MXPA06013277A - Vector hibrido adenovirus-alfavirus para la administracion eficaz y expresion de genes terapeuticos en celulas tumorales. - Google Patents

Vector hibrido adenovirus-alfavirus para la administracion eficaz y expresion de genes terapeuticos en celulas tumorales.

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Abstract

La presente invencion se refiere a un vector hibrido adenoviral de expresion genica caracterizado porque comprende, orientados en direccion 5 degree a 3 degree , al menos los siguientes elementos: i. una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia senal para el empaquetamiento del adenovirus; ii. una primera secuencia no codificante de relleno; iii. una secuencia correspondiente a un promotor especifico de tejido; iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de al menos un gen exogeno de interes, v. una secuencia de poliadenilacion, y vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral; preferentemente se refiere a un vector hibrido adenoviral que comprende como gen exogeno de interes el gen terapeutico interleucina de mamifero IL-12, y mas preferentemente aun, interleucina humana hIL-12; asi como al uso del vector hibrido en un procedimiento para transferir material genetico a una celula, especialmente una celula tumoral y preferentemente que expresa AFP, y a su uso para inducir una respuesta inmune contra antigenos extranos.

Description

VECTOR HÍBRIDO ADENOVIRUS-ALFAVIRUS PARA LA ADMINISTRACIÓN EFICAZ Y EXPRESIÓN DE GENES TERAPÉUTICOS EN CÉLULAS TUMORALES CAMPO LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vectores de expresión génica derivados de adenovirus, para la obtención de productos terapéuticos . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Uno de los principales problemas de la terapia convencional del cáncer es la falta de especificidad tumoral, lo que causa con frecuencia serios efectos secundarios y limita la dosis terapéutica. Aunque la terapia génica se mantiene como una promesa de gran potencial para la terapia del cáncer, también se enfrenta a un problema específico: dirigir la expresión transgénica al sitio del tumor. Varios estudios sugieren que cuando los vectores virales se administran de manera intralesional, aunque la expresión transgénica está esencialmente confinada a un área adyacente al tracto de la aguja, también puede ocurrir en otros tejidos. Por lo tanto un objetivo importante en la terapia génica del cáncer es dirigir la expresión de los genes terapéuticos a los tumores a través de la administración específica al tejido neoplásico ("objetivo tejido") y/o activación específica ("objetivo transcripcional") en el tejido neoplásico, sin afectar a las células sanas. El REF.: 177704 "objetivo tejido" se puede conseguir creando un vector dirigido mediante modificaciones de las interacciones receptor-ligando, permitiendo la infección de las células que expresan un receptor específico. El objetivo transcripcional se puede conseguir usando un promotor específico de tumor para controlar la expresión transgénica. Se han usado en estudios previos, distintos promotores específicos de tumores. Sin embargo tienen una limitación esencial, qué es que no conducen a un nivel elevado de expresión génica, y por tanto limitan la actividad antitumoral. Una revisión de los últimos avances en el desarrollo de vectores virales para terapia génica se puede encontrar en Lundstrom K. "Latest development in viral vectors for gene therapy"; Trends in Biotechnology, 2003 , 21 : 118-122. Entre los vectores virales usados en la actualidad se encuentran los alfavirus. Los alfavirus son virus envueltos que contienen una molécula de una hebra simple de ARN positiva, como genoma. Se han diseñado y construido vectores de expresión derivados de los alfavirus Sindbis Virus (SIN) , Semliki Forest Virus (SFV) , y virus de encefalitis equina de Venezuela (VEE) . Los vectores de alfavirus están basados en el uso de moléculas de ARN autoreplicativas derivadas de genomas de alfavirus, en las que las secuencias 51 y 31 necesarias para la replicación y el gen de la replicasa (Rep) se han mantenido, mientras que se han suprimido los genes que codifican para las proteínas virales estructurales y se han sustituido por un transgen. Después de la transfección de estos vectores en una célula, Rep será traducida y copiará el vector ARN en una hebra de ARN negativo, que será usada como molde para la amplificación del vector de ARN. Rep también puede reconocer un promotor subgenómico en la hebra de ARN negativo, de la cual hará un ARN subgenómico más pequeño, que puede ser traducido para producir proteínas heterólogas a niveles elevados . Los vectores de alfavirus se pueden usar directamente como ARN cuando son transcritos in vi tro a partir de un promotor procariótico, tal como SP6 o T7 , o bien como ADN cuando la secuencia del replicón se coloca bajo un promotor eucariótico tal como CMV. El vector de ARN puede ser empaquetado en partículas virales por cotransfección del mismo en células, junto con uno o más ARNs "ayudantes" que codifican para las proteínas estructurales virales. Los vectores de alfavirus tienen varias propiedades que los hacen atractivos para la terapia génica: un tropismo muy amplio, baja inmunogenicidad y un alto nivel de expresión de proteínas heterólogas. Esta expresión es, sin embargo, transitoria debido a la inducción de apoptosis en las células cuando tiene lugar la replicación. En el documento: Rayner J.O., Dryga S.A., Kamrud K.I. "Alphavirus vectors and vaccination" ; Rev. Med. Virol . 2002; 12 279-296, se describe el desarrollo de vectores de expresión basados en alfavirus para su uso en el campo de las vacunas. Otro tipo de vectores virales son los basados en adenovirus. Existe amplia bibliografía sobre el uso de adenovirus, que se han desarrollado para superar algunos de los inconvenientes de la terapia génica y como fuente para crear vectores de expresión. Un documento que recoge los últimos avances en vectores adenovirales es: Volpers C, Kochanek S. "Adenoviral vectors for gene transfer and therapy11; J Gene . Med. 2004 ; 6 : S164 -S171 . Los adenovirus tienen la ventaja de poseer una alta eficacia de transducción y capacidad de persistir en forma episomal . Sin embargo, la expresión de proteínas adenovirales induce fuertes respuestas inmunes, que limitan la duración de la expresión del transgén y causan toxicidad a las células infectadas por el vector. Se han desarrollado adenovirus vacíos para superar estos problemas . Dichos adenovirus vacíos están desprovistos de todos los genes adenovirales (las únicas secuencias conservadas son las dos secuencias terminales repetidas invertidas y las señales de empaquetamiento) , y por lo tanto, las células transducidas no expresan ningún producto adenoviral y no provocan una respuesta inmune contra el vector. En suma, la eliminación de todos los genes adenovirales deja suficiente sitio para alojar grandes casetes de expresión y es por ello, por lo que a los adenovirus vacíos se les llama también vectores adenovirales de alta capacidad. Un documento que describe aspectos concretos de los vectores adenovirales, relacionados con la supresión de todas las secuencias codificantes de proteínas virales es el trabajo de Morsy MA et al. "An adenoviral vector deleted for all viral coding sequences results in enhanced safety and extended expression of a leptin transgene"; Proc . Nati . Acad. Sci . USA 1998, 95 : 7866- 7871 . El documento Schiedner G et al. "Variables Affecting In Vivo Performance of High-Capacity Adenovirus Vectors"; ". Virol . 2002, 76: 1600-1609 describe el uso de ADN de relleno en los vectores de expresión basados en adenovirus vacíos, mostrando que la presencia de dicho ADN de relleno es esencial para conseguir un incremento considerable de la expresión génica; y en general, que el diseño de vectores basados en adenovirus de alta capacidad (vacíos) puede variar sustancialmente el grado de expresión y la duración de la expresión de un gen. Por otra parte el documento US-5,981,225 describe un vector para transferencia de genes basado en adenovirus, que comprende secuencias terminales invertidas repetidas (ITR) , al menos una secuencia de señal de empaquetamiento y un gen adenoviral VAII y/o un gen adenoviral VAII; y comprende un gen extraño al adenovirus operativamente unido a un promotor funcional en células diana para adenovirus . El documento US-5, 985, 84.6 describe un vector de transferencia génica que comprende secuencias terminales invertidas repetidas (ITR) de adenovirus y partículas recombinantes de adenovirus que contienen dichas secuencias.
