KR100973424B1 - 네스틴 발현 모낭 줄기 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유동물로부터 네스틴-발현 세포를 분리하여 모낭 줄기 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 이들 모낭 줄기 세포는 자가유래성 또는 이종 줄기 세포 치료를 위한 성인 줄기 세포의 공급원이다. 당해 줄기 세포는 포유동물에 전신 이식하거나, 기관으로 직접 이식한다. 또한, 당해 줄기 세포는 추가로 생체내에서 분화되고, 포유동물에 전신 또는 직접 이식할 수 있다.
네스틴 발현 모낭 줄기 세포, 분리법

Description

네스틴 발현 모낭 줄기 세포{Nestin-expressing hair follicle stem cells}
관련 출원에 대한 교차 문헌
본 출원은 본 명세서에 참조로 인용된, 2001년 9월 20일자로 출원된 가특허원 제60/323,963호로부터 미합중국 코드 § 119(e)하에 우선권을 주장한다.
본 발명은 모낭 줄기 세포(stem cell) 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 네스틴-발현 모낭 줄기 세포, 줄기 세포의 분리법 및 줄기 세포를 사용하는 질환 또는 질병의 치료법에 관한 것이다.
줄기 세포 치료법의 중요성이 인지되었음에도 불구하고, 줄기 세포 치료법은 이러한 치료법에 사용되는 배아 줄기 세포의 사용으로 인하여 논쟁으로 남아있다. 또한, 골수와 같은 공급원으로부터의 줄기 세포는 채취하기가 어렵다. 보다 논쟁의 여지가 있고 입수하기 덜 용이한 줄기 세포 공급원과 동일한 이점을 부여할 수 있는, 채취하기가 보다 용이한 성인의 줄기 세포 공급원이 있다면 당해 분야에 유용할 것이다. 본 발명은 포유동물의 모낭으로부터 유도되는 줄기 세포의 발견에 의한 필요성을 나타내고 있다. 모발과 관련된 간단한 배경이 본 발명의 모낭 줄기 세포에 대한 근간을 제공한다.
모발 성장은 독특한 주기적인 재생 현상이다. 모낭은 포유동물의 일생을 통하여 성장(아나젠), 회귀(카타젠) 및 휴지(텔로젠)기의 반복적인 사이클을 겪게 된다. 모낭 줄기 세포의 위치 및 기능은 모발 성장의 생물학 및 병리학을 모두 이해하는데 결정적인 문제이다[참조: Oshima, H., et al., Cell (2001) 104:233-245]. 줄기 세포의 특징인, 라벨 보유 세포가 소위 벌지 영역(bulge area)이라 불리우는 모낭의 항구적인 상부 부분에 위치하는 것으로 밝혀졌다[참조: Cotsarelis, G., et al., Cell (1990) 61:1329-1337].
최근에, 문헌[참조: Taylor, G., et al. Cell (2000) 102:451-461]은 모낭 벌지 줄기 세포가 잠재적으로 이들이 모낭 뿐만 아니라, 표피를 생성할 수 있는 양성 능력이 있다고 보고하고 있다. 다른 실험[참조: Oshima, et al., (상기 참조)]은 또한 마우스 성체의 비모의 상부 외모근초가 모낭 기질 세포, 피지선 기저 세포 및 표피로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포를 포함하는 새로운 증거를 제공하였다. 보다 최근에는, 문헌[참조: Toma, J. G., et al. Nature Cell Biology (2001) 3:778-784]에 피부 유도 전구체(SKP; skin derived precursor)라 불리우는, 포유동물의 피부 진피로부터 분리된 다능성 성인의 줄기 세포가 뉴론, 글리아, 평활근 세포 및 지방 세포를 생성하기 위하여 배양시 증식되고 분화될 수 있다고 보고하고 있다. 그러나, 피부에서 이들 줄기 세포의 정확한 위치 및 이들의 기능은 확실치 않다.
모발로부터 신경 줄기 세포와 관련된 줄기 세포를 분리하는 것이 당해 분야에서 유용하다. 본 발명에 따라, 모낭 줄기 세포 및 신경 줄기 세포의 관계가 형성되었다.
본 발명은 분리된 모낭 줄기 세포 및 이로부터 분화된 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 마커(예: 네스틴) 및 보다 바람직하게는, 녹색 형광 단백질에 결합된 네스틴을 근거로 하여 분리된다.
본 발명의 다른 측면은 모낭을 함유하는 피부를 포유동물로부터 제공하고, 이로부터 모낭 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 모낭 줄기 세포의 분리법에 관한 것이다. 바람직하게는, 피부는 텔로젠 피부이다.
본 발명의 다른 측면에서, 분리된 모낭 줄기 세포는 배양 배지에서 다시 배양하여 분화된 세포를 생성한다. 바람직한 양태로, 배양 배지는 FBS, BDNF, PDGF 또는 CNTF를 포함한다. 다른 바람직한 양태로, 분화된 세포는 뉴론, 성상 세포, 평활근 세포 또는 지방 세포이다.
본 발명의 다른 측면은 줄기 세포 또는 이로부터 분화된 세포를 질환을 나타내는 포유동물로 이식하는 단계를 포함하는, 질환, 바람직하게는 신경학적 또는 퇴행성 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 세포는 자가유래성 또는 이종성일 수 있다. 한 양태로, 세포는 포유동물에 전신 주사에 의해 이식되며, 다른 방법으로는 포유동물의 기관으로 세포를 직접 주사하여 이식된다. 바람직한 기관 또는 조직은 뇌, 간 또는 심혈관계 조직이다. 바람직한 질환은 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 연령 관련 기억 상실, 탈모, 화상, 피부 노화 및 피부 대체이다.
도 1a 내지 도 1d는 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스 피부의 텔로젠기에 있는 모낭 네스틴-GFP 발현 세포이다. 피부 샘플은 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스의 등 피부로부터 절제한 직후 신선하게 준비하였다. 그 다음에, 피부 샘플은 피하 조직으로부터 절개후 진피 부분을 위로 하여 형광 현미경 또는 공촛점 현미경에 의해 직접 관찰한다. 도 1a 내지 도 1c는 형광 현미경의 상이다. 도 1d는 공촛점 현미경의 상이다. 각각의 모낭에서 모낭 네스틴-GFP 발현 세포(백색 화살표)의 독특한 벨 형 구조 및 위치를 주시한다. 모낭 네스틴-GFP 발현 세포는 피지선 바로 아래 전적으로 위치하며(도 1a, 백색 파선), 이는 소위 모낭 벌지 영역으로 불리우고 이에 위치하는 모낭 줄기 세포와 동일하다. 모낭에서 네스틴-GFP 발현 세포는 네스틴-GFP 발현 신경형 세포 네트워크에 의해 서로에 대해 결합됨을 주시한다(회색 화살표). 배율: 도 1a 100X, 도 1b 및 도 1c 200X, 도 1d 400X.
