MXPA06010744A - Injerto biomimetico, de tejido manipulado, de foliculos pilosos. - Google Patents
Injerto biomimetico, de tejido manipulado, de foliculos pilosos.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere a un andamio mejorado que se construye para imitar la arquitectura de los foliculos pilosos naturales. La presente invencion tambien se refiere al uso de composiciones especificas y los metodos de fabricacion para producir andamios que combinan la biocompatiblidad con las velocidades de bioabsorcion deseadas. En otra modalidad, la presente invencion se refiere a un proceso para fabricar un injerto biomimetico de foliculos pilosos y a un metodo para sembrar el injerto con celulas e implantarlo en la piel donde se desea el crecimiento de nuevo cabello. Otra modalidad de la presente invencion se refiere a un metodo para la multiplicacion del cabello en el cual se multiplican las celulas en cultivo y se separan en alicuotas en una multitud de andamios bioabsorbibles en combinacion con queratinocitos cultivados u otras celulas relacionadas.
Description
Es bien sabido que tipos específicos de células que se encuentran en las sub-estructuras dentro del folículo del cabello tienen la capacidad para inducir la formación de folículos pilosos completos, que funcionan normalmente. Estas células son conocidas como células madre foliculares o células progenitoras de folículo. En vista del gran mercado para un tratamiento eficaz para la restauración de cabello, se han hecho muchos intentos para explotar la capacidad de inducción del folículo de estas células para el propósito de la multiplicación del cabello. Aunque parecen ser científicamente posibles, los esquemas descritos de la técnica anterior han probado ser insuficientes para el objetivo de proporcionar un nuevo tratamiento clínica y cosméticamente aceptable para la calvicie. Por ejemplo, las células de las papilas dérmicas cultivadas de un bigote de rata se implantaron justo debajo de la piel en la oreja de una rata, dando como resultado el crecimiento de bigotes en el lugar de la implantación. Cf . , R. F. Oliver y C. A. B. Jahoda en la Patente U. S. 4,919,664, "Estimulación del crecimiento del cabello", del 24 de abril de 1990, las enseñanzas de la cual se incorporan en la presente para referencia. En un estudio clínico no publicado, de 5 personas voluntarias, del Dr. Andrew Messenger, se cultivaron las células de papila dérmica de folículo de cabello disecadas de biopsias de cuero cabelludo de los voluntarios. Las células se multiplicaron y cubrieron la superficie del frasco de cultivo, se retiraron raspándolas de la superficie del frasco y se implantaron en incisiones superficiales en la piel del lado de abajo del antebrazo de cada persona de quien se obtuvieron las células. No se observó crecimiento de cabello nuevo en los lugares de implantación de la célula. Después de 6 meses se realizó una biopsia en todos los lugares y se encontró, por medios histológicos, que no había evidencia de formación de folículos pilosos en el cuero cabelludo "Andamios para Tejido Piloso Manipulado", 28 de febrero de 2002, las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente, un método para implantar el mismo tipo de células cultivadas en un "andamio" poroso hecho de un material bioabsorbible . Un estudio clínico subsiguiente en este caso produjo el primer ejemplo documentado de la inducción de nuevos folículos pilosos y el crecimiento de cabello en la piel de una persona mediante la implantación de células cultivadas (ver T. H. Barrows, S.A. Cochran, E. I. Grif in, y A. R. Solomon, "Tejido de Cabello Humano, Manipulado: Resultados Clínicos Preliminares", TE2002 : "Taller Internacional sobre Tejidos Manipulados, St. Gallen, Suiza, 24-27 Febrero, 2002, las enseñanzas del cual se incorporan a la presente como referencia) . Las células inyectadas sin la presencia de una estructura de andamio sólido no mostraron alguna evidencia de neogénesis de folículo. Sin embargo, en la actualidad únicamente una de 16 implantaciones de células en combinación con andamios da como resultado el crecimiento de tallos pilosos útiles para usarse en cosmética. Aunque se observó por medios histológicos evidencia equivocada de neogénesis de folículo en un número de lugares de implante de las células y el andamio, también hubo una persistente inflamación en respuesta a los residuos de desechos de andamios degradados parcialmente. Este tipo de respuesta a cuerpos extraños se ha postulado para crear un ambiente en detrimento de la formación de folículos pilosos (ver K. S. Stenn, "Composiciones y Métodos para inducir la formación de nuevos folículos pilosos y el crecimiento del cabello en la orientación deseada", Solicitud de Patente U. S. 10/123,984, 17 de abril de 2002, las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente) .
Por lo tanto permanece una necesidad sin cubrir para un método confiable y reproducible para cultivar células progenitoras de folículos pilotos e implantar las células cultivadas en la piel de tal manera que se creen nuevos folículos pilosos viables para usarse en cosmética.
COMPENDIO DE LA INVENCION
Brevemente, en un aspecto, la presente invención es un andamio mejorado, el cual se construye para imitar la arquitectura de los folículos pilosos naturales y está diseñado para implantación percutánea. Unas partes del implante sirven como estructuras de soporte para sembrar tipos específicos de células y otras partes en contacto con o que sobresalen a través de la epidermis sirve como un lugar para el crecimiento bajo la epidermis. Este crecimiento hacia abajo es benéfico para crear un infundíbulo en comunicación con las células implantadas, lo cual a su vez ayuda a controlar el ángulo de salida del tallo piloso nuevo que se forma .
En otro aspecto de la presente invención es el uso de composiciones específicas y métodos de fabricación para producir andamios que combinen biocompatibilidad con la proporción deseada de bioabsorción . Las características de desempeño de estos tipos de andamios son muy importantes en la construcción de un implante de inducción de folículo exitoso, el cual facilita o mejora el proceso de neogénesis del folículo.
En otro aspecto, la presente invención es una combinación especifica de células cultivadas que proporcionan iniciación confiable y reproducible de la neogénesis del folículo. La implantación de células solas de papila dérmica cultivada (también conocidas como papila folicular) da resultados impredecibles- o no reproducibles . Se encontró que los queratinocitos, es conveniente que los queratinocitos se obtengan de piel neonatal (es decir tejido del prepucio infantil) también deben implantarse en combinación con células de papila dérmica. Otros tipos de células también se pueden combinar con la combinación de papila dérmica/queratinocitos para mejorar la proporción de éxito de la neogénesis del folículo. Las células opcionales adicionales se pueden seleccionar de colonias de células madre que se sabe que existen en el embrión humano, piel del cuero cabelludo de niños o fetos, prepucio infantil, sangre del cordón umbilical, médula ósea de adulto, músculo, tejido adiposos, y piel.
Otro aspecto más de la presente invención es el sorprendente descubrimiento de 6-sulfato condroitina como una sustancia que proporciona un efecto benéfico sobre, o mejoramiento del proceso de neogénesis del folículo.
En otro aspecto, la presente invención es un proceso para fabricar un injerto biomimético de folículos pilosos y un método para sembrarlo con células e implantarlas en la piel donde se desea el crecimiento del nuevo tallo piloso.
Otro aspecto más de la presente invención es un método para la multiplicación de cabello en el cual las células de los folículos cosechados, se multiplican en cultivo, y se alicuotan en una multitud de andamios bioabsorbibles en combinación con queratinocitos cultivados u otras células alogénicas. La implantación de los injertos biomiméticos de células sembradas resultantes proporciona un mayor grado de restauración de cabello que los obtenidos con los métodos de la técnica anterior. Por lo tanto, el método de la presente invención reduce, inhibe o cura la pérdida de cabello incluyendo específicamente, pero no limitando a, patrones de calvicie de hombre o mujer y otras condiciones de pérdida de cabello.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación esquemática transversal de un filamento hueco de la presente invención que muestra un filamento externo sólido (1) de un polímero bioabsorbible, un filamento interno poroso (2) del mismo o diferente polímero bioabsorbible, y una luz central (3) .
La Figura 2 es una representación esquemática transversal del filamento hueco de la Figura 1 que muestra células (4) (es decir queratinocitos) que se sembraron en el filamento interno poroso por medio de la absorción de una suspensión de células en la luz del filamento y una acumulación de células (5) (es decir células de papila dérmica cultivadas o un fragmento de folículo de cabello) que se sembró en la luz del filamento forzándolo mecánicamente a entrar en un extremo abierto del filamento .
La Figura 3 es una representación esquemática transversal del filamento de la Figura 2 poco después de la implantación en la piel, de tal manera que el extremo próximo (6) está en la dermis (7) y el extremo distante (8) está rodeado por epidermis de crecimiento descendente (9) .
La Figura 4 es una micrografía electrónica de barrido (SEM) de un filamento hueco de la presente invención hecho de un copolímero poroso de d, 1-lacturo y glicoluro (PLGA) .