El documento US-6,566,093 describe vectores de ADNc derivado de alfavirus que consisten en ADN complementario de al menos parte del ARN de un alfavirus, esencial para la replicación del alfavirus, y ADNc heterólogo, por ejemplo, ADNc que codifica una sustancia deseada. Dicha sustancia deseada puede ser una proteína o polipéptido biológicamente activo, así como una proteína o polipéptido inmunogénico o antigénico, o una proteína o polipéptido terapéuticamente activo, o un RNA terapéuticamente activo. El objetivo de la presente invención es mejorar la expresión transgénica y la inducción de apoptosis en células tumorales mediada por vectores híbridos in vi tro e in vivo . Un objetivo adicional es mejorar la eficacia de la terapia de tumores en modelos animales mediante vectores híbridos. Un objetivo adicional es además conseguir un método de terapia génica, en particular para el tratamiento del cáncer, mediante el uso de vectores híbridos . Los objetivos de la presente invención se consiguen combinando en un único vector: - una elevada capacidad de infección, por medio del uso de un sistema de liberación de adenovirus, - un nivel elevado de expresión transgénica y la inducción de apoptosis, mediante el uso de un vector derivado de un alfavirus, tal como el SFV, y - una especificidad tumoral mediante el uso de un promotor específico de tumores. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en primer lugar a un vector híbrido adenoviral de expresión génica caracterizado porque comprende, orientados en dirección 5' a 3', al menos los siguientes elementos: i . una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus; ii. una primera secuencia no codificante de relleno; iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido; iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de un gen exógeno de interés; v. una secuencia de poliadenilación, y vi . una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral. De manera más específica, la presente invención se refiere a la construcción de un vector híbrido adenoviral, que comprende como elemento iv una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, que es la secuencia de un replicón recombinante de SFV, bajo el control transcripcional de un promotor específico de tumor (elemento iii.), que es el promotor de alfa-fetoproteína, AFP. En este constructo, un transgén puede ser insertado en el replicón de SFV, dirigido por el promotor subgenómico de SFV. Después de la infección de las células tumorales con este vector híbrido, el ARNm del replicón de SFV es transcrito a partir del promotor específico de tumor, y las proteínas no estructurales - nsPs - que constituyen el gen de la replicasa del SFV son traducidas a partir de dicho ARNm del replicón de SFV. Dichas proteínas nsPs - replicasa viral - inician la replicación del ARNm del replicón de SFV, para generar el ARN subgenómico de SFV. Consecuentemente, el transgén puede ser expresado a un nivel elevado a partir del ARN subgenómico de SFV. Todo este proceso de replicación viral dará lugar a la producción de apoptosis en las células infectadas. En el caso de que este híbrido infecte células no tumorales, el ARNm del replicón de SFV no será transcrito a partir del promotor específico de tumor, el cual no será activo en estas células. Por lo tanto no se producirá expresión del transgén, y no se producirá apoptosis en células normales infectadas por el vector híbrido. Además, la presente invención se refiere a un método para obtener dicho vector híbrido adenoviral, que comprende ensamblar mediante técnicas de ingeniería genética los elementos i. a vi . del vector híbrido adenoviral definido anteriormente . La presente invención se refiere también al uso de dicho vector híbrido para transferir material genético a una célula, y más particularmente para introducir y expresar genes extraños en células eucarióticas que puedan ser células diana para adenovirus . De manera preferida la transferencia de material genético tiene como consecuencia la inducción de una respuesta inmune contra antígenos extraños en dicha célula. La presente invención se refiere también a una composición farmacéutica que comprende dicho vector híbrido adenovirus-alfavirus y su uso en el tratamiento terapéutico del cáncer, que comprende administrar a un sujeto dicha composición farmacéutica. La presente invención se refiere también a un método de tratamiento del cáncer mediante el uso del vector híbrido definido anteriormente, que comprende administrar a un sujeto dicho vector híbrido. La presente invención se refiere a un vector híbrido adenoviral de expresión génica caracterizado porque comprende, orientados en dirección 5' a 3', al menos los siguientes elementos i . una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus ; ii. una primera secuencia no codificante de relleno; iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido; iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de un gen exógeno de interés; v. una secuencia de poliadenilación, y vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral. La naturaleza del elemento i. en el vector híbrido alfavirus-adenovirus de la presente invención, es decir, la naturaleza de la cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento (?) del adenovirus, no es un aspecto crítico para la presente invención y puede proceder de cualquier serotipo de adenovirus. Dichos serotipos son bien conocidos en la técnica e incluyen por ejemplo Adl2 (subgénero A) , Ad3 y Ad7 (subgénero B) , Ad2 y Ad5 (subgénero C) , Ad8 (subgénero D) , Ad4 (subgénero E) , Ad40 (subgénero F) , y otros adenovirus no humanos conocidos que pueden proceder de especies como cerdo, ovejas, vacas y aves. Por lo tanto dicha primera secuencia terminal invertida repetida que puede contener aproximadamente entre 100 y 500 bp en longitud, puede variar según el serotipo de adenovirus utilizado. Del mismo modo, la secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus puede variar según el serotipo de adenovirus utilizado. Según una realización particular preferida dicho vector adenoviral de expresión génica comprende un elemento i. que tiene la SEQ ID No 1, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 1 para realizar la misma función. La naturaleza del elemento ii. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. Dicho elemento ii . , que tiene como función aumentar el tamaño total del constructo, puede ser cualquier secuencia no codificante de relleno. Preferentemente dicha secuencia es una secuencia no codificante humana. De manera más preferida aún dicha secuencia no codificante de relleno es la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana HPRT. De manera preferente el vector híbrido adenoviral definido comprende además un elemento vii. que es una segunda secuencia no codificante de relleno, que se coloca entre el elemento v. y el elemento vi. definidos anteriormente. La naturaleza del elemento iii. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. De manera preferida el promotor específico de tejido iii. es un promotor específico de tumores. Como ejemplos se pueden citar como promotor específico de tumores, los promotores AFP, telomerasa TERT, PAP ("pancreatic associated protein"), E2F y HIF. Según una realización particular preferida de la invención, el promotor específico de tumores tiene la secuencia SEQ ID No 7, que corresponde al promotor/potenciador AFP, (AFP p+e) o la secuencia SEQ ID No.15 correspondiente a telomerasa TERT, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con la secuencia SEQ ID No 7 o con la secuencia SEQ ID No.15, para realizar la misma función, respectivamente. La naturaleza del elemento iv. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. Preferentemente las secuencias alfavirales del elemento iv. se derivan del virus Semliki Forest (SFV) . Sin embargo se podrían usar otras secuencias alfavirales derivadas de cualquiera de las especies pertenecientes a la familia Togaviridae, por ejemplo SIN, RRV y VEE. Dicha cadena iv de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral comprende preferentemente, además de una secuencia codificante de al menos un gen exógeno de interés : a) una secuencia 5' necesaria para la replicación del alfavirus, b) una secuencia codificante de las proteínas no estructurales necesarias para la replicación del ARN alfaviral, c) al menos un promotor subgenómico del alfavirus, y d) una secuencia 3' necesaria para la replicación del alfavirus; De manera preferida el elemento iv. forma un replicón funcionalmente controlado por el promotor iii., y donde a su vez el promotor subgenómico alfaviral comprendido en iv.c) controla funcionalmente la expresión del gen exógeno de interés . Según una realización particular especialmente preferida, las secuencias a) a c) del elemento iv. en su conjunto, tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID No. 3 (SFV 5'-rep-Psg) o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 3 para realizar la misma función, y SEQ ID No. 4 (SFV 5 ' -rep-Psg-enh) o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 4 para realizar la misma función. Según una realización particular especialmente preferida, el elemento iv.d) tiene la secuencia SEQ ID No. 5 (SFV31), o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 5 para realizar la misma función. En el elemento iv. del vector híbrido alfavirus-adenovirus de la presente invención, el gen exógeno de interés es preferentemente un gen terapéutico o un gen reportero, o una combinación de ambos. Sin que deba considerarse limitante, el gen terapéutico se selecciona preferentemente entre interleucina de mamífero - IL-12 -, el factor estimulante de colonias GMCSF, interferón alfa y timidin-kinasa del virus herpes simple (tk) . El gen exógeno de interés en el elemento iv. puede ser además un gen reportero. Sin que deba considerarse limitante, el gen reportero puede ser uno seleccionado entre el LacZ, Luciferasa, tk y GFP . De manera especialmente preferida el gen terapéutico es interleucina de mamífero IL-12 -, de forma más preferente aún el gen terapéutico es interleucina humana, hIL-12. El vector híbrido adenoviral de expresión génica puede incluir en el elemento iv en serie uno o varios subconjuntos de (promotor subgenómico + gen exógeno de interés) . La naturaleza del elemento v. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. De manera preferida el elemento v. es una secuencia de poliadenilación de SV40. De manera especialmente preferida dicha secuencia de poliadenilación de SV40 es la secuencia SEQ ID No. 6, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con la secuencia SEQ ID No . 6 para realizar la misma función.
