KR20110103519A - 슈완 유사세포를 유효성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 슈완(Schwann) 유사세포를 유효성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피하 지방 조직으로부터 분리된 스페로이드-형성 세포로부터 분화시킨 슈완 유사세포를 유효 성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.

Description

슈완 유사세포를 유효성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물{Pharmaceutical composition for treating central or peripheral nerves system containing Schwann-like cells as active ingredient}

본 발명은 슈완(Schwann) 유사세포를 유효성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 피하 지방 조직으로부터 분리된 스페로이드-형성 세포로부터 분화시킨 슈완 유사세포를 유효 성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.

다분화능 신경 줄기세포 또는 신경 전구세포는 신경세포, 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 성상세포(astrocyte)로 분화 가능하다. 성체 포유류에서 미세 환경이 신경 분화를 허용하는 경우 신경 줄기세포는 뇌의 해마 또는 뇌실하층(subventricular zone)의 치아 이랑(dentate gyrus)과 같은 신경 영역에서만 확인되었다.

그러나 현재 개발된 기술만으로는 이러한 줄기세포를 신경 줄기세포 치료법에 이용하기에 용이하지 않다. 따라서 대안으로 이용 가능한 신경 세포 공급원을 개발하고자 하는 여러 시도가 이루어지고 있다. 피부-유래 전구세포(SKP), 조혈 줄기세포(HSC), 중간엽 줄기세포(MSC) 및 지방 조직-유래 줄기세포(ADSC)와 같은 다양한 조직 유래의 체세포 줄기세포는 적당한 시험관 내 조건 하에서 신경 및 아교 세포로 분화되는 것으로 알려져 있다.

피부-유래 전구세포는 잔여 신경 능선세포 또는 관련 세포의 선택 및 확장에 의해 마우스, 래트 및 인간 피부로부터 수득될 수 있다. 이러한 세포는 특정 유도 프로그램을 이용하여 신경 세포 또는 다른 계통 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포의 배아 기원은 신경 능선인 것으로 추정되었으나 상기 세포는 신생아 또는 성체 피부 내 모낭 근방에 주로 위치하는 것으로 나타났다.

그러나 여러 종류의 세포가 진피 내에 존재하기 때문에 성체 조직의 특정 부위에서 피부-유래 전구세포 또는 피부-유래 전구세포-관련 세포를 확인하는 것은 매우 어렵다. 신경 능선세포로서 피부-유래 전구세포의 발달 기원이 여러 증거에 의해 지지되나 이러한 세포의 유도 효율에는 변수가 많다. 더욱이 신경 능선 기원의 피부-유래 전구세포는 풍부하지 않고, 따라서 성체 피부로부터의 초기 분리를 상당히 어렵게 한다. 이러한 이유로 충분한 양의 분화 세포를 수득하기 위해 장기간 스페로이드(spheroid) 배양이 필수적이다. 그러나 뉴로스페로이드(neurospheroid)-유사 세포가 특정 후생학적 조건으로 자극함으로서 성체 조직 내 다른 계통의 세포로부터 직접 유도될 수 있는지 또는 이러한 세포가 진피 내에 존재하는 잔여 신경 능선 줄기세포의 작은 풀(pool)의 선택성 확장에 의해 수득될 수 있는지 여부는 명확하지 않다.

고유 슈완 세포(Schwann cell, SC) 또는 후각 초성 세포(olfactory ensheathing cell, OEC)는 척수 손상(SCI) 복구에 대한 치료 효능을 제시하였고, 실제로 유망한 임상적 결과가 보도된 바 있다. 그러나 이러한 세포는 신경 조직에서만 분리 하여 이용할 수 있다. 때문에 임상 적용 시 정상 신경 조직 손상 및 한정된 세포 확장 능력으로 인해 자가 세포 치료제로서의 사용이 제한된다. 최근 슈완 세포 또는 슈완 세포-유사 세포는 접근이 용이한 말초 조직으로부터 유도되었다.