도 2는 초기 모낭을 형성하는 모낭 줄기 세포이다. 텔로젠기에 있는 GFP 발현 모낭 줄기 세포(백색 화살표). GFP 모낭 줄기 세포는 초기 아나젠기의 새로운 모낭을 형성한다(회색 화살표). 원배율 400X.
도 3a 내지 도 3f에서 공촛점 상은 벌지 네스틴-GFP 발현 세포로부터 성장하고, 모발 주기를 통해 발생하는 새로운 모낭을 나타낸다. 아나젠기 모낭은 분홍색 피부에 의해 결정된 텔로젠기인 모발 주기를 갖는 6 내지 7주된 C57B16 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스의 등쪽 피부 위에서 뜨거운 왁스에 의해 탈모시켜 도입시킨다. 도 3a는 탈모 직전의 샘플이며, 벌지 영역에만 위치하는 벌지 네스틴-GFP 세포를 나타낸다. 도 3b는 탈모한 지 2일째인 샘플이다. 네스틴-GFP 발현에 의해 생성되는 새로운 모낭아(hair follicle bud)는 벌지 네스틴-GFP 줄기 세포로부터 직접 바로 형성됨을 주지한다. 도 3c 및 도 3d는 탈모한 지 4일 및 5일째 되는 샘플이고, 초기 아나젠의 모낭을 나타낸다. 새로운 모낭은 네스틴-GFP를 발현하면서 계속해서 성장하고 발생함을 주지한다. 도 3e는 탈모한 지 8일째 되는 샘플이며, 중간 아나젠기 모낭을 나타낸다. 상부 외모근초에서는 네스틴-GFP 발현되고, 모낭구에서는 네스틴-GFP 발현되지 않은 완전히 형성된 모낭을 주지한다. 도 3f 및 도 3g는 탈모한 지 19 내지 20일째 되는 샘플이고, 카타젠기인 모낭을 나타낸다. 모낭은 퇴화되어, 모발 벌지로 다시 회귀됨을 주지한다. 공촛점 현미경. 배율: 도 3a 내지 도 3d 400X. 도 3e 및 도 3f 100X. 도 3g 200X.
도 4는 면역조직화학적 염색법에 의해 측정되는 모낭 벌지 줄기 세포 및 외모근초의 GFP, 네스틴 및 케라틴 5/8 및 15의 공국부화를 나타낸다. 도 4a는 새로운 모낭을 형성하는(백색 화살표), 네스틴-GFP 발현 모낭 벌지 줄기 세포(회색 화살표)를 나타내는 생 조직의 공촛점 상이다. 도 4b는 네스틴 항체(1:100)에 의해 면역조직화학적으로 염색한 파라핀 혼입된 조직 부위로, 도 4a의 네스틴-GFP 발현과 정확한 패턴의 네스틴 발현을 나타낸다. 회색 화살표는 네스틴 포지티브 모낭 벌지 줄기 세포를 나타낸다. 백색 화살표는 네스틴 포지티브의 새로이 형성된 모낭을 나타낸다. 도 4c 및 도 4d는 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스 피부 모낭의 두 개의 일련의 파라핀 세로방향 절편으로, GFP mAb(1:100) 및 케라틴-15 mAb(1:100)에 의해 이중-면역조직화학적으로 염색한다. GFP는 크로모겐 패스트 레드(chromogen fast red)에 의해 검출하며, 케라틴-15는 크로모겐 DAB에 의해 검출한다. 벌지 모낭 줄기 세포에서 네스틴-GFP 및 케라틴-15의 국부화를 주지한다. 도 4e 내지 도 4g는 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스 피부 모낭의 일련의 파라핀 횡단면으로, GFP mAb(도 4e, 1:100), 케라틴 5/8 mAb(도 4f, 1:250) 및 네스틴 mAb(도 4g, 1:100)에 의해 각각 면역조직화학적으로 염색한다. 모낭의 외모근초 세포에서 GFP, 케라틴 5/8 및 네스틴의 공국재화를 주지한다. 배율 400X.
도 5는 모낭 네스틴-GFP 발현 줄기 세포 및 모낭간 신경형 세포 네트워크를 나타낸다. 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스 피부로부터의 텔로젠기 모낭은 GFP 발현 줄기 세포를 나타낸다. 피지선 바로 아래에 모낭 벌지 영역에 위치한 줄기 세포의 독특한 구조(백색 화살표)를 주지한다. 모낭은 GFP 발현 신경형 세포 네트워크와 서로 연결된다(회색 화살표). 원배율 100X.
도 6에서 모낭으로부터 분리된 네스틴-GFP 발현 세포는 시험관내에서 다중 세포 형태를 생성한다. 도 6a는 모낭 네스틴-GFP 발현 세포로부터 성장된 신경구(neurosphere)이고, 도 6b에서 피복판 위에 플레이팅한 지 2일후, 신경구가 표면에 부착되고, 세포는 이동하기 시작하여, 이들의 GFP 형광을 잃게 된다. 도 6c에서 플레이팅한 지 1주후, 세포는 신경원 세포 마커-β-튜불린(섬유 형 구조)을 발현하기 시작하며, 일부 세포는 여전히 낮은 수준의 GFP(밝음, 비교적 원형인 점)를 나타낸다. 도 6d에서 플레이팅한 지 2주후, GABA-포지티브 신경원 세포가 확인된다. 도6e에서 플레이팅한 지 1주후, 세포는 성상 세포 마커 GFAP를 발현하기 시작하며, 일부 세포는 여전히 낮은 수준의 GFP를 발현한다.
한 측면으로, 본 발명은 분리된 모낭 줄기 세포에 관한 것이다. 모낭 세포는 중추 신경계 선조 세포(progenitor cell)를 위한 마커(예: 네스틴)를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 있어서, 이들 모낭 세포는 마커인 네스틴의 발현을 근거로 하여 분리된다.
네스틴은 중추 신경계 선조 세포를 위한 마커인 중간체 필라멘트이다. 특히, 네스틴 조절 서열의 제어하에 있는 녹색 형광 단백질(GFP)을 갖는 트랜스제닉 마우스는, CNS 줄기 세포의 자체 재생 및 다능성의 가시화를 위해 생성되고 사용되어 왔다. 바람직한 양태로, 네스틴이 분리 공정을 용이하게 하기 위하여 검출제(예: 녹색 형광 단백질)에 결합될 수 있음에도 불구하고, 이들 세포에 대한 다른 마커가 다른 검출 가능한 제제 뿐만 아니라, 모낭 줄기 세포를 분리하기 위하여 사용될 수 있다고 여겨진다. 예를 들면, 세포는 시험관내에서 또는 동일 반응계 내에서 분석되어, 표지된 결합 파트너, 항체 또는 결합되는 핵산에 대해 시험한다. 모낭 줄기 세포가 고체 지지체에 결합되는 양태에 있어서, 검정법은 다른 형태의 신호 분자를 사용할 수 있으며, 이때 결합되지 않은 신호 분자는 세포에 결합된 신호 분자로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 신호 분자는 방사성 동위원소(예: 125I, 131I, 35S, 32P, 14C 또는 3H); 광 산란 라벨[제조원: 제니콘 사이언시스 코포레이션(Genicon Sciences Corporation), 캘리포니아주 샌 디에고 소재 및 참조예; 미합중국 특허 제6,214,560호]; 효소 또는 단백질 라벨(예: GFP 또는 퍼옥시다제) 또는 다른 색원성 라벨 또는 염료[예: 텍사스 레드(Texas Red)]에 의해 표지될 수 있다. 또한, FACS 또는 다른 세포 분류 메카니즘이 세포를 분리하기 위하여 사용될 수 있다.