La naturaleza del elemento vi. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención, no es un aspecto crítico de la misma. Según una realización preferida dicho vector adenoviral de expresión génica comprende una secuencia terminal invertida repetida como elemento vi . que tiene la secuencia SEQ ID No 2, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 2 para poder realizar la misma función. La naturaleza del elemento vii. en el vector híbrido adenoviral de la presente invención no es un aspecto crítico de la misma. La segunda secuencia no codificante de relleno puede ser cualquiera. Preferentemente es una secuencia no codificante humana, y de manera especialmente preferida es una secuencia procedente del cósmido humano C346. El vector híbrido adenoviral de expresión génica de la presente invención puede tener una longitud variable, y tiene preferentemente una longitud comprendida entre 27 y 38 kilobases . Según una realización particular preferida el vector híbrido adenoviral comprende ITR 5', como primera secuencia terminal invertida repetida; HPRT, región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana como primera secuencia de relleno; AFP (p+e) , promotor específico de tumores; una secuencia replicón de SFV que contiene mlL-12, interleucina-12 de ratón; SV40 PoliA, secuencia de poliadenilación de SV40; C346, cósmido C346 genómico humano como segunda secuencia de relleno, y ITR 3' como segunda secuencia terminal invertida repetida. Según una realización particular adicional preferida el vector híbrido adenoviral comprende ITR 5' como primera secuencia terminal invertida repetida; HPRT, región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana como primera secuencia de relleno; AFP (p+e) , promotor específico de tumores; una secuencia replicón de SFV que contiene LacZ; SV40 PoliA, secuencia de poliadenilación de SV40; C346, cósmido C346 genómico humano como segunda secuencia de relleno, y ITR 3' como segunda secuencia terminal invertida repetida. Según una realización adicional particularmente preferida el vector híbrido adenoviral comprende ITR 5' como primera secuencia terminal invertida repetida; HPRT, región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana como primera secuencia de relleno; AFP (p+e) , promotor específico de tumores; una secuencia replicón de SFV que contiene hIL-12, interleucina-12 humana; SV40 PoliA, secuencia de poliadenilación de SV40; C346, cósmido C346 genómico humano como segunda secuencia de relleno, y ITR 3 ' como segunda secuencia terminal invertida repetida. Según una realización particular preferida de la presente invención, el vector híbrido adenoviral de expresión génica tiene la secuencia SEQ ID No 8, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 8 para realizar la misma función. Según una realización particular adicional preferida de la presente invención, el vector híbrido adenoviral de expresión génica tiene la secuencia SEQ ID No 9, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 9 para realizar la misma función. Según una realización particular adicional preferida de la presente invención el vector híbrido adenoviral de expresión génica tiene la secuencia SEQ ID No 10, o cualquier otra secuencia con suficiente homología con SEQ ID No. 10 para realizar la misma función. Además la presente invención se refiere a un método para obtener dicho vector híbrido adenoviral, que comprende ensamblar mediante técnicas de ingeniería genética los elementos i. a vi., o i. a vii., del vector híbrido adenoviral definido anteriormente. La presente invención se refiere también al uso de dicho vector híbrido para transferir material genético a una célula, y más particularmente para introducir y expresar genes extraños en células eucarióticas que puedan ser células diana para adenovirus . Dicho uso comprende administrar a un sujeto dicho vector híbrido. La infección de células tumorales con un vector híbrido adenoviral según la invención, tiene como consecuencia que el ARNm del replicón del alfavirus SFV sea transcrito a partir del promotor específico de tumor, con lo que se traducirá el gen Rep y se amplificará el ARN de SFV. Rep también producirá un ARN subgenómico de SFV, a partir del cual será expresado el gen terapéutico o reportero en niveles elevados . El producto del gen terapéutico secretado por las células infectadas activará los inmunocitos en el sitio de infección. Además, la replicación de SFV inducirá apoptosis en las células infectadas, conduciendo a la liberación de antígenos de tumor por las células apoptóticas, que pueden ser tomados por células presentadoras de antigenos (APCs) , activando de este modo la respuesta inmune contra el tumor. Sin embargo, si este vector híbrido infecta células no-tumorales, el ARNm del replicón SFV no será transcrito y por tanto no habrá expresión transgénica y no se producirá apoptosis. De manera preferida las células tumorales se infectan con un vector híbrido adenoviral según la invención, de modo que el ARNm del replicón de SFV sea transcrito a partir del promotor específico de tumor AFP, con lo que se traducirá el gen Rep y se amplificará el ARN de SFV. Rep también producirá un ARN subgenómico de SFV, a partir del cual será expresado mIL-12 o hIL-12 a niveles elevados. mIL-12 o hIL-12 secretadas por células infectadas activarán los inmunocitos en el sitio de infección. Además, la replicación de SFV inducirá apoptosis en las células infectadas, conduciendo a la liberación de antígenos de tumor por las células apoptóticas, que pueden ser tomados por células presentadoras de antígenos, APCs, activando de este modo la respuesta inmune contra el tumor. Sin embargo, si este vector híbrido infecta células no tumorales, el ARNm del replicón de SFV no será transcrito y por tanto no habrá expresión transgénica y no se producirá apoptosis . La presente invención tiene como objeto adicional el uso de un vector híbrido adenoviral definido anteriormente en un procedimiento para transferir material genético a una célula, preferentemente, una célula tumoral, y que comprende administrar a un sujeto dicho vector híbrido. De modo más preferido aún dicha célula es una célula tumoral que expresa AFP. Además, la presente invención también tiene como objeto el uso de un vector híbrido adenoviral definido para preparar un medicamento eficaz en el tratamiento de tumores, así como su uso para inducir una respuesta inmune contra antígenos extraños. Dicho uso comprende administrar a un sujeto dicho medicamento. Además, la presente invención también tiene como objeto adicional una composición farmacéutica, que comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido según la presente invención y el uso de la misma en un procedimiento para el tratamiento de tumores, o para inducir una respuesta inmune frente a antígenos extraños. De manera especialmente preferida dicha composición farmacéutica comprende un vector híbrido adenoviral según la presente invención, en el que el gen exógeno de interés es la interleucina de mamífero, IL-12, preferentemente interleucina humana hIL-12. Dicho uso comprende administrar a un sujeto la composición farmacéutica que comprende dicho vector híbrido. La presente invención se refiere también a un método de tratamiento del cáncer mediante el uso del vector híbrido de acuerdo con la presente invención, comprendiendo dicho método la administración a un sujeto de dicho vector híbrido. Por lo tanto según realizaciones preferidas de la presente invención, se ha elegido el AFP (p+e) como promotor específico de tumores, se han construido dos vectores híbridos adenovirales en los cuales el replicón SFV está controlado por el promotor AFP, y el gen reportero LacZ y el gen terapéutico IL-12 son insertados bajo el control del promotor subgenómico de SFV, respectivamente - Ad/AFP-SFV-LacZ y Ad/AFP-SFV-mIL-12 -, y como vectores control se han preparado dos vectores vacíos adenovirales que llevan LacZ y IL-12 de ratón directamente controlados por el promotor AFP -Ad/AFP-LacZ y Ad/AFP-mIL12- . Se ha mostrado que el vector híbrido de la presente invención funciona de manera más eficaz que los vectores control que se han venido utilizando hasta el momento. De acuerdo con la presente invención se ha mostrado que el vector Ad/AFP-SFV-mIL-12 puede ser un vector útil en terapia de tumores HCC (hepatocarcinoma) que expresan AFP. Se ha mostrado también que el uso de otros promotores de tumores como el promotor telomerasa - TERT - que es ampliamente activado en la mayor parte de los tumores malignos, para controlar SFV puede convertir el uso de un vector híbrido como el de la presente invención, en una estrategia general para el tratamiento de todo tipo de cáncer. Además, de manera ventajosa, el vector híbrido de la presente invención funciona específicamente con células tumorales y mata células tumorales sin necesidad de incorporar un gen terapéutico. Y adicionalmente, se muestra que ventajosamente, el vector híbrido de la presente invención cuando incluye un gen terapéutico como IL-12 induce una potente actividad antitumoral. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura ÍA. Diagrama de un vector híbrido según una realización de la invención, Ad-SFV, que contiene una secuencia de adenovirus vacío en la que se ha insertado un replicón SFV bajo el control del promotor/potenciador AFP (AFP (p+e), y que contiene el gen heterólogo mIL-12, el cual está colocado bajo el control del promotor subgenómico SFV (Pr sg) . Figura IB. Representación de la actividad antitumoral del vector híbrido, según la invención: después de infección de células tumorales de HCC con este vector híbrido (derecha) , gracias a la presencia en el vector híbrido del replicón de SFV que comprende mll-12, se producirá la expresión de mIL-12 a niveles elevados, lo cual activará los inmunocitos en el sitio de infección. Además, la replicación de SFV inducirá apoptosis en las células infectadas. Sin embargo, si este vector híbrido infecta células no tumorales, el ARNm del replicón SFV no será transcrito y por tanto no habrá expresión transgénica ni se producirá apoptosis. En esta figura: ITR, secuencias adenovirales terminales invertidas repetidas ; - ?, señal de empaquetamiento adenoviral; - HPRT y C346, secuencias de ADN de relleno procedentes de la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana o del cósmido humano C346, respectivamente; - PoliA, señal de poliadenilación (por ejemplo, de SV40) ; - APCs, células presentadoras de antígeno. Figura 2. Estructura de los vectores híbridos adenovirales vacíos y vectores adenovirales vacíos. AFP-SFV-lacZ y AFP-SFV-mIL-12 son vectores de adenovirus híbridos, en los que la secuencia del replicón de SFV está bajo control del promotor/potenciador AFP (AFP(p+e))y los genes heterólogos LacZ o mIL-12 han sido clonados bajo el control del promotor subgenómico de SFV (Pr sg) , respectivamente. AFP-lacZ y AFP-mIL-12 son vectores adenovirales que contienen LacZ o mIL-12 dirigidos directamente por AFP (p+e) . SFV nspl-4, proteínas no estructurales de SFV. Figuras 3A y 3B. Expresión específica de mIL-12 in vi tro en células de hepatocarcinoma que expresan AFP, HCC, (Figura 3A A) , y no derivadas de HCC (Figura 3B) después de la infección con los vectores híbridos de Ad-SFV: AFP-mIL-12 (AFP-12) , AFP-SFV-mIL-12 (AFP-SFV-12) o con el vector control AdCMVmIl-12 (CMV-12) . Se ensayaron diferentes multiplicidades de infección "moi" (10, 100 y 1000) . Hep3B, Huh-7, HepG2 y PLC/PRF/5: líneas de HCC; Hela, A549, MHC1, SK-Hep-1 y Clon 9: líneas no derivadas de HCC. En B solo se muestra la expresión correspondiente a moi 1000. Figura 4. Expresión específica de ß-gal en 4 líneas celulares de HCC (Hep3B, Huh-7, HepG2 y PLC/PRF/5) después de la infección in vitro con el vector híbrido AFP-SFV-lacZ o con el vector control AFP-LacZ a diferentes "moi" (10, 100, ó 1000) . Figuras 5A a 5F. Análisis de la expresión de ß-gal en líneas celulares de HCC infectadas con AFP-LacZ y AFP-SFV-LacZ. Microfotografías de células infectadas con AFP-LacZ (Figuras 5A-5C) o AFP-SFV-LacZ (D-F) y teñidas con X-Gal . Figuras 5A y 5D, Hep3B; Figuras 5B y 5E, Huh7 ; Figuras 5C y 5F, HepG2. Figuras 6A y 6B . Cinética de la expresión de IL-12 en líneas celulares de HCC Hep3B (Figura 6A) y Huh-7 (Figura 6B) , infectadas in vitro con vectores adenovirales AFP-mIL-12 (AFP-12) o AFP-SFV-mIL-12 (AFP-SFV-12) , a una "moi" de 1000.
