AMPLIFICACIÓN POR DESPLAZAMIENTO DE HEBRA USANDO NUCLEOTIDOS BORONADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para inducir el corte por endonucleasas de restricción, métodos para la amplificación de secuencias blanco de ácido nucleico, y par icularmente a la amplificación por Amplificación por Desplazamiento de Hebra (SDA). ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos in vitro son herramientas potentes para detectar y analizar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos, y el alto grado de sensibilidad de estos métodos ha generado interés en desarrollarlos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas, para el aislamiento de genes para su análisis, y para la detección de ácidos nucleicos específicos como por ejemplo en el caso de la medicina forense. Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR), la Reacción en Cadena de Ligasa (LCR), la Repl icación Autosostenida de Secuencias (3SR), la Amplificación Basada en Secuencias de Ácidos Nucleicos (NASBA), la Replicación Mediada por Transcripción (TMR) así como la Amplificación por Desplazamiento de Hebra (SDA). La Amplificación por Desplazamiento de Hebra es una reacción de amplificación isotérmica que puede producir una amplificación superior al billón de veces de una secuencia blanco en menos de 30 minutos a temperatura constante (S. T. Wal er, et al. 1992. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 392-3965 G- t« Walker, et al. 1992. Nuc. Acids. Res. 20, 1691-1696? Patente Norteamericana No. 5,455, 166f Patente Norteamericana No. 5,270,184? EP 0 684 315), La reacción de Amplificación por Desplazamiento de Hebra pueden llevarse a cabo a una temperatura constante comprendida entre aproximadamente 37ßC y 42'C o bien a temperaturas constantes más altas para mejorar la eficiencia de la amplificación y la especificidad de dicha amplificación (SDA ter ofílica o bien tSDA de conformidad con lo descrito en la Solicitud de Patente Europea No. O 684 315). En cualesquiera de los formatos, la Amplificación por Desplazamiento de Hebra emplea 1) una endonucleasa de restricción que corta un sitio de reconocimiento/disociación de endonucleasa de restricción he imodif icado y 2) una psli erasa que se extiende desde el corte y desplaza una copia de la secuencia blanco mientras polimerisa una nueva hebra usando la secuencia blanco como templado. Ciclos repetidos de corte y desplazamiento producen copias adicionales de la secuencia blanco. La Reacción de Amplificación por Desplazamiento de Hebra se describe en la Patente Norteamericana No. 5,455,166, la Patente Norteamericana No. 5,270,184 y el documento EP 0 684 315. Los pasos para la reacción de Amplificación por Desplazamiento de Hebra son los mismos independientemente de la temperatura y de las enzimas empleadas, y se requiere de varias actividades enzimáticas específicas para amplificar exitosamente una secuencia blanco. La polimerasa de SDA debe 1) no tener actividad endonucleasa 5 '-3', ya sea naturalmente o bien por medio de desactivación, 2) incorporar los trifosfatos de desoxinucleósido derivados (dNTPs) requeridos por la Amplificación por Desplazamiento de Hebra (nucleótidos análogos como por ejemplo alfatio-dNTPs), 3) desplazar una hebra única corriente abajo a partir de una molécula de doble hebra que inicia en un corte de hebra única, y de preferencia 4) incorporar dUTP para permitir la descontaminación de la amplificación. La endonucleasa de restricción de SDA debe 1) cortar, (es decir disociar una hebra única de) su si io de reconocimiento/disociación de hebra doble cuando el sitio de reconocimiento/disociación se encuentra hemimodificado, 2) disociar de su sitio de reconocimiento/disociación para permitir que la psli erasa se una y amplifique el blanco, y de preferencia 3) no está afectada por dUTP incorporado en su sitio de reconocimiento/disociación. La incorporación de análogo de dNTP en el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción induce el corte por la endonucleasa de restricción. Los dNTPß tiolados son los análogos pucleótidas más ampliamente usados en SDA, sin embargo, la incorporación de dNTPs sustituido con metilo inducen también el corte. Ejemplos de pal imerasas y endonucleasas de restricción que tienen las actividades biológicas apropiadas para SDA se describen en las publicaciones de patente antes mencionadas. Términos que se relacionan a la amplificación de SDA son definidos en EP 0 684 315. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora que los trifosfatos de desoxinucleósidos al fa-boronados, cuando se incorporan en un sitio de reconocimiento/disociación de endonucleasa de restricción de hebra doble para una endonucleasa de restricción para producir un sitio de reconocimiento/disociación he imodificado, inducen el corte (la disociación de una de las dos hebras) por la endsnucleasa de restricción. Los trifosfatos de desoxinucleótidos al fa-boronadoß (dNTPalfaBH3) son por consiguiente útiles en SDA para producir el sitio de reconocimiento/disociación de endonucleasa de restricción he i odi f icads que puede cortarse requerido para sostener la reacción de amplificación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La amplificación por desplazamiento de hebra requiere de una polimerasa que no tiene la actividad exonucleasa 5 '-3', inicia la polimerización en un corte de hebra única en ácidos nucleicos de doble hebra, y desplaza la hebra corriente abajo del corte mientras genera una nueva hebra complementaria usando la hebra no contada como templado. La actividad de desplazamiento de hebra hace que el blanco sea disponible para síntesis de copias adicionales y genere el producto de extensión de hebra única al cual se híbrida un segundo iniciador de amplificación en reacciones de amplificación exponenciales. Puesto que la incorporación de análogos de dNTP induce el corte por endonucleasa de restricción, la polimerasa debe poder incorporar el análogo seleccionado de deso inucleó idos así como desplazar una hebra que lo contiene. Se han identificado numerosas polimerasas que tienen las características adquiridas para su uso en SDA cuando se emplean de dNTPs tiolados o bien metilados: exo-Klenow, polimerasa de ADN T5 y polimerasa de ADN Phi29, exo-Vent (New Englad Biolabs), exo-Deep Vent (New England Biolabs), Bst (BioRad), e?o-Pfu (Stratagene) , Bca (Panvera), y Sequencing Brade Taq (Promega). Las polimerasas Tth (Boehringer) , Tfl (Epicenter), REPLINASE (DuPont) y REPLITHERM (Epicentre) desplazan la hebra a partir de un corte, pero tienen también una actividad exonucleasa 5'-3'. Estas polimerasas son útiles en los métodos de la invención después de la remoción de la actividad exonucleasa, por ejemplo, mediante ingeniería genética. Ensayos de tamizado de rutina de conformidad con lo descrito a continuación pueden emplearse para determinar si o no una polimerasa tiene las características requeridas cuando se desea un dNTP con una nueva sustitución. La actividad de corte es esencial para la Amplificación por Desplazamiento de Hebra, puesto que es el corte que perpetua la reacción y permite el inicio de rondas subsecuentes de amplificación de blanco. Es decir, endsnucleasas de restricción adecuadas para SDA deben también disociar solamente una de las dos hebras de un sitio de reconocimiento/disociación hemimodif icado de doble hebra para la endonucleasa de restricción ("corte"). La endonucleasa de restricción debe disociarse después del sitio de reconocimiento/disociación para permitir que la polimerasa se una en el corte y se inicie la extensión. Puesto que las enzimas de restricción producen generalmente cortes de hebra doble, la disociación de una de las dos hebras en el dúplex del sitio de disociación debe inhibirse de manera selectiva. En la amplificación por