UNA COMPOSICIÓN DE SABOR DE QUESO Y PROCESO PARA HACER LA MISMA
Campo de la Invención La presente invención se refiere a composiciones de sabor de queso y, de manera particular, a concentrados de queso cultivados y un proceso para hacerlos . Antecedentes de la Invención El arte de hacer queso es complejo y ha evolucionado muy poco sobre el tiempo. El proceso aun comienza con leche principalmente de vacas, ovejas o cabras. Alrededor de diez libras de leche se requieren para producir una sola libra de queso. La leche es frecuentemente, pero no siempre, pasteurizada para matar bacterias no deseadas. Siguiente, un cultivo inicial de bacterias deseables se añade a la leche. El cultivo inicial puede ser, por ejemplo, bacterias Streptococci o Lactobacilli . La cepa particular de bacterias y cantidad usada ayudan en el desarrollo de sabor. Entonces se le permite fermentar a la leche y los microorganismos descomponen lactosa convirtiéndola en ácido láctico, ácido cítrico, y otros metabolitos. Después de que la fermentación se completa, enzimas se añaden que comienzan a descomponer la caseína, una proteína soluble en leche. Cuajo es una tal enzima que se obtiene a partir de la cubierta del cuarto estómago de becerros . Además de
descomponer la caseína, el cuajo ayuda a coagular los sólidos de leche en cuajadas flotando en una solución de azúcar de leche, minerales y otras proteínas solubles en agua también conocidas como suero . Las cuajadas y suero se calientan y agitan, y el suero se drena. Las cuajadas se transfieren hacia un molde, se prensan hacia bloques y se dejan añejar. Tiempos de añej amiento varían, por ejemplo, unos cuantos días a varios meses y en ocasiones años. En el caso de queso cheddar añejar por alrededor de sesenta días proporciona un sabor suave a medio mientras que sabor extra-fuerte requiere alrededor de quince meses . Reacciones microbianas y químicas continúan ocurriendo en el queso conforme envejece. Durante el proceso de envejecimiento muchos compuestos se producen los cuales contribuyen a generación de sabor. De hecho, se ha estimado que alrededor de cuatrocientos diferentes compuestos contribuyen al sabor del queso cheddar. Las clases principales de compuestos que se cree que contribuyen a generación de sabor en queso incluyen aminoácidos, péptidos, compuestos de carbonilo, ácidos grasos y compuestos de azufre. Varios compuestos volátiles incluyendo ácidos grasos, ésteres, aldehidos, alcoholes, cetonas, y compuestos de azufre se incluyen en listas que describen el aroma de varios quesos. La producción de varios de estos compuestos de aroma y sabor se han atribuido a múltiples reacciones enzimáticas y químicas que toman lugar en una manera secuencial en el queso conforme envejece.
Una serie de reacciones particular que ocurre involucra proteínas que se descomponen en sus aminoácidos componentes . Estos aminoácidos entonces se convierten a sus a-ceto ácidos correspondientes. Los -ceto ácidos se metabolizan aun adicional-mente proporcionando compuestos que añaden notas de sabor particulares al queso. El catabolismo de aminoácidos se ha identificado como un paso limitante de velocidad en el desarrollo de sabores de queso. Conforme la demanda de consumidores continúa creciendo por queso de alta calidad y sabroso, es necesario disminuir el tiempo que se toma para que el sabor se desarrolle por completo. Un enfoque ha sido hacer un concentrado de queso cultivado ("CCC") teniendo sabor de queso mas intenso, y luego usarlo como un agente de saborización de queso en otro material a granel. CCC's se han fabricado que logran desarrollo de sabor de queso completo dentro de un número de días en lugar de meses. Estos CCC's se añaden a otros alimentos a granel, tales como quesos procesados y alimentos de botanas, para impartir o intensificar un sabor de queso. Métodos para la fabricación de tales concen-trados de sabor de queso han sido descritos, tal como en la patente US 4,708,876. Típicamente el proceso involucra un sustrato lácteo que se cultiva con un cultivo láctico seguido por adición de varios cultivos, proteasas, peptidasas, y lipasas. La patente US 4,708,876 describe concentrados de sabor de queso que se pueden obtener a partir de leche como un material inicial, en
lugar de cuajadas de queso, o sin la formación del sub-producto de suero. La patente US 6,214,586 describe el uso de cultivos vivos teniendo altos niveles de enzimas proteolíticas y enzimas peptidolíticas para quitar lo amargo a cultivos modificados enzimáticos . Aunque estos procesos previos pueden producir un desarrollo acelerado, o una mejora, del sabor de queso, no producen mejoras que atiendan a componentes de sabor de queso específicos. Mas recientemente una tecnología se ha desarrollado para producir un sistema de saborización de queso bio-generado natural que se puede usar para preparar diferentes productos/derivados de queso, objetivados en varios perfiles de sabor de queso usando un enfoque modular a creación de sabor, que se describe en, por ejemplo, la patente US 6,406,724. El sistema de saborización de queso descrito en esta patente se deriva de componentes diferentes, donde los componentes individuales se combinan en diferentes relaciones para proporcionar perfiles de sabor específicos en productos concentrados de queso cultivado. A pesar de los desarrollo descritos en las publicaciones anteriores, una necesidad aun existe para rutas alternativas para hacer sistemas de saborización de queso, especialmente con un rango mas diversificado de sabores posibles. La presente invención proporciona un concentrado de queso cultivado y un método para su fabricación que cumple con estas y otras necesidades deseables así como proporciona otros beneficios.