모낭 줄기 세포의 위치는 모발 주기에 따라 변한다. 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스의 초기 아나젠기에서, 네스틴 발현 세포는 모낭 줄기 세포가 위치하는 모낭 벌지의 피지선 바로 아래에 있는 항구적인 상부 모낭에 위치한다. 벌지 영역의 네스틴 발현 세포는 비교적 작고, 타원형이며, 서로에 대해 결합된 짧은 수지상 조직이 모간을 둘러싼다. 도 3은 모낭의 네스틴 발현 세포의 위치가 모발 주기 의존성임을 나타낸다. 텔로젠(실시예 1 및 도 1) 및 초기 아나젠기 도중에, GFP-포지티브 세포, 즉 네스틴 발현 세포는 주로 벌지 영역에 존재한다. 도 2에서, GFP 발현 모낭 줄기 세포는 텔로젠 및 초기 아나젠기에서 모두 보여진다. 세포가 모발 주기의 특정 단계로부터 수거될 수 있음에도 불구하고, 텔로젠기로부터의 모낭 줄기 세포가 가장 원시적으로 국재화된 것으로 보이므로, 이들이 수거에 바람직하다.
중간 및 말기의 아나젠기에서, GFP 발현 세포는 벌지 영역 뿐만 아니라 상부 외모근초에 위치하지만, 모발의 기질 모구에는 위치하지 않는다. 이러한 관찰은 모낭 줄기 세포에 대해 관찰된 거동과 일치하게 네스틴 발현 세포가 외모근초를 형성함을 제시하고 있다. 보여지는 면역조직화학적 염색법의 결과 네스틴, GFP, 케라틴 5/8 및 케라틴 15는 실시예 3 및 도 4에 제시된 바와 같이 모낭의 벌지 세포, 외모근초 세포 및 피지선의 기저 세포에 공국재화되는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터는 또한 모낭 벌지의 네스틴-GFP 발현 세포가 모낭 줄기 세포임을 나타내고 있다. 네스틴 유도된 GFP는 또한 도 5에 제시된 바와 같이 모낭간 신경형 네트워크에서 상당히 발현되는 것으로 밝혀졌다. 신경 줄기 세포, 모낭 줄기 세포 및 모낭간 신경형 네트워크에서 네스틴의 공통적 발현은 이들의 공통의 기원을 제안한다. 실시예 6은 네스틴-GFP 줄기 세포의 신경구로의 전환을 나타내는데 이는 신경 세포, 성상 세포 및 당해 분야에 공지된 적절한 조건하에서 아마도 다른 세포 형태로 분화된다.
다른 측면으로, 본 발명은 포유동물로부터 피부를 제공하거나 절제하고, 모낭 줄기 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 모낭 줄기 세포의 분리법에 관한 것이다. 바람직하게는, 피부로부터 네스틴 발현 세포를 분리함으로써, 모낭 줄기 세포가 분리된다. 피부 샘플은 모발 주기의 특정 단계로부터 수거할 수 있다. 바람직하게는, 피부 샘플은 텔로젠기로부터 수득하는데, 이는 모낭 줄기 세포가 우선적으로 이 단계에서 국재화되어 수거하기 보다 용이하기 때문이다. 이러한 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 텔로젠기 도중 세포의 수거 또한 이들의 가장 원시적 상태로 당해 세포를 수거할 수 있도록 한다. 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 네스틴 발현 세포는 또한 아나젠기, 중간-아나젠기 및 후기 아나젠기에서도 발견된다. 당해 세포는 절개된 피부 및 바람직한 양태에서와 같은 분리법을 사용하여 분리할 수 있지만, 다른 분리 방법이 또한 고려된다. 예를 들면, 세포는 동일 반응계내에서 개체로부터 수거할 수 있다.
이렇게 분리된 모낭 줄기 세포는 다능성 또는 다잠재력을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 모낭 줄기 세포를 분화시키는 방법에 관한 본 발명의 다른 측면에 있어서, 모낭 줄기 세포를, 분화가 되도록 하는 다양하게 선택된 조건하에서 배양하여 특히 뉴론, 성상 세포, 평활근 세포 또는 각질 세포 및 지방 세포와 같은 분화된 세포를 제공하게 된다. 뉴론을 생성하는 배양 배지에는 PDGF 또는 CNTF가 포함될 수 있다. 성상 세포를 위한 배양 배지에는, 예를 들면, GFAP가 포함된다. 또한, 평활근 조직을 위한 배양 배지에는, 예를 들면, FBS가 포함된다. 당해 분야에 교시된 조건 뿐만 아니라, 하기의 참조 문헌에서 논의되는 세포의 분화 조건은 본 발명의 세포를 분화하는 방법에서 고려된다.
이식은 당해 분야에 공지된 방식으로 수행할 수 있다. 한 양태로, 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화된 세포를 대상에게 전신 주사한다. 다른 측면으로, 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화된 세포는 대상의 기관 또는 조직으로 직접 주사한다. 바람직하게는, 기관 또는 조직은 뇌, 간 또는 심혈관계와 관련되는 기관이나 근육(예: 심장)이다. 또한, 합성 지지체 위에 부착되거나 성장시킨 다음 이식되는 세포 또는 조직이 고려된다. 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화된 세포는 세포가 유도된 대상 보다는 다른 대상에게 이종으로 이식될 수 있다. 그러나, 모낭 줄기 세포의 접근성으로 인하여, 한 바람직한 양태로, 세포는 치료할 대상으로부터 수득하여, 경우에 따라, 분화된 세포를 제공하기 위하여 성장시키고, 줄기 세포 또는 분화된 세포를 자가 이식할 수 있다. 본 발명의 줄기 세포가 충분히 원시적이고, 따라서 숙주가 이식시 세포를 거부할 것 같지 않으므로 모낭 줄기 세포 뱅크의 사용이 또한 고려된다.