Figuras 7A y 7B. Inducción de muerte celular después de la infección de líneas celulares de HCC - Hep3B (Figura 7A) y McA-RH7777 (Figura 7B) - in vitro con los vectores AFP-IL-12 (AFP-12), AFP-SFV-IL-12 (AFP-SFV-12) , AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ, o vector control Ad/CMVmIL-12 (CMV- 12) . La supervivencia celular se muestra como el porcentaje de células vivas en pocilios infectados, comparado con las células vivas en pocilios control no infectados. Figuras 8A - 8F. Expresión de SFV Rep en células HCC -Hep3B (Figuras 8A-8D) y Huh-7 (Figuras 8E y 8F) - después de infección con vectores AFP-mIL-12 (Figuras 8A y 8B) o AFP-SFV-mIL-12 (Figuras 8C-8F) , a "moi" de 1000. Dos días después de la infección las células fueron fijadas y analizadas por inmunofluorescencia con un anticuerpo específico para Rep. Las células que expresan Rep fueron visualizadas en un microscopio de fluorescencia con un filtro FITC (Figuras 8A, 8C, y 8E) mientras que los núcleos teñidos con DAPI en todas las células fueron visualizados con un filtro UV (Figuras 8B, 8D, y 8F) . Figuras 9A -9G. Transferencia génica con los vectores híbridos vacíos in vivo. (Figuras 9A-9D) , Eficiencia de la transferencia génica e inducción de apoptosis en tumores Huh-7. Tumores Huh-7 humanos establecidos en ratones inmunodeficientes "nude" fueron tratados por inyección intratumoral con los vectores de AFP-LacZ (n=4) , o AFP-SFV-LacZ (n=4) a lxlO10 partículas virales/animal. Tres días después de la administración del virus los ratones fueron sacrificados y secciones del tumor fueron analizadas para estudiar la expresión del transgén por tinción con X-Gal (A-B) o para estudiar la inducción de apoptosis mediante TÚNEL (Figuras 9C-9D) . Figuras 9A, 9C; Microfotografías de tumores que recibieron AFP-LacZ. Figuras 9B, 9D; Microfotografías de tumores que recibieron AFP-SFV-LacZ . (Figuras 9E-9G) , Especificidad de la expresión génica con los vectores híbridos vacíos. Ratones Balb/c sanos fueron inyectados por vía intravenosa con lxlO10 partículas virales de los vectores AFP-LacZ (Figura 9E) , AFP-SFV-LacZ (Figura 9F) o Ad/CMV-LacZ (Figura 9G) . Se muestran micrografías de cortes de tejido hepático tomados tres días tras la inoculación y teñidos con X-Gal. Figuras 10A - 10G. Tratamiento de tumores de HCC con vectores híbridos. Tumores HCC ortotópicos fueron establecidos mediante implantación de células McH-RH7777 en el hígado de rata. Cuando el tumor alcanzó un tamaño de 7-10 mm de diámetro, los animales fueron tratados con 1011 (Figuras 10A-10C) o con 2 xlO11 (Figuras 10D-10G) partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o solución salina como control. El tamaño del tumor fue medido a los días 15 y 30 después de la administración de solución salina (Figuras 10A y 10E) , AFP-mIL-12 (Figuras 10B y 10F) o AFP-SFV-mIL-12 (Figuras 10C y 10G) . Figura 10G; índice de supervivencia de animales. Figuraa HA y 11B. Estudio de toxicidad en ratas inoculadas con vectores que expresan IL-12. Se determinó el nivel de las transaminasas (GPT, GOLT, y GGTL) (Figura HA) o de IL-12 (Figura 11B) en el suero de ratas que portaban tumores HCC en hígado y que habían sido inoculadas intratumoralmente con los vectores de adenovirus AFP-SFV-IL-12, AFP-SFV-mIL-12, de alfavirus SFV-IL-12 o con suero salino. La medición se hizo a los 4 y 8 días tras el tratamiento. Figuras 12A - 12D. Tinción con hematoxilina/eosina de secciones hepáticas de ratas tratadas con los vectores híbridos adenovirales . Se trataron ratas portadoras de tumores de HCC mediante inyección intratumoral con suero salino (Figura 12A) , con los vectores adenovirales de AFP-IL-12 (Figura 12B) , o AFP-SFV-IL-12 (Figura 12C) , o con partículas virales de SFV-IL-12 (Figura 12D) . A los tres días tras el tratamiento se sacrificaron los animales, se extrajeron los hígados, se fijaron con formol y se obtuvieron secciones que se tiñeron con hematoxilina/eosina. Las flechas negras indican zonas con hepatocitos eosinófilos. Figuras 13A y 13B: mapas de restricción de los plásmidos pGL3/AFP y pBS/mIL-12 respectivamente. Figuras 14A y 14B: mapas de restricción de los plásmidos pTGC3001 y pTGC3011 respectivamente. Figuras 15A y 15B: mapas de restricción de los plásmidos pTGC3012 y pTGC3013 respectivamente. Figura 16: mapa de restricción del plásmido pTGC30l4. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Plásmidos pGEM-T "easy" y pCMVb fueron adquiridos de Promega, U.S.A y pBS-SK+ de Stratagene, U.S.A. pSTK120 fue donado por el Dr. Kochanek (Universidad de Ulm, Alemania) . pBK-SFV-1 y pBK-SFV-3 han sido descritos en Berglund P. et al. "Enhancing immune responses using suicidal DNA vaccines". Nature Biotechnology 1998, 16:562-565. pGL3/AFP y pBS/mIL-12 (Yonglian Sun, Cheng Qian, Dacheng Peng and Jesús Prieto. 2000. Gene transfer to liver cáncer cells of B7-1 in addition to IL-12 changes immunoeffector mechanisms and suppress Thl cytokine production induced by IL-12 alone. Human Gene Therapy 11:127-138) fueron producidos en nuestro laboratorio.
Para la construcción de pGL3/AFP, las regiones del promotor/potenciador de AFP (p+e) se obtuvieron mediante amplificación por PCR de ADN genómico humano. Los iniciadores ("primers") utilizados para la amplificación del promotor de AFP (AFP pro) fueron CTCTAGATTTTCTGCCCCAAAGAGCTC y CGGGATCCTGTTATTGGCAGTGGTGGA . Los iniciadores utilizados para la amplificación del potenciador de AFP (AFP "enhancer") fueron CGGAATTCGCCTGTCATACAGCTAATAA y CTCTAGACTGTCAAATAAGTGG CCTGG. Las secuencias del promotor (217 pares de bases) y del potenciador (785 pares de bases) se clonaron en plásmidos pGEM-T. Posteriormente se realizó una confirmación de los fragmentos amplificados mediante secuenciación. El promotor AFP se retiró del plásmido pGEM-T/AFP-p mediante restricción con Xba I/BamHI y se empalmó con extremos romos en un plásmido pGL3-basic digerido con S a I. De este modo se obtuvo un plásmido pGL3/AFP-p. El potenciador de AFP se retiró del plásmido pGEM-T/AFP-e mediante restricción con Xba I/Eco Rl y se empalmó con extremos romos en el plásmido pGL3/AFP-p digerido con Nhe I, para obtener finalmente el plásmido pGL3/AFP.
Líneas celulares y cultivos de tejidos Las líneas celulares de HCC humanos Hep3B, PLC/PRF/5, HepG2 y SK-Hep-1, la línea celular Hela de adenocarcinoma epitelial cervical humano, la línea celular A549 de carcinoma de pulmón humano, la línea celular 293 de riñon de embrión humano, las líneas celulares de HCC de rata McA-RH7777, MHC1, y el Clon 9 de hepatocito normal de rata y la línea celular de HCC de ratón Hepal-6, fueron obtenidas de la ATCC. Las células 293 que expresan Cre recombinasa (293Cre4) fueron obtenidas de Merck Research Laboratories. Las células Hep3B, PLC/PRF/5, Hela, SK-Hep-1, Clon 9, Huh-7 y Hepal-6 fueron crecidas en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% inactivado por calentamiento y penicilina/estreptomicina. Las células HepG2 y A549 fueron crecidas en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% inactivado por calentamiento y penicilina/estreptomicina. Las células McH-RH7777 y MHC1 fueron crecidas en medio DMEM suplementado con suero de caballo al 20% y FBS al 5% FBS. Las células 293Cre4 fueron crecidas en medio DMEM suplementado con FBS al 10% y 0.4 mg/ml de G418.