Compendio de la Invención La presente invención proporciona una composición de sabor de queso y un proceso para preparar una composición de sabor de queso que comprende los pasos de (a) poner en contacto un producto lácteo que contiene protelna con un cultivo de ácido láctico para formar una mezcla de reacción a una temperatura de alrededor de 25 a alrededor de 45°C por alrededor de 8 a alrededor de 72 horas para proporcionar péptidos y aminoácidos libres y, (b) poner en contacto a los péptidos y aminoácidos libres dentro de la mezcla de reacción con aminoácido oxidasa para quitar las aminas a los péptidos y aminoácidos libres para proporcionar a-ceto ácidos, donde los a-ceto ácidos son adicio-nalmente metabolizados dentro de la mezcla de reacción para proporcionar compuestos de sabor. La presente invención también proporciona un producto alimenticio que comprende la composición de sabor de queso . Descripción Detallada de la Invención En una primera forma de realización, la presente invención proporciona un proceso para preparar una composición de sabor de queso que comprende los pasos de (a) poner en contacto un producto lácteo que contiene proteína con un cultivo de ácido láctico para formar una mezcla de reacción a una temperatura de alrededor de 25 a alrededor de 45°C por alrededor de 8 a alrededor de 72 horas para proporcionar péptidos y aminoácidos libres y, (b) poner en contacto los péptidos y aminoácidos libres
dentro de la mezcla de reacción con aminoácido oxidasa para eliminar las aminas de los péptidos y aminoácidos libres para proporcionar a-ceto ácidos, donde los a-ceto ácidos se metaboli-zan adicionalmente dentro de la mezcla de reacción para proporcionar compuestos de sabor. El producto lácteo conteniendo proteína se selecciona a partir de un concentrado de leche, leche, un concentrado de suero, un sustrato de suero, o cualquier combinación de los mismos . El cultivo de ácido láctico se selecciona a partir del grupo que consiste en Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ss. lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostoe lactis, Leuconos-toc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, y Lactobacillus casei, y sus mezclas. En una segunda forma de realización, el paso (a) del proceso anteriormente mencionado además comprende poner en contacto un producto lácteo conteniendo proteína con por lo menos una enzima proteasa . En una tercera forma de realización, el paso (a) del proceso anteriormente mencionado además comprende poner en contacto un producto lácteo conteniendo proteína con por lo menos una enzima peptidasa.
En una cuarta forma de realización, cualquiera de los procesos anteriormente mencionados además comprende el paso de desactivar las enzimas dentro de la mezcla de reacción después del paso (b) mediante calentar la mezcla de reacción a una temperatura de alrededor de 60 °C a alrededor de 80°C por un periodo de tiempo de alrededor de 15 segundos a alrededor de 1 hora. En una forma de realización, el paso de desactivar las enzimas dentro de la mezcla de reacción ocurre mediante calentar la mezcla de reacción a una temperatura de alrededor de 74 °C por alrededor de 16 segundos. En otra forma de realización, el paso de desactivar las enzimas dentro de la mezcla de reacción ocurre mediante calentar la mezcla de reacción a una temperatura de alrededor de 63.5°C por alrededor de 30 minutos. En una quinta forma de realización, el paso (a) de cualquiera de los procesos anteriormente mencionados además comprende añadir por lo menos un aminoácido libre a la mezcla de reacción. Los aminoácidos usados pueden ser, por ejemplo, pero no limitados a los mismos, no ramificados, ramificados o aromáticos. En una forma de realización, isoleucina, leucina, valina, fenilalanina, triptofano, metionina, ya sea individualmente o cualquier combinación de los mismos, se puede añadir a la mezcla de reacción para mejorar una nota o notas de sabor deseadas. En una sexta forma de realización, el paso (b) de cualquiera de los proceso anteriormente mencionados además comprende el paso de oxigenar la mezcla de reacción.
En una séptima forma de realización, el paso (b) de cualquiera de los proceso anteriormente mencionados además comprende añadir enzima catalasa a la mezcla de reacción. En una octava forma de realización, el paso (b) de cualquiera de los proceso anteriormente mencionados además comprende añadir enzima catalasa y peróxido de hidrógeno a la mezcla de reacción. En una novena forma de realización, el paso (b) de cualquiera de los proceso anteriormente mencionados además comprende añadir aminotransferasa a la mezcla de reacción. En una décima forma de realización, el paso (b) de cualquiera de los proceso anteriormente mencionados además comprende añadir un aceptador de grupo amino a la mezcla de reacción. El término "un producto lácteo conteniendo proteína" se define como un producto lácteo que comprende una combinación o mezcla de una fuente de proteína acuosa y una fuente de grasa. El producto lácteo puede ser un concentrado de leche, un sustrato de leche, un concentrado de suero, un sustrato de suero, o combinaciones de estas sustancias lácteas entre sí, y en combinación con una proteína o fuente de grasa suplementarias . El producto lácteo generalmente estará en la forma de una combinación de proteína acuosa y fuente de grasa. Puede estar en forma de emulsión. Los productos lácteos, tales como un concentrado de leche fluido, útiles como el material inicial generalmente tienen