La Figura 5 es una SEM de la superficie interna porosa del filamento hueco de la Figura 4, la cual se expuso abriendo por corte el tubo .
La Figura 6 es una foto micrografia de luz que muestra un filamento (10) con la construcción que se muestra en la Figura 1 en donde el filamento externo (1) está hecho de PLGA sólido y el filamento interno poroso (2) está hecho de ácido hialurónico reticulado (HAX) . La Figura 6 también muestra un filamento (11) hecho de PLGA que no contiene HAX. Ambos filamentos se colocaron en una gota de agua (12) con colorante grado alimenticio de color rojo. La fibra únicamente de PLGA (11) flotó en la parte superior del agua y no absorbió agua hacia la luz de la fibra, en donde el HAX que contiene fibra PLGA (10) rápidamente absorbe el agua hacia la luz, dando a la fibra el color rojo.
La Figura 7 (A) es una fotografía de un folículo vibrisa de ratón (bigote) (13) y un filamento hueco PLGA (14) con un diámetro interior de tamaño suficiente para acomodar el folículo escindido.
La Figura 7 (B) es una fotografía del filamento hueco PLGA de la Figura 7(A) con el folículo (13) insertado en la luz .
La Figura 8 es la fotografía de un bigote de ratón (15) que se observó creciendo en la espalda del un ratón contra el fondo del pelaje afeitado y nuevamente crecido (16) 30 días después de la implantación del folículo vibrisa contenido en un filamento hueco PLGA.
La Figura 9 es una foto micrografía de un bulbo de folículo de cabello (17) y tallo piloso (18) que crece bajo la piel del ratón 30 días después de la implantación de una mezcla de células obtenidas de la piel de un ratón neonato contenido en un filamento hueco PLGA (19) .
La Figura 10 es una comparación lado a lado de dos foto micrografías tomadas con la misma amplificación del lado de debajo de la piel cortada de un ratón desnudo que se inyectó 13 días antes con células obtenidas de la epidermis y dermis de un ratón negro recién nacido. El tablero A muestra el lugar de la inyección de control y el tablero B muestra el lugar de inyección que contiene exactamente el mismo número de células excepto que el fluido de la inyección también contiene 5% ( /v) de 6 sulfato condroitina, lo cual da como resultado que la neogénesis de folículos filosos sean más largos y más numerosos que los de control.
La Figura 11 también es una comparación lado a lado de dos foto micrografias tomadas con la misma amplificación del lado de abajo de la piel cortada de un ratón desnudo que se inyectó 13 días antes con células obtenidas de la epidermis y dermis de un ratón negro recién nacido. El tablero A muestra el mismo lugar de inyección de la Figura 10 y el tablero C muestra el lugar de la inyección en el mismo ratón y que contiene exactamente el mismo número de células excepto que el fluido de la inyección también contiene 20% (w/v) del surfactante Pluronic™ F-127, (un copolimero de óxidos de etileno y propileno) lo cual da como resultado que la neogénesis de folículos filosos sean más largos y más numerosos que los de control .
La Figura 12 es una representación esquemática transversal de un filamento hueco de la presente invención en la cual la luz (20) es ligeramente cónica a un extremo cercano (21) unido a un obturador poroso (22) .
La Figura 13 es una representación esquemática transversal de un ' filamento hueco de la presente invención que muestra una punta fina de una pipeta (23) que contiene células (24) y fluido (25) que se inserta hacia la luz cónica (20) .
La Figura 14 es una representación esquemática transversal de un filamento hueco de la presente invención que muestra una suspensión de fluido (25) y células (24) que son expelidas de una punta de pipeta (23) en donde las células se recolectan en el extremo cerrado de la luz (21) y el fluido (25) se absorbe completamente en el obturador poroso (22)
La Figura 15 es una fotografía de un andamio de filamento hueco del Ejemplo 10 y una punta de pipeta de 10 microlitros (26) idéntica a una que se usa como mandril en el proceso para hacer la modalidad de la presente invención. La envoltura (27) se hace de PLGA y la masa fibrosa (28) contenida en la punta bulbosa (29) se hace de filamentos de gelatina reticulada/6 sulfato condroitina. Las partículas de carbón se recolectan en la parte próxima del andamio fibroso al inyectarle una lechada de partículas de carbón y agua en el andamio a través de una punta de pipeta insertada en la envoltura del andamio .
DEFINICIONES
Como se usan en la presente, los términos que se listan a continuación tendrán los siguientes significados: "Tejido manipulado" se define como la técnica de crear combinaciones de células, andamios biocompatibles, generalmente andamio bioabsorbibles, que tienen la utilidad de reemplazar, reparar, o aumentar tejidos y órganos del cuerpo humano .
"Neogénesis del folículo" se define como el fenómeno de la formación de folículo piloso nuevo en una región de la piel donde no existía previamente ninguno o además de y entre folículos que ya existían.
"Bioabsorbible" se define como la propiedad de un material que permite que se rompa en el cuerpo en subproductos no tóxicos que se excretan del cuerpo o se metabolizan en él.
"Andamio" se define como una estructura no citotóxica capaz de contener células vivas y mantenerlas en una configuración específica.
"Filamento" se define como una estructura cilindrica que tiene una longitud que es mayor que su diámetro.
"Fibra" se define como un filamento que posee una integridad física.
"PLGA" se define como un copolimero de lacturo y glicoluro .
VEGF" se define como un factor de crecimiento endotelial vascular.
"EDC" se define como N- (3-dimetilaminopropil) -N' -etilcarbodiimide clorhidrato.
"TFE" se define como 2, 2, 2-trifluoroetanol .
?????" se define como un ácido hialuronico reticulado.
"Mandril" se define como un objeto cilindrico, aguzado o cónico usado para conservar la forma de materiales aplicados a las superficies exteriores y se quita en un proceso que rinde un filamento hueco de los materiales aplicados .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
En una modalidad de la presente invención, el componente andamio del tejido biomimético de folículos pilosos es un filamento hueco que consiste de uno o más polímeros bioabsorbibles, el cual define una luz interior que por lo general se extiende de un extremo del andamio al otro. Las paredes internas del filamento hueco o las paredes externas pueden ser uniformes o porosas dependiendo del uso deseado. Por ejemplo, un filamento hueco con una superficie relativamente uniforme se puede usar para retener un tipo de célula (es decir queratinocitos de prepucio humano) sobre la superficie luminal y otro tipo de célula (es decir células de papila de folículos pilosos de humanos adultos cultivados es conveniente que sean en la forma de un agregado de una acumulación de células) , colocadas dentro de la luz y en contacto con las células dé la superficie que la rodea. Se puede usar un filamento hueco con una alta porosidad, con un interior hidrofílico para absorber una suspensión de células de uno o más tipos hacia el filamento, el cual por sí mismo puede ser relativamente hidrofílico y por lo tanto no es capaz de absorber el fluido acuoso.
El interior hidrofílico, poroso puede tener una proporción mas rápida de absorción o licuación que el exterior del filamento hueco para facilitar la reorganización de las células sembradas dentro de la luz del filamento mientras continúa contenido por las más lentas, paredes de filamento de bioabsorción. Pero de otra forma, un andamio de polímero puede tener una proporción variable o gradiente de bioabsorcion desde el interior luminal al exterior del andamio. De esta forma, el interior es decir, el luminal, el polímero bioabsorbente o proporción de bioabsorcion son más altos que las proporciones de bioabsorcion de polímero colocadas externamente o en el exterior.
Los materiales bioabsorbibles, biocompatibles adecuados tanto para la fabricación de filamentos huecos y para usarse como material para rellenar el interior de los filamentos huecos se pueden seleccionar de una gran variedad de materiales biocompatibles, sintéticos, naturales, y semi-sintéticos, que generalmente se usan en práctica clínica y en investigación biomédica. Los filamentos huecos pueden consistir de polímeros que incluyen poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) , poli (carbonato de trimetileno) , poli (carbonato de dimetiltrimetileno) , poli (ácidos aminos) , poli (carbonatos) derivados de tirosina, poli (carbonatos) , poli (caprolactona) , poli (para-dioxanona) , poli (ésteres) , poli (ésteres-amidos) , poli (anhídridos) , poli (orto ésteres) , colágeno, gelatina, albúmina de suero) , proteínas, polisacáridos, mucopolisacáridos, carbohidratos, glicosaminoglicanos, poli (glicoles de etileno) , poli (glicoles de propileno) , poli (ésteres de acrilato) poli (ésteres de metacrilato) poli (vinilo alcohol) , y copolímeros, sus combinaciones y mezclas de esos polímeros, asi como oligómeros que contienen ligaduras bioabsorbibles que están copolimerizados en bloque con otros polímeros no degradables que son metabolizados o excretables al liberarse por hidrólisis o degradación de las ligaduras bioabsorbibles . La modificación de la superficie, copolimerización, o mezcla de los materiales bioabsorbibles de esta invención con factores de crecimiento, porciones de las posiciones de la unión a la célula, y las moléculas de señalización de células pueden ser ventajosas para mejorar la unión de las células y/o mejorar la función de la célula, agregado o inicio del proceso de neogénesis del folículo.