많은 보고서[참조: Mezey, E, et al., Science (2000) 290:1779-1782; Brazelton, T. R., et al., Science (2000) 290:1775-1779; Jiang, Y., et al., Nature (2002) 418:41-49; Krause, D. S., et al., Cell(2001) 105:369-377; Lagasse, E., et al., Nat. Med. (2000) 6:1229-1234; Petersen, B. E., et al., Science (1999) 284:1168-1170; Sata, M., et al., Nat. Med. (2002) 8:403-409; Shimizu, K., et al., Nat. Med. (2001) 7:738-741; Jackson, K. A., et al., J. Clin. Invest. (2001) 107:1395-1402; 및 Orlic. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:10344-10349]는 골수, 피부 및 뇌 등을 포함하는 다양한 조직으로부터 유도된 성인의 줄기 세포의 유연성을 제시하고 있다. 메제이(Mezey) 등(상기 참조)은 이식된 성인의 골수 세포가 마우스의 뇌로 이동되어, 뉴론-특이성 항원을 발현하는 세포로 분화됨을 보였다. 브라젤톤(Brazelton) 등(상기 참조)은 표지된 마우스 성체 골수를 치명적으로 조사된 정상적인 마우스 성체로 주사한 다음, 뇌에서 공여체 유도된 신경 단백질 발현 세포를 관찰했다. 지앙(Jiang) 등(상기 참조)은 간엽 줄기 세포라 불리우는 성인의 다능성 선조 세포 또는 MAPC와 함께 정제시킨 세포를 초기 낭포로 주사하는 경우에, 전부는 아니지만 대부분의 체세포에 기여하고, 마우스에 주사하는 경우에, 간, 폐 및 소화관의 상피 이외에, 조혈성 계통으로 분화된다고 보고하고 있다. 크라우제(Krause) 등(상기 참조)은 성인의 골수 세포가 간, 폐, 위장관 및 피부의 상피 세포로 분화됨을 제시하고 있다. 라가제(Lagasse) 등(상기 참조)은 타이로신혈증 제I형의 동물 모델인 FAH(-/-) 마우스에 주사된 성인의 골수 세포가 이의 간의 생화학적 기능을 회복한다고 보고하고 있다.
페터슨(Petersen) 등(상기 참조)은 성인 골수 세포의 주사는 재생 간 세포로 전환된다고 밝히고 있다. 사타(Sata) 등(상기 참조)은 골수 세포가 동맥 재구축 마우스에 기여하는 대부분의 평활근 세포(SMC)를 생성한다고 제시하고 있다. 시미쯔(Shimizu) 등(상기 참조)은 대동맥 동종이식편 수용체로의 베타-갈락토시다제-발현 세포의 골수 이식이, 혈관 내막 세포가 골수 본래의 것을 포함함을 설명한다고 제시하고 있다. 잭슨(Jackson) 등(상기 참조)은 풍부한 조혈성 줄기 세포가 심근 세포 및 내피 세포로 분화되고, 마우스에서 기능적 조직의 형성에 기여함을 밝혀 내었다.
올릭(Orlic) 등(상기 참조)은 급성 심근경색의 존재시, 사이토킨 매개된 골수 세포의 전위는 상당한 정도의 심근 재생을 유발한다고 보고하고 있다.
그러나, 문헌[참조: Terade, N., et al., Nature (2002) 416:542-545]은 마우스의 골수 세포가 인터류킨-3을 함유하는 시험관내 배양시 배아 줄기 세포와 자발적으로 융합될 수 있음을 설명하고 있다. 더욱이, 자발적으로 융합된 골수 세포는 수용체 세포의 표현형을 채택할 수 있고, 이는 분화로 해석될 수 있다. 또한, 최근에 문헌[참조: Wagers, A. J., et al., Science, (Sep 5, 2002)][e-published ahead of print]은 골수 줄기 세포를 생체내에서 다른 세포 형태로 형질전환시키는 것을 설명하지 못했다. 이들 결과가 성인 줄기 세포의 유연성의 관심을 증가시키지만, 네스틴을 발현하는 모낭 줄기 세포는 보다 근본적인 분화를 설명하고, 이들의 다잠재력을 유지한다.
따라서, 모낭 줄기 세포는 상기 문헌에 보고된 줄기 세포와 유사한 결과를 제공함으로써, 다른 공급원(예: 배아, 골수, 뇌 및 피부)으로부터 유도된 줄기 세포와 관련되어 당해 분야에 공지된 다양한 질병 및 상태를 치료하는데 사용될 수 있으리라 예상된다. 또한, 본 발명의 한 양태는 분리된 모낭 줄기 세포를 질환을 나타내는 포유동물에 이식하는 단계를 포함하는, 질환, 바람직하게는 신경학적 또는 퇴행성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 주입되거나 이식된 모낭 줄기 세포는 적절한 조건하에 뇌, 또는 상기 문헌에 기술된 바와 같은 체세포 형태, 조혈성 조직, 심근 세포, 내피 조직, 심근 조직, 간, 폐, 소화관, 위장관의 상피, 평활근 조직, 피부, 간 조직, 동맥 및 심혈관 조직과 관련된 세포에서 신경 단백질을 발현하는 세포로 분화될 수 있으리라 예상된다. 한 바람직한 양태로, 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 분화되는 세포가 이들 기관 및/또는 조직과 관련된 질환 또는 질병의 치료 방법에 사용된다.
모낭 줄기 세포는 세포가 이식되어, 간 조직, 뇌 조직, 심혈관계 조직과 같은 조직을 회복하거나 재생하는 경우에 생체내에서 분화되리라 예상된다. 다른 측면으로, 모낭 줄기 세포는 시험관내에서 분화되고, 분화된 세포는 신경학적 또는 퇴행성 질환 등의 질환 치료에 유사하게 사용될 수 있다. 보다 바람직한 양태로, 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포는 알쯔하이머 병, 파킨슨 병 및 연령 관련 기억 상실로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환의 치료시 사용된다. 또한, 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포는 탈모의 치료시 또는 피부 대체용으로 사용되거나, 화상 또는 피부 노화와 같은 진피와 관련된 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포에 의해 치료할 수 있는 질환 또는 질병은 심혈관계 질환 또는 간 질환과 관련된다. 다른 질환의 치료가 하기에서 상세히 논의된 바와 같이 시도되었다.
또한, 본 발명은 발현 시스템을 사용하여 하기에서 보다 상세히 논의되는 질환을 연구하고 치료하고자 하였다. 본 발명은 또한 시험관내에서 줄기 세포를 사용하여 모낭 줄기 세포의 다양한 분화 잠재력의 효과를 알아보고자 하였다.
상기 언급한 특별한 질환 및 질병 이외에, 본 발명의 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화된 세포는 내피 세포 질환, 간 질환 또는 뇌 질환 및 바람직하게는 하기에서 상세히 논의되는 바와 같은 뇌 또는 간 질환을 포함하는, 세포 증식성 및/또는 분화 질환, 골 대사와 관련된 질환, 심혈관계 질환을 위한 줄기 세포 치료법에 사용될 수 있다.