contenidos de sólidos totales de alrededor de 30 a alrededor de 50 porciento, contenidos de proteína de alrededor de 10 a alrededor de 19 porciento, contenidos de grasa de alrededor de 15 a alrededor de 30 porciento, y contenidos de lactosa de alrededor de 0.1 a alrededor de 10 porciento. De preferencia, tienen contenidos de sólidos totales de alrededor de 35 a alrededor de 47 porciento, contenidos de proteína de alrededor de 12 a alrededor de 17 porciento, contenidos de grasa de alrededor de 18 a alrededor de 25 porciento, y contenidos de lactosa de alrededor de 0.5 a alrededor de 5 porciento . Los niveles de humedad del producto lácteo son generalmente de alrededor de 50 a alrededor de 70 porciento, de preferencia de alrededor de 53 a alrededor de 65 porciento. La fuente de proteína puede ser una proteína seca o material concentrado y es de preferencia un ingrediente lácteo, tal como concentrado de proteína de leche, proteína de leche fraccionada, grasa de leche concentrada, concentrado de proteína de suero, suero seco, leche seca no grasa, o sus mezclas. Otras fuentes de proteína, tales como proteína de suero hidrolizada, caseína hidrolizada, vegetales, extracto de levadura (v.gr. , Umamex II, Hy-Yep 77, Yep L) , cereales, proteína de legumbres, proteína de soja, proteína de maíz, proteína de trigo, y/o proteína de arroz pueden usarse en parte o como la única fuente de proteínas. La fuente de grasa de preferencia es una grasa de leche tal como grasa de leche anhidra, mantequilla, crema, o sus
mezclas. Otras fuentes de grasa no lácteas, tales como aceite vegetal, se pueden usar en parte o como la única fuente de grasa. El pH del concentrado o sustrato lácteo está generalmente en el rango de alrededor de 6 a alrededor de 7 y de preferencia en el rango de alrededor de 6.5 a alrededor de 6.7. En general, por lo menos una de las fuentes de proteína y grasa incluirá un ingrediente lácteo en la práctica de esta invención para proporcionar un material inicial altamente útil a partir del cual varios sabores que son normalmente o de otra forma asociados con productos de queso se puedan desarrollar. Una fuente de proteína seca, si se usa, se reconstituye con agua. El agua se usa en un nivel suficiente para proporcionar humedad total de alrededor de 50 a alrededor de 70 porciento, de preferencia de alrededor de 53 a alrededor de 65 porciento en el sustrato. La fuente de proteína reconstituida se combina con la fuente de grasa para proporcionar el sustrato. Si es necesario, el pH del sustrato se puede reducir al rango apropiado (es decir, alrededor de 4.6 a alrededor de 6 y de preferencia de alrededor de 4.8 a alrededor de 5.6) por la adición de un ácido comestible o por el uso de un microorganismo productor de ácido láctico. Ácidos comestibles adecuados son ácidos no tóxicos, inorgánicos u orgánicos, que incluyen ácido clorhídrico, ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido fosfórico, ácido láctico, y sus mezclas. Al preparar el concentrado de leche, un dispositivo de homogeneización se puede usar para reducir el
tamaño de partículas de gota de grasa y asegurar homogeneidad en el sustrato. En una forma de realización, el producto lácteo usado como el material inicial es un concentrado o sustrato derivado de leche acuoso que es un concentrado de leche fluido preparado por ultrafiltración (sola o aun mas preferentemente combinada con diafiltración) o un sustrato de leche reconstituido preparado a partir de una mezcla de polvo de leche ultra iltrado (UF) o ultrafiltrado/diafiltrado (UF/DF) y leche de grasa. El material inicial puede ser una leche UF/DF teniendo las siguientes características :
Estos concentrados de leche pueden usarse como son o en combinación con una fuente de grasa suplementaria para proporcionar al sustrato (material inicial) . Productos lácteos preferidos útiles como materiales iniciales para los métodos de la presente invención se pueden preparar a partir de leche entera o descremada con, si se desea, crema o grasa de leche anhidra (AMF)
añadidas . La crema o AMF generalmente se añade en una cantidad de 0 a alrededor de 20 porciento, de preferencia de alrededor de 2 a alrededor de 15 porciento, por peso de la mezcla. En una forma de realización para hacer el producto lácteo, leche descremada se sujeta a técnicas de ultrafiltración/diafiltración convencionales para producir un producto concentrado de leche de alrededor de 3X a alrededor de 8X (de preferencia alrededor de 5X) . Crema o grasa de leche anhidra o una combinación de los mismos se mezcla con el concentrado de leche. En una forma de realización ejemplar no limitativa, la mezcla resultante se homogeneiza, y se pasteuriza bajo condiciones de alta temperatura por corto tiempo (HTST) , tal como a alrededor de 76°C por alrededor de 16 segundos en un intercambiador de calor, y luego se enfría entre alrededor de 21 y alrededor de 27°C. Este tratamiento adicional ayuda a reducir el tamaño de gotas de grasa y asegura homogeneidad del sustrato previo a la fermentación. El producto lácteo resultante puede usarse como el material inicial que se sujeta a fermentación para preparar los componentes de sabor específicos de la presente invención. De preferencia, alrededor de 1 a alrededor de 2 porciento de sal se añade al producto lácteo previo al tratamiento con las varias enzimas/cultivos/aditivos para producir los componentes de sabor específicos. El producto lácteo pasteurizado es un líquido relativamente viscoso, de preferencia conteniendo alrededor de 30 a alrededor de 50 porciento de sólidos. El término un "cultivo de ácido láctico" se define como