Los polímeros que se encuentran en la naturaleza " (o biopolímeros, o biomateriales) , adecuados para usarse como filamentos huecos o como materiales para rellenar filamentos huecos incluyen colágeno, gelatina, derivados de celulosa, almidón, dextrina, chitosana, lipoproteínas, formas recombinantes humanas de colágeno y gelatina, fibrinógeno, fibrina, fibronectina, laminina, albúmina, otras proteínas de suero, polisacáridos, mucopolisacáridos, y otros biopolímeros que se encuentran naturalmente en el cuerpo humano. Los biopolímeros adecuados se pueden usar en su forma nativa o modificada por medio de un retículo con agentes de retículo aceptable de manera toxicológica es decir, para reducir su solubilidad. El material de relleno se puede utilizar en una variedad de formas físicas que incluyen fibras, geles, y estructuras porosas. Por ejemplo, las células se pueden combinar con una solución de fibrinógeno, el cual después se convierte en un gel bioabsorbible al exponerse a trombina.
Otra propuesta involucra el uso de un copolímero de oxido de etileno y óxido de propileno conocido como Pluronic™ F-127, el cual está disponible comercialmente de BASF Corp., Mount Olive, NJ. Este surfactante es compatible con células vivas y arriba de concentraciones críticas
Forma un gel cuando se calienta a la temperatura del cuerpo de temperaturas más frías . De esta forma el filamento huevo puede, por ejemplo, ser tratado primero con una solución de Pluronic™ F-127 en alcohol seguido por evaporación del alcohol para proporcionar un recubrimiento hidrofílico en sus superficies luminales . Una solución fría de Pluronic™ F-127 que contiene una suspensión de células se puede absorber o inyectar hacia la luz del filamento y colocarse en un medio tibio para convertir el Pluronic™ F-127 en gel y prevenir que las células se suelten del filamento. Otros materiales biocompatibles en forma de gel incluyen colágeno, gelatina, albúmina sérica, Matrigel™ matriz de membrana basal (BD Biosciences, San José, CA) y varias moléculas de polietilenglicol con grupos terminales que reaccionan de forma covalente para formar redes de gel .
Se prevén otros usos para las estructuras de la presente invención. Por ejemplo, simplemente reuniendo un mazo de una gran cantidad de filamentos huecos, con o sin la adición de otros ingredientes, es posible obtener un objeto tridimensional como el producto terminado con poros continuos corriendo a través de él. Estas estructuras son útiles en el campo de tejido manipulado de cartílago. Debido a que el cartílago es esencialmente avascular, los andamios usados para el tejido manipulado de cartílago adecuados tienen un interior que es rápidamente accesible para los nutrientes . Más aún, el sembrado de estos andamios se facilita por medio de los poros que recorren directamente el aparato. Además, al orientar los poros a lo largo del eje de la carga biomecánica, los condrocitos sembrados se estimulan para responder apropiadamente y organizarse en la arquitectura de columna del cartílago articular nativo.
Se sabe que el ácido hialurónico es un biomaterial útil para las aplicaciones de tejido manipulado y es adecuado para los andamios antes mencionados para tejido manipulado de cartílago. Se obtiene un material adecuado al reticular ácido hialurónico con un agente de condensación, es conveniente que sea EDC como lo describe Ktomihata y Y. Ikada, "Reticulación de ácido hialurónico con carbodiimida sobluble en agua", J. Biomed. Mater. Res., 37,234,251 (1997), las enseñanzas del cual se incorporan a la presente para referencia. Alternativamente, el ácido hialurónico se puede reticular por medio de una variedad de otras propuestas que incluyen métodos que se describen en "Modificación de Polímeros Naturales: Acido Hialurónico" de Y. Luo, K:R. Kirker, y G. D. Prestwich, Capítulo 45 en Métodos de Manipulación de Tejidos, A. Atala y R. P. Lanza, eds . , Academic Préss, 2002, pp. 539-553, las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente.
Alternativamente, el ácido hialurónico se puede convertir en un material insoluble para usarse en la presente invención, por medio de esterificación, como se describe en la Patente U. S. 4,851,521, "Esteres de Acido Hialurónico ", por Francesco della Valle y Aurelio Romero (Julio 25, 1989), las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente. Un material adecuado de este tipo es el éster bencílico de ácido hialurónico. Mientras que la trans-esterificación es un método adecuado para reticular porque el producto resultante se convierte nuevamente en ácido hialurónico soluble al hidrolizar las ligaduras de éster dentro de unos pocos días in vivo, también se pueden emplear otros agentes para reticular y agregar moléculas formadas por reticulación. También son adecuadas las moléculas para reticular con terminaciones en amina, incluyendo, pero no limitando a, diaminas alifáticas, ésteres de diaminoácidos, como los ésteres alquilo de lisina, y el poli (etilenglicol) con terminaciones de grupos en amina.
Muchos de los métodos químicos para reticular ácido hialurónico se pueden usar para facilitar la unión covalente de las moléculas bioactivas de la estructura del ácido hialurónico para mejorar el rendimiento del andamio resultante. Por ejemplo, los péptidos que contienen la unión de células de secuencia del dominio de los amino ácidos Arg-Gly-Asp (RGD) se pueden usar para mejorar la unión de la célula al andamio de ácido hialurónico reticulado.
Es deseable que en el uso de ácido hialurónico para fabricar, andamios para folículos pilosos de tejido manipulado se agreguen al andamio factores de crecimiento y factores de la angiogénesis, de tal manera que se libere durante la degradación del andamio para estimular a los vasos sanguíneos para que crezcan en el folículo recién formado o para otros propósitos benéficos. Además de la unión covalente de moléculas pequeñas a los andamios, las moléculas de peso molecular más alto como las proteínas, glicoproteínas, y otros biopolímeros, como el colágeno, laminina, fibronectina, y similares, se pueden dirigir física o electrostáticamente hacia la estructura para proporcionar una mayor integridad física, capacidad de unión de la célula, o bioactividad. Otros glucosaminoglucanos que incluyen sulfato de condroitina, heparina, sulfato de dermatan, versican, y similares también se pueden usar ventajosamente en la presente invención en lugar de ácido hialurónico.
Un material adecuado para la fabricación de andamios para tejido manipulado de folículos pilosos es 6-sulfato condroitina. El sorprendente efecto benéfico de 6-sulfato condroitina en el proceso de neogénesis de folículo se muestra en el Ejemplo 6. La composición una mezcla de 6-sulfato condroitina y gelatina, reticulado con EDC, y se vuelve micro poroso con el uso de partículas de ácido sebácico como un porógeno, como se muestra en el Ejemplo 9, o por conversión a una masa de fibras como se muestra en el Ejemplo 10.
La formación de folículos pilosos requiere una interacción entre células de la epidermis (es decir, queratinocitos) con célula de la dermis (es decir fibroblastos dérmicos/células de papila folicular) . La células dérmicas y epidérmicas que se usan en la fabricación de tejido manipulado equivalente a piel viva para usarse en el tratamiento de pacientes quemados actualmente se obtienen frecuentemente de tejido de prepucio de niños porque está disponible rápidamente. Estos equivalentes de piel, aunque son de un gran valor clínico, están exentos de folículos pilosos. De esta manera los queratinocitos en general o queratinocitos de esa fuente por lo general no han enseñado tener un valor particular en la construcción de implantes de tejido manipulado que se requieran para inducir la formación de nuevos folículos pilosos. Se ha establecido que, ? [p] referentemente las células epidérmicas sean del mismo paciente que se está tratando..." se describen por Cooley y Vogel (WO 99/01034), las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente.
Sorprendentemente se ha descubierto que estos queratinocitos del cuero cabelludo de adulto no son particularmente confiables y que los queratinocitos del prepucio de niños son, de hecho, más efectivos en su habilidad para inducir la neogénesis folicular en combinación con las células de papila dérmica. Aunque no se conoce la razón de estos descubrimientos (y no se desea dirigirse a ninguna teoría en particular) creemos que las células madre epidérmicas, una muy pequeña subcolonia de queratinocitos epidérmicos, se requieren para iniciar la neogénesis folicular y la epidermis de niños es una fuente más rica de estas células que la epidermis de adulto . Otras fuentes de células madres de los niños, por lo tanto, también pueden ser útiles. Por ejemplo, la sangre obtenida del cordón umbilical puede ser una fuente de células madre útiles, como lo pueden ser las células obtenidas de embriones o líneas de células madre embriónicas establecidas, o células obtenidas de la piel del cuero cabelludo de niños bajo procedimientos establecidos de donación de órganos.