Animales Ratones hembras BALB/c inmunodeficientes "nude" de siete semanas de edad fueron adquiridos a Charles Rivers Laboratories (Barcelona, Spain) . Ratas Buffalo macho de 4-6 semanas fueron obtenidas de CIFA (Instalación de Animales de la Universidad de Navarra) . Ratones y ratas se mantuvieron en condiciones habituales en CIFA. Los ratones "nude" fueron alimentados con dieta irradiada y agua tratada en autoclave. La manipulación de los ratones "nude" se realizó siempre bajo en campana de flujo laminar. Todos los procedimientos con animales fueron realizados de acuerdo con protocolos y recomendaciones estandard para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Construcción de vectores Construcción de casetes de expresión AFP-SFV La secuencia 5' terminal de SFV (1-292 nt) fue amplificada por PCR usando el plásmido pBK-SFV-1 (que contiene la secuencia completa del replicón de SFV) como molde. El cebador 1 contenía un sitio de restricción Spe I en el extremo 5' terminal (subrayado) seguido de 50 nt de la secuencia del promotor de AFP y los primeros 20 nt de la secuencia de SFV (en cursiva) 5' -ACT AGT TAA CAG GCA TTG CCT GAA AAG AGT ATA AAA GAA TTTCAG CAT GAT TTT CCA TGG CGG ATG TGT GAC ATA C-3'. El cebador 2 contenía un sitio de restricción Xho I (subrayado) seguido de 19 nt de la secuencia de SFV (en cursiva) : 5 ' -CTC GAG GAT ATC CAÁ GAT GAG TGT GT-3 ' . Se generó un fragmento de DNA de 342bp mediante PCR y se clonó directamente en el plásmido pGEM-T-easy, originando pGEM-Te-SFV-1. La ausencia de errores de PCR en este plásmido se confirmó mediante secuenciación. El fragmento de 342 bp se extrajo de pGEM-Te-SFV-1 por digestión con Spe I y Xho I, y fue clonado en pGL3/AFP digerido con las mismas enzimas para dar pGL3/AFP-SFV-l, el cual posee el promotor (217bp y el potenciador (785bp) de AFP completos seguidos de la secuencia 5' terminal de SFV (SFV-1, que comprende 292bp) . Se obtuvo un cásete AFP-SFV-1 (1342bp) a partir de pGL3/AFP-SFV-l mediante digestión con Mlu 1/ Xho I, se trató con Klenow y se clonó en pBS-SK+ digerido con EcoR V, generando pBS/AFP-SFVl . El polyA tardío de SV40 (262bp) fue extraído de pGL3/AFP mediante digestión con Xba I/BamH I, romizado con Klenow e insertado en el sitio Sal I de pBS/AFP-SFV1, romizado también con Klenow, dando lugar a pBS/AFP-SFV-1-pA. Se insertó un "polylinker" que contenía los sitios únicos Apa I y Nru I, entre los sitios Bam Hl y Xma I, en pBS/AFP-SFV-1-pA. La secuencia 3' terminal de SFV que comprende 7985bp fue extraída mediante digestión con Spe I/Eco RV de pBK-SFV-1, se romizó con Klenow y se insertó en la posición EcoR V de pBS/AFP-SFV-1-pA, dando lugar a pBS/AFP-SFV-pA. El gen reportero LacZ se obtuvo a partir de pCMVb mediante digestión con Not I, se trató con Klenow y se insertó en el sitio BamH I de pBS/AFP-SFV-pA tratado con klenow para formar pBS/AFP-SFV-lacZ-pA. Se separó de pBS/mIL-12 un cásete mIL-12, que contenía los genes que codifican para las subunidades p35 y p40 unidas por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) , mediante digestión con Spe i/Xho I, se trató con Klenow y se insertó en la posición BamHI de pBS/AFP-SFV-pA, también tratada previamente con Klenow, generándose el plásmido pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA.
Construcción de vectores híbridos vacíos adenovirales Cuatro vectores adenovirales vacíos han sido construidos, como se muestra en la figura 2. AFP-SFV-LacZ y AFP-SFV-mIL-12 contienen una secuencia del replicón recombinante SFV, dirigida por el promotor y potenciador AFP. En estos vectores el gen reportero LacZ o el gen terapéutico mIL-12 fueron clonados bajo el control del promotor subgenómico de SFV, respectivamente. AFP-lacZ y AFP-mIL-12 también son vectores de adenovirus vacíos, que contienen genes LacZ y mIL-12, dirigidos directamente por el promotor/potenciador AFP, respectivamente. A continuación se describe el proceso seguido para la construcción de estos vectores. Con objeto de generar un vector de adenovirus con suficiente espacio de clonaje para albergar el cásete de expresión de AFP-SFV-IL-12 se procedió a modificar el plásmido pSTK120 que contiene la secuencia de un adenovirus vacío. Para ello se eliminó un fragmento de 9 kb del plásmido pSTK120 mediante digestión con Apa I. Además en este nuevo plásmido se insertó un "polylinker" que contenía los sitios Ase I y Sbf I dando lugar a pTGC3001. Éste plásmido contiene la ITR izquierda, la señal de empaquetamiento, ADN de relleno procedente de HPRT y C346, y la ITR derecha. El cásete AFP-SFV-LacZ se separó mediante digestión con Apa I de pBS/AFP-SFV-lacZ-pA y se insertó en el sitio Apa I de pTGC3001, dando lugar a pTGC3011. De manera similar, el c sete AFP-SFV-mIL-12 fue liberado de pBS/AFP-SFV-mIL-12-pA por digestión con BssH II, tratado con Klenow e insertado en el sitio Ase I de pTGC3001, también tratado con Klenow para generar pTGC3012.
Construcción de vectores control Construcción del vector adenoviral vacío AFP-LacZ La secuencia del potenciador/promotor de AFP (AFPp+e) se separó de pGL3/AFP por digestión con Mlu I/Xho I, se trató con Klenow y se insertó en pCMVb, el cual había sido previamente digerido por EcoRI /Xho I y tratado con Klenow. De este modo el promotor temprano inmediato de CMV fue eliminado de pCMVb y sustituido por AFP (p+e) generándose pAFPb. A continuación se extrajo el cásete AFP-LacZ (5077 bp) de pAFPb mediante digestión con Xba I/Nar I se trató con Klenow y se insertó en el sitio Swa I de pSTK120, también romizado con Klenow, dando lugar a pTGC3013.
Construcción del vector adenoviral vacío AFP-mIL-12 El cásete mIL-12 se extrajo de pBS/mIL-12 mediante digestión por Xho I/Spe I, y se insertó en pGL3/AFP previamente digerido con Xho I/Xba I, lo cual eliminó el gen luciferasa de 'este último plásmido y dio lugar a pAFP-mIL-12. El cásete AFP-mIL-12 (3760 bp) fue extraído a partir de pAFP-mIL-12 mediante digestión con BamH I/Sca I, tratado con Klenow e insertado en pSTK120 digerido por Swa I, y tratado también con Klenow para generar pTGC3014.
Recuperación de los vectores adenovirales vacíos Después de la digestión con Pme I, extracción con fenol/cloroformo, y precipitación con etanol, se transfectaron 2 µg de ADN de pTGC3011, pTGC3012, pTGC3013, o pTGC3014 en células 293Cre4, respectivamente. Tras la transfección, las células fueron infectadas con el virus "ayudante" AdLCdcluc. A continuación se llevaron a cabo los pasos de amplificación y preparación a gran escala, como se ha descrito previamente (Philip Ng., Robin J. Parks, and Frank L. Graham. Preparation of helper-dependent adenoviral vectors. Methods in Molecular Medicine, Vol . 69, Gene Therapy Protocols, 2nd . Ed. 69, 371 - 88, 2002 ; H. Zhou, L. Pastore, A. L. Beaudet. Helper-dependent adenoviral vectors. Methods in Enzymology, vol , 346, 177-198, 2002; Hillgenberg M., et al. System for efficient helper-dependent minimal adenovirus constructions and rescue. Hum Gene Ther. , 12; 643 - 657, 2001 ) . Todas las preparaciones de vectores fueron purificadas dos veces por centrifugación en gradiente de CsCl. Los vectores de ADN purificados se analizaron mediante digestión con enzimas de restricción, y no mostraron reordenamientos de secuencias. El título del adenovirus vacío y la contaminación por el virus "ayudante" se evaluaron mediante PCR cuantitativa. La proporción de las partículas virales totales frente a las unidades infecciosas (iu) fue 20:1. La contaminación por partículas de virus "ayudante" fue aproximadamente del 0.5-1%.
PCR cuanti tativa Para determinar el grado de contaminación por el virus "ayudante" se diseñaron una sonda y cebadores para PCR cuantitativa de la región Ad5 E4, mediante el programa TaqMan (TaqMan Probé #2) y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd (cebador) y Applied Biosystems (sonda) . Para determinar el título de los adenovirus vacíos, se diseñaron sondas y cebadores para PCR cuantitativa de secuencias de LacZ y IL-12 de ratón, mediante el programa TaqMan program (TaqMan Probé #2) , y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd (cebador) y Applied Biosystems (sonda) . Para determinar la contaminación por Ad de tipo silvestre, se diseñaron sondas y cebadores para PCR cuantitativa de la región El de Ad5 mediante el programa TaqMan program (TaqMan Probé #2) , y fueron sintetizados por Sigma-Genosys Ltd (cebador) y Applied Biosystems (sonda) .