desplazamiento de hebra, esto se logra mediante la introducción de al menos un nucleótido sustituido (un análogo de pucleótidos) en el sitio de reconocimiento de endsnucleasa de restricción durante la polimerización para producir un sitio hemimodificado. Ensayos de tamizado de rutina co o lo descrito a continuación pueden emplearse para determinar si o no se induce el corte cuando un análogo de nucleótido nuevo se incorpora en un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción hemimodificado. Se han empleado dess i nucleó ido fosforotiatos así co o nucleótidos meti lados para inducir el corte en la amplificación por desplazamiento de hebra. Ejemplos de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción útiles en SDA y los análogos de desoxinucle?tido que inducen el corte de estos sitios se describen en la Patente Norteamericana No. 5,455,166 y EP 0 684 315. La presente invención proporciona un nuevo grupo de análogos de dNTP (dNTPs al fa-boronados) incorporados por polimerasas durante la amplificación por desplazamiento de hebra y que inducen el corte por la endonucleasa de restricción para sostener la reacción de amplificación. El dNTP al fa-boronado correspondiente puede estar sustituido por cualquiera de los análogos de dNTP presentados en estas publicaciones, en reacciones de amplificación por desplazamiento de hebra que emplean la endanucleasa de restricción y el sitio de reconocimiento apropiados según lo descrito. Compuestos de trifosfato de deso inúcleosido boronadss (disponibles en Boron Biologicals) se tamizan en tres ensayos para graduar y predecir ßu utilidad en amplificación por desplazamiento de hebra. El primero eß un ensayo de actividad de polimerasa empleada para determinar si o no una polimerasa puede incorporar los dNTPs boronados. En un ensayo de actividad de polimerasa, se empleó el ADN de timo activado como sustrato para variar disoluciones de polimerasa. La polimerasa seleccionada fue diluida en diluyente de enzima que comprende 25 M de fosfato de potasio, 5 mM de sulfato de amonio, 10 M de 2-mercaptoetanol y 1 mg/ml de BSA. Se agregaron 10 µl de la dilución a un regulador para el ensayo (25 mM de fosfato de potasio, 0.15 M cada uno de dNTP y análogo de dNTP, 4 mM de cloruro de magnesio, 4.5 µg de ADN de timo de cera, activado, y 0.3 µl de 3000 mCi/ mol de dNTP marcado con 32P ) . Después de alcanzar el equilibrio, la reacción fue incubada a la temperatura de reacción durante 15 minutos. A intervalos de tiempo, se removieron 15 µl de la reacción y se agregaron a 45 µl de 25 M EDTA para detener la reacción. Cuarenta µl de la reacción terminada fueron graficadss en un disco de filtro DE-81 y lavados al menos cuatro veces en 10 mi de formato de amonio 0.3 M, pH 8.0, durante 5 minutos para cada lavado. Después del lavado final, los filtros fueron enjuagados en metanol, secados en aire en papel absorbente, colocados en frascos de centelleo con fluido de centelleo y contados. Por ejemplo, la incorporación de polimerasa de Bca (Takara o Pan Vera) de dCTPalfaBH3 a 60ßC se probó en el ensayo de actividad de polimeraßa con referencia a dCTP y dCTPalfaS como controles. El control dCTP fue ensayado en diluciones de 1:30,000 y 1:40,000. El control de dCTPalfaS fue ensayado en diluciones de 1:20,000 y 1:30,000 y el dCTP boronado fue ensayado en diluciones de 1:20,000, 1:30,000 y 1:40,000. Los resultados fueron contados en tres momentos (5, 10 y 15 minutos) y comparados con lecturas de antecedentes para filtros en blanco. La polimerasa de Bca que incorpora dCTP no modificado proporcionó una actividad de 152 unidades/µl. Una sustitución completa con dCTPalfaS provocó una caída de la actividad de polimerasa a 39 unidadeß/µl . La actividad reducida de las polimerasas en presencia de dNTPs tioladss había sido previamente observada, pero no parece interferir significati amente con la eficiencia de SDA. Una sustitución