슈완 세포는 말초 신경계(PNS) 내 수초(myelin sheath)의 주요 구성성분이고 신경세포의 방향 유도 및 손상 부위의 세포 제거 모두에 작용한다. 또한 슈완 세포는 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래 향신경 인자(BDNF), 아교 세포-유래 향신경 인자(GDNF) 및 섬모 향신경-인자(CNF)와 같은 다양한 향신경 인자를 분비하고 라미닌(laminin)과 같은 세포외 매트릭스 분자를 생성하거나 분비한다. 말초 신경계 내에서 슈완 세포는 단일 축삭(axon)을 수초화시킨다(myelinate). 이와 대조적으로 중추 신경계(CNS) 내에서 슈완 세포 대응물인 희소돌기아교세포는 많은 돌기 형성하여 여러 인접한 축삭에서 수초를 형성한다. 이들 세포 타입의 발달 기원 및 유전자 발현 프로파일은 구별되나 말초 신경계 유래 슈완 세포는 중추 신경계 내에서도 수초를 형성할 수 있다.

본 발명자들은 대한민국 공개특허공보 제10-2006-60346호 '피부 진피로부터 신경전구세포를 유도하는 방법 및 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제'에서는 피부 진피 세포로부터 특정 배양조건으로 배양하여 신경 전구세포를 유도하는 방법을 개시한 바 있으며, 또한 대한민국 공개특허공보 제10-2007-80561호 '중추 또는 말초신경계 손상 치료용 조성물'에서 피하 조직으로부터 유도된 신경 전구세포를 다시 분화시킨 신경세포 또는 희소돌기 아교세포 또는 슈완 세포를 분리하는 방법을 개시한 바 있다.

척수 손상은 즉각적인 세포 괴사, 염증 반응 및 2차적 세포 사멸의 복잡한 과정에 의해 시간적 및 공간적으로 동시에 발생한다. 병변 부위에서 절단된 축삭을 재생하여 다시 연결되게 하는 것은 어려우나 박탈된 예비 축삭에 다시 수초 형성하게 하는 것은 척수 손상치료에서 중요한 방법 중의 하나이다. 따라서 희소돌기아교세포 또는 슈완 세포는 동물 모델 및 인간 척수 손상 조직학 연구에서 나타난 효과를 기반으로 치료 가능성을 나타낼 것으로 기대된다. 동물 모델을 이용한 연구에서 한정된 척수 손상 회복 성공을 보여 주었으나 일부 회복 메커니즘은 확인되었다. 예를 들면 척수 손상 시 강한 항염 스테로이드를 이용한 즉각적인 초기 치료가 필수적이고, 또한 손상 조기단계에 세포이식 최적 이식 시간 윈도우(window)가 있음을 보고되었다.

지방 조직은 신체 전체에서 발견되고 골형성, 지방형성 및 연골형성 중배엽 계통 및 신경 및 아교 세포와 같은 외배엽 계통으로 분화 가능한 성체 줄기세포 공급원으로 간주된다.

본 발명에서 본 발명자들은 모낭 및 다른 피부 부속기관이 결여된 피부의 피하 지방 조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하고 스페로이드-형성 세포를 유도한 후 이들 세포를 시험관 내에서 슈완 세포-유사 세포로 분화되도록 하였다. 유도 여부는 RT-PCR 및 면역형광 염색을 이용하여 각 단계에서 모니터링 되고 평가하였다. 이후 척수 손상 부위에서 이식한 슈완 세포- 유사 세포가 중추 신경계 축삭에 수초 형성 및 랑비에르(Ranvier) 결절을 형성하는 능력을 평가하였다.

세포 생존, 통합, 최종 운명 및 척수 손상 회복 상의 효과는 이중 면역형광 염색, Basso, Beattie, and Bresnahan(BBB) 득점 및 녹색형광단백질(EGFP)-발현 형질전환 래트 유래 또는 PKH26 표지화 이용에 의한 유도 슈완 세포의 운명 추적에 근거 하여 분석하였다.

본 발명의 해결하려는 과제는 피하 지방 조직으로부터 분리된 중간엽 줄기세포로부터 유도된 스페로이드-형성 세포를 분리한 후, 이를 분화시킨 슈완 유사세포를 유효 성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 세포 치료제 조성물을 개발코자 한 것이다. 또한 유도된 슈완 유사세포를 척수 손상 부위에 주입하여 중추 신경계(CNS) 축삭 상에 말초 신경계(PNS)-타입 수초 형성을 측정함으로써 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 세포 치료제 조성물을 개발코자 한 것이다.

본 발명의 목적은 피하 지방조직의 다분화능 지방줄기세포를 N2, EGF 및 bEGF를 함유한 스페로이드-유도 배지에서 배양 분리시킨 네스틴-발현 뉴로-스페로이드 형성세포를 시험관 내 분화 유도 배지에서 분화시킨 슈완 유사세포를 제공하는 것이다.