Experimentos "in vi tro" Expresión transgénica en células infectadas con vectores adenovirales vacíos Las líneas celulares derivadas de HCC (Hep3B, Huh7 , HepG2 y PLC/PRF/5) y las líneas celulares no derivadas de HCC (A549, Hela, MHC1, y Clon 9) o derivadas de HCC pero que no expresan AFP (SK-Hep-1) fueron infectadas con cada uno de los 4 vectores adenovirales vacíos (AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ, AFP-mIL-12, o AFP-SFV-mIL-12) a "moi" 1000, 100, ó 10 (partícula/célula), respectivamente. Tres adenovirus de primera generación (Ad/CMV-mIL-12 , Ad/CMV-LacZ, Ad/AFP-LacZ) fueron usados como control. Se recogieron en pocilios por duplicado los sobrenadantes de las células infectadas con los vectores mIL-12, y los lisados de las células infectadas con vectores LacZ, , para la determinación de mIL-12 y ß-galactosidasa (ß-gal), respectivamente. Las células infectadas con vectores LacZ fueron también teñidas con X-gal. El nivel de mIL-12 (p70) fue medido con un kit ELISA (Pharmingen, San Diego, CA) . El nivel de ß-gal fue medido con un kit ELISA (Roche,). La cinética de expresión de IL-12 fue evaluada en células de HCC (Hep3B y Huh7) después de la infección con AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12 , o con el vector control Ad/CMV-mIL-12 a "moi" de 1000. Los sobrenadantes se recogieron diariamente hasta los 5 días postinfección.
Análisis de la especificidad de la expresión transgénica usando vectores híbridos Ad-SFV in vitro Para examinar la especificidad de la expresión transgénica con los vectores recombinantes descritos anteriormente, se infectaron 4 líneas celulares de HCC humanas (Hep3B, HepG2 , Huh-7 y PLC/PRF/5) y 5 líneas celulares humanas no derivadas de HCC (Hela, A549, , MHC1, y Clon 9) o derivadas de HCC que no expresaban AFP (SK-Hep-1) con AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12 o Ad-CMVmIL-12 como control positivo, a diferentes "mois" (10, 100, ó 1000) . Después de dos días de la infección, el sobrenadante fue recogido y se determinó la cantidad de mIL-12 en el mismo. Los resultados se muestran en la figura 3 (A) y (B) . No se observó expresión de mIL-12 en las células HCC humanas cuando se infectaron con AFP-mIL-12 a "moi" 10 ó 100, y sólo a "moi" 1000 se pudo observar un nivel muy bajo de mIL-12 en algunas líneas celulares (figura 3A) . En contraste, la infección de estas células con AFP-SFV-mIL-12 a "mois" 10, 100, ó 1000 dio como resultado la expresión de mIL-12 en un modo dependiente de la dosis (figura 3A) . El nivel de expresión de mIL-12 en células infectadas con "moi" 10 de AFP-SFV-mIL-12, fue comparable al nivel obtenido en células infectadas con AFP-mIL-12 a moi 1000. Además, el nivel de mIL-12 en células de HCC infectadas con AFP-SFV-mIL-12 a diferentes "mois" fue comparable al obtenido con el vector control AdCMVmIL-12. Sin embargo, la infección de células que no expresan AFP con AFP-mIL-12 o AFP-SFV-mIL-12, no produjo niveles detectables de mIL-12, incluso cuando se usó la "moi" más elevada (1000) (Figura 3B) . En estas células, sólo el vector control Ad-CMV-mIl-12 fue capaz de producir un alto nivel de expresión de mIL-12. Por otro lado se infectaron 4 líneas celulares de HCC (Hep3B, Huh-7, HepG2 y PLC/PRF/5) con vectores híbridos de LacZ - AFP-lacZ, o AFP-SFV-lacZ - a diferentes "mois" (10, 100, ó 1000), y se determinó la expresión específica de ß-gal . Datos similares se observaron también en este caso, cuyos resultados se muestran en la Figura 4. En la figura 5 se muestran microfotografías de células de HCC infectadas con los vectores vacíos adenovirales de AFP-lacZ y AFP-SFV-lacZ, seguidas de tinción con X-gal. La infección de células de HCC con AFP-lacZ dio como resultado un bajo nivel de expresión en las células infectadas, las cuales mostraron una tinción débil. En contraste, la infección de células HCC con AFP-SFV-lacZ produjo un alto nivel de expresión de ß-gal que se tradujo en una fuerte tinción con X-gal. Este dato indica que un vector híbrido Ad-SFV que lleva un replicón SFV bajo el control del promotor AFP, puede dar lugar en alto grado a una fuerte expresión transgénica en células tumorales que expresan AFP.
Cinética de la expresión de mIL-12 en células de HCC in vitro Para estudiar la producción de mIL-12 a diferentes tiempos tras la infección con los vectores híbridos de Ad- SFV, 2 líneas celulares de HCC (Hep3B y Huh-7) fueron infectadas con AFP-mIL-12 o con AFP-SFV-mIL-12 , y los sobrenadantes fueron recogidos diariamente hasta 5 días después de la infección. La Figura 6 muestra los resultados obtenidos para la expresión transgénica tras la infección de las células mencionadas . Dichos resultados muestran que hay un aumento constante de la expresión de mIL-12 del día 1 al día 4 post-infección en células infectadas con AFP-SFV-mIL-12 (Figura 6) . Sin embargo en el día 5 después de la infección el nivel de mIL-12 se redujo ligeramente. En las células infectadas con AFP-mIL-12, los niveles de expresión fueron muy bajos y sólo se observó un ligero aumento de la producción de mIL-12 a lo largo del tiempo.
Ensayo de citotoxicidad - ensayo de proliferación celular mediante incorporación de MTT. Células de HCC (Hep3B, Huh7 , MCH-RH7777, Hepl-6) fueron infectadas con AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ, AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o Ad/CMV-mIL-12 a "moi" 1000. Cinco días después de la infección, se determinó la supervivencia celular mediante un ensayo de MTT (bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazolil) -2 , 5-difeniltetrazolio) Mosmann, T. (1983) ". Immunol . Meth . 65, 55- 63 ; Tada, H. et al. (1986) J. Immunol . Meth . 93 , 157- 65. Brevemente, las células se lavaron una vez con PBS, y se añadieron por cada pocilio 200 µl de solución de colorante MTT recién preparada (en bandejas de 48-pocillos) . Las células fueron crecidas adicionalmente durante 3-4 horas, seguido de la adición de 500 µl de tampón de solubilización. Se tomaron 100 µl de cada muestra para la medida en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm.
Inducción de muerte celular después de infección de células HCC con vectores híbridos Ad-SFV in vitro Se ha descrito que la replicación de vectores SFV induce la muerte celular mediada por apoptosis en la mayoría de las células de origen vertebrado. Para analizar si también es este el caso de células HCC infectadas con vectores híbridos de Ad-SFV, se infectaron células Hep3B y Huh-7 con estos vectores y se determinó la supervivencia celular en el día 5 después de la infección. Como se muestra en la Figura 7, la supervivencia a este tiempo postinfección fue menor del 20% en células infectadas con AFP-SFV-mIL-12 , o con AFP-SFV-lacZ. Sin embargo, la infección de las mismas células con AFP-mlL-12, o AFP-lacZ, o con el vector control AdCMVmIL-12, no afectó a la supervivencia de las células. Estos resultados indican que hay replicación de SFV en células infectadas con vectores AFP-SFV.
Detección de SFV Rep mediante inmunofluorescencia Células de HCC (Hep3B, Huh7 , MCH-RH7777) fueron sembradas sobre cubreobjetos de vidrio, en bandejas de 6-pocilios (lxlO5 células/pocilio) , e infectadas con AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o Ad/CMV-mIL-12 a "moi" 1000. Dos días después de la infección las placas fueron lavadas dos veces con PBS, y las células fueron fijadas con metanol a -20°C durante 6 min. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con PBS y se incubaron a temperatura ambiente (RT) durante 30 min con PBS que contenía 0.5% gelatina y 0.25% BSA para bloquear las uniones no específicas. A continuación el tampón bloqueante fue reemplazado por el anticuerpo primario (MAb anti-replicasa) diluido 1:10 en tampón bloqueante, y fue incubado a RT durante 30 min. Las células fueron lavadas de nuevo 3 veces con PBS-0.25% BSA, e incubadas durante 30 minutos a RT con el anticuerpo secundario (suero de conejo antiratón conjugado con FITC, Sigma) diluido 1:250 en tampón bloqueante. Finalmente, las células fueron lavadas 3 veces con PBS-0.25%BSA, una vez con agua, y dispuestas sobre portaobjetos de vidrio usando medio de montaje Vecta-Shield con Dapi para teñir los núcleos celulares.
Expresión de SFV Rep en células de HCC infectadas con vectores híbridos Ad-SFV in vi tro La expresión de SFV Rep fue examinada en células de HCC infectadas con vectores híbridos Ad-SFV mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal específico para esta proteína. La Figura 8 muestra que las células HCC infectadas con AFP-SFV-mIL-12 o AFP-SFV-lacZ mostraron una fuerte tinción citoplásmica para Rep. Las células infectadas con AFP-mIL-12 o AFP-lacZ no mostraron ninguna tinción.