세포 증식성 및/또는 분화 질환의 예로는 암(예: 암종, 육종), 전이성 질환 또는 조혈성 신생물성 질환(예: 백혈병)이 포함된다. 전이성 종양은 이로써 제한되는 것은 아니지만, 전립선, 결장, 폐, 유방 및 간 기원의 종양을 포함하는 다수의 원시 종양 형태로부터 유발될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "암"(또한 "과증식성" 및 "신생물성"과 호환적으로 사용됨)은 자율적인 성장에 대한 능력을 갖는 세포, 즉 세포 성장을 신속히 증식시킴을 특징으로 하는 비정상적인 상태 또는 조건을 의미한다. 암 질환 상태는 병리학적으로, 즉 질환 상태를 특성화하거나 구성하는 것으로 분류하거나(예: 악성 종양 성장), 비병리학적으로, 즉 질환 상태와 관련되지 않지만 정상으로부터의 벗어남으로 분류할 수 있다(예: 상처 회복과 관련된 세포 증식). 당해 용어는 조직병리학적 형태 또는 침입성 단계와 무관하게, 모든 형태의 암 성장 또는 종양원성 과정, 전이 조직 또는 악성적으로 형질전환된 세포, 조직이나 기관을 포함하고자 한다. 용어 "암"은 대부분의 결장암, 신장 세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 폐의 작지 않은 세포 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성 종양을 포함하는 선암 뿐만 아니라, 폐, 가슴, 갑상선, 림프, 위장 및 비뇨생식기에 영향을 주는 것과 같은 다양한 기관 시스템의 악성 종양을 포함한다. 용어 "암종(carcinoma)"은 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식계 암종, 고환 암종, 유방암종, 전립선암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함하는 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양으로 인식되고 언급된다. 암종의 예로는 경부, 폐, 전립선, 가슴, 머리 및 목, 결장 및 난소 조직으로부터 형성되는 것이 포함된다. 용어 "암종"은 또한 암육종을 포함하며, 예를 들면, 이는 암종 및 육종 조직으로 구성된 악성 종양을 포함한다. "선암종(adenocarcinoma)"은 선 조직으로부터 유도된 암종을 의미하거나, 이때 종양 세포는 인지 가능한 선 구조를 형성한다. 용어 "육종(sarcoma)"은 당해 분야에 간엽 유도 악성 종양으로 인식되고 언급된다.
본 발명의 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포는 다양한 증식성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환에는 조혈성 종양 질환이 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "조혈성 종양 질환"은, 예를 들면, 척수, 림프구 또는 적혈구 계통으로부터 유발되는, 조혈성 기원의 과형성/신생물성 세포 또는 이의 전구체 세포를 포함하는 질병을 포함한다. 바람직하게는, 당해 질병은 불량 분화 급성 백혈병, 예를 들면, 적혈구모세포성 백혈병 및 급성 거핵아세포성 백혈병으로부터 유발된다. 척수 질환의 부가적 예로는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 급성 전골수성 백혈병(APML), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수성 백혈병(CML)이 포함되며[참조: Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-297]; 림프구 악성 종양에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, B-계통 ALL 및 T-계통 ALL을 포함하는 림프성 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 모세포성 백혈병(HLL) 및 발덴스트롬 마크로글로블린혈증(WM: Waldenstrom's macroglobulinemia)이 포함된다. 악성 림프종의 부가 형태에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma) 및 이의 변형, 말초 T 세포 림프종, 성인의 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T 세포 림프종(CTCL), 거대과립 림프구성 백혈병(LGF), 호지킨 병 및 리드-스테른버그 병(Reed-Sternberg disease)이 포함된다.
본 발명의 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포는 골 대사와 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. "골 대사"는 뼈 구조의 형성 또는 퇴행시, 예를 들면, 골 형성, 골 흡수 등에 있어서 직접 또는 간접적인 영향을 의미하며, 이는 궁극적으로 칼슘 및 인산염의 혈청 농도에 영향을 줄 수 있다. 이 용어는 또한 뼈 세포, 예를 들면, 파골세포 및 조골세포에 있어서의 활성을 포함하여, 이는 결국 골 형성 및 퇴행을 유발할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포는 단구 세포 및 단핵 식세포의 파골세포로의 분화 자극과 같은 골-재흡수 파골세포의 상이한 작용을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 모낭 줄기 세포 또는 이로부터 유도된 분화 세포는 골 형성 및 퇴행에 영향을 줄 수 있는 골세포의 생성시 사용될 수 있으므로, 골 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예로는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 골다공증, 골이영양증, 골연화증, 구루병, 낭종 섬유성 골염, 신성골이영양증, 골경화증, 항경련 치료, 골감소증, 골섬유불완전 형성증, 2차 부갑상선 기능항진증, 부갑상선 기능감퇴증, 부갑상선 기능항진증, 경변증, 폐색성 황달, 약물 유도 대사, 수질 암종, 만성 신장 질환, 구루병, 유육종증, 당류 코티코이드 길항작용, 흡수장애 증후군, 지방변증, 열대성 스프루우, 특발성 과칼슘혈증 및 유열(milk fever)이 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 심장에 관여되는 질환 또는 "심혈관계 질환"에는 심혈관계, 예를 들면, 심장, 혈관 및/또는 혈액에 영향을 주는 질병 또는 질환이 포함된다. 심혈관계 질환은 동맥압의 불균형, 심장의 기능부전 또는, 예를 들면, 혈전에 의한 혈관의 폐색에 의해 유발될 수 있다. 심혈관계 질환에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 동맥경화증, 허혈성 재관류 손상, 재발협착증, 동맥 염증, 혈관벽 재형성, 심실 재형성, 속심실 조율, 관상 미세색전증, 빈맥, 서맥, 압력 과부하, 대동맥 벤딩, 관상 동맥 결찰, 혈관심장 질환, 혈관 질환, 심방세동, 장-QT 증후군, 울혈성 심장 질환, 사인형 이상, 동방결절 이상, 협심증, 심장 질환, 고혈압, 심방 세동, 심방 조동, 심근증(예: 확장 심근증 또는 특발성 심근증), 심근경색, 관상동맥 질환, 관상동맥 경련, 허혈성 질환, 부정맥 및 심혈관계 발병 질환(예: 동정맥 기형, 동정맥루, 레이노 병, 신경원성 흉곽출구 증후군, 작열통/반사 교감신경 이상, 혈관종, 동맥류, 해면상 혈관종, 대동맥판 협착증, 심방 격벽 결함, 방실관, 대동맥 교착증, 엡스타인 이상(Ebstein's anomaly), 발육부전 좌심 증후군, 동맥궁 단절, 승모판막탈, 동맥관, 개방 난원공, 부분 이상 폐정맥성 복귀, 심실 격벽 결함이 있는 폐동맥 폐쇄증, 심실 격벽 결함이 없는 폐동맥 폐쇄증, 태아 순환의 지속성, 폐동맥판 협착증, 단일 심실, 전체 이상 폐정맥 복귀, 대혈관 전위증, 삼천판 폐쇄증, 동맥간, 심실 격벽 결함)이 포함된다. 심혈관계 질병 또는 질환에는 내피 세포 질환이 또한 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "내피 세포 질환"에는 이상, 비조절 또는 원치않는 내피 세포 작용, 예를 들면, 증식, 이동, 혈관형성 또는 혈관화나, 혈관형성과 관련된 세포 표면 부착 분자 또는 유전자(예: TIE-2, FLT 및 FLK)의 이상적인 발현을 특징으로 하는 질환이 포함된다. 내피 세포 질환에는 종양 형성, 종양 전이, 건선, 당뇨성 망막증, 자궁내막증, 그레이브씨 병(Grave's disease), 허혈성 질환(예: 아테롬성 경화증) 및 만성 염증 질환(예: 류마티스 관절염)이 포함된다.