상기 슈완 유사세포는 생체 내에서 NF200-양성 중추신경계 축삭(axon) 주변에 PO-포함 말초 신경계 타입 수초를 형성시킴을 특징으로 한다.

상기 슈완 유사세포는 생체 내에서 손상된 부위로 희소돌기아교세포의 내부 이동을 유발시킴을 특징으로 한다.

상기 슈완 유사세포는 NGF, BDNF, CTNF 및 GDNF와 같은 향신경인자를 발현시킴을 특징으로 한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 슈완 유사세포를 유효성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 슈완 유사세포는 생체 내 고유 슈완 세포와 같이 O4, A2B5, GFAP, p75, S100β 및 Sox10을 발현시킴을 특징으로 한다.

또한 상기 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물은 파킨슨씨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측쇄경화증, 척수손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상질환에 유효함을 특징으로 한다.

본 발명의 효과는 피하 지방 조직으로부터 분리된 중간엽 줄기세포로부터 유도된 스페로이드-형성 세포를 분리한 후, 이를 분화시킨 슈완 유사세포를 유효 성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다. 또한 유도된 슈완 유사세포를 척수 손상 부위에 주입하여 중추 신경계(CNS) 축삭 상에 말초 신경계(PNS)-타입 수초 형성을 측정함으로써 중추 또는 말초 신경계 손상 치료용 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 래트 피하 지방 조직으로부터 스페로이드의 유도 및 스페로이드 특성을 나타낸 것이다. 도 1(A)에서 스페로이드가 분리한 세포들로부터 유도되고(Sph 1st), 단일 세포로 분리 후 단층(Mon)배양으로 계대 5까지 계대 배양되었음을 나타낸다. 이후 이들 세포는 실시예에 나타난 바와 같이 스페로이드를 재형성하도록 유도되었다(Sph 2nd). 도 1(B)는 네스틴 및 비멘틴에 대한 스페로이드(Sph 1st)의 면역형광 염색을 나타낸다. 7일째에 스페로이드 중심 부분만이 네스틴에 대해 양성반응을 나타냈다. 도 1(C)는 배양 전인 최초 세포 분리체의 RT-PCR 분석을 나타낸다. mRNA는 래트 피하 조직으로부터 절제 직후 분리한 세포로부터 추출되었고 RT-PCR 분석이 수행되었다. 최초 세포 분리 후 분리한 세포내에는 슈완 세포 또는 신경 능선 세포 기원 세포가 존재하지 않았다. 도 1(D)는 피하 조직 유래 스페로이드 형성 세포의 다분화능 분화 능력을 보여준다. 지질 소적의 Oil Red O 염색은 지방세포 분화를 입증하였고 칼슘 침착의 Alizarin red 염색은 골세포 분화를 나타내었다. Mon, 단일층; Sph, 스페로이드; SC-I, 유도된 슈완 세포; SC-N, 고유 슈완 세포; S, 표본; mw, 분자량. 축척 막대: 400 ㎛(A ,D); 50 ㎛(B).
도 2는 스페로이드 세포의 슈완 세포-유사 세포로의 분화 및 표현형 특성을 나타낸 것이다. 도 2(A)는 2-단계 유도에 의한 슈완 세포-유사 세포로의 분화를 나타낸다. 슈완 세포 유도 후 대표적인 슈완 세포의 양극성 돌기가 융합 단계에서 발견되었고, 전체 세포 형태는 고유 슈완 세포(SC-N)와 유사하였다. 도 2(B)에서는 슈완 세포 유도 전후의 O4, GFAP, S100, A2B5 및 p75에 대한 면역형광 염색이 비교되었다. 모든 슈완 세포 마커의 발현은 A2B5의 발현과 함께 슈완 세포 분화에 의해 유도되었다. A2B5의 세포핵 위치는 분화 전에 뚜렷하였으나 분화 후 세포질로의 재위치화가 명백하였다. 도 2(C)는 래트 좌골 신경 유래 스페로이드, 유도된 슈완 세포 및 고유 슈완 세포 내 슈완 세포 마커에 대한 RT-PCR 분석을 나타낸다. 도 2(D)는 향신경 인자 발현에 대한 RT-PCR 분석을 나타낸다. 좌측 레인은 분자 마커를 나타낸다. Sph1st/mon, 단일층 배양 내에서 확장된 최초 스페로이드; Sph2nd, 계대 5까지 단일층 배양 후 스페로이드 재형성; SC-I, 유도된 슈완 세포; SC-N, 유도된 슈완 세포. 축척 막대: 200 ㎛(B에서 저배율); 100 ㎛(A 및 B에서 고배율).