El componente dérmico de la construcción e la célula epidérmica/dérmica de la presente invención se puede obtener de folículos disecados obtenidos del sujeto que va a recibir el tratamiento de restauración de cabello.
Otra posibilidad, sin embargo, es obtener células del cuero cabelludo de un donador de órganos, convenientemente un niño. Las células que se van a sembrar en un andamio se pueden obtener por medio de cultivo de un fragmento de folículo seleccionado de fragmentos que consisten de papila dérmica, vaina dérmica, matriz, y vaina interna y externa de las raíces. Alternativamente, las células simplemente se pueden cultivar de una mezcla de células preparadas de la dermis intacta del cuero cabelludo o de raspaduras de tejido dérmico y folicular que queda después de disecar la unidad folicular del donador de tejido de un procedimiento quirúrgico de restauración de cabello tradicional, en el cual el donador es también el recipiente de las células.
Las células epidérmicas, sin importar su origen, están convenientemente contenidas dentro de la luz del filamento hueco, adherente o adyacente a la pared interna de la luz o de otra forma contenido en una estructura porosa ahí. Las células progenitoras de folículo piloso obtenidas de una biopsia de cuero cabelludo con cabello, y multiplicadas en cultivo, de la persona que va a recibir el injerto biomimético están convenientemente contenidas principalmente en el compartimiento próximo a la luz del filamento, que corresponde al bulbo del folículo piloso. De esta manera el inserto se auto contienen en los componentes dérmico y epidérmico que están presentes en la correcta relación entre ellos, obviando la necesidad de implantar células que interactúen con la epidermis intacta o con las células epidérmicas que crecen abajo del injerto implantado. Esto, a su vez, proporciona conflabilidad y reproductibilidad de la formación de nuevos folículos pilosos.
Alternativamente, las células dérmicas y epidérmicas se pueden combinar como una mezcla, con la adición opcional de células madres, y sembrarlas en el andamio justo antes del implante. En este caso las células se asocian y reorganizan in situ. Una configuración de andamio adecuado para este método de entrega de células se muestra en las figuras 12 a 14. En esta modalidad, el andamio se fabrica como un filamento hueco con un extremo cerrado para formar una estructura porosa, tipo esponja que sirve como un depósito para absorber el fluido. De esta manera al inyectarle una suspensión de células y fluido hacia la luz del filamento hueco, el fluido se absorbe hacia el extremo de depósito provocando la recolección de las células en un área concentrada en el extremo cerrado del filamento. El andamio que contienen las células se implanta inmediatamente en la herida profunda en la piel, de la misma manera que se implantó el injerto folicular en un procedimiento quirúrgico tradicional de restauración de cabello. Un proceso para fabricar el andamio de esta modalidad se muestra en el ejemplo 9 y consiste de los siguientes pasos:
1. Proporcionar un mandril cónico con las mismas dimensiones del segmento distante de una punta de pipeta u otros medios de entrega de fluido adecuados . 2. Proporcionar una cavidad de molde, abierto en ambos extremos, que acomode el mandril del paso 1 como un inserto para la cavidad, la cual es más larga que el mandril, la longitud adicional crea un volumen vacio aproximadamente igual al volumen del mandril mismo.
3. Proporcionar una mezcla de materiales bioabsorbibles A disueltos en el disolvente B y partículas de porógeno C que son solubles en el disolvente D, pero no en el disolvente B. 4. Llenar la cavidad del paso 2 con la mezcla del paso 3 e insertar el mandril del paso 1. 5. Remover el disolvente B y extraer la parte moldeada de la cavidad del molde.
6. Colocar la parte moldeada del paso 5 en el disolvente D para remover la partícula de porógeno.
7. Colocar la parte moldeada del paso 6 en una solución reticulada E disuelta en disolvente F. 8. Enjuagar con disolvente F fresco u otro disolvente adecuado y permitir al andamio resultante que se seque . 9. Opcionalmente re-hidratar el andamio del paso 8 con una solución acuosa de una sustancia soluble en agua G y permitir que se evapore el agua para crear un recubrimiento protector. 10. Preparar una solución de material bioabsorbible H en disolvente I . 11. Cubrir el andamio del paso 9 con la solución del paso 10 y permitir que el disolvente I se evapore . 12. Remover el recubrimiento protector del material G remojando el andamio en agua, enjuagando con agua fresca, y permitiendo que se evapore el agua.
En un proceso adecuado que involucra los pasos antes mencionados, A es una mezcla de 6 sulfato condroitina y gelatina, B es agua, C es partículas de ácido sebácico menor que 63 micrones, D es acetona, E es EDC, y F es una mezcla de 9:1 por volumen de acetona: agua.
Una modificación del proceso antes mencionado para crear la modalidad que se muestra en el Ejemplo 10 consiste de los siguientes pasos:
1. Proporcionar un mandril aguzado con las mismas dimensiones del segmento distante de una punta de pipeta u otros medios de entrega de fluido adecuados, excepto que la punta del mandril se extiende ligeramente para proporcionar una punta afilada . 2. Cubrir el mandril del paso 1 con un polímero A soluble en agua. 3. Unir a la punta del mandril del paso 1 una sustancia B de filtración bioabsorbible, permeable que sea adecuada para separar las células de una suspensión de células en un fluido, la sustancia de filtración considerablemente encerrada en una cubierta protectora C que se pueda quitar, soluble en el disolvente D. 4. Cubrir el mandril completo y la sustancia de filtración B con un polímero bioabsorbible E que forme una película, disuelto en el disolvente F. 5. Remover el disolvente F del paso 4 para crear una capa continua de película de polímero bioabsorbible que cubra el mandril y una la punta del paso 3. 6. Crear una abertura en la película del paso 5 quitando un pedazo pequeño de la película que cubre el material de filtración distante a los puntos de unión del mandril. 7. Remover considerablemente el polímero A remojando el producto del paso 6 en agua. 8. Remover considerablemente el material C de recubrimiento protector remojándolo en disolvente D. 9. Remover el mandril del producto y continuar con los paso 7 y 8 como sea necesario para remover completamente los materiales A y C.
En una modalidad adecuada del proceso antes mencionado, A es un surfactante, por ejemplo Pluronic™ F-127, B es una masa de fibras que comprende 6 sulfato condroitina y gelatina reticulada, C es azúcar de caña caramelizada, D es agua, E es PLGA, y F es diclorometano .
Un método adecuado para fabricar andamios de filamento hueco largo de la presente invención que están abierto por ambos extremos involucra el uso de monofilamentos de nailon como un mandril, posteriormente removido por disolución, sobre el cual se depositan varios ingredientes. Las fibras hechas de otros materiales se pueden quitar sin dañar el biomaterial, se prevé que las investigaciones sean útiles en este proceso. Alternativamente, la extrusión del fundido del filamento hueco es una tecnología probada que también se puede usar para crear los filamentos huecos de la presente invención.
En un proceso de la presente invención, una fibra fina de nailon se recubre primero con partículas para asegurar que la aplicación del material bioabsorbible en la forma de una solución viscosa se adherirá a la fibra. Estar particular se aplican a, adhieren a, o asocian con, la fibra de nailon usando una solución de nailon u otros polímeros como el poliestireno . Las partículas de nailon (u otro polímero) se adhieren firmemente a la fibra fina de nailon y ayudan al subsiguiente recubrimiento de la fibra con una solución acuosa, viscosa, por ejemplo una solución de ácido hialurónico, el cual de otra forma no se pegaría a la superficie del nailon. Una sustancia adecuada para usarse como partículas es el ácido sebácico, el cual es considerablemente insoluble en agua (un disolvente para ácido hialurónico) y TFE (un disolvente para nailon) , pero es libremente soluble en acetona (un no disolvente para ácido ialurónico y nailon) . Las partículas también sirven para impartir una superficie luminal porosa a los filamentos huecos resultantes al remover esas partículas. Después de curar, reticular, o de otra manera volver el material del recubrimiento bioabsorbible insoluble en agua, el nailon y las partículas unidas al nailon se quitan con los disolventes adecuados. Si se desea, se puede aplicar una capa de un material bioabsorbible diferente. En esta etapa del proceso, con el nailon y las partículas de nailon quitadas, se puede usar una mayor variedad de disolventes para aplicar este segundo material. Un segundo material adecuado es un copolímero de lacturo y glicoluro (de aquí en adelante llamado PLGA) , que proporciona en este proceso un filamento hueco con un interior HAX y un exterior PLGA.