본 명세서에 기술된 방법에 의해 치료될 수 있는 질환에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 기존 섬유의 붕괴 및 응축을 수반하는 세포외 기질의 생성 및 분해 사이의 불균형에 의해 유발되는 것과 같은, 섬유상 조직인 간에서의 축적과 관련된 질환이 포함된다. 본 명세서에 기술된 방법은 염증 과정, 독성 손상 또는 변화된 간 혈류로부터 생성되는 조직 손상 및 감염(예: 세균성, 바이러스성 및 기생충)과 같은 생체항상성을 방해하는 과정을 포함하는 광범위한 제제에 의해 유도되는 간세포성 괴사 또는 손상을 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 방법은 문맥압 항진증 또는 간 섬유증 등의 간 손상을 치료하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 방법은 선천적인 대사과정 오류, 예를 들면, 고오씨에씨 병(지질 이상) 또는 글리코겐 저장 질환과 같은 저장 질환, A1-항트립신-결핍증; 외인성 물질의 축적(예: 저장)을 매개하는 질환, 예를 들면, 혈색소증(철 과잉 증후군) 및 구리 저장 질환(윌슨씨 병), 독성 대사물질의 축적을 초래하는 질환(예: 타이로신혈증, 과당혈증 및 갈락토스혈증) 및 과산화소체 질환(예: 젤베거(Zellveger) 증후군)으로부터 유발되는 섬유증에 기인되는 간 섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 기술된 방법은 다양한 화학약품 또는 약제(예: 메토트렉세이트, 이소니지드, 옥시페니아사틴, 메티도파, 클로르프로마진, 톨부타미드 또는 알콜)의 투여와 관련되거나, 간내 또는 간외 담즙 유동의 파괴나, 예를 들면, 만성 심부전, 정맥 폐쇄성 질환, 문맥 정맥 혈전증 또는 버드-키아리 증후군(Budd-Chiari syndrome)으로부터 유발되는 간 순환의 이상과 같은 혈관 질환의 간 증상을 나타내는 간 손상의 치료시 유용할 수 있다.
뇌에 관여되는 질환에는 이로써 제한되는 것은 아니지만, 뉴론이 관여되는 질환 및 글리아(예: 성상 세포, 희돌기 교세포, 상세포 및 신경교세포)가 관여되는 질환; 뇌부종, 상승되는 두개내 뇌압 및 헤르니아 형성과 뇌수종; 기형 및 발달성 질환(예: 신경관 결함, 전뇌 이상, 후와 이상 및, 척수공동증과 수척수증; 분만시 뇌 손상; 저혈압, 관류 저하, 및 국부 혈액 공급 장애로부터의 저유동 상태-글로벌 대뇌 허혈증과 병소 대뇌 허혈증-경색을 포함하는 저산소증, 허혈증 및 경색, 뇌내(실질성내) 출혈, 지주막하 출혈 및 파열된 딸기 상동맥류를 포함하는 두개내 출혈, 및 혈관 기형, 강경색, 슬릿 출혈 및 고혈압성 뇌증을 포함하는 고혈압성 대뇌혈관 질환과 관련되는 것 등의 뇌혈관 질환; 급성 발열성(세균성) 수막염 및 급성 무균성(바이러스) 수막염을 포함하는 급성 수막염, 뇌농양, 경막하 축농증 및 경막외 축농증을 포함하는 급성 병소 화농성 감염, 결핵 및 마이코박테륨증을 포함하는 만성 세균성 수막뇌염, 신경 매독 및 뉴로보렐리오시스(neuroborreliosis)(Lyme disease), 절지동물 매개성(Arbo) 바이러스성 뇌염, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 제1형, 헤르페스 심플렉스 바이러스 제2형, 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-zoster virus)(Herpes zoster), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 회백수염, 광견병, 및 HIV-1 수막뇌염(아급성 뇌염)을 포함하는 사람의 면역결핍 바이러스 1을 포함하는 바이러스성 수막뇌염, 공포성 척수증, AIDS-관련 근증, 말초 신경증 및 어린이 AIDS, 진행성 다중 병소 백질뇌증, 아급성 경화성 범뇌염, 진균성 수막뇌염, 신경계의 다른 감염성 질환; 투과성 해면 형태 뇌증(프리온 병); 다발성 경화증, 다발성 경화증 변이, 급성 산재성 뇌척수염 및 급성 괴사 출혈성 뇌척수염과 수초탈락이 있는 다른 질환을 포함하는 수초탈락성 질환; 알쯔하이머 병 및 피크 병(Pick disease)을 포함하는 대뇌 피질에 영향을 주는 퇴행성 질환, 파킨슨증, 특발성 파킨슨 병(진전 마비), 진행성 상핵 마비, 피질기저 퇴행성, 기저 신경절 및 뇌간의 퇴행성 질환, 스트리에이토니그랄 퇴행성(striatonigral degeneration), 샤이-드레거 증후군(Shy-Drager syndrome) 및 올리브교소뇌피질 위축을 포함하는 다발성 시스템 위축증과, 헌팅톤 병(Huntington disease) 등의 퇴행성 질환; 프리드라이히 운동실조(Friedreich ataxia)을 포함하는 척수소뇌 운동실조, 및 모세혈관 확장성 운동실조을 포함하는 척수소뇌 퇴행성, 근위축성 측삭 경화증(운동 신경 질환), 척수구 위축증(케네디 증후군) 및 척수성 근위축을 포함하는 운동 신경에 영향을 주는 퇴행성 질환; 크라베 병(Krabbe disease), 이염백질이영양증, 부신백질이영양증, 펠리재우스-메르쯔바커 병(Pelizaeus-Merzbacher disease) 및 카나반 병(Canavan disease)을 포함하는 백질이영양증, 레이 병(Leigh disease) 및 기타 미토콘드리아 엔세팔로미오패티를 포함하는 미토콘드리아 엔세팔로미오패티 등의 선천적인 대사 오류; 비타민 결핍증(예: 티아민(비타민 B1) 결핍증 및 비타민 B12 결핍증), 저혈당증, 과혈당증 및 간성 뇌증을 포함하는 대사 장애의 신경학적 후유증, 메토트렉세이트 및 방사선 유도된 손상을 포함하는, 일산화탄소, 메탄올, 에탄올 및 방사선을 포함하는 독성 질환; 원섬유(확산성) 성상 세포종 및 다형성 교아종을 포함하는 성상 세포종, 필로사이틱 성상 세포종, 다형성 황색성상 세포종 및 뇌간 글리오마을 포함하는 글리오마, 희돌기 교종, 뇌실막과 관련 심실주위 매스 병변, 신경 종양, 수아종을 포함하는 불량 미분화 종양, 1차 뇌 림프종, 미생물 세포 종양 및 송과체 실질성 종양을 포함하는 다른 실질성 종양, 수막종, 전이 종양, 방종양성 증후군, 신경초종, 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양(악성 신경초종)을 포함하는 말초 신경초 종양, 및 제1형 신경섬유종증(NF1)과 제2형 신경섬유종증(NF2)을 포함하는 신경섬유종증, 결절성 경화증 및 폰 힙펠-린다우 병(Von Hippel-Lindau disease) 등의 종양이 포함된다.