도 3은 척수 손상 병변 중심점 내로 SC-I의 이식 및 회복 및 조직 재생 상의 SC-I 효과를 나타낸 것이다. 도 3(A)는 대조군(n=7) 및 SC-I 동물(n=10)의 8주간의 주간 BBB 득점을 나타낸다. 도 3(B)는 대표적인 세로 절편 및 횡단-절편의 H&E 염색을 나타낸다. 대조군은 빈 공동(cavity)을 나타낸다. SC-I 그룹은 섬유-유사 구조를 지닌 재생 조직으로 가득 채워져 있었다. 도 3(C)는 손상 영역의 GFAP 및 CSPG에 대한 면역형광 염색을 나타낸 것이다. GFAP 및 CSPG의 강한 염색은 대조군의 공동 주변부에서 뚜렷하였으나 SC-I-이식 동물에서는 전체 회복 조직에 걸친 확산된 염색이 관찰되었다. 좌측 패널 내 백색 상자는 우측에서 고배율로 나타나 있다. 도 3(D)은 손상 조직 내 p75에 대한 면역형광 염색 및 이식된 SC-I를 수용한 척수 손상 부위에서 PKH26-표지화 영역을 지닌 p75 동시-위치를 나타낸다. p75-양성 세포(FITC)는 손상 조직의 전체 영역에 걸쳐 분포되었고 PKH26-표지화된 세포(적색)와 동시-위치하였다. 상부 패널 내 백색 상자는 하부 패널에서 고배율로 나타나 있고 중심점(ec) 또는 가장자리(m)로 주석이 달려 있다. 축척 막대: 400 ㎛(B, C의 좌측 패널 및 D의 상부 패널); 100 ㎛(C의 우측 패널 및 D의 하부 패널).
도 4는 SC-I로 이식된 척수 손상 내 회복 조직의 면역형광 염색을 나타낸 것이다. 도 (A-D) 저배율(상부 패널) 및 고배율(하부 패널)에서 NF200(A)-, MBP(B)-, P0(C)- 및 OMG(D)- 양성 세포 및 돌기는 FITC-컨쥬게이트된 2차 항체(화살촉)에 의해 검출되었고 PKH26-표지화된 이식 SC-I는 적색으로 나타나 있다(화살표). 병합 영역은 오렌지색으로 나타나 있다. 도 4(E)는 재생 조직 내 PLP 및 P0에 대한 이중 면역형광 염색 및 PKH26-표지화된 이식 세포의 동시 관찰을 나타낸다. 중추신경계-타입 수초를 나타내는 PLP-양성 염색(청색)은 병변 주변부에 주로 위치하였다. 그러나 P0-양성 염색은 병변의 중심에 더 많이 위치하였고, 대부분 PKH26-표지화된 영역과 동시-위치하였다. 축척 막대: 200 ㎛(A-D에서 저배율); 100 ㎛(E); 12.5 ㎛(A-D에서 고배율).
도 5는 회복 조직 내 축삭 및 섬유의 재증식을 나타낸 것이다. 도 5(A)는 척수 손상 병변 중심 내 GAP43에 대한 면역형광 염색을 나타낸다. PKH26-표지화된 관(tube) 구조 중 GAP43-양성 축삭 성장 추체(화살표)가 풍부하였고 PKH26-표지화된 작은 고리에 밀접하게 나란히 놓였다. 도 5(B-D)는 세로토닌성 하행 신경 섬유를 나타내는 5-HT에 대한 면역 형광(B), GABA성 신경세포에 대한 GABA 염색(C) 및 새로이 형성된 조직 내 2차 신경에 대한 CGRP 염색(D)을 나타낸다. CGRP-양성 2차 신경세포는 좌측 및 우측 배측면에서 뚜렷하였다. 패널 A에서 상부 패널의 저배율 이미지 내 백색 상자는 하부 패널에서 고배율로 나타나 있다. 저배율의 좌측 패널 내 백색 상자는 고배율로 우측 패널에 나타나 있다(B-D). D; 배측; V, 복측. 축척 막대: 400 ㎛(B-D에서 저배율); 100 ㎛(A에서 저배율); 50 μm (B-D에서 고배율); 12.5 ㎛(A에서 고배율).
도 6은 척수 손상의 손상 부위로의 EGFP-SC-I의 이식 및 말초신경계-타입 수초 합성의 확인을 나타낸 것이다. 도 6(A)는 저배율에서 이식 4주 후 착상된 EGFP-SC-I를 나타낸다. 도 6(B)는 NF200 및 EGFP-SC-I의 이중-형광 관찰을 나타낸다. NF200-양성 섬유는 EGFP-양성 세포에 의해 완전하게 피복되었다. 병합 이미지는 오렌지색으로 나타나 있다. 도 6(C)는 CASPR 및 EGFP-SC-I의 이중-형광 관찰을 나타낸다. CASPR 이중체의 일반적인 결절주위성 구조는 EGFP-SC-I에 의해 외부로 포위되었다. 백색 상자 영역의 고배율은 우측에 나타나 있다. Ro, 문측; Ca. 미측; R, 우측; L, 좌측. 축척 막대: 200 ㎛(A); 20 ㎛(B); 50 ㎛(C, D에서 저배율); 25 ㎛(C, D에서 고배율).
도 7은 이식 EGFP-SC-I에 의한 척수 손상 내 말초신경계-타입 수초 형성의 재확인을 나타낸 것이다. 도 7(A)는 NF200, EGFP-SC-I 및 P0-발현 수초의 삼중-형광을 나타낸다. NF200-양성 섬유(청색)은 PO-양성 작은 고리(적색)에 의해 피복되었고 EGFP-발현 세포 소체-유사 구조(녹색)와 동시-위치되었다. 도 7(B)은 EGFP-SC-I 및 P0-발현 수초의 이중-형광 관찰을 나타낸다. EGFP-양성 빈 관-유사 구조 및 작은 고리는 수초의 횡단면을 나타내는 PO-양성 관-유사 구조 및 작은 고리와 병합되었다. 축척 막대: 100 ㎛(A에서 저배율); 50 ㎛(A 및 B의 상부 패널에서 고배율); 25 ㎛(B에서 2개의 하부 패널).

