186). Las placas donde previamente se realizaron las cromatografías en placa fina fueron plastificadas por inmersión durante 75 segundos en una solución de 0, 1% de poliisobutilmetacrilato (PIBM) en N-hexano. A continuación las placas se secan a temperatura ambiente durante 30 minutos, entonces se aplica una solución de PIBM al 1% en los bordes de las placas, manteniéndose a temperatura ambiente toda la noche.

El bloqueo para la eliminación de interacciones inespecíficas se hizo por 30 minutos con una solución de albúmina de suero bovino al 1 %, disuelta en tampón fosfato salino pH entre 7,2 y 7,4. Inmediatamente se incubó con el AcM 14F7 a una concentración entre 0.01 y 0.02 mg / mi en la solución de bloqueo. Entre este paso y el siguiente, se realizó el primer lavado con tampón fosfato salino. Se incubó seguidamente con un antisuero de conejo contra inmunoglobulinas de ratón conjugado con Peroxidasa de Rábano de Caballo (DAKO), diluido en la solución de bloqueo. Transcurrida 1 hora de incubación con agitación a temperatura ambiente las placas se lavaron nuevamente y se añadió la solución de sustrato consistente en 0,4 mg/ml de ortofenilendiamina (C6H8N2 ) Sigma, en tampón citrato-fosfato 80 mM pH 5 con 0, 12%o de Peróxido de Hidrogeno (H2O2) (Riedel de Haen). La reacción fue detenida con lavados sucesivos de tampón fosfato. La reacción reveló especificidad solamente por el gangliósido NGcGM3 y no por los otros gangliósidos N-glicolilados evaluados como GMl a , GMlb , GM2 y N-acetilados (Figuras 4 y 5). EJEMPLO 5: Reconocimiento de tejidos tumorales y fetales, por el anticuerpo monoclonal 14F7. Los tejidos fueron fijados en una solución de formalina tamponada al 10% y se deshidrataron, clarificaron y se incluyeron en parafina. La histopatología se evaluó en cortes teñidos con hematoxilina eosina.

Cortes consecutivos confeccionados a partir de los bloques evaluados histológicamente fueron usados para realizar el inmunomarcaje por el método del complejo biotina estreptavidina peroxidasa descrito previamente (Hsu, S. M. y Raine, L. 1981. J. Histochem Cytochem. 29; 1349-1353 ). Los cortes desparafinados y rehidratados se trataron con 3% de peróxido de hidrógeno (solución de metanol) durante 30 minutos, para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Los cortes se incubaron con el AcM 14F7 (purificado) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se añadió suero anti-ratón biotinilado y complejo estreptavidina peroxidasa (Dakopatts) a temperatura ambiente. Entre las incubaciones, los cortes se lavaron con una solución salina tamponada con Tris-HCl . La reacción de la Peroxidasa (POD) se reveló al usar 5 ml de una solución tamponada de Tris 0.005 ml de H2O2 al 30 % y 3 mg de 3-3 diaminobencidina. Las láminas se lavaron con agua corriente contrastadas con hematoxilina de Mayer, recubiertas con un medio de montaje que contiene bálsamo y tapadas con cubreobjetos. La reacción con la enzima produce una coloración carmelita-marrón. Los fragmentos de tejido normal de adultos se obtuvieron de fallecidos por accidentes y/ o muerte encefálica dentro de la hora posterior al exitus letalis. Los fragmentos de biopsias frescas de tejido patológico se obtuvieron dentro de la hora posterior a la exéresis quirúrgica, los tejidos fetales se obtuvieron a partir de fetos normales humanos, entre 12 y 18 semanas, dentro de 1 hora posterior al aborto inducido. Todos los tejidos se lavaron en solución salina, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservaron congeladas a -80°C. Los fragmentos congelados fueron cortados en criostato Leica a - 25°C obteniéndose cortes seriados a 5 um que se secaron al aire y se utilizaron inmediatamente o se conservaron a -20°C envueltos en papel de aluminio y fueron post-fijados en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos. En la Figura 6 se muestra el estudio inmunohistoquímico del AcM 14F7 en los tejidos normales humanos, donde no se aprecia reconocimiento por el AcM en la membrana y en la región citoplasmática de estos tejidos. En la Figura 7 se muestra el mismo estudio para tejidos patológicos, resultando positivos todos los tumores de mama y melanoma analizados, 33/33 y 20/20 respectivamente. En el estudio realizado en 70 tumores de pulmón con diversas etiologías todos fueron negativos y el mismo resultado se obtuvo en 33 de los tumores de diferente origen del sistema nervioso central. En la Figura 8 se muestra el reconocimiento del AcM 14F7 por los tejidos del sistema digestivo y por el riñon fetal. EJEMPLO 6: Reconocimiento del gangliósido NGcGM3 por el AcM 14F7 en líneas celulares por citometría de flujo. Las líneas celulares utilizadas fueron el Mieloma P3X63 murino que expresa GM3 y NGcGM3 descrito por Muthing , J. et al. (J. Biochem 116, 64-73,(1994) y el Melanoma B16 que expresa GM3. Las células fueron cultivadas en medio RPMI con suero al 8% y se ajustaron a concentración 107 células / ml de una solución de tampón fosfato salino pH de 7,4 conteniendo 0.02% de azida sódica y 1% de albúmina de suero bovino 0, 1 ml de la suspensión celular se le añadió a cada tubo y seguidamente 0.05 ml de la solución del AcM 14F7 disuelto en tampón fosfato salino con el propósito de obtener una concentración final 0.1 mg/ml e incubado durante 30 minutos a 4°C. Transcurrido este tiempo se lavó con la solución donde estaban disueltas las células.