De lo anterior, los pasos detallados de este proceso son: 1. Proporcionar un material soluble en agua W. 2. Proporcionar una fibra de material X que sea soluble en el disolvente A. 3. Proporcionar material bioabsorbible Y que sea soluble en el solvente B. . Proporcionar partículas P que sean solubles en el disolvente C.
Proporcionar material bioabsorbible Z que sea soluble en el disolvente D. Proporcionar un polímero M que sea soluble en el disolvente N. Preparar una solución de polímero M en disolvente N. Cubrir la fibra del paso 2 con la solución del paso 7. Cubra la partícula P del paso 4 sobre la fibra recubierta del paso 8 y permita que el disolvente N se evapore, enlazando las partículas sobre la fibra . . Prepara una solución del material Y en el disolvente B. . Cubra la solución del paso 10 sobre la partícula de fibra incrustada del paso 9 y permita que el disolvente B se evapore. . Si el material Y es soluble en agua, vuelva el material Y insoluble en agua por medio de la reticulación. Remueva el polímero N de la fibra recubierta del paso 12 por medio de disolución y enjuague con disolvente N. Remueva las partículas P de la fibra recubierta del paso 13 por medio de disolución y enjuague con disolvente C.
. Remueva la fibra X de la fibra revestida del paso 14 por medio de disolución y enjuague con disolvente A. . Prepare una solución de material W en agua. . Si se requiere, aplique una cubierta protectora de la solución del paso 16 al filamento del paso 15 y permita que se evapore el agua. . Prepare una solución de material bioabsorbible del material Z en disolvente D. . Cubra la fibra del paso 17 con la solución del paso 18 y permita que el disolvente D se evapore. . Remueva la cubierta protectora del material W remojando los filamentos en agua, enjuague con agua fresca y permita que el filamento se seque. . Corte los filamentos en las longitudes adecuadas y esterilice. . Siembre los filamentos con las células adecuadas permitiendo una suspensión de las células en el volumen adecuado del fluido adecuado para que se mojen en la luz del filamento. . Opcionalmente cargue el filamento con construcciones celulares adicionales insertándolo en un extremo del filamento. . Haga una incisión en la piel donde se desea que crezca el tallo piloso e implante el filamento del paso 22 o 23 en la incisión con el extremo que contiene la construcción celular anidado en la piel y el extremo distante extendido de forma percutanea sobre la piel.
En un proceso adecuado que involucra los pasos antes mencionados, W es azúcar cañe caramelizada, X es nailon, A es TFE, Y es ácido hialurónico (sal de sodio) , B es agua, P es ácido sebácico (partícula del tamaño de 10 a 50 micrones, preferentemente de 50 a 200 micrones) , Z es PLGA, D y N son diclorometano, M es poliestireno, y C es acetona. Si se desea impartir porosidad al PLGA, D se puede especificar como una solución de glicerol y TFE. Después de la evaporación del TFE, en la fase de separación el PLGA y el glicerol se separan en una emulsión bicontinua. Quitar el glicerol por medio de disolución en agua imparte una estructura micro porosa al recubrimiento PLGA restante.
Para fabricar un andamio que se use en aplicaciones de tejido manipulado de cartílago, un gran número de las fibras del paso 11 mencionado anteriormente, con o sin la adición de otros ingredientes, se pueden hacer manojo juntas usando una solución de recubrimiento adicional del paso 10 como un adhesivo. Antes de disolver las fibras del mandril, el manojo se puede cortar en discos de los cuales se pueden construir los productos deseados después de disolver las fibras y completar los pasos del proceso.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. El PLGA no daña el transplante del folículo sobreviviente y el crecimiento del cabello .
Un copolímero (PLGA) de d, 1-lacturo y glicoluro (52:48) se obtuvo de CCA Purac Biochem bv, Gorinc em, Los Países Bajos (Purasorb® PLGA, de viscosidad inherente 1.06 dl/g en cloroformo) y se disolvió en diclorornetaño (10% w/v) . El azúcar de caña de fundió y calentó hasta que se caramelizó y se dejó enfriar hasta el punto en que los filamentos del tamaño deseado se pudieron jalar del fundido. Los filamentos se enfriaron hasta solidificarse y entonces inmediatamente se colocaron en una superficie cubierta con polvo de cloruro de sodio para prevenir que se volvieran pegajosos. Los filamentos huecos se prepararon recubriéndolos con la solución de PLGA sobre los filamentos de azúcar caramelizada con polvo, encostrados en sal. Se evaporó el diclorometano, y el azúcar y la sal se disolvieron y quitaron al colocar los filamentos recubiertos en agua.
Los folículos vibrisa (bigotes) se extirparon de ratones sacrificados C57B16 (Charles River) en la Universidad Mercer (Atlanta, Ga) bajo una IACUC-aprobada. Los bigotes extirpados se reimplantaron en incisiones oblicuas en la piel dorsal rasurada de los ratones singénicos. Este procedimiento se repitió con los folículos extirpados primero insertados y que ajustan apretadamente en la luz del filamento hueco PLGA de tal manera que los- folículos quedan completamente rodeados por el polímero (Fig. 7) . Después de 30 días se sacrificaron los ratones a los que se les hizo el implante y se les extirpó la piel, se estiraron sobre rectángulos de cartón, fijados en formalín y se procesaron por medio de métodos rutinarios de parafina incrustados, se cortaron y tiñeron con H&E para analizarlos por medio de microscopía óptica.
Después de 30 días, se encontró que a 7 de 8 folículos de control implantados les estaban creciendo tallos pilosos vibrisa. También se encontró que 2 de 3 PLGA/folículos implantados también les estaban creciendo tallos pilosos (Fig. 8) . Los estudios histológicos no revelaron anomalías en los folículos transplantados, regenerados con o sin formación de la vaina en PLGA.
Ejemplo 2. Preparación de filamento hueco micro poroso PLGA.
Una solución de glicerol (glicerina U.S.P.) y PLGA (Resomer™ RG504, Boehringer Ilgelheim, Alemania) se preparó en TFE (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) de tal manera que la proporción de glicerol a PLGA fue de 80:20 (w/w) . Esta solución se recubrió sobre filamentos de azúcar caramelizada (preparada como se describe en el Ejemplo 1) en varias capas con tiempo permitido entre el recubrimiento y el secado. La evaporación del TFE, un disolvente tanto para glicerol como PLGA, provocó que la concentración de los solutos aumentara hasta que el glicerol ya no fue miscible. La fase de separación de glicerol del PLGA/TFE produce una emulsión bicontinua. Los filamentos recubiertos se colocaron entonces en agua, lo cual provocó que el azúcar y el glicero, asi como cualquier residuo de TFE, se disolvieran rápidamente y lixiviara del PLGA ahora micro poroso. Los filamentos huecos porosos resultantes se enjuagaron con agua y se les permitió secar completamente en un desecador. La estructura porosa de los filamentos huecos de PLGA, secos se muestra en las fotografías SEM de las Figuras 4 y 5.
Ejemplo 3. Preparación de un filamento hueco hidrofílico PLGA.
Se preparó una solución de aproximadamente 5% (w/v) surfactante Pluronic™ F-127 (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) , el cual es un copolimero de oxido de etileno y óxido de polipropileno, en anhidro etanol con calentamiento suave. Los filamentos huecos de PLGA se prepararon como se describe en el Ejemplo 1. A la solución clara, sin color de Pluronic™ F-127 se le permitió que se absorbiera hacia uno de los filamentos de PLGA y al etanol se le permitió que se evaporara completamente. Se colocó una gota de color rojo para alimentos en un plato de vidrio. Un filamento hueco de PLGA tratado con Pluronic™ F-127 de 15 mm de longitud y un filamento de control no tratado de 15 mm de longitud, del mismo diámetro, se pusieron en contacto con la tintura tocando un extremo de cada filamento en la superficie del liquido. El filamento tratado con Pluronic™ F-127 absorbió rápidamente la solución de tintura acuosa en su longitud completa y el filamento no tratado únicamente absorbió lentamente la tintura en 4mm de su longitud.
Ejemplo 4. Preparación de un filamento de PLGA recubierto de HAX.