본 발명에서 본 발명자들은 A2B5, GFAP, O4, p75, S100, Sox10, Krox-20 및 L1과 같은 슈완 세포(Schwann cell) 마커의 발현을 기반으로 시험관 내에서 피하 지방 조직의 다분화능 지방 줄기세포에서 유래된 네스틴(nestin)-발현 스페로이드 세포가 슈완 세포(SC)로 유효하게 분화될 수 있음을 관찰하였다.

유도된 슈완 세포는 척수 손상 부위에 주입되고 중추 신경계(CNS) 축삭 상에 말초 신경계(PNS)-타입 수초를 형성하였다. 손상된 조직 내 말초 신경계-타입 수초 형성은 유도 후 PKH26-표지화된 슈완 세포 및 녹색형광단백질(EGFP) 형질전환 래트로부터 유도된 EGFP-발현 슈완 세포 이식에 의해 확인되었다.

손상된 조직 내 수초-형성 슈완 세포로서 직접적인 관여 이외에 유도된 슈완 세포는 생체내 자연 슈완 세포와 같이 여러 향신경 인자를 발현하였고, 이는 내인성(endogenous) 치료 반응을 자극하는 유도된 슈완 세포의 추가적 역할을 입증한다. 따라서 피하 지방 조직 유래의 스페로이드-형성 세포는 슈완 세포로의 신속하고 유효하게 분화됨을 입증하였고, 이러한 세포는 중추 신경계 및 말초 신경계 손상의 복구에 대한 치료제로서 활용을 가능케 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