un cultivo que convierte lactosa a ácido láctico y reduce el pH. En general, el sustrato inoculado se fermenta en presencia del cultivo láctico a una temperatura y por un tiempo suficientes para proporcionar catabolismo homo-fermentativo de lactosa a lactato al nivel deseado. El punto final generalmente puede corresponder con una reducción en el pH de la mezcla de fermentación a un valor dado. Los parámetros de periodos de tiempo, temperaturas, y pH de punto final de la fermentación pueden variar dependiendo del tipo de sabor de queso siendo preparado. El cultivo de ácido láctico usado incluye aquellos comúnmente usados en fermentación de ácido láctico incluyendo bacterias termofilas y/o mesófilas usadas para ese propósito. El cultivo de ácido láctico usado en la presente invención incluye aquellos comúnmente usados en la fermentación de ácido láctico asociados con producción de queso natural incluyendo bacterias termofilas y/o mesófilas adecuadas para ese propósito. Cuando se usan cultivos termófilos, un cultivo de bastón puede usarse comprendiendo Lactobacillae y/o un cultivo de coco que comprende Streptococcus thermophillus . Los Lactobacillae pueden seleccionarse, por ejemplo, de Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ss. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Enterococ-cus faecium, o sus mezclas. En un aspecto preferido, un cultivo de bastón de Lactobacillae generalmente se añade a la mezcla de fermentación en un nivel de alrededor de 0.01 a alrededor de 1
porciento, particularmente de alrededor de 0.05 a alrededor de 0.5 porciento. El cultivo de Streptococcus ther ophilus puede añadirse generalmente en un nivel de alrededor de 0.01 a alrededor de 1 porciento, particularmente alrededor de 0.05 a alrededor de 0.5 porciento. Fuentes comerciales de Lactobacillae termófilos están disponibles de, por ejemplo, CHR. Hansen A/S, ítersholm, Dinamarca. Fuentes comerciales de bacterias termófilas Streptococcus thermophilus también están disponibles de, por ejemplo, CHR. Hansen A/S, H0rsholm, Dinamarca (incluyendo, por ejemplo, TH-3 y TH-4) . De preferencia, los cultivos son cultivos establecidos en cuba directa (DVS) , aunque iniciadores a granel en casa también se pueden usar. Fermentación de lactococos mesófilos también se puede usar para generar cantidades significativas de ácido láctico a un pH sobre 5.0 y a 30°C. Como se conoce generalmente, las cepas de bacterias de ácido láctico de cultivo mesófilo generalmente tienen una temperatura de crecimiento óptima en alrededor de 30°C, y las cepas de bacterias de ácido láctico de cultivo termófilo generalmente tienen temperaturas de crecimiento óptimas en el rango de alrededor de 40 a alrededor de 45 °C. Ejemplos de bacterias termófilas incluyen los cultivos de bastones y cocos anteriormente identificados. Ejemplos de bacterias mesófilas incluyen, por ejemplo, Lactococ-cus lactis subsp . lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar . diacetylactís, Leuconos-toc lactis, Leuconostoc mesenteroid.es subsp. cremoris, Pediococ-
cus pentosaceus, y Lactobacillus casei subs . casei . Fuentes comerciales de bacterias mesófilas de Lactococcus lactis incluyen, por ejemplo, R-603, R-604, y R-607 de CHR. Hansen A/S, Horsholm, Dinamarca. Enzimas de cultivo de ácido láctico adecuadas de los tipos anteriores pueden producirse a partir de varios microorganismos o extraerse de tejidos de plantas o animales. Cultivos iniciales DVS y/o cultivos iniciales en volumen pueden usarse. Los cultivos DVS pueden obtenerse comercialmente en forma concentrada congelada, forma líquida, o como cultivos secos por congelación o liofilizados en forma de polvo. El término "aminoácido oxidasa" se define como una enzima que quita las aminas de manera oxidativa de los aminoácidos a los oí-ceto ácidos correspondientes. La enzima con actividad amino oxidasa puede ser un material de enzima purificado a partir de ya sea microorganismos, animales o plantas; o células de un microbio que producen actividad de amino oxidasa; o material de tejido de una planta o animal que produce la enzima o ácidos nucleicos, vectores y microorganismos expresando tales aminoácido oxidasas . Formas D y/o L de la enzima se pueden usar en la práctica de la presente invención. D- o L-aminoácido oxidasas generalmente transformarán selectivamente D- o L-aminoácidos , respectivamente, presentes en la mezcla de reacción. Los aminoácidos que se pueden transformar por la aminoácido oxidasa a sus oí-ceto ácido correspondientes no son particularmente
limitados, pero de preferencia comprenden aminoácidos que sirven como precursores e intermedios para compuestos alimenticios de sabor y aroma y metabolitos derivados directamente o indirectamente de degradación de los intermediario de a-ceto ácido generados en la mezcla de reacción durante la etapa dos del procesamiento. Por ejemplo, y no a manera de limitación, tales aminoácidos pueden incluir alanina, fenilalanina, glutamina, valina, isoleucina, leucina, lisina, prolina, glicina, triptofa-no, treonina, y similares. Aminoácidos libres conteniendo azufre, es decir, tri-péptidos conteniendo aminoácidos que contienen azufre, e hidrolizados de proteínas conteniendo aminoácidos que contienen azufre, se pueden utilizar. Hidrolizados de proteínas alimenticias adecuados están disponibles, por ejemplo, de Quest International (Hoffman Estates, Illinois, Estados Unidos) bajo los nombres comerciales N-Z-Amine, N-Z-Case, Hy-Case, y Peptica-se, así como de otros proveedores. De preferencia, los aminoácidos que contienen azufre incluyen L-metionina, L-glutationa, y L-cisteína, o una mezcla de los mismos. De preferencia, una combinación de D-aminoácido oxidasa y L-aminoácido oxidasa se añaden para propósitos de conducir la segunda etapa de procesamiento de acuerdo con la presente invención. Fuentes comerciales de L- y D-aminoácido oxidasa están disponibles (v.gr. , Sigma Chemicals, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos) . La aminoácido oxidasa generalmente se usa en niveles de alrededor de 0.001 a alrededor de 4 porciento, de preferencia en niveles de 0.01 a