El ácido sebácico (Aldrich Chemical Co . , Milwaukee, WI) se molió por medio de mortero y pistilo y se tamizó para obtener partículas del tamaño de >63 y <212 micrones. Una fibra de nailon de monofilamento fino de un metro de longitud (0.003 pulg. de diámetro, Shakespeare Monofilament División, Columbia, SC) se recubrió con una solución de nailon en TFE (10% w/v) e inmediatamente se incrustó con partículas de ácido sebácico extrayendo la fibra a través de una pipeta que contenía la solución y después a través de una pila de partículas de ácido sebácico colocada en la salida de la punta de la pipeta. Se suspendió la fibra en un extremo y se permitió que colgara en una posición vertical. Se hizo una solución de sal sódica de ácido hialurónico al combinar 180 mg de polvo de hialuronato de sodio (peso molecular 1.4 millones, Lifecore Biomedical, Chaska, MN) con 10 mi de agua y se le permitió hidratarse y disolverse a temperatura ambiente durante toda la noche. La solución se mezcló bien y después se recubrió la fibra manualmente corriendo una gota del líquido gelatinoso en la fibra. Al recubrimiento delgado de la solución de hialuronato se le permitió secarse y entonces se le aplicaron dos capas adicionales con tiempo permitido para secarse entre capas. La fibra se cortó en longitudes de aproximadamente 4-cm y se colocó en un vial que contenia 0.2% (w/v) de ?,?' -isopropiletilaminocarboimida (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en acetona que contenia 10% (v/v) de agua. Después de 3 horas a temperatura ambiente, se decantó la solución y se reemplazó con acetona pura. Se decantó la acetona y se removió el residuo de acetona por medio de evaporación. El vial se llenó entonces con TFE (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) y se le permitió pernoctar a temperatura ambiente. El TFE se decantó y se reemplazó con TFE fresco y después de varias horas se decantó y se reemplazó con acetona. La acetona se decantó y el residuo de acetona se removió por medio de evaporación para producir filamentos HAX.
El azúcar de caña se calentó sobre una flama abierta en un tubo de prueba agitándolo hasta que se fundió y caramelizó. El fundido café oscuro se vertió y se permitió que solidificara. Se preparó un jarabe al disolver esto en agua (aproximadamente 20% w/v) . Los filamentos HAX secos se colocaron en el jarabe en donde absorbieron rápidamente el liquido y se hicieron notablemente más grandes en diámetro. Los filamentos se quitaron del jarabe y se les permitió que se secaran parcialmente. Después se recubrieron con cloruro de sodio en polvo (<63 micrones) y se colocaron en un desecador para secarse toda la noche. Los filamentos rígidos, frágiles, de color ámbar se introdujeron en una solución de 10% (w/v) de PLGA (Purasorb®PDLG, de viscosidad inherente 1.06 dl/g en cloroformo, CCA Purac Biochem bv, Gorinchem, Los Países Bajos) en diclorometano (Aldrich Chemical Co . , Milwaukee, WI ) y se permitió que se evaporara el disolvente. Se permitió que los filamentos recubiertos se remojaran en agua hasta que se disolvieran el azúcar y la sal, como lo evidencia la pérdida del color ámbar. Después se regresaron los filamentos al desecador y se les permitió secar completamente. Los filamentos huecos de control PLGA que no contenían HAX se prepararon por medio del método del Ejemplo 1. La habilidad de estos filamentos para absorber fluido acuoso se probó al sumergir un extremo en una gota de agua que contenía tintura de color rojo para alimentos. El agua roja entró rápidamente a la luz del filamento que contenía HAX y la llenó completamente, dándole un color rojo al filamento. El filamento que no contenía HAX, sin embargo, no absorbió el agua y, al ser repelente al agua, flotó en la superficie del agua.
Ejemplo 5. Neogénesis de folículo piloso y crecimiento del tallo piloso in vivo de células de ratón contenidas en un andamio de filamento hueco de PLGA.
Se aislaron células epidérmicas y dérmicas de ratones recién nacidos como se describe anteriormente (S.M Prouty, L. Lawrence, et al. (1996). "Inducción dependiente de fibroblastos de una lesión de piel murina con similitud al nevo azul humano, común." Am. J Pathol 148(6): 1871-85), las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente. Dos divergencias del procedimiento publicado son el uso de ratones C57/B16 (Charles River Laboratories) y el uso de dispasa (Gibco) , en lugar de tripsina, para facilitar la separación de la epidermis de la dermis de la piel del ratón neonato. Una vez que ambas colonias de células, dérmicas y epidérmicas, se aislaron separadamente, se recombinaron en una proporción de células dérmicas a epidérmicas, también conocidas como yemas epidérmicas, de 100:1. Esta combinación de células se retorció a 900 rpm durante 5 minutos. El sedimento resultante se resuspendió en PBS para obtener una concentración de células de al menos 10 millones de células totales por milímetro y se cargó rápidamente en filamentos huecos de PLGA, preparados de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1, simplemente sumergiendo la fibra en la suspensión de células. Estos filamentos de células sembradas se implantaron debajo de la piel dorsal ratones desnudos (Nu/Nu) perforando la piel con una aguja hipodérmica calibre 19 separando la aguja hasta que la mitad del bisel abierto está expuesto, insertando el filamento hueco implantado en la abertura, y después separando la aguja completamente mientras empuja el filamento debajo de la piel. Tres semanas después de la implantación los ratones fueron sacrificados y se extirpó la piel. Se observaron estructuras similares a folículos y tallos pilosos asociados con el material del andamio PLGA en el lado subcutáneo de la piel en el lugar de la implantación de filamentos . Como se muestra en la Figura 9, en esta foto micrografía se pueden ver un bien formado bulbo de folículo piloso y un tallo piloso largo. El material del andamio es difícil de ver porque tiene menos color y está parcialmente degradado.
Ejemplo 6. Uso de 6-sulfato-condroitina como aditivo en la suspensión de células.
Los métodos descritos en el Ejemplo 5 se utilizaron para evaluar un número de materiales solubles agregados a la suspensión de células antes de inyectarlas a un ratón desnudo.
Se inyectó exactamente el mismo número de cada tipo de célula tanto en los lugares de inyección del material de control y de prueba, los cuales fueron localizados en el mismo ratón. Como se muestra en la Figura 10, los folículos formados en el espacio subcutáneo 13 días después de la inyección de las células eran claramente más largos exactamente en la misma ampliación en presencia de una concentración inicial de 5% de 6-sulfato-condroitina (Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) .
Ejemplo 7. Uso de Pluronic™ F-127 como aditivo en la suspensión de células.
El experimento del Ejemplo 6 se repitió sustituyendo el 20% de surfactante Pluronic™ F-127 (Sigma Chemical co., St. Louis, MO) con 6-sulfato-condroitina . Como se muestra en la Figura 11, los folículos formados en el espacio subcutáneo 13 días después de la inyección de células era claramente más largo exactamente en la misma ampliación que los folículos en el lugar de la inyección de control donde el surfactante Pluronic™ F-127 no estuvo presente en el fluido inyectado .
Ejemplo 8. Preparación de filamentos huecos de gelatina reticulada.
La gelatina de piel de porcino (300 sangre, Sigma Chemical Co . , St. Louis, MO) se disolvió en agua tibia para dar un 5% (w/v) de solución. Esta solución se aplicó a un filamento de nailon fino incrustado con partículas de ácido sebácico como se describe en el Ejemplo 4. Se aplicaron varias capas con tiempo entre aplicaciones para que secara el recubrimiento. La fibra se cortó entonces en longitudes de aproximadamente 4 cm y se colocó en un vial conteniendo 0.2% (w/v) de EDC (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en acetona que contenía 10% (v/v) de agua. Después de 3 horas a temperatura ambiente, se decantó la solución y se reemplazó con acetona pura. Se decantó la acetona y los residuos de acetona se removieron por medio de evaporación. El vial se llenó entonces con TFE (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) y se permitió que estuviera toda la noche a temperatura ambiente. Se decantó el TFE y se reemplazó con TFE fresco y después de varias horas se decantó y reemplazó con acetona. La acetona se decantó y el residuo de acetona se removió por evaporación para producir filamentos huecos de gelatina insolubles en agua.
Ejemplo 9. Preparación de andamios de gelatina/6-sulfato-condroitina reticulado.
El ácido sebácico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) se molió con mortero y pistilo en partículas que pasaron por un tamiz de 63-micrones . Las puntas de pipeta de 10 microlitros desechables (Eppendorf epTIPS™, Brinkman instruments, Westbury, NY) se cortaron en tres partes iguales. La pieza próxima se descartó y la pieza media se empacó con el polvo de ácido sebácico. El 6-sulfato-condroitina (80 mg) y la gelatina de piel porcina (80 mg) se disolvieron en 2.0 mi de agua tibia. Esta solución se cargó en una jeringa ajustada con un tubo de acero inoxidable que ajustó apretadamente en la abertura larga de la sección de punta de la pipeta llena con ácido sebácico. La solución se inyectó en el ácido sebácico empacado de tal manera que el aire se expelió del polvo a medida que el fluido se movió a través del paquete. La pieza distante que se cortó de la punta de la pipeta se insertó en la pieza llena. El exceso de pasa que se salió del extremo abierto se limpió con frotación.