래트 피하 지방 조직 유래 네스틴-발현 스페로이드의 유도

신경 능선세포 특징을 지닌 피부-유래 스페로이드는 신생 래트, 성체 래트, 마우스 피부 및 인간 포피에서 확인된 바 있다. 스페로이드-형성 세포가 모낭 및 다른 피부 부속기관이 결여된 성체 피하 지방 조직에 존재하는지 여부를 측정하기 위해 이러한 조직으로부터 분리한 세포를 N2, EGF 및 bFGF를 함유한 스페로이드-유도 배지에 배양하였다. 이러한 배양 조건에서 피하 지방 조직에서 분리한 세포는 스페로이드를 형성하였다(도 1A). 스페로이드는 3일째에 형성을 시작하였고 10일째에 직경 약 90∼110 ㎛으로 성장되었다. 60% 내지 80%로 세포가 스페로이드를 형성하였다. 스페로이드 성장이 느리기 때문에 스페로이드를 단일 세포로 분리하고 스페로이드 재형성 유도 전에 5 계대(Mon)까지 단층으로 배양하였다. 초기 스페로이드-형성 세포(Sph 1st)를 단층 배양으로 확장한 후 거의 모든 세포는 스페로이드-유도 배지에서 다시 스페로이드를 재생하였다(Sph 2nd). 스페로이드-형성 세포가 분리된 후 스페로이드 유도는 단층 확장 이후에도 가역적이었다.

피하 지방 조직으로부터 유도된 스페로이드의 특성을 부여하기 위해 유도 7일 후 회득된 스페로이드를 고정하여 네스틴 및 비멘틴(vimentin)에 대해 면역형광 염색하였다(도 1B). 스페로이드 내부 일부 세포만이 네스틴에 대해 양성이었으나 모든 스페로이드 세포는 비멘틴에 대해 강하게 양성반응을 보였다.

피하 지방 조직 유래 스페로이드-유도 세포의 확인

지방 조직에서 최초로 유래된 스페로이드는 단층 배양 후에도 스페로이드-형성 능력을 보유하였다. 초기 세포 분리체 및 Sph 1st 세포 모두에서 신경 능선 기원 세포에 의한 가능한 오염을 배제시키기 위해 초기 세포 분리체의 전체 mRNA을 추출하여 RT-PCR 분석되었다(도 1C). 독립적으로 분리된 세포의 3 세트 중 어떤 것도 양성 대조군으로 고유 슈완 세포 내에서 높은 수치로 발현하는 Sox10, p75, P0, GFAP 또는 LI을 발현시키지 않았다. 이는 피하 지방 조직 유래 세포 분리체 내에 신경 능선-유래 내인성 슈완 세포 또는 멜라닌세포에 의한 오염이 없음을 보여준다.

Sph 1st 세포는 적당한 유도 조건 하에서 골세포 또는 지방세포로 분화되도록 유도되었다(도 1D). 스페로이드-형성 세포는 지질 소적(lipid droplet)의 Oil Red O 염색에 의해 입증된 바와 같이 지방세포로, 칼슘 침착의 Alizarin Red 염색에 의해 나타난 바와 같이 골세포로 분화될 수 있었다. 그러나 연골형성은 불완전하였다.

스페로이드-유도 세포의 슈완 세포-유사 세포로의 분화

다음으로 본 발명자들은 실시예에 기재된 바와 같이 2-단계 슈완 세포 유도 프로토콜을 이용하여 스페로이드-유도 세포가 슈완 세포-유사 세포로 분화될 수 있는지 여부를 시험하였다. 슈완 세포 유도 후 2 또는 3개 돌기를 나타내는 세포가 확인되었고 래트 좌골 신경에서 분리된 고유 슈완 세포와 유사하였다(도 2A).

이들 슈완 세포-유사 세포의 분자 특성을 분석하기 위해 각각 O4, A2B5, GFAP, p75 및 S100β에 대한 면역형광 염색; 및 RT-PCR 분석을 슈완 세포 분화 전후 모두에서 수행하였다(도 2B 및 C). 슈완 세포 분화 전 단층 세포는 O4, GFAP, p75 또는 S100β를 발현하지 않았으나 세포핵 내에서만 A2B5를 발현하였다. 그러나 슈완 세포 분화 후 거의 모든 세포는 O4, A2B5, GFAP, p75 및 S100β를 강하게 발현하였다. S100β 발현이 슈완 세포 분화 전 RT-PCR에 의해서는 양성이었으나(도 1C 및 2C) S100β 단백질은 슈완 세포 분화 전에 검출되지 않았고 분화 후 면역형광 염색에 의해 검출되었다(도 2B).