alrededor de 2 porciento . Cuando el sabor objetivo se alcanza en la segunda etapa de procesamiento, las enzimas (proteasas, peptidasas, aminoácido oxidasas, y similares) se desactivan mediante calentar la mezcla de reacción a una temperatura y mantenerla por un periodo de tiempo suficiente para asegurar desactivación de enzimas completa (v.gr. , mediante calentar de alrededor de 70 a alrededor de 100°C y mantener por alrededor de 5 a alrededor de 60 minutos u otros ciclos térmicos adecuados para este propósito) . El término "enzima proteasa" y "enzima peptidasa" se definen como enzimas que tienen interacción y/o reaccionan con el sustrato lácteo para generar aminoácidos libres en la etapa inicial (fermentación) . Como se indica, las enzimas proteasa y peptidasa son multi-funcionales en el contexto de formas de realización de esta invención. Las proteasas y peptidasas pueden añadirse secuencialmente o todas durante la etapa de fermentación del procesamiento. No se desactivan hasta después de la terminación de la segunda etapa del procesamiento. Las enzimas multi-funcionales pueden producirse a partir de varios microorganismos o extraerse de tejidos de plantas o animales. Las varias enzimas del sistema de enzimas están disponibles comercialmente como polvos secos o en forma líquida. Las proteasas son enzimas que se pueden derivar de fuentes de hongos, plantas, o animales, como se conoce bien en la materia. Ejemplos de proteasas adecuadas incluyen Enzeco Neutral
Bacterial Protease 2X, disponible de Enzyme Development Corp., y Promod 215 disponible de Biocatalysts . Las proteasas en polvo son generalmente usadas en niveles de alrededor de 0.01 a alrededor de 1 porciento, de preferencia en niveles de 0.1 a alrededor de 0.4 porciento. Una enzima con actividad de peptidasa, de preferencia actividad de aminopeptidasa, también se usa en el sistema. La enzima con actividad de peptidasa puede ser un material de enzima purificado o puede ser células de un microbio que producen actividad de peptidasa, tal como Lactobacillus helveticus. Las células cultivadas pueden ser células secas por rocío, secas por congelación, congeladas, o cultivadas frescas y pueden ser no crecientes o capaces de propagación dentro del sustrato. Lactobacillus helveticus seco por rocío puede usarse en un nivel de alrededor de 0.01 a alrededor de 3 porciento, de preferencia en niveles de 0.065 a alrededor de 0.5 porciento. Durante el primer paso, también conocido como la "etapa de ferment ción", un producto lácteo tal como, por ejemplo pero no limitado a, un concentrado de leche UF/DF, se inocula con bacterias de ácido láctico. Esta mezcla de inoculación se complementa con proteasas y peptidasas para ayudar en la generación de aminoácidos libres. Alternativamente, proteínas lácteas hidrolizadas (v.gr., NZ Amine disponible de Fonterra; Peptigen y Lacprodan disponibles de Arla Foods Ingrediente ; Barpro disponible de Glanbia Nutritionals ; Enzcase y Hycase
- Indisponibles de Kerry Bioscience) pueden usarse como el sustrato inicial o un medio rico en lactosa (azúcar) se complementa con proteína hidrolizada y extracto de levadura. Proteasas y peptidasas se añaden con el cultivo de ácido láctico. La mezcla resultante se fermenta como parte de una primera etapa del procesamiento. La mezcla se fermenta a 30°C por 12-18 horas. La preparación de enzima peptidasa, en conjunto con las enzimas proteasas, crea una alta concentración de aminoácidos libres y pequeños péptidos en la mezcla de reacción que contribuyen al desarrollo de sabor de queso. Consecuentemente, una mezcla de proteínas hidrolizadas resultante obtenida a partir de esta etapa de proceso inicial contiene aminoácidos libres. El sustrato inoculado puede fermentarse en un proceso de fermentación de una sola etapa o multi-etapas como parte de la Etapa 1 del procesa-miento. La mezcla de proteínas hidrolizadas intermedia puede adicionalmente procesarse inmediatamente, o temporalmente almacenarse bajo condiciones enfriadas (v.gr., alrededor de 4°C) antes de proceder a procesamiento subsecuente descrito mas adelante. La mezcla de reacción fermentada opcionalmente puede sujetarse a un paso de homogeneización previo al procesamiento adicional . En la segunda etapa del proceso, aminoácido oxidasa se añade para generar intermedios de a-ceto ácido in situ en la matriz de queso cultivado conteniendo aminoácidos libres y los microorganismos de queso. Los microorganismos de queso no se
desactivan previo a la segunda etapa de procesamiento. Los a-ceto ácidos generados in si tu (y/o aquellos añadidos externamente como se describe mas adelante) son a su vez convertidos in situ a metabolitos de sabor y aroma de queso perceptibles en la matriz de queso. La mezcla de reacción intermedia conteniendo los compuestos de producto lácteo fermentado, aminoácidos libres, aminoácido oxidasa, enzimas proteoliticas , y enzimas peptidolíti-cas es aireado durante la segunda etapa de procesamiento suficiente para impedir condiciones anaerobias . La aireación puede efectuarse químicamente o mecánicamente. Catalasa se puede introducir a la mezcla de reacción que libera oxígeno de subproducto de peróxido de hidrógeno generado mediante la conversión de aminoácidos a -ceto ácidos. Aire, oxígeno, u otro gas conteniendo oxígeno también se puede introducir dentro de la mezcla de reacción, tal como mediante una placa de difusión o un tubo rociador en línea. Cuando un perfil de sabor de queso deseado ha sido suficientemente desarrollado, la mezcla de reacción se calienta a una temperatura y por un periodo de tiempo suficientes para desactivar las enzimas. La aireación se descontinúa durante el tratamiento de desactivación. El producto de composición de sabor de queso resultante puede usarse inmediatamente o almacenarse de manera estable bajo condiciones enfriadas hasta que se use posteriormente como un aditivo de sabor de queso en fabricación de productos alimenticios u otra aplicación.