하기의 실시예는 본 발명을 기술하고자 하는 것으로, 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
텔로젠기 네스틴 발현 세포의 관찰
네스틴은 중추신경계(CNS) 선조 세포 및 신경상피 줄기 세포를 위한 마커인 중간체 필라멘트(IF: intermediate filament) 유전자이다[참조: Lendahl, U., et al., Cell (1990) 60:585-596]. 네스틴 제2-인트론 인핸서(nestin second-intron enhancer)의 조절하에 증진된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 함유하는 네스틴-EGFP 트랜스제닉 마우스가 CNS 줄기 세포의 자가 재생 및 다잠재력의 연구 및 가시화를 위해 사용되어 왔다[참조: Lendahl, et al., (상기 참조); Zimmerman, L., et al., Neuron (1994) 12:11-24 및 Kawaguchi, A., Molecular and Cellular Neuroscience (2001) 259-273]. 네스틴-EGFP 마우스에서 모낭간 신경형 네트워크 뿐만 아니라, 모낭 줄기 세포에서 네스틴의 강한 발현을 관찰했다.
텔로젠기인 네스틴-GFP 피부 샘플은 형광 광학장치가 장착된 니콘-형광 현미경으로 진피 위 및 표피 아래를 직접 관찰한다. 10X PlanApo 대물렌즈를 사용하는 니콘 옵티포트(Nikon Optiphot) 위에 설치된 MRC-600 공촛점 영상 시스템(Bio-Rad)이 있는 공촛점 현미경이 또한 이들 피부 샘플을 관찰하는데 사용된다. 네스틴 발현 세포는 피지선 바로 아래에, 벌지 영역내 텔로젠기 모낭의 항구적인 상부 부분에만 오로지 압도적으로 위치하는 것으로 밝혀졌다(도 1). 이들 세포는 비교적 작고, 방추체, 타원형 또는 둥근 형태이다(도 2).
실시예 2
모발 주기 도중 네스틴 발현 세포의 비교
네스틴 발현 세포의 위치는 모발 주기 의존성임을 관찰했다. 이들 네스틴-GFP 발현 세포가 생성되는 모낭과 어떻게 관련이 있는 지를 관찰하기 위하여, 텔로젠기인 7 내지 8주된 마우스를 탈모에 의해 아나젠기로 유도한다. 피부 샘플(5 x 5 ㎟)을 발모 직전(텔로젠기) 뿐만 아니라, 발모한 지 1, 2, 3, 4 및 5일째(초기 아나젠기), 8 및 10일째(중간 아나젠기), 15 및 16일째(후기 아나젠기)와, 19 및 20일째(카타젠기)에 등쪽 피부로부터 절제한다. 상기 언급한 바와 같이, 텔로젠기 중에, 모낭의 네스틴 발현 세포는 상부의 항구적인 벌지(bulge) 영역에만 위치한다. 새로운 모발 주기가 유도되면, 아나젠기 모낭이 자라기 시작한다. 발모한 지 2 내지 3일 후에, 새로운 네스틴 발현 모낭 세포가 벌지에 위치한 네스틴-GFP 발현 세포로부터 직접 증식된다. 중기 및 후기 아나젠기에 있는 모발 주기에서, 네스틴 발현 모낭 세포는 모낭 또는 모발의 기질 모구의 하부 1/3에서 발현없이 외모근초의 상부 2/3에 특정적으로 위치한다. 네스틴 발현 외모근초 세포는 전체 아나젠 및 카타젠기 동안에 가시화된다. 카타젠기에서, 모구 기질 세포가 회귀 및 퇴행을 수행하는 경우에, 외모근초 네스틴-GFP 발현 세포가 잔류한 다음, 모낭의 수축을 따라 감소되어, 실제로 새로운 텔로젠기에 의해 벌지에서만 발견된다(도 3).
모발 주기에서 벌지의 네스틴-GFP 발현 세포의 동적 주기적 패턴은 이들이 모낭 줄기 세포이고, 새로운 모낭 구조를 형성하는 살아있는 줄기 세포의 첫 직접적인 증거를 제공한다고 강력히 나타내고 있다. 본 관찰로 벌지 세포는 모발 주기 중에 네스틴-GFP 발현 세포를 따라 실제로 모낭 구조를 형성함을 알 수 있다. 본 결과는 다른 사람들의 발견에 의해 강력히 지지된다. 최근에, 오시마 등(상기 참조)은 마우스 성체의 비모 모낭의 외모근초의 상부 영역이 다수의 모낭, 피지선 및 표피를 생성하기 위하여 형태발생적 신호에 반응하는 다능성 줄기 세포를 함유한다고 보고하고 있다. 이들 발견은 외모근초내 네스틴-GFP 발현의 본 관찰과 상호관련이 있다.
실시예 3
네스틴 발현 모낭 줄기 세포의 추가 특성 분석
이들 네스틴-GFP 발현 모낭 줄기 세포를 다시 특성화하기 위하여, 네스틴(1:80, Rat401, DSHB, University of Iowa, Iowa City, IA); GFP(1:100, Boehringer Mannheim); 케라틴 5/8(1:250, Chemico International, Temecula, CA) 및 모낭 줄기 세포의 잠재적 마커중 하나인 케라틴 15(1:100, Chemico International, Temecula, CA)의 공국재화를 파라핀 혼입된 야생형 C57B16 및 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스 피부에서 면역조직화학적으로 측정한다. DAKO ARK 동물 연구 키트 또는 DAKO En Vision Doublestain 시스템이 크로모겐 DAB (3,3-디아미노벤지딘) 또는 뉴클리어 패스트 레드(nuclear fast red)와 함께 면역조직화학적 염색을 위해 사용된다. 면역조직화학적 염색의 결과(도 4)로 네스틴, GFP 및 케라틴 5/8과 케라틴 15는 모낭 벌지 세포, 외모근초 세포 및 피지선의 기저 세포에 공국재화됨을 알 수 있다. 이들 데이터는 모낭 벌지에서 네스틴-GFP 발현 세포가 모낭 줄기 세포임을 추가로 나타내고 있다.