RT-PCR 분석시(도 2C) 슈완 세포-유사 분화 세포의 유전자 발현 프로파일은 고유 슈완 세포와 동일하였다. S100β, PMP22, PLP/DM20(DM20은 PLP의 스플라이싱 변이체임) 및 신경세포-특이적 에놀라제(NES)와 같은 여러 신경 및 아교 유전자는 단층 배양, 스페로이드 배양(sph 2) 세포, 슈완 세포-유사 분화 세포 및 고유 슈완 세포 내에서 지속적으로 발현하였다. 슈완 세포 분화에 필요한 전사 인자로 알려진 Krox-20 및 L1 발현은 슈완 세포 분화 유도 후 더욱 강하였다. 그러나 Sox10은 고유 SC와 같이 피하 지방 조직에서 분리된 초기 세포에서 발현되지 않았으나(도 1C) 슈완 세포 분화 후에만 검출 가능하였다. 특히 PDGFr-aa, ErbB2 및 p75과 같은 성장 인자 수용체는 스페로이드 배양이 아닌 단층 배양에서 발현되었고 슈완 세포 분화 후 재발현하였다. 이러한 성장 인자 수용체 발현의 가역적 패턴은 스페로이드 상태의 느린 세포 성장 속도를 반영한다. 스페로이드로부터 유도된 슈완 세포는 고유 슈완 세포(SC-N)와 구별하기 위해 SC-I로 표기하였다.

고유 슈완 세포는 신경 재생에 주요한 역할을 하는 여러 향신경 인자를 분비하는 것으로 알려져 있다. SC-I가 이러한 능력을 고유 슈완 세포와 공유하는지 여부를 조사하기 위해 NGF, BDNF, CTNF 및 GDNF 유전자 발현 분석을 초기 스페로이드, SC-I 및 SC-N의 단층 배양 유래의 세포 상에서 수행하였다(도 2D). 모든 선택된 스페로이드-형성 세포 및 SC-N은 4개의 성장 인자를 발현하였다.

척수 손상의 병변 부위로의 슈완 세포의 착상

면역형광 염색 및 RT-PCR 분석에 의해 SC-I의 분자적 및 세포적 특성은 SC-N과 유사하였다(도 1 및 2). SC-N 또는 후각 초성 세포(OEC)는 척수의 신경 또는 아교세포 손상 회복을 자극시키는 것으로 나타났다. 지방 조직 유래의 SC-I가 신경 재생을 자극하거나 척수 손상 시 수초-형성 세포로 작용할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 본 발명자들은 손상조직 내 병리학적 변화가 NYU 타박상 척수 손상 모델과 유사하기 때문에 클립 압축 척수 손상 모델을 이용하였다. 래트 척수 상의 클립 압축 후 큰 타원형 공 같은 빈 공동(cavity)이 손상 1주 후에 형성되었다. 손상 8주 후 병변 부위를 포함한 전체 척수를 세로-수평 절단하여 분석 하였을 때 미측부터 문측까지 대략적인 공동 길이는 451.9±28 ㎛이었고 우측부터 좌측까지 공동 폭은 315.4±37.9 ㎛이었다. SC-I-이식군에서 BBB 득점은 8주에 약 11.0이었으나 PBS-주사 대조군 동물에서는 9.0이었다(P>0.05, 도 3A). SC-I 이식 후 BBB 득점은 손상 8주 후에 2.0점까지 증가되었다. 1.0 이하의 초기 BBB 득점을 지닌 래트는 세포 이식 후에도 7.0 이상의 득점을 달성하지 않았고, 세포 이식 없이도 4.0 이상의 득점을 지닌 래트는 자발적으로 16.0까지 증가되었다. 이러한 동물은 최종 분석에 포함되지 않았다.

대조군 동물은 세로 절편 및 횡단 절편 모두에서 척수 손상 병변 중심에 큰 빈 공동을 나타내었다. 이와 대조적으로 SC-I-이식군에서 척수 손상 병변은 세포 및 세포외 기질로 완전히 채워져 있었고 인접 정상 조직과 잘 연결되었다(도 3B). 대조군 척수 손상 내 공동 주변은 강한 GFAP- 및 콘드로이친 황산 프로테오글리칸(CSPG)-양성 반응을 나타냈다(도 3C).

신경 능선세포 및 슈완 세포에 대한 마커인 p75는 GFAP 및 CSPG와 같이 대조군에서 공동의 가장자리에 한정되었다. 이식 동물에서는 회복 병변 중심 내 약 50%의 PKH26-표지화된 SC-I가 p75-발현 세포와 동시-위치하고(도 3D) 병변의 가장자리에는 적게 나타났다. PKH26-표지화된 SC-I는 미측 및 문측 모두에서 주사 중심점으로부터 약 5 mm 이내에서 검출되었다. p75-양성 분포 범위는 PKH26-표지화된 영역보다 더 컸다.