Antes y/o después de la desactivación de enzimas, el nivel de sabor y aroma del concentrado de leche cultivado pueden juzgarse organolépticamente y/o se pueden estimar a través de mediciones analíticas, tales como pH, acidez titulable, y concentración de ácidos grasos libres, aminoácidos, u otros metabolitos conocidos por estar asociados con un perfil de sabor de queso dado. Pruebas sensoriales usadas pueden incluir, por ejemplo, sabor y/o aroma. Esta trayectoria enzimática de pasos múltiples única es útil para desarrollar compuestos de sabor y aroma a partir de o¡-ceto ácidos en productos de queso cultivados frescos, que mejoran o amplifican la percepción similar a queso global del producto cultivado. El uso de aminoácido oxidasa, y enzimas proteolíticas y peptidolíticas , en la matriz de queso cultivado puede ayudar en el desarrollo de compuestos de sabor y aroma para la producción de concentrados de sabor de queso en muchas maneras en la práctica de la presente invención, tales como, por ejemplo, mediante ayudar en la mejora de la percepción a queso global cuando se usa en fermentaciones de bacterias de ácido láctico que son altas en aminoácidos; y mediante atacar el metabolismo de aminoácidos específicos en una fermentación particular, sabores específicos se pueden desarrollar en un bloque particular dependiendo en el aminoácido siendo atacado incluyendo bloques con perfil de sabor de tipo "similar a nueces" . También, compuestos de sabor y aroma pueden generarse en la producción de
concentrados de sabor de queso dentro de un periodo de tiempo relativamente corto sin necesidad del paso de añej amiento. Este enfoque único también ofrece una alternativa aventajada en costo al uso de aminotransferasas , y es también mas adecuada para una aplicación de concentrado de queso cultivado ("CCC") donde la fermentación se puede hacer bajo condiciones anaerobias. En una forma de realización alternativa, aminoácidos libres pueden introducirse externamente hacia el sistema de reacción para producir una fuente primaria de aminoácidos libres, y/o complementar o diversificar el contenido de aminoácidos libres desarrollado por separado in situ durante la etapa inicial (fermentación) del proceso. Los aminoácidos generados in situ y añadidos externamente se hacen disponibles para la segunda etapa de procesamiento involucrada anteriormente que involucra generación de a-ceto ácido mediante salida de aminas oxidativa de aminoácidos catalizada por aminoácido oxidasa, y su degradación subsecuente a metabolitos de sabor en la co-presencia de proteasas y peptidasas. Adición externa de aminoácidos puede también usarse para atacar el metabolismo de aminoácidos selectos en una fermentación particular, con lo cual sabores específicos se pueden desarrollar en un bloque particular dependiendo del aminoácido siendo atacado. Bloques de sabor que se pueden producir con procesos de la presente invención incluyen, por ejemplo, un componente de perfil de sabor similar a nueces, un componente de perfil de
sabor similar a malta, y un componente de perfil de sabor a chocolate. Estos bloques de sabor se pueden combinar en diferentes relaciones para generar sabores deseados de varios quesos. Otras sinergias de enzimas complementarias opcionalmen-te se pueden incorporar durante la segunda etapa del procesamiento para ayudar a las reacciones enzimáticas de segunda etapa descritas anteriormente. Por ejemplo, según se indica, catalasa opcionalmente se puede añadir durante la anteriormente indicada segunda etapa de procesamiento en una cantidad suficiente para regenerar oxígeno del sub-producto H202. Aminotransferasa también puede añadirse opcionalmente durante la segunda etapa de procesamiento anteriormente mencionada para promover adicional-mente la ínter-conversión de aminoácidos y ceto ácidos para generar un rango de ceto ácidos usando ceto ácidos generados por aminoácido oxidasa como aceptadores de grupo amino. Sin embargo, el uso adicional opcional de aminotransferasa generalmente requiere la presencia de un aceptador de grupo amino, tal como -ceto glutatarato, el cual es limitado en la matriz de queso y necesita suplementarse para mejorar la transaminación . El proceso puede ser, y de preferencia es, conducido en un solo receptáculo sin transferencia a receptáculos adicionales para pasos secuenciales . El receptáculo de preferencia se proporciona con equipo de mezclado para asegurar buen contacto entre el cultivo de ácido láctico, enzimas, y los materiales de sustrato y para mantener los sólidos en suspensión. Un tanque de
mezclado de superficie rasgada puede usarse. Un dispositivo de recirculación y homogeneización puede emplearse para impedir segregación de una fase grasosa de materiales acuosos y para ayudar a mantener los sólidos en suspensión. Agua se puede añadir durante la etapa de fermentación para mantener contenido de humedad y materiales ácidos o básicos pueden añadirse para ajustar el pH. La fermentación puede llevarse a cabo con recirculación usando una bomba de corte para impedir que la mezcla de reacción se vuelva anaerobia y para proporcionar buen mezclado . Para la etapa de fermentación, aditivos de concentrado de queso comunes y aditivos de procesamiento también pueden opcionalmente incluirse con el sustrato concentrado de leche en cantidades menores suficientes para sus funciones respectivas pretendidas, tales como sal, espesantes (v.gr., goma xantana) , emulsificantes , medios iniciadores complementarios para cultivos de queso (v.gr., hidrolizado de levadura), agentes anti-espuma (v.gr., Hodag FD-62 K que es un anti-espumante de emulsión de silicona 10% activo, Lambent Technologies Corp., Gurnee, Illinois, Estados Unidos), y así sucesivamente. Lipasa (en ocasiones referida como una esterasa) es una enzima que es bien conocida en la materia. Lipasas típicamente se derivan de los tejidos del esófago de animales jóvenes (becerros, chivos, o corderos) , del páncreas de animales adultos, o de fuentes microbianas. Varias preparaciones comerciales derivadas de tejido
del esófago están disponibles de SKW Biolndustries , Marschall Laboratory, u otras tales compañías bajo varios nombres comerciales. La enzima puede fabricarse mediante moler el esófago comestible con sal y leche seca descremada, secar la mezcla, y moler de nuevo. Fuentes microbianas de lipasa son, por ejemplo, los hongos Candida cylindracea Tipo VII, Aspergillus oryzae, A. niger, Pencillium roqueforti , P. glaucum, y Rhizopus oryzae. Una mezcla de enzimas lipasa y proteasa también se puede obtener comercialmente en forma pre-mezclada, tal com enzima R2 de SKW Biolndustries. Una lipasa de hongo adecuada está disponible comercialmente de Biocatalysis bajo el nombre comercial Lipomod 187. Una lipasa en polvo (de preferencia lipasa de hongo) generalmente se puede usar en un nivel de alrededor de 0.05 a alrededor de 0.4 porciento. Como otra opción para la Etapa 1 de procesamiento, el pH del sustrato se puede reducir previo a la fermentación a un rango adecuado para desarrollo de sabor por la adición de ácido láctico libre solo o en combinación con otros ácidos comestibles (v.gr., HC1 , ácido acético, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido fosfórico, y sus mezclas) , y luego la fermentación se lleva a cabo. Otras enzimas, cultivos, adjuntos, y otros aditivos específicos pueden proporcionarse para la Etapa 1 de procesamiento para alentar a la preparación de un bloque de sabor objetivo, tales bloques correspondientes a un componente "sulfuroso-cheddar" , un componente "similar a queso", o un componente