Posteriormente los cultivos se centrifugaron durante 5 minutos a bajas revoluciones para precipitar las células. Entonces el conjugado anti-ratón (IgG+IgM) biotinilado (Jackson) fue adicionado y transcurrido 30 minutos a 4°C realizándose otro lavado, finalmente 0.002 mg de estreptavidina-fluoresceina (FITC) (Jackson) fueron adicionados e incubados en las mismas condiciones anteriores. Se realizó el último lavado, esta vez con tampón fosfato salino. Se decantó luego de la última centrifugación y se resuspendieron las células en 0,6 ml de la última solución de lavados. El 80%o de las células de la línea de Mieloma P3X63 fueron marcadas por el anticuerpo monoclonal 14F7 (Figura 9). EJEMPLO 7: Estudio de citotoxicidad directa del anticuerpo monoclonal 14F7. La línea celular murina, Mieloma P3X63 se incubó con el anticuerpo monoclonal 14F7, según lo descrito en el Ejemplo 6. Después del lavado se le añadió a las células 0,01 ml de una solución de ioduro de propidium en tampón fosfato salino para determinar la viabilidad celular usando el citómetro de flujo. Los resultados evidenciaron que el 78% de las células murieron (Figura 10). EJEMPLO 8: Estudio de la biodistribución del anticuerpo monoclonal 14F7 marcado con Te 99, en ratones Balb/C sanos y con el tumor Mieloma P3X63. 20 Ratones Balb/C hembras con pesos entre 20-22 g (10 sanos y 10 a los cuales se les inoculó el tumor Mieloma P3X63 por vía intraperitoneal fueron inyectados por vía intravenosa con el AcM 14F7 marcado con Tc99. La relación de concentración de mareaje fue de 0.03 mg de AcM 14F7 / 60 Ci de Tc99. Los estudios de cuantificación de radiactividad en los diferentes órganos se realizaron en 5 animales de cada grupo, a las 4 y las 24 horas después de la inyección. Los animales fueron sacrificados y se tomaron los pesos de cada uno de los órganos. La medición de los pesos se hizo en una balanza Sartorius y se determinó la radiactividad de todos los tubos a la vez, alrededor de 25 horas después de iniciado el experimento en un contador gamma modelo (WIZARD 1470) de la firma WALLAC.