A las piezas ensambladas se les permitió secar completamente al almacenarse en un desecador toda la noche. Después se colocaron en una solución de EDC al 0.2% (w/v) al 9:1 (v/v) acetona: agua. Después de aproximadamente una hora las dos piezas de la punta de la pipeta se separaron suavemente y se sacó el producto moldeado y se regresó a la solución EDC durante 3 horas adicionales, después de lo cual andamio reticulado se remojó en acetona pura durante una hora, y después se le permitió secarse.
Ejemplo 10. Andamio de vaina de punta de pipeta de PLGA y filamentos de 6-sulfato-condroitina/gelatina reticulada.
El 6-sulfato condroitina y la gelatina de piel porcina (100 mg cada uno) se disolvieron en 2.0 mi de agua tibia de-ionizada y se inyectó lentamente a través de una aguja calibre 26 hacia el tubo de goma de silicón lleno con acetona que estaba fluyendo desde un depósito elevado hacia un vaso de precipitado. Los filamentos blancos, finos se recolectaron y colocaron en una solución de EDC al 0.2% (w/v) al 9:1 (v/v) acetona: agua durante aproximadamente 4 horas. Los filamentos se enjuagaron después con acetona pura y se les permitió secarse. Una solución al 30% (w/v) de azúcar de caña caramelizada en agua se agregó a los filamentos secos y se le permitió remojarse hasta que los filamentos estuvieron completamente saturados . Un pequeño mechón de la masa de fibras saturadas se colocó en un tubo Teflón™ de un diámetro interior de 1.0 mm y se le permitió secarse completamente en el desecador. El cilindro de azúcar café que encierran los filamentos se sacó del tubo y se montó en la punta de una aguja calibre 30 sobresaliendo un poco a través del extremo de la punta de la pipeta Eppendorf (10 microlitros epTIPS™, Brinkman Instruments, Inc., USA) . La punta de la pipeta con los filamentos unidos encerrados en azúcar se sumergió en una solución de Pluronic™ F-127 al 30% ( /v) en diclorometano, se le permitió secarse, y después se sumergieron en una solución de PLGA al 15% (w/v) en diclorometano y se le permitió secarse, con la punta suspendida hacia abajo. El extremo distante del PLGA seco se cortó con tijeras y la punta de la pipeta completa se colocó en agua. Después de algunos minutos la película de PLGA se deslizó fuera de la punta de la pipeta debido al recubrimiento del surfactante Pluronic™ F-127 hidratado. Al andamio resultante se le permitió remojarse más hasta que el color café del azúcar caramelizada desapareció.
Para probar la habilidad del material fibroso contenido en la vaina de PLGA para funcionar como medio de filtración, y por lo tanto como un medio para recolectar e implantar células inductivas de folículo piloso, se extrajo en agua una lechada de partículas de carbón (100-400 malla, Norit CAI Carbón Activado, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en una punta de pipeta de 10 microlitros, la punta se insertó en la vaina del andamio de PLGA, y la lechada salió de la pipeta a través del extremo del andamio. Como se muestra en la figura 15, las partículas de carbón son claramente visibles en el extremo próximo del material fibroso en donde se recolectan a medida que el agua pasa.
Ejemplo 11. Andamio HAX de filamento hueco en manojo para tejido manipulado de. cartílago.
Se disolvió hialuronato de sodio (MW 1.4 x 106 Daltons, producto no. 80081, LifeCore Biomedical, Inc., Chaska, MN 55318) en agua deionizada, se colocó en un tubo de diálisis y se dializó contra celulosa de intercambio catiónico (Dowex AG 50"-X4, comprada de BIO-RAD Laboratories, Inc., Hercules, CA) a 1 gramo por 100 mi de agua deionizada y se agitó por medio de una barra magnética a 4°C durante 2 días. La solución se quitó del tubo de diálisis y se secó por congelación para obtener un sólido blanco esponjoso, el cual se volvió a disolver en agua deionizada para obtener una solución viscosa que contenía ácido hialuronico al 3.4% (w/v) .
Los hilos de monofilamento de nailon (0.003 pulgadas de diámetro, SN-38 WonderThread™, Shakespeare Monofilament División, Columbia, SC) se estiraron en 3 metros de longitud y se recubrieron con una lechada de polvo de ácido sebácico (<63 micrones) en una solución de aproximadamente 5% (w/v) de poliestireno (fragmentos de placas de cultivo desechables) en diclorometano hilando la fibra a través de una pipeta de transferencia desechable (cat. No. 231, Samco Scientific Corp.,- San Fernando, CA) con una parte del bulbo cortado, inyectando la lechada en la pipeta a través de la apertura del bulbo, y después corriendo la pipeta hacia debajo de la longitud de la fibra (primero el bulbo) de tal manera que la punta de la pipeta actúe como un orificio para la depositación uniforme de la lechada. Después de la evaporación del diclorometano, la fibra recubierta era de un color blanco plano y tenia una notable sensación más áspera al tacto que la fibra no recubierta. Después se aplicó la solución de ácido hialurónico antes mencionado a la fibra recubierta de una manera similar. Se aplicaron cinco capas con aproximadamente una hora para secar entre la aplicación de cada capa de ácido hialurónico. Las fibras se enrollaron entonces cuidadosamente y se colocaron en una placa cubierta con una solución de EDC al 0.2% (w/v) en acetona con 10% (v/v) de agua deionizada y se le permitió remojarse toda la noche sumergida en este liquido. Se enjuagaron en acetona pura y se estiraron otra vez, esta vez en manojos de aproximadamente 10 fibras hacia un manojo continuo. El manojo se recubrió con la solución de ácido hialurónico a mano, es decir, sosteniendo una pequeña masa de la solución viscosa entre el pulgar y los dos primeros dedos de una mano con el manojo colocado en la separación formada por la unión de los tres dígitos y corriendo la mano hacia debajo de la longitud del manojo. Se aplicaron varias capas con tiempo permitido para secarse entre cada aplicación. El manojo recubierto se enrolló y colocó en una placa cubierta de solución EDC como se menciona anteriormente y se le permitió remojarse toda la noche. Después se enjuagó con acetona pura y se le permitió secarse .
El manojo se cortó en longitudes de 4 cm y cada pieza se recubrió con una cantidad libre de la solución de ácido hialurónico. Se hicieron manojos con las piezas recubiertas juntas y se amarraron con monofilamento de nailon de un diámetro de 0.009 pulgadas (Shakespeare) amarrando bucles individuales alrededor del manojo. Como cada bucle se apretó y amarró, el exceso de la solución de ácido hialurónico se extruyó del manojo, el cual se colgó por un extremo para secarse. El exceso de solución se aplicó por goteo al extremo y un dia después el manojo era un compuesto ligero, duro. Se cortó entonces en discos de 3 mm de diámetro con una hoja de rasurar y los discos se colocaron en una solución de EDC antes mencionada de un lote reciente durante toda la noche tanto para reticular el ácido ialurónico como para disolver el ácido sebácico y el diclorometado durante otro periodo de una noche para terminar de disolver el poliestireno . Después se colocaron en TFE para disolver el nailon. El TFE se reemplazó después de una hora con TFE fresco y se le permitió a los discos remojarse en TFD toda la noche. Después se enjuagaron con TFE fresco, después con acetona y se les permitió secarse. Los discos secos se colocaron en una solución acuosa al 50% de glutaraldehido (Acros no. 41096-5000, comprado de Fisher Scientific co . , Fairlawn, NJ) y se les permitió remojarse durante 72 horas a temperatura ambiente como se recomienda en "Método con ' otro tratamiento de polipéptido mejora la adhesión de fibroblastos a las hebras de hialuronano" por M. Hu, E.E. Sábelman, S. Lai, E. . timek, F. Zhang, V. R. Hentz, y W. C. Lineaweaver en el Periódico de Investigación de Materiales Biomédicos, vol. 47 hojas 79-84 (1999), las enseñanzas de la cual se incorporan a la presente. Este tratamiento convirtió el EDC reticulado con HAX en un material que se degrada más lentamente más adecuado para la aplicación de tejido manipulado de cartílago. Al quitar los discos del glutaraldehido se enjuagaron con varios cambios de agua deionizada y después se remojaron en agua toda la noche. Entonces se enjuagaron otra vez y se colocaron en una solución al 70% (v/v) de isopropanol/agua como desinfectante antes de usarlo para sembrar células y estudios de biorreactores.