Experimentos in vivo Inducción- de xeno- inj ertos de HCC y estudio de la eficacia y especificidad de la transferencia génica in vivo. Células Huh7 fueron recogidas y lavadas dos veces con un medio exento de suero. 2 x 10s células fueron resuspendidas en 100 µl de suero salino e inyectadas subcutáneamente (s.c.) en el flanco derecho de ratones inmunodeficientes Balb/c ("nude") . Cuatro semanas después de la inoculación de las células, y cuando los nodulos tumorales alcanzaron 6-8 mm de diámetro, se inyectaron intratumoralmente lxlO10 partículas virales de AFP-LacZ (n=4) o de AFP-SFV-LacZ (n=4) diluidos en 80 µl de suero salino. Los animales control (n=3) fueron inyectados intratumoralmente con 80 µl de suero salino. Los ratones fueron sacrificados a día 3 ó 6 después de la inoculación En ese momento se extrajeron los tumores y el hígado de cada animal, se sumergieron en O.C.T. (Sakura, Holand) , y se congelaron a -80°C. Los tejidos congelados fueron cortados y colocados en portaobjetos de vidrio para ser teñidos con X-gal o analizados por TÚNEL. Para estudiar la especificidad de la infección con el vector híbrido in vivo se inyectaron por vía intravenosa ratones Balb/c normales con AFP-LacZ (n=4) , AFP-SFV-LacZ (n=4) o Ad/CMV-LacZ a razón de ÍO10 partículas virales/ratón. Al tercer día tras la inoculación se sacrificaron los animales y se recogieron los órganos principales para analizar la expresión de LacZ mediante tinción con X-gal.
Eficacia de la transferencia génica de los vectores híbridos Ad-SFV en xeno- injertos HCC humanos en ratones inmunodef icientes "nude " . Para estudiar la eficacia de la transducción de vectores híbridos vacíos in vivo, se usó un modelo de HCC humano basado en células Huh7 que pueden expresar AFP. Las células Huh7 fueron inoculadas subcutáneamente en ratones inmunodeficientes "nude" Balb/c, y tras la generación de nodulos tumorales a los 30 días, los animales fueron inyectados intratumoralmente con lxlO10 partículas virales de AFP-SFV-LacZ o AFP-LacZ como control. Los ratones fueron sacrificados 3 ó 6 días después de la inyección del virus, y tanto el tumor como el hígado se recogieron y se analizaron por tinción con X-gal. Como se muestra en la Figura 9A, hay una débil expresión transgénica en secciones de tumores de animales que han recibido AFP-lacZ. En contraste, hay una fuerte expresión de LacZ en secciones de tumores de animales que habían recibido AFP-AFV-LacZ (Figura 9B) . No se observó expresión transgénica en secciones de hígado de animales que recibieron o bien AFP-lacZ o AFP-AFV-lacZ, indicando que los vectores probablemente quedaron confinados en el sitio de inoculación (datos no mostrados) . Con objeto de estudiar si los vectores híbridos Ad-SFV inducen apoptosis en las células tumorales infectadas se analizaron secciones de los tumores tratados mediante la técnica de TÚNEL. No se observó apoptosis en las muestras procedentes de ratones inoculados con AFP-LacZ (Figura 9C) . Sin embargo se observó una abundante cantidad de células apoptóticas en los tumores de los animales que habían recibido AFP-SFV-LacZ (Figura 9D) . Estos datos indican que los vectores híbridos de Ad-SFV no sólo inducen expresión génica de forma específica en tumores sino que además inducen muerte celular selectiva por apoptosis en estas mismas células.
Especificidad de los vectores híbridos Ad-SFV in vivo. Para demostrar la especificidad de los vectores híbridos, se administraron 1010 partículas virales de AFP-LacZ, AFP-SFV-LacZ o del vector control Ad/CMV-LacZ por vía intravenosa en ratones Balb/c. Tres días tras la administración de los vectores se analizó la expresión de D-galactosidasa en hígado. Como se muestra en la figura 9 (E-F) ni AFP-LacZ ni AFP-SFV-LacZ fueron capaces de inducir expresión detectable del transgén en el hígado. Sin embargo en aquellos animales que recibieron Ad/CMV-LacZ se observó una alta proporción de células positivas para D-galactosidasa en secciones del tejido hepático (figura 9G) . Estos datos confirman que la expresión mediada por los vectores híbridos es específica de células del tumor.
Inducción de HCC ortotópico y terapia génica in vivo. 5 x 105 células McA-RH7777 fueron inoculadas en el lóbulo izquierdo del hígado de ratas Buffalo. 10 días después de la inoculación de las células tumorales se observó la aparición de un único nodulo de tumor de 7-10 mm de diámetro en cada animal. Los tumores fueron tratados con 1011 ó 2x1o11 partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o con suero salino como control. Dos y 4 semanas después del tratamiento, los animales fueron anestesiados y sometidos a laparotomía para observar la evolución del tumor. Asimismo se analizó la supervivencia de los animales. El tamaño de los tumores de determinó mediante la medida de la longitud y anchura de cada nodulo y aplicando la fórmula: Volumen de tumor = (longitud en mm) X (anchura en mm) 2 X 0.5236 (Janik et al. , 1975) .
Eficacia del tratamiento en HCC ortotópico en ratas Buffalo Para investigar la eficacia antitumoral del vector híbrido de Ad-SFV que lleva interleucina- 12, tumores de HCCs ortotópicos fueron establecidos en ratas mediante la implantación de células McH-RH7777 de rata en el hígado. Este modelo fue elegido porque se ha demostrado que las células McH-RH7777 expresan AFP. En un primer experimento los animales fueron tratados con una única inyección intratumoral de lxlO11 partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12 , o con suero salino como control (figura 10A-C) . Los animales que recibieron AFP-mIL-12 mostraron un tamaño de tumor reducido comparado con los animales control, que sufrieron una aumento constante del tamaño del tumor a lo largo del experimento (Figura 10A-B) . Sin embargo, el tratamiento con AFP-SFV-mIL-12 dio como resultado una regresión completa del tumor en 1 de 4 ratas tratadas, estabilización de la enfermedad en 2 , y ausencia de respuesta en 1 animal (Figura 10C) . Con objeto de comprobar si dosis mayores del vector híbrido podían aumentar el efecto antitumoral se ha realizado un segundo experimento en el que los animales han sido tratados intratumoralmente con una dosis de 2 x 1011 partículas virales de AFP-mIL-12, AFP-SFV-mIL-12, o con suero salino como control (figura 10 D-G) . Al igual que en el experimento anterior los animales que recibieron el vector AFP/IL-12 experimentaron una ligera respuesta antitumoral que se tradujo en una única remisión completa, 4 animales con tumores con crecimiento más lento que los controles y 7 animales en los que no hubo respuesta, de un total de 12 animales tratados (Figura 10E) . Sin embargo, el tratamiento con el vector AFP/SFV-IL-12 tuvo un efecto mucho más potente, induciendose regresión tumoral completa en 4 animales (33%) , regresión tumoral parcial en 6 animales (50%) , retraso en el crecimiento tumoral en 2 animales (16%) y ausencia total de respuesta en otros 2 animales (16%) de un total de 12 animales tratados (Figura 10F) . En este segundo estudio el vector AFP/SFV-IL-12 permitió la supervivencia del 50% de los animales tratados, frente a un 0% de supervivencia en los animales tratados con AFP-IL- 12o con suero salino (Figura 10G) .
Estudio de toxicidad in vivo: determinación de niveles de transaminasas e 11 -12 en suero, y estudios histológicos en hígado Se tomaron muestras de sangre de las ratas tratadas intratumoralemente con los vectores adenovirales AFP-SFV-IL-12 o AFP-IL-12 a dosis de 2 x 1011, o con suero salino, a los 4 y 8 días postinoculación. También se incluyeron en este estudio ratas inoculadas con 108 partículas del alfavirus SFV-IL-12. Se separó el suero de la sangre mediante centrifugación a 2000 rpm durante 15 minutos. La determinación de los niveles de transaminasas se hizo mediante un analizador automático Hitachi 911 Automatic Analyzer (Boehringer Mannheim, Alemania) . Los niveles de IL-12 se determinaron mediante ELISA. El estudio histológico se realizó mediante la extracción del hígado en los animales inoculados tres días tras el tratamiento. Se fijó el órgano en formol, se procesó incluyéndolo en parafina y se realizaron cortes de 6 mieras con un microtomo. Estos cortes se tiñeron con hematoxilina/eosina.