"cremoso-mantequilloso" , tal como se describe en las patentes US 6,406,724 y 6,562,383, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Como se indica anteriormente, catalasa opcionalmente puede añadirse durante la segunda etapa de procesamiento para promover liberación de oxígeno del sub-producto de peróxido de hidrógeno de la transformación de aminoácidos en a-ceto ácidos. También indicado anteriormente, aminotransferasa o células o extractos de células libres de organismos produciendo altos niveles de aminotransferasa también pueden opcionalmente añadirse durante la segunda etapa de procesamiento anteriormente indicada para promover adicionalmente la interconversion de aminoácidos y ceto ácidos para generar un rango de ceto ácidos usando ceto ácidos generados por aminoácido oxidasa como aceptadores de grupo amino . Sin embargo, como se indica, el uso adicional opcional de aminotransferasa generalmente requiere la presencia de un aceptador de grupo amino, tal como a-ceto glutatarato. El producto concentrado de queso cultivado obtenido a partir del proceso descrito anteriormente en la presente generalmente tiene una consistencia líquida o pastosa. La forma de pasta se caracteriza por una masa viscosa teniendo consistencia susceptible de untarse. La forma líquida o de pasta del concentrado de queso cultivado puede, si se desea, secarse por rocío para formar una forma en polvo de la misma. Las formas de líquido/pasta o polvo de los mismos son materiales de sabor de
queso listos para usarse, que pueden usarse en productos alimenticios para adición de sabor, mejora de sabor, y como un sustituto para sus ingredientes de queso natural . Coagulantes de queso, tales como cuajo o agentes de solidificación de sal de tierra alcalina comúnmente usados en la fabricación de queso, no se requieren. No hay paso de drenado de suero usado o necesario después de la fermentación. Además, no hay bloques de queso que se necesiten formar o curar/añejar por periodos de tiempo largos para desarrollar un perfil de sabor de queso útil en el producto CCC obtenido. El concentrado de queso cultivado no necesita molerse, rebanarse, cortarse, limpiarse, o similares, antes de usarse como un aditivo de sabor de queso. Los productos de composición de sabor de queso obtenidos por los procesos personificados por esta invención tienen muchos usos potenciales, especialmente en productos alimenticios. Por ejemplo, el concentrado de queso cultivado puede incorporarse hacia alimentos a granel, tales como quesos procesados, composiciones para untar de queso, quesos naturales, análogos de queso, quesos cot age, quesos crema, polvos de queso, sazonadores, salsas de queso, saborizantes de queso para botanas, mejoradores, aderezos, alimentos de botana (v.gr., hojuelas de botana, rellenos de queso para alimentos de botana) , y similares, para impartir o intensificar un sabor de queso en ellos. El concentrado de queso cultivado puede incorporarse hacia una base de queso, una formulación alimenticia, y/o puede llenarse hacia
o aplicarse sobre productos alimenticios, en formas de pasta o de polvo del mismo. Se puede usar como un sustituto para ingredientes de queso naturales que de otra manera se pretenden usar en tales productos alimenticios. En fabricación de queso procesado y composiciones para untar de queso, el concentrado de queso cultivado puede usarse para reducir requerimientos de queso duro naturales sin impactar de manera adversa la facilidad de procesamiento del producto, funcionalidad, o los atributos organolépticos deseados del producto. La reducción de las cantidades de queso natural en particular y niveles de materia seca de una formulación de queso procesado o de composición para untar de queso lograda mediante uso de los concentrados de queso cultivado presentes como un sustituto para alguna porción de las mismas puede llevar a ahorros de costo significativos. Los concentrados de queso cultivado también se producen en formas listas para usarse mucho mas rápidamente que los quesos naturales que requieren periodos de curado largos. También, operaciones de manejo normales para quesos naturales (v.gr., almacenamiento a granel frío, limpieza, molienda, y similares) se reducen o eliminan mediante usar los concentrados de queso cultivado de esta invención según se sustituyen por al menos una porción de las mismas. La composición de sabor de queso también se puede usar como un concentrado de queso cultivado incorporado en un sustrato de leche o sustrato de suero a partir del cual queso natural o un
análogo de queso se produce. Por ejemplo, los concentrados de queso cultivados pueden añadirse como un agente de saborización a un sustrato de leche usado para producir queso natural, donde el sustrato de leche entonces es tratado de manera generalmente acostumbrada para producir el queso "natural" saborizado deseado. Según se indica, bloques de construcción de sabor de queso también se pueden preparar usando los principios de esta invención, los cuales se pueden combinar con otros bloques en forma modular para desarrollar un perfil de sabor deseado. La cantidad total de concentrado de queso cultivado incorporado puede variarse para lograr combinaciones de sabor o notas de sabor particulares dependiendo de las características de sabor deseadas . Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Las partes y los porcentajes se dan por peso a menos que se indique de otra manera. Todas las patentes y publicaciones citadas en la presente incorporan en la presente por referencia. Ej emplos Control : Generación de Ceto Ácidos Usando Aminoácido Oxidasa en Solución Amortiguada. Un experimento de control se condujo en el cual la generación de ceto ácidos en una solución amortiguada se investigó por reacción de aminoácidos libres selectos y enzimas de aminoácido oxidasa. La solución amortiguada estuvo libre de un sustrato lácteo y microorganismos de queso . La
mezcla de reacción contuvo una solución de aminoácidos, aminoácido oxidasa, y catalasa (la cual reaccionó con el sub-producto de peróxido de hidrógeno de la reacción) . Los siguientes aminoácidos se añadieron como reactivos ácidos libres: D-alanina, D-valina, D-ácido glutámico, L-isoleucina y D,L-leucina. Cada aminoácido se añadió en una concentración de 10 mM en un amortiguador de fosfato (100 mM, pH 8.0) , y 8 unidades/mL de cada una de L- y D-aminoácido oxidasa (Sigma Chemicals, Saint Louis, Missouri, Estados Unidos) y 32 mg/mL de catalasa (Novozymes) , se añadieron a un volumen de reacción de 5 mL. La muestra se incubó a 37°C por 2 horas con aireación. Los productos de reacción se analizaron mediante electroforésis capilar electrocinética micelar para detectar la presencia y respuesta analítica característica de los varios productos de a-ceto ácidos. Experimentos comparativos adicionales se condujeron los cuales indicaron que la reacción en el control se pudo llevar a cabo en ausencia de catalasa, bajo condiciones de reacción de otra forma similares. Sin embargo, según se compara con un experimento separado conducido sin catalasa, la eficiencia de reacción se incrementó cuando la catalasa se incluyó en el experimento de control . La reacción de oxidación también se pudo conducir exitosamente sin la presencia de H202 pero a menores eficiencias; oxigeno también se pudo suministrar usando aire, aire enriquecido con oxigeno, u oxígeno.