completa con dCTPalfaBH3 resul ó en una reducción de la actividad polimeraßa similar a la de dCTPalfaS (40-50 unidades/µl). En base a estos resultados, se podría esperar que laß polimeraßaß de SDA podrian incorporar otroß de dNTPs boronados también (por ejemplo, dATPalfaBH3, TTPalfaBH3 o bien d6TPalfaBH3) , puesto que el ensayo de actividad de psli erasa demuestra que la al fa-boronación de dNTPß no impide la reacción de polimerización. Se emplea un ensayo de extensión de polimerasa para evaluar la capacidad de las polimerasas de desplazar hebras en presencia de trifosfatos de desa in cleosidos boronados. En un ensayo de extensión de polimerasa, el corte que eß esencial para sostener la reacción de SDA se establece mediante el templado de un iniciador marcado, corriente arriba, adyacente a un iniciador no marcado, corriente abajo en un plás ido M13 digerido con Alul. El plás ido es digerido para proporcionar un punto de suspensión definido para la pslimerasa lo que produciría una banda de tamaño definido en un gel. En este ejemplo, el ensayo fue llevado a cabo en 25 M de KiP04, pH 7.5, 0.1 µg/µl BSA, 1 M cada uno de dNTP, 250 ng de plásmido blanco digerido, pslimerasa y 40 nM corriente arriba desplazando el iniciador marcado de extremos radioactivamente con un pol inucleósido quinasa. De dCTP tiolado o bien boropado se encontraba presente en varias cantidades y 40 nM del iniciador corriente abajo se encontraba presente o bien ausente en cada reacción. La mezcla fue desn tur lizada a 100*C durante 3 minutos y enfriada durante 2 minutos a la temperatura de reacción apropiada para la polimerasa. La polimerasa que se está probando fue después agregada y se permitió que la reacción de extensión prosiguiera durante 10 minutos. La extnesión fue defendida mediante la adición de 25 M de EDTA/formamida al 98%. Las muestras fueran despuéß ßome idas a electrof resis en geles desnaturali adas y analizadas por autaradiografia. Si la polimerasa desplazaba el iniciador corriente abajo y extendía totalmente el iniciador marcado corriente arriba, se podía observar una banda de tamaño definido. La cantidad de la banda de producto indicaba la eficiencia de la extensión de iniciador por la polimerasa. La polimerasa de Bca (probada a 60'C) tuvo un desempeño igualmente satisfactorio en el ensayo de extensión ya sea con dCTP boronado o bien dCTPalfaS boronado. En ausencia del iniciador corriente abajo, se observaran cantidades iguales de producto de extensión en presencia de varios análogos de nucleótido, indicando una incorporación igualmente eficiente. Cuando el iniciador corriente abajo se encontraba presente, todas laß reacciones. produjeron menos del producto totalmente extendido con la apariencia de productos más cortos abortados. Aún cuando más de los productos abortados se observaron en la reacción con dCTPalfaBH3 que en la reacción con dCTPalfaS, los dCTPs boronados fueron considerados comparables a los dCTP tioladaß en el ensayo. En base a estos resultados, se podría esperar que las poli erasaß de SDA se extendieran y desplazaran en presencia de otros de dNTPs boronados (por ejemplo, dATPalfaBHS, TTPalfaBH3 o bien dGTPalfaBH3) , puesto que el ensayo demuestra que la derivación del boro no impide estas actividades polimerasa. No todos los análogos de nucleótido pueden inducir el corte por todas laß endonucleasas de restricción. Un ensayo para evaluar las características de corte de las endonucleasaß de restricción en presencia de un análogo de nucleótidos seleccionadoß se desarrolló por consiguiente en base a la capacidad de un trifoßfato de desoxinucleósido modificado e incorporado en el sitio de reconocimiento/disociación de la endonucleaßa de restricción de doble hebra "para proteger una de laß dos hebras contra la disociación por parte de la endonu leasa. Esto se conoce como un ensayo de corte inducido por análogo o bien el ensayo de protección