La metodología del mareaje fue previamente descrita por Schwarz y Steinstrasser (1987) y modificada por Muther y Ellison en 1990. El AcM 14F7 marcado fue eliminado en los ratones sanos por vía renal y hepática (Figura 11). En los ratones con el tumor Mieloma P3X63 pudo comprobarse el reconocimiento del tumor por el AcM 14F7 a las 4 horas (12% de la radiactividad total inyectada por gramo de tejido) y a las 24 horas 35% de la de la radiactividad total inyectada por gramo de tejido. La eliminación del anticuerpo fue principalmente por la vía renal (Figura 12). EJEMPLO 9: Efecto antitumoral del Anticuerpo monoclonal 14F7 en ratones Balb/C con Mieloma P3X63 ascítico. Ratones Balb/C hembras de 20-22 g de peso, se inyectaron por vía intravenosa con 6 dosis del anticuerpo monoclonal 14F7 (un primer grupo con 0.1 y un segundo grupo con 0,2 mg) cada 2 días, en solución tampón fosfato salino. Tres días antes del experimento, fue irritada la cavidad peritoneal con Adyuvante Incompleto de Freund para favorecer el prendimiento de 10 000 células del Mieloma P3X63 murino, que fueron inoculadas el día 0 del experimento por la misma vía intraperitoneal, coincidiendo con el inicio de la terapia pasiva con el anticuerpo monoclonal 14F7, sólo que éste por vía intravenosa.

Mientras el control de buen pronóstico (mejor tratamiento) utilizado para comparar fue un tercer grupo tratado por vía intravenosa con Ciclofosfamida. (Shangai Hua Lian Pharmaceutical Corp.) a la dosis de 20 mg/kg. de peso corporal, que consistía en una dosis semanal durante todo el experimento. Como control del experimento se utilizó el tratamiento intravenoso con solución tampón fosfato salino pH 7,4. En la Figura 13, aparecen los resultados de sobrevida de los 4 grupos previamente descritos. Es de resaltar que en los grupos tratados con el AcM 14F7 (0.1 y 0.2 mg) y con 20 mg/kg. de peso de Ciclofosfamida se observó que no hubo prendimiento tumoral en algunos animales.

Los resultados de sobrevida favorecieron a los grupos tratados con el AcM 14F7. El día 30 del experimento, mientras no quedaba vivo ninguno de los animales del grupo control, se mantenían con vida 6 animales, tanto del primer grupo (0, 1 mg del AcM) como del grupo tratado con Ciclofosfamida y 7 animales del segundo grupo (0,2 mg del AcM). A los 60 días del tratamiento, dos animales del primer grupo, así como dos del grupo tratado con Ciclofosfamida sobrevivieron, mientras que en el segundo grupo fueron 5 los animales que quedaron con vida.

EJEMPLO 10: Inhibición del crecimiento tumoral del Mieloma P3X63 sólido en ratones atímicos. Diez ratones atímicos hembras, procedentes de la abierta NMRI, con peso entre 20 y 22 gramos fueron inoculados por vía subcutánea con 106 células de la línea tumoral murina Mieloma P3X63 el día 0 del experimento. Los animales se dividieron en dos grupos de 5. Un grupo empezó el tratamiento por vía intraperitoneal con el AcM 14F7 purificado, 0.15 mg por dosis (6 dosis) cada 2 días. Mientras el otro servía de control y recibió por la misma vía el mismo número y frecuencia de dosis de igual volumen de tampón fosfato salino. La Figura 14 muestra la inhibición del crecimiento de los tumores en los ratones tratados con el AcM 14F7, respecto al grupo control, apreciándose diferencias significativas entre los dos grupos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS: Figura 1: Muestra los niveles obtenidos de anticuerpos séricos contra NGcGM3 y no contra GM3 el día 56 del experimento, en ratones inmunizados con el preparado vacunal NGcGM3/VLDL/ Adyuvante Completo de Freund. Figura 2: Determinación por ELISA del isotipo de la respuesta de anticuerpos contra el gangliósido NGcGM3, en el suero de un ratón luego de tres meses de recibir la cuarta dosis de 0,2 mg de NGcGM3/VLDL/ Adyuvante Completo de Freund. Figura 3: Determinación de la subclase de inmunoglobulinas (IgG) a la que pertenece el anticuerpo monoclonal 14F7, por la técnica de ELISA. Figura 4: Reconocimiento por inmunotinción sobre cromatografía en capa fina de los gangliósidos N-glicolilados y N-acetilados que fueron utilizados durante el estudio de especificidad del Anticuerpo Monoclonal 14F7. Figura 5: Reconocimiento del gangliósido NGcGM3 por el Anticuerpo Monoclonal 14F7 utilizando la inmunotinción sobre la cromatografía en capa fina. Figura 6: No reconocimiento en cortes de tejido normal de adulto con el Anticuerpo Monoclonal 14F7 por estudios inmunohistoquímicos. Figura 7: Reconocimiento por inmunohistoquímica de algunos tumores humanos malignos y benignos por el Anticuerpo Monoclonal 14F7. Figura 8: Reconocimiento por inmunohistoquímica del AcM 14F7 en tejido fetal humano normal. Figura 9: Reconocimiento por el AcM 14F7 de la línea celular Mieloma P3X63 que expresa el gangliósido NGcGM3, mediante Citometría de Flujo. Figura 10: Efecto citotóxico independiente de complemento del AcM 14F7 utilizando la línea celular Mieloma P3X63, mediante la técnica de Ioduro de Propidium, por Citometría de Flujo.