Estudio de la toxicidad de los vectores híbridos de Ad-SFV en rata Para evaluar la toxicidad asociada con la administración del vector híbrido de AFP-SFV-IL-12 se determinaron los niveles de transaminasas (GOT, GPT y GGTL) en el suero de las ratas tratadas por vía intratumoral con 2 x 1011 partículas virales de los diferentes vectores (ver apartado anterior) . En este estudio se incluyó además un grupo de ratas inoculadas también intratumoralmente con 108 partículas virales del vector alfaviral SFV-IL-12 (figura HA) . Las ratas que habían sido inoculadas con los vectores adenovirales de AFP-SFV-IL-12 o de AFP-IL-12 mostraron niveles de transaminasas muy bajos, que eran muy similares a los de los animales control que habían sido inoculados con suero salino. Sin embargo, los niveles de transaminasas en los animales tratados con las partículas de SFV-IL-12 fueron significativamente más altos que en los otros grupos (p<0.05) . En este estudio también se determinó el nivel de IL-12 presente en el suero de los animales a los mismos tiempos. No se detectó IL-12 en el suero de los animales que habían sido inoculados con los vectores de Ad AFP-SFV-IL-12 o AFP-IL-12 o con suero salino (figura 11B) , indicando que la expresión del transgén en estos vectores está restringida a los tumores y sugiriendo que la toxicidad del vector híbrido de Ad-SFV es muy baja. El tratamiento con las partículas virales de SFV-IL-12, sin embargo, indujo altos niveles séricos de IL-12 a tiempos cortos, lo cual podría producir toxicidad hepática. Finalmente, el estudio de toxicidad se completó con un análisis histológico de secciones hepáticas teñidas con hematoxilina/eosina procedentes de ratas tratadas intratumoralmente con los mismos vectores y a las mismas dosis ya descritas (figura 12) . Este estudio mostró que no había diferencias histológicas entre las ratas que recibieron suero salino y aquellas que recibieron los vectores adenovirales de AFP-SFV-IL-12 o de AFP-IL-12. Sin embargo en secciones hepáticas de ratas tratadas con las partículas virales de SFV-IL-12 si se observaron zonas con hepatocitos eosinófilos así como fusiones de estos hepatocitos, indicando un cierto grado de toxicidad (flechas negras, figura 12D) .
Lista de secuencias SEQ ID No 1: Ad ITR 5'. secuencia de origen adenoviral que comprende una primera secuencia ITR y una señal de empaquetamiento del adenovirus . SEQ ID No 2: Ad ITR 3 ' segunda secuencia terminal invertida repetida ITR. SEQ ID No 3: SFV 5'-rep-Psg-. Porción del replicón alfaviral que está situada delante del gen exógeno. SEQ ID No 4: SFV 5' -rep-Psg-enh. Porción del replicón alfaviral que está situada delante del gen exógeno y que incluye una porción del potenciador del alfavirus. SEQ ID No 5: SFV 3' . Secuencia del replicón situada detrás del gen exógeno y que incorpora la región 3' necesaria para la replicación. SEQ ID No 6: SV40 Poli A. Secuencia de poliadenilación de SV40. SEQ ID No 7: AFP p+e. Promotor AFP que incluye la región promotora y potenciadora. SEQ ID No 8: AFP-SFV-mIL12. Vector adenoviral vacío híbrido con alfavirus que incorpora como promotor AFP (p+e) y como gen exógeno IL12 de ratón como gen terapéutico. SEQ ID No 9: AFP-SFV-LacZ. Vector adenoviral vacío híbrido con alfavirus que incorpora AFP como promotor y LacZ como gen reportero. SEQ ID No 10: TERT-SFV-mIL12. Vector adenoviral vacío híbrido con alfavirus que incorpora el promotor telomerasa (TERT) e IL12 de ratón como gen terapéutico. SEQ ID No. 11: pGL3-AFP. Plásmido utilizado y descrito en la memoria. SEQ ID No. 12: mIL12. Secuencia correspondiente a IL12 de ratón. SEQ ID No. 13: hIL12. Secuencia correspondiente a IL12 humana. SEQ ID No. 14: Gen reportero LacZ. Secuencia del gen reportero. SEQ ID No. 15: Promotor de la telomerasa (TERT) .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica caracterizado porque comprende, orientados en dirección 5' a 3', al menos los siguientes elementos: i . una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus ; ii. una primera secuencia no codificante de relleno; iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido; iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral, que comprende al menos una secuencia codificante de al menos un gen exógeno de interés; v. una secuencia de poliadenilación, y vi . una segunda secuencia terminal invertida repetida
  3. (ITR) adenoviral. 2. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además, un elemento vii que es una segunda secuencia no codificante de relleno, entre el elemento v y el elemento vi . 3. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento ii. es una secuencia no codificante de relleno humana .
  4. 4. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque el elemento ii. es la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana, HPRT.
  5. 5. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el elemento i. tiene la SEQ ID No 1.
  6. 6. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento iii. es un promotor específico de tumores.
  7. 7. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el elemento iii. es un promotor específico de tumores seleccionado entre AFP, telomerasa TERT, PAP, E2F y HIF.
  8. 8. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento iii. es un promotor específico de tumores que tiene una secuencia seleccionada entre SEQ ID No 7, correspondiente a AFP p+e, y SEQ ID No 15, correspondiente a telomerasa TERT.
  9. 9. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el elemento iv. comprende una secuencia derivada del virus Semliki Forest SFV.
  10. 10. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 1 ó 9, caracterizado porque dicha cadena iv de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral, comprende al menos una secuencia codificante de al menos un gen exógeno de interés, y comprende además: a) una secuencia 5' necesaria para la replicación del alfavirus, b) una secuencia codificante de las proteínas no estructurales necesarias para la replicación del ARN alfaviral, c) al menos un promotor subgenómico del alfavirus, y d) una secuencia 3' necesaria para la replicación del alfavirus .
  11. 11. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las secuencias a) a c) del elemento iv. , en su conjunto, tienen una secuencia seleccionada entre SEQ ID No . 3 y SEQ ID No. 4.
  12. 12. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 10 ó la 11, caracterizado porque el elemento iv.d) tiene la secuencia SEQ ID No. 5.
  13. 13. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el gen exógeno de interés está seleccionado entre uno o más genes terapéuticos, uno o más genes reporteros, o combinaciones de ellos.
  14. 14. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gen exógeno de interés es el gen terapéutico interleucina de mamífero IL-12.
  15. 15. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gen exógeno de interés es el gen terapéutico interleucina humana, hIL-12.
  16. 16. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gen exógeno de interés es un gen terapéutico seleccionado entre el factor estimulante de colonias GMCSF, interferón alfa y timidin-kinasa del virus de herpes simple HSV-TK.
  17. 17. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el elemento iv comprende en serie uno o varios subconjuntos de (promotor subgenómico + gen exógeno de interés) .
  18. 18. Un vector híbrido .adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el gen exógeno de interés es un gen reportero seleccionado entre el LacZ, Luciferasa, timidin kinasa del virus de herpes simple HSV-TK y GFP.
  19. 19. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, caracterizado porque el elemento iv. forma un replicón funcionalmente controlado por el promotor iii., y porque el promotor subgenómico alfaviral comprendido en iv.c) controla funcionalmente la expresión del gen exógeno de interés.
  20. 20. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el elemento v. es una secuencia de podiladenilación de SV40.
  21. 21. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el elemento v. tiene la secuencia SEQ ID No. 6.
  22. 22. Un vector adenoviral de expresión génica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la segunda secuencia no codificante de relleno es C346.
  23. 23. Un vector adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque el elemento vi. tiene la secuencia SEQ ID No 2.
  24. 24. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende: i . una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus ; ii. una primera secuencia no codificante de relleno, que es la región intron de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana; iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido, que es el promotor AFP, iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral derivado del virus SFV, que comprende una secuencia codificante de un gen exógeno de interés que es hIL-12 , v. una secuencia de poliadenilación de SV40, vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral y vii. una segunda secuencia no codificante de relleno, que es C346 genómico humano, colocada entre el elemento v y el elemento vi .
  25. 25. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque comprende: i . una primera cadena de origen adenoviral que comprende una primera secuencia terminal invertida repetida (ITR) y una secuencia señal para el empaquetamiento del adenovirus; ii. una primera secuencia no codificante de relleno, que es la región intrón de la fosforribosiltransferasa de hipoxantina genómica humana; iii. una secuencia correspondiente a un promotor específico de tejido, que es el promotor AFP, iv. una cadena de ADNc derivada de un alfavirus, cuya secuencia es en parte complementaria de un ARN alfaviral derivado del virus SFV, que comprende una secuencia codificante de un gen exógeno de interés, seleccionado entre mIL-12 v y LacZ, v. una secuencia de poliadenilación de SV40, vi. una segunda secuencia terminal invertida repetida (ITR) adenoviral, y vii. una segunda secuencia no codificante de relleno, que es C346 genómico humano, colocada entre el elemento v y el elemento vi.
  26. 26. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene una longitud comprendida entre 27 y 38 kilobases.
  27. 27. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque tiene la secuencia SEQ ID No 8.
  28. 28. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque tiene la secuencia SEQ ID No 9.
  29. 29. Un vector híbrido adenoviral de expresión génica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque tiene la secuencia SEQ ID No 10.
  30. 30. Uso de un vector híbrido adenoviral de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en un procedimiento para transferir material genético a una célula.
  31. 31. Uso de conformidad con la reivindicación 30 en el que dicha célula es una célula tumoral .
  32. 32. Uso de conformidad con la reivindicación 31 en el que dicha célula es una célula tumoral que expresa AFP.
  33. 33. Uso de un vector híbrido adenoviral definido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 29 para preparar un medicamento eficaz en el tratamiento de tumores .
  34. 34. Uso de un vector híbrido adenoviral definido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 29 para inducir una respuesta inmune contra antígenos extraños.
  35. 35. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 29.
  36. 36. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 29, en el que el gen exógeno de interés es hIL-12.
  37. 37. Uso de una composición farmacéutica, que comprende al menos un vector híbrido adenoviral definido de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 29, en un procedimiento para inducir una respuesta inmune frente a antígenos extraños .
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