Ejemplo 1: Generación de Ceto Ácidos Usando Aminoácido Oxidasa en Sustrato Lácteo . En este experimento aminoácido oxidasa se evaluó para la generación de ceto ácidos en un sustrato lácteo, particularmente concentrado de leche 5X. Como el sustrato lácteo, leche entera se sujetó a técnicas de ultrafil-tración/diafiltración convencionales para producir un producto concentrado de leche aproximadamente 5X. El sustrato lácteo se complementó con aminoácidos libres añadidos por separado, pues la generación in situ de niveles bajos de aminoácidos libres se esperaba ya que el concentrado de leche no fue cultivado con ácido láctico o tratado con proteasas/peptidasas . Los tipos y cantidades de aminoácidos añadidos fueron idénticos a aquellos en el sistema amortiguador del control descrito anteriormente. Todas las otras condiciones experimentales de reactivos y síntesis fueron las mismas como en el experimento de control . La mezcla de reacción bio-generada obtenida se analizó mediante electroforésis capilar electrocinética micelar. La presencia de los siguientes a-ceto ácidos se detectó en la mezcla de reacción; ácido a-ceto pirúvico, ácido a-ceto isocaproico, ácido a-ceto valérico, y ácido a-ceto isovalérico. Datos sensoriales en el impacto de sabor se recolectaron por la adición de a-ceto ácidos sintetizados químicamente de los tipos identificados anteriormente (0.1 porciento cada uno) a matriz de concentrado de queso cultivado ante lo cual un incremento en la percepción de sabor similar a queso se notó
mediante pruebas de gusto. Estos experimentos demostraron que los aminoácidos se pueden convertir a sus ceto ácidos respectivos con enzima aminoácido oxidasa en tanto sustrato lácteo (concentrado de leche 5X) y sistemas amortiguados. Ejemplo 2: Evaluación de aminoácido oxidasa en EMFC. La base de queso consistió de polvos de leche secos, crema, grasa de mantequilla, sal, ácido láctico y agua. Una mezcla de enzima comprendiendo proteasa microbiana, lipasa microbiana y peptidasa se añadieron (proteasa bacteriana neutra, Promod 215, Enzobact, Lipomod 187) . La mezcla de queso resultante se inoculó con los siguientes cultivos; Lactococcus lactis spp . lactis, Lactococcus lactis spp. crémoris, y Lactococcus helveticus se añadieron a 0.01% cada uno. -Ceto ácidos se añadieron cada uno a una tasa de 0.1%, estos ceto ácidos comprendieron -ceto isocaproato, a-ceto glutarato y a-ceto glutarato mas leucina. Cada uno de estos ceto ácidos se añadieron para separar lotes de queso para evaluar el impacto de los ceto ácidos individualmente. Los lotes de queso se incubaron a 32°C por 48 horas a un pH final de alrededor de 5.2. Las muestras de queso se trataron con calor para desactivar los cultivos y enzimas y entregados para análisis de sabor mediante GC-MS y GC-olfatometría . Ejemplo 3: Experimentos conducidos para investigar el impacto de suplementar a-ceto glutarato, y a-ceto glutarato junto con leucina durante fermentación en leche 5X. Leche UF DF 5X se
fermentó usando una inoculación al 0.01% de cultivo R607. Los siguientes se añadieron a la fermentación después de 14 horas de incubación a 30°C, 0.02% de Promod, 0.02% de Enzobact, 0.02% de Proteasa Bacteriana Neutra, 0.02% de Lipomod. Muestras experimentales conteniendo (a) 0.2% de a-ceto glutarato, (b) 0.2% de ácido cx-ceto isocaproico, y (c) 0.2% de a-ceto glutarato mas 0.2% de leucina. Las muestras de control no contuvieron ninguna adición de aminoácidos libres o ceto ácidos . Muestras se incubaron a 30°C por 48 horas. Las muestras se trataron con calor a 63 °C por 30 minutos para desactivar las enzimas. Cada una de las muestras de evaluó organolépticamente para sabor. Muestras experimentales (a) y (c) se evaluaron teniendo sabor mas parecido a queso comparadas con la muestra de control. La muestra (b) se juzgó siendo mas verde, similar a nueces, similar a malta, y similar a chocolate. Aunque la invención se ha descrito particularmente con referencia específica a formas de realización de proceso y producto particulares, se apreciará que varias alteraciones, modificaciones y adaptaciones se pueden basar en la presente divulgación, y pretenden estar dentro del espíritu y alcance de la presente invención según se define por las reivindicaciones siguientes .