Figura 11: Biodistribución del Anticuerpo Monoclonal 14F7 marcado con Tc99. Resultados de % de radiación gamma respecto al peso en gramos del órgano analizado en animales Balb/C normales. Figura 12: Biodistribución del Anticuerpo Monoclonal 14F7 marcado con Tc99. Resultados de % de radiación gamma respecto al peso en gramos del órgano analizado en animales Balb/C con el tumor Mieloma P3X63. Figura 13: Efecto antitumoral de la terapia pasiva del Anticuerpo Monoclonal 14F7 en grupos de ratones Balb/C inoculados con el tumor murino Mieloma P3X63 ascítico, tratados con 0, 1 y 0,2 mg de dicho anticuerpo, comparado un grupo tratado con Ciclofosfamida 20mg/kg de peso y un grupo control. Figura 14: Inhibición del crecimiento tumoral "in vivo" del tumor murino Mieloma P3X63 (sólido) en ratones atímicos de la cepa abierta NMRI.

Claims (11)

REIVINDICACIONES:

1. Anticuerpo monoclonal generado contra el gangliósido NGcGM3 caracterizado porque reconoce específicamente la secuencia oligo sacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galactosa-Glucosa en gangliósidos y glicoproteínas, pertenece a la subclase IgGl y provoca actividad citolítica de las células tumorales portadoras de dicha secuencia.

2. Anticuerpo monoclonal según reivindicación 1 caracterizado porque dicha actividad citolítica de las células tumorales portadoras de la secuencia oligosacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galactosa- Glucosa puede ser directa o mediada por complemento.

3. Anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque se denomina 14F7, obtenido a partir del hibridoma designado con el mismo nombre y depositado bajo el número de acceso provisional 98101901 en la colección ECACC, UK y con fecha Octubre 19, 1998

4. Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 3 depositado bajo el número de acceso provisional 9810190 len la colección ECACC, UK y con fecha Octubre 19, 1998

5. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones de la 1 a la 3, y que contiene adicionalmente un diluente o un excipiente adecuado.

6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 5 donde dicho anticuerpo puede estar unido a agentes terapéuticos tales como drogas, radioisótopos, inmunomoduladores, lectinas y toxinas.

7. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 5 y 6 para ser usada en el tratamiento de neoplasias malignas.

8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7 para el tratamiento del cáncer de mama, renal, del sistema digestivo y melanoma humano.

9. Un reactivo que contiene el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones de la 1 a la 3, acoplado a marcadores como enzimas, cromóforos, materiales quimioluminiscentes o radionucleótidos.

10. Un reactivo según la reivindicación 9 para la detección de células tumorales.

11. Un reactivo según la reivindicación 10 para la detección de células de tumores humanos de melanoma, mama, sistema digestivo tales como hígado, colon, estómago y recto, así como riñon.