de hebra. En el ensayo de protección de hebra, un templado de una sola hebra que contiene el sitio de recono imiento de endonucleaßa de restricción seleccionada y el iniciador complementario al extremo 3' del templado se sintetizan. El templado y el iniciador ße enmarcan después, de preferencia con un radiomarcador. El iniciador y el templado se hibridan y los dNTPs modificados (análogos de nucleótidos) se incorporan en una hebra por la extensión del iniciador, produciendo una molécula completa de doble hebra que contiene un sitio de reconocimiento/disociación de endonucleasa de restricción hemimodificado. Eßte producto es tratado con la endonucleaßa de restricción bajo condiciones convencionales para la disociación. El análisis electroforético de los productos de la reacción bajo condicioneß de desn turalización ße emplea para determinar, mediante el tamaño de los fragmentos generados, si o no el ßitio de reconocimiento/disociación fue cortado, disociado en ambas hebraß o bien no cortado. El tamaño de los fragmentos en la electroforesis puede también emplearse para determinar cuál de laß dos hebraß del sitio de reconocimiento/disociación (es decir, modificado o no modificado) fue protegida contra la disociación. Por ejemplo, un templado 45-mer que contiene un sitio BsoBI (CTCGGT) y un complementario 21-mer de la parte 3' del templado fueron sintetizados. Ya sea el templado o bien el iniciador fueron marcados radioactivamente en extremo usando pol inucleótidsquinasa . El 21-mer fue hibridado sobre el templado y el sitio de restricción de BsoBI he imodi ficado fue construido mediante la extensión del 21-mer sobre el templado en presencia de dCTP al f -boronado (dCTPalfaBH3> de la ßiguiente manera. Se ensamblaron reacciones conteniendo 35 mM de ÍP04, pH 7.5; 0.1 µg/µl de BSA; 1 mM cada uno de TTP, dATP, dGTP y dCTP; dCTPalfaBH3 o bien alfa-tio-dCTP (dCTPalfaS); templado de 50 nM (marcado o no marcado) e iniciador de 50 nM (marcado o no marcado). El ADN fue desnaturalizado a 100ßC durante 2 minutos y las reacciones fueron enfriadas a 37*C durante 2 minutos. Ocho unidades de polimerasa exo-Klenow fueron agregadaß y la reacción de extensión se dejó proseguir a 37°C durante 30 minutos en presencia del reactivo de dCTP selec ionado. La polimerasa fue desactivada térmicamente a 60ßC durante 10 minutoß y 10 µl de la reacción fueron removidos para su uso como control. Veinte unidades de BsoBI en 35 mM de KÍP04, 0.1 µg/µl de BSA ße agregaron y la reacción de dißociación fue incubada a 60ßC durante 15 inutoß. La reacción de dißociación fue ßußpendida mediante la adición de 25 M de EDTA/ formamida a 98%. Laß reacciones fueron despuéß sometidas a electrofóresis en geleß desnaturalizantes al BV, y los resultados fueron visual izadoß mediante autoradisgraf ía . La hebra modificada del sitio de restricción he imodi f icado para BsoBI fue totalmente protegida mediante la incorporación ya sea de dCTPalfaBH3 o bien dCTPalfaS, con disociación eficiente de la hebra no modificada (corte). La observación de la actividad de corte en el ensayo de protección de hebra es una indicación que el par de análogo de nucleótido/endonucleasa de restricción que ße está probando soportará la SDA. En todos los ensayos anteriores se observó que el desempeño de dCTPalfaBH3 fue virtualmente idéntico al deße peño de dCTPalfaS. Puesto que el sitio de modificación en el dNTP boronado es el mismo que el sitio de modificación en el dNTP tislado, y que los dos grupos son de tamaño similar y tienen una carga ßimilar, se puede concluir que la mayoría de loe dNTPß alfa-boronadoß imitarán un dNTP alfa-tiolado correspondiente en esenci lmente todos los aspectos en cuanto a SDA. Por consiguiente ße considera que el dNTPalfaBH3 correspondiente puede sustituirße por cualquiera de lo dNTPalfaS conocidos para inducir el corte en cualeßquiera de los sitioß de reconocimiento de endonucleasa de restricción previamente identificados para su uso en SDA. Es decir, la incorporación de los siguientes dNTPs alfa-borsnados en el si io de recono imiento de endonucleasa de restricción he imo i ficado indicado inducirá el corte requerido para la reacción de SDA como lo hace el dNTPalfaS correspondiente: ENDONUCLEASA DE SITIO DE dNTP ANALOG