본 발명자는 또한 표피, 모낭, 진피, 피하 및 모낭을 서로 연결하는 근육층을 포함한 전체 피부층에 존재하는 네스틴 발현 세포의 "신경형(neural-like)" 3차원 네트워크로 나타나는 것을 관찰했다(도 5). 이들 세포의 정확한 확인 및 기능은 다시 증명할 필요가 있다. 따라서, 모낭 줄기 세포 및 모낭내 신경형 네트워크에서의 네스틴 발현은 신경 줄기 세포에 대한 관계를 제시하고 있다.
실시예 4
모낭 줄기 세포의 분리
이들 네스틴-GFP 발현 모낭 세포가 다능성 줄기 세포인지를 추가로 확인하기 위하여, 모낭의 벌지 네스틴-GFP 발현 줄기 세포를 분리하고, 시험관내에서 이들을 배양한다. 텔로젠기의 네스틴-GFP 트랜스제닉 마우스 피부 샘플을 절제하고, 잘게 다진다. 그 다음에, 잘게 저민 조직을 37 ℃에서 2시간 동안 트립신(0.25%), 콜라게나제(0.4%) 및 디스파제(1.0%)의 혼합물로 분해한다. 벌지 영역에 네스틴-GFP 발현 세포가 있는 개개의 모낭을 형광 광학장치가 장착된 해부 현미경하에서 분리한다. 그 다음에, 모낭의 벌지 영역에 있는 네스틴-GFP 발현 세포는 형광 해부 현미경하에서 미세한 시린지를 사용하여 다시 분리한다.
실시예 5
줄기 세포 성장
모낭의 벌지 영역으로부터 수득한 네스틴-GFP 발현 세포를 성장 인자 보충물없이, 신경구를 성장시키기 위한 통상의 신경 유지 배지인 M21 배지로 옮긴다[참조: Uchida, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:14720-14725]. 12일 후에, 신경구 형 콜로니가 확인된다. 다른 실험에서, 모낭의 벌지 영역으로부터 분리된 네스틴-GFP 발현 세포는 표피 성장인자(EGF)(20 ng/㎖), 섬유아세포 성장인자(FGF)(20 ng/㎖) 및 백혈병 억제인자(Lif)(10 ng/㎖)로 2일 간격으로 보충한 메틸셀룰로즈(1.2%) 함유 신경 줄기 세포 배양 배지에서 10 cell/㎟로 성장하였다. 구가 배양 배지에 나타나면, 이들은 메틸셀룰로즈가 없는 새로운 플레이트로 옮긴다. 2차 구가 1차 구로부터 또한 생성된다. 그 다음에, 구는 이들의 분화 잠재력을 위해 검정한다.
실시예 6
분화 배양 검정법
구는 폴리-오르니틴/라미닌 피복된 판 위에서 플레이팅하고, 각각 태아 소 혈청(FBS)(5%), 뇌 유도된 신경 친화성 인자(BDNF)(10 ng/㎖), 혈소판 유도된 성장인자(PDGF)(10 ng/㎖) 및 섬모 신경 친화성 인자(CNTF)(10 ng/㎖)의 존재하에 둘베코의 개질된 이글즈 배지(DMEM; Dulbecco's Modified Eagles Medium)-F12에서 배양한다. 그 다음에, 세포는 뉴론(β-III 튜불린, 1:500, Promega); 성상 세포(GFAP, 1:300, Sigma), 평활근 세포(SMA, 1:300, Sigma) 및 각질 세포(Pan-keratin, 1:100, Sigma)에 대한 마커를 사용하여 면역화학적 염색법으로 분석한다. 지방 세포는 육안 관찰에 의해 검사한다(도 6).
BDNF의 존재하에 성장시킨 구는 뉴론의 존재를 나타내는 β-III 투불린 및 GABA에 대해 면역양성이다. PDGF의 존재하에 성장시킨 구는 대부분 뉴론을 생성하지만, 지방 세포의 존재를 나타내는 임의의 GFAP 양성 세포를 갖는다. CNTF의 존재하에 성장시킨 세포만이 뉴론을 나타내는 β-III 투불린 양성 세포를 생성한다. FBS의 존재하에 성장시킨 모든 구는 임의의 각질 세포와 함께 평활근 액틴(SMA) 양성 세포로 분화된다.
본 관찰 및 실험적 데이터를 근거로 하여, 다음과 같이 결론지었다: 1) 네스틴-GFP 발현으로 벌지 세포가 모낭 줄기 세포임을 알 수 있다. 이는 세포가 실질적으로 모낭 줄기 세포로서 작용한다는 것을 최초로 증명한 것이다. 2) 모낭 줄기 세포가 네스틴을 발현한다는 사실은 이들이 신경 줄기 세포와 관련이 있음을 제시하는 것이다. 3) 모낭은 네스틴-GFP 발현 신경형 네트워크에 의해 상호 결합된다. 4) 모낭 줄기 세포는 적절한 조건하에 신경 세포를 포함하는 다세포 형태를 형성할 수 있는데, 이는 생체내에서 뇌 세포를 형성하는 이들의 잠재력을 제시하는 것이다.

Claims (19)

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  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 네스틴 조절 서열의 통제하에 형광 단백질을 생산하는 세포를 포함하는 개별 모낭을 제공하는 단계 및
    텔로젠기 또는 초기 아나젠기 동안에 피지선 바로 아래의 모낭의 벌지 영역으로부터 형광 단백질을 생산하는 세포를 분리하는 단계
    를 포함하는, 모낭 줄기 세포를 분리하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 분리된 모낭 줄기 세포를 배양 배지에서 배양하여 분화된 세포를 생성함을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 배양 배지가 FBS, BDNF, PDGF 또는 CTNF를 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    분리된 모낭 줄기 세포를 FBS에서 배양하여 평활근 액틴 양성 세포로 분화시키거나,
    분리된 모낭 줄기 세포를 BDNF 존재하에 배양하여 뉴론으로 분화시키거나,
    분리된 모낭 줄기 세포를 PDGF에서 배양하여 뉴론 및 성상 세포로 분화시키거나 ,
    분리된 모낭 줄기 세포를 CNTF에서 배양하여 뉴론으로 분화시키는 방법.
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