Claims (31)
- REIVINDICACIONES Una estructura bioabsorbible que consiste de un filamento que define una luz interna, la estructura se adapta para usarse en tejidos manipulados. La estructura de la reivindicación 1 se adapta para usarse en tejidos manipulados de folículos pilosos. Un manojo de la pluralidad de estructuras de la reivindicación 1, el manojo se adapta para usarse en aplicaciones de tejidos manipulados seleccionados de un grupo que consiste de hueso, cartílago y tejidos osteocartilaginosos . La estructura de la reivindicación 1 en donde el filamento consiste de una capa interna y una capa externa, la capa interna tiene una superficie interna que define la luz. La estructura de la reivindicación 1 consiste de uno o más materiales bioabsorbibles seleccionados del grupo que consiste de poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) , poli (carbonato de trimetileno) , poli (carbonato de dimetiltrimetileno) , poli (ácidos aminos) , poli (carbonatos) derivados de tirosina, poli (carbonatos) , poli (carprolactona) , poli (para-dioxanona) , poli (ásteres) , poli (éster-aiaidas) , poli (anhídridos) , poli (orto esteres), colágeno, gelatina, albúmina de suero, proteínas, polisacáridos, mucopolisacáridos, carbohidratos, glicosaminoglicanos, poli(etileno glicoles) , poli (propileno glicoles), y copolímeros, combinaciones y mezclas de los materiales bioabsorbibles, así como oligómeros que contengan ligaduras bioabsorbibles que son copolímerizados en bloques con polímeros que, de otra forma, no son degradables que se metabolizan o excretan al liberarse por medio de hidrólisis o degradación de las ligaduras biodegradables . La estructura de la reivindicación 4 en la cual la capa externa es considerablemente no porosa y la capa interna porosa. La estructura de la reivindicación 4 en la cual la capa interna consiste de biomateriales seleccionados de un grupo que consiste de: colágeno, gelatina, derivados de celulosa, almidón, dextrina, chitosana, lipoproteínas, 6 sulfato condroitina, formas humanas recombinantes de colágeno y gelatina, fibrinógenos, fibrina, fibronectina, laminita, albúmina, proteínas de suero, polisacáridos, mucopolisacáridos, biopolímeros naturales que . se encuentran en el cuerpo humano de manera natural, y copolímeros, combinaciones y mezclas de los biomateriales y derivados reticulados de ellos . La estructura de la reivindicación 4 en la cual la capa externa consiste de un copolímero de lacturo y glicoruro y la capa interna consiste de un material bioabsorbible seleccionado del grupo que consiste de ácido hialurónico reticulado y 6 sulfato condroitina. Un proceso para la fabricación de las estructuras bioabsorbibles de la reivindicación 4 consiste de los pasos de: a. Preparar un estructura moldeada que consiste de un primer material bioabsorbible y un porogeno; b. Remover el porogeno de la estructura moldeada del paso a; y c. Reticular el material bioabsorbible; d. Cubrir la estructura con un segundo material bioabsorbible . El proceso de la reivindicación 9 en donde el primer material biodegradable consiste de una mezcla de 6 sulfato condroitina y gelatina y el porógeno consiste de partículas de ácido sebácico. Un implante para inducir el crecimiento de un folículo pilosos consiste de una estructura de la reivindicación 2, el filamento se siembra con células seleccionadas del grupo que consiste de: células obtenidas de fragmentos de folículo piloso, células de papila dérmica, células madre dérmicas, células de matriz, células de raíz interna y externa, células de epidermis de adulto o niño, células dérmicas de adulto o niño; células ítem derivadas de embriones, células de sangre del cordón umbilical, células de médula ósea, células de tejido adiposo, células de músculo, células de piel, y cualquier combinación de esas células. El implante de la reivindicación 11 en donde las células se multiplican en cultivo antes de sembrarse en los filamentos. El implante de la reivindicación 11 en donde las células epidérmicas se siembran en las paredes de la luz del filamento y las células foliculares se insertan sobre un extremo del filamento . El implante de la reivindicación 13 en donde las células foliculares consisten de células de papila dérmica. El implante de la reivindicación 14 en donde las células epidérmicas se siembran en la luz interna del filamento y una acumulación de las células de la papila dérmica cultivadas se insertan sobre un extremo de la luz del filamento. Un método de crecimiento de cabello o restauración consiste de los pasos de: a. Obtener células foliculares del cuero cabelludo; b. Cultivar las células foliculares para incrementar su número; c. Proporcionar una estructura con células epidérmicas; d. Sembrar la estructura con las células epidérmicas; e. Sembrar las células epidérmicas que contienen la estructura con las células foliculares obtenidas en el paso b; e f . Implantar la estructura sobre la piel donde se desea que crezca el pelo. El método de la reivindicación 16 en la cual las células del paso d se obtienen del prepucio infantil . El método de la reivindicación 17 en la cual las células del paso d se complementan con células ítem obtenidas de embriones, sangre del cordón umbilical, médula ósea, tejido adiposo, músculo, piel, y cualquier combinación de esas células. El método de la reivindicación 17 en la cual las células del paso a se cultivan de fragmentos de folículo seleccionados de fragmentos que consisten de papila dérmica, madre dérmica, matriz, y raíces madres internas y externas . El método de la reivindicación 16 en donde la estructura consiste de 6-sulfato condroitina. 21. Un proceso para la fabricación de estructuras bioabsorbibles consiste de los pasos de: a. Recubrir una fibra con partículas; b. Recubrir la fibra recubierta de partículas del paso a con una solución de material bioabsorbible; c. Volver el material bioabsorbible insoluble en agua, y d. Remover la fibra y partículas. El proceso de la reivindicación 21 además consiste del paso de recubrir la estructura resultante con un segundo material bioabsorbible. El proceso de la reivindicación 21 en donde la fibra es nailon, las partículas son ácido sebácico, y el material bioabsorbible de ácido ialurónico. El proceso de la reivindicación 22 en donde la fibra es nailon, las partículas son ácido sebácico, el material bioabsorbible es ácido hialurónico, y el segundo material bioabsorbible es un copolímero de lacturo y glicoluro . Un método para el crecimiento de hueso y cartílago que consiste de: a. Obtener hueso o cartílago de células progenitoras ; b. Sembrar la estructura de la reivindicación 3 con células del paso a; c. Implantar la estructura del paso b en un lugar en donde se deseé el crecimiento del nuevo tejido de huevo o cartílago. El método de la reivindicación 25 en donde la estructura consiste de ácido hialurónico reticulado. La estructura de la reivindicación 2 consiste de materiales bioabsorbibles seleccionados de poli (ácido láctico), poli (ácido glicólico) , poli (carbonato de dimetiltrimetileno) , poli (carbonato de trimetileno) , poli (ácidos aminos) , poli (carbonatos) derivados de tirosina, poli (carbonatos) , poli (carprolactona) , poli (para-dioxanona) , poli (ésteres) , poli (ester-amidas) , poli (anhídridos) , poli (orto ésteres), y copolímeros, combinaciones y mezclas de los materiales bioabsorbibles, así como de oligómeros que contengan ligaduras bioabsorbibles que son copolimerizados en bloque con polímeros que de otra forma no son degradables que se metabolizan o excretan al liberarse por medio de hidrólisis o degradación de las ligaduras biodegradables, y cubiertos en sus superficies internas (luminar) con materiales bioabsorbiles seleccionados de derivados de celulosa, almidón, dextrina, chitosana, lipoproteínas, formas humanas recombinantes de colágeno y gelatina, 6-sulfato condroitina, fibrinógenos, fibrina, fibronectina, laminina, albúmina, otras proteínas de suero, polisacáridos, mucopolisacáridos, y otros biopolimeros naturales que se encuentran en el cuerpo humano de manera natural, ya sea en su forma nativa o insoluble restituida por medio de retícula cori reagentes de retícula, proteínas, carbohidratos, glicosaminoglicanos, poli (etilenos glicoles) , poli (propilenos glicoles), poli (acrilato ésteres) poli (metacrilato ésteres), poli (vinilo alcohol), y copolímeros, combinaciones y mezclas de esos polímeros . La estructura de la reivindicación 27 en donde el material consiste de un copolímero de lacturo y glicoluro . La estructura de la reivindicación 28 en donde la estructura bioabsorbible se cubre con un copolímero de óxido de etileno y óxido de propileno. 30. El proceso para la fabricación de las estructuras de la reivindicación 2 consiste de los pasos de: a. Cubrir un mandril cónico con un polímero soluble en agua; b. Unir un material bioabsorbible a la punta del mandril; c. Cubrir el mandril y el material bioabsorbible con una película formada de polímero bioabsorbible; d. Remover el mandril de la estructura. 31. El proceso de la reivindicación 30 en donde el material bioabsorbible consiste de una masa de fibras que consiste de 6-sulfato condroitina y gelatina reticulada y la película formada de polímero bioabsorbible consiste de un copolímero de lacturo y glicoluro.
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