RESTRICCIÓN RECONOCIMIENTO (5 '-3') HincII GTTGAC HincII GTCAAC dGTPalfaBH3 Aval CCCGAG TTPalfaBH3 Aval CTCG6G dCTPalfaBH3 Ncil CCGGG dCTPalfaBH3 HindII GTTGAC dATPalfaBH3 HindII GTCAAC dGTPalfaBH3 Fnu4HI GC6GC dCTPalfaBH3 BBssttXXII CCAAAACCCTGG TTPalfaBH3 (SEQ ID NOíl) BßtXI CCAGGTTTTG6 dCTPalfaBH3 (SEQ ID N0:2)H3 Bs l AAAGCATTC TTPalfaBH3
BsrI AACCAGT TTPa 1 faBH3 Bsal 6GTCTCTTTTTT dATPalfaBH3 (SEQ ID N0:3) Nlalv GGAACC TTPalfaBH3
NspI GCATGT dCTPalfaBH3
NspI GCATGT dCTPalfaBH3 & dGTPalfaBH3
PflMI CCA66TTTTGG dCTPalfaBH3 (SEQ ID NO:4) Hphl GGTGAGGATCGTTT dATPalfaBH3 (SEQ ID NO:5) Alw? GGATCGTTTTT dATPalfaBH3 (SEQ ID N0:6) Fokl GGATGGCATGTCTTTTGGG dCTPalfaBH3 (SEQ ID N0:7) Accl GTAGAC dCTPalfaBH3 Accl GTAGAC TTPalfaBH3 Accl GTAGAC TTPalfaBH3 fc dCTPalfaBH3
Accl GTCTAC dATPalfaBH3 Accl GTCTAC dGTPalfaBH3 Accl GTCTAC dATPalfaBH3 & dGTPalfaBH3
Tthlll GACCACGTC TTPalfaBH3 Tthllll GACCAC6TC TTPalfaBH3 & dGTPalfaBH3 Tthllll GACGTGGTC dCTPa 1 f BH3 Tthllll 6ACGTG6TC dCTPalfaBH3 & dATPalfaBH3
Mval CCTG6 dATPalfaBH3 Bsll CCC6AG6AA6G dCTP lfaBH3 (SEQ ID N0:8) Bß l GAATGC dCTPalfaBH3 GCATTC dATPalfaBH3
B mAI GTCT dGTPalfaBH3 * TTPalfaBH3 GTCTCCAATC dGTPalfaBH3 (SEQ ID N0?9) BßoBI CTCGGG dCTPalfaBH3 CCCGAG TTPalfaBH3
Bßrl CCAGT dATPalfaBH3
BßrDI CATTGC TTPalfaBH3
BßtNS CCT6G dATPalfaBH3 fc dCTPalfaBH3
BßtOI CCTGG dATPalfaBH3 & dCTPalfaBH3
BstXI GGGTCTCCA6GAA TTPalfaBH3 (SEQ ID NO: 10) Mwol GCAATGGCGGC dGTPalfaBH3 %>. TTPalfaBHS (SEQ ID NO: 11) Puesto que los dNTPs modificados más f ecuentemente em leadoß en SDA son dNTPs tiolados, la Amplificación por Desplazamiento de Hebra ha sido optimizada para producir una amplificación altamente eficiente usando estos reactivos. Mientras la sustitución directa de dNTPß boronadss en reacciones de SDA optimizadas para dNTPß tiolados no se espera que de reßultadoß ópti oß, eß el método máß conveniente para demoßtrar SDA en presencia de dNTPs bsronadss. Por conßiguiente ße probó dCTPalfaBH3 en reacciones de Amplificación por Desplazamiento de Hebra según lo generalmente realizado con dNTPalfaS, usando polimerasas Bst (New England BioLabs) y Bca. La reacción con Bst contenía 25 mM de iP04, pH 7.5; 0.1 µg/µl de BSA; 0.05 µM de cada iniciador regulador; 0.5 µM cada uno de Regulador de Amplificación SDA; 1.4 M de dCTPalfaS o bien dCTPalfaBH3; 0.5 mM cada uno de dGTP, dUTP y dATP; 500 ng de ADN humano; 400,000 blancos (elemento de inßerción IS6110 de Mycobacterium tuberculosis > ; 10% de glicerol; 120 unidades de BsoBI y 60 unidades de Bst. Las reacciones incluyeron adicionalmente 6.9 mM, 7.6 M o bien 8.4 M de MgC12, que representaban 4 M, 4.7 mM o bien 5.5 mM de magnesio libre. Laß reacciones de Bca fueron ßimila eß, excepto en el caso de la sußtitución de 35 M de iP04, pH 7.5; 0.2 mM cada uno de dGTP y dATP; 160 unidades de Bßo I , 8 unidades de Bca. Laß reaccioneß de Bca incluyeron 5.5 M, 6 mM o bien 6.5 M de MgC12 que representaban 3.2 M, 3.7 mM y 4.2 M de magnesio libre. Todas las reacciones de SDA fueron preparadas conteniendo todos los agenteß excepto enzimas y MgCl2, y fueron después desnaturalizadas a 100*C durante 3 minutos. Las reacciones fueron después enfriadas a 55*C durante 2 minutos y la polimeraßa, endonucleaßa de restricción y MgC12 fueron agregados y mezclados. La amplificación se dejó proseguir a 55'C durante 30 minutos. Laß reacciones fueron terminadas mediante el enfriamiento rápido de las muestras en hielo seco. Se detectó la amplificación mediante electrof resis en geleß no desnatura1 izantes al 10% y tinción con bromuro de etijdio. Alternativamente, se híbrid una sonda detectara marcada radioactivamente en los extremos sobre los productos de amplificación y se extendió de la siguiente manera: 5 µl de 1 µM de sonda detectsra en 35 mM de iP04, 1 mM cada uno de dNTP, 4-6 M de MgCl2 ße agregaron a la reacción de amplificación y la mezcla fue desnaturalizada durante 2 minutos a lOO'C. Las muestras fueron equilibradaß a 37ßC durante 1 minuto y ße agregó una unidad de polimeraßa exo-Klenow. La reacción de extensión fue encubada a 37ßC durante 10 minutos, suspendida mediante la adición de 11 µl de formamida y sometida a electrofóresis en un gei de secuenc i mien o al 8%. La sonda detectora extendida fue visualizada mediante autoradiografía .
El blanco fue amplificado exitosamente en presencia de dCTPalfaBH3, con factores de amplificación de apro imadamente 10,000 a 300,000. Los factores de amplificación fueron aproximadamente 1000 veces menores que los obtenidos en la reacción de dCTPalfaS, sin embargo, como antes planteado, una reducción de la eficiencia de amplificación no eß inesperada puesto que las reacciones no fueron optimizadas para la incorporación de dNTPs boronados. Este experimento demuestra claramente que la incorporación de dNTPalfaBH3 en Amplificación por Desplazamiento de Hebra soporta la amplificación de blancos.
LISTA DE SECUENCIAS ( 1 ) INFORMACION GENERAL : (i) SOLICITANTE: Fraißer, Melinda S. Walker, George T. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: AMP IFICACIÓN POR DESPLAZAMIENTO DE HEBRA USANDO NUCLEOTIDOS BORONADOS (iii) NUMERO DE SECUENCIA: 11 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Richard J. Rodrick, Becton Dickinson y Compañía (B) CALLE: 1 Becton Drive (O CIUDAD: Franklin Lakeß (D) ESTADO: NJ (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 07417 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Dißco blando (B) COMPUTADORA: compatible con computadora perßonal de IBM (O SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patent?n Reléase No. 1.0, Versión No. 1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: - (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: - (C) CLASIFICACIÓN: -(viii) INFORMACIÓN SOBRE ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Fugit, Donna R. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32,135 <C> NUMERO DE REFERENCIA/CÉDULA: P-3556 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l¡ CCAAAACCCT G6 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 pares de baseß (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:2¡ CCAGGTTTT6 G (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 paree de baßeß (B) TIPO: ácido nucleico (O CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal •?y.
(xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:3: G6TCTCTTTT TT (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (O CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:4: CCAGGTTTTG G (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:5c
GGTGA6GATC GTTT (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:6:
GGATCGTTTT T (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7: GGATGGCATG TCTTTTG6G (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID N0:8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 pares de baßeß (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:8: CCCGAGGAAG G (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 paree de bases (B) TIPO: ácido nucleico (O CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:9: GTCTCCAATC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 pares de baseß (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID N0:10¡ GGGTCTCCAG GAA (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 paree de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CONFORMACIÓN DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (?i) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:llí GCAATGGCGG C