척수 손상시 이식된 SC-I에 의한 말초신경계-타입 수초 형성

SC-I가 척수 손상 부위에서 수초 형성에 관여할 수 있는지 여부를 측정하기 위해 신경세포 축삭 항체 뉴로필라멘트 200 kDa(NF200), 수초 항체인 수초 염기성 단백질(MBP), 말초신경계-타입 수초 항체 P0 및 희소돌기아교세포 항체인 희소돌기아교세포 수초 당단백질(OMG)에 대한 면역형광 염색이 수행하였다(도 4A-D). 저배율에서 NF200-양성, MBP-양성 및 P0-양성 구역은 PKH26-양성 병변 중심점에 동시-위치하였다. 그러나 OMG-양성 구역은 PKH26-반응성 영역과 구별되었다.

고배율에서 신경세포 축삭의 횡단면에 상응하는 NF200-양성 작은 고리는 회복된 병변 부위에서 PKH26-표지화된 작은 고리-유사 구조에 의해 친밀하게 피복되었다(도 4A). MBP-양성 작은 고리 및 튜브-유사 구조는 유사한 PKH26-표지화된 형태로 명백하게 중복되었다(도 4B). 전체 연장된 튜브-유사 구조물에서 PKH26-표지화된 튜브-유사 구조는 주기적 간격으로 표면-분절되었고, 이는 뚜렷한 랑비에르 결절-유사 구조의 존재를 나타내었다. 따라서 이식된 PKH26-표지화된 SC-I는 척수 손상 부위에서 수초의 회복에 관여하였다.

수초 염기성 단백질(MBP)은 중추신경계 및 말초신경계 모두의 수초에서 발현되는 것으로 알려져 있으나 P0 발현은 슈완 세포에 의해 형성된 말초신경계-타입 수초에 제한된다. MBP-양성 작은 고리 및 튜브-유사 수초가 말초신경계 타입인지 중추신경계 타입인지 여부를 측정하기 위해 PO에 대한 면역형광 염색이 수행되었다(도 4C). PO-양성 작은 고리 구조는 PKH26-표지화된 작은 고리 및 튜브-유사 구조와 동시-위치하였다. 따라서 이식된 SC-I는 병변 부위 내 착상 후에도 획득된 슈완 세포-표현성 및 수초-형성 능력을 유지하였다(즉 말초신경계-타입 수초가 형성됨).

또한 이식된 슈완 세포는 병변 부위 내로 내인성 희소돌기아교세포의 활성적인 내부 이동을 촉진시킨다. 희소돌기아교세포 수초 당단백질(OMG)에 대한 면역형광 염색에 의해 많은 OMG-양성 돌기는 이식된 SC-I가 존재하는 중심을 향해 병변 주변으로부터 발생하는 것으로 나타났다(도 4D). 고배율에서 대부분의 OMG-양성 돌기는 PKH26-표지화된 세포와 일치하지 않았으나 일부는 PKH26-표지화된 돌기와 나란히 정렬되었다(도 4D). 이는 대부분의 PKH26-표지화된 SC-I가 희소돌기아교세포로 분화되지 않고 내인성 희소돌기아교세포의 내부 이동을 자극시킴을 나타내었다.

이식된 SC-I가 회복된 척수 손상 부위 내에서 중추신경계-타입 수초보다는 말초신경계-타입 수초를 재생시키는지 여부를 더욱 상세히 분석하기 위해 말초신경계-타입 수초를 검출하는 PO 및 중추신경계-타입 수초를 확인시키는 PLP를 이용하여 이중-면역형광 염색이 수행하였다(도 4E). P0-발현 세포는 PKH26-표지화된 세포의 영역과 정확하게 일치하여 병변 중심점 내에 주로 집중되었다. PLP-발현 세포는 병변 중심 내에 이식된 PKH26-표지화되고 P0-발현 세포와 현격히 분리되었고 주로 주변부에 위치하였다. 적은 수의 PLP-발현 세포만이 병변 중심에서 발견되었고 작은 섬을 형성하였다.

척수 손상을 지닌 대조군 래트에서 NF200-양성 염색은 병변 공동의 외부 가장자리에 한정되었다. DRG로부터 침윤된 P0-양성 내인성 슈완 세포는 척수 배면의 좌측 및 우측에서 검출되었다. 희소돌기아교세포 수초 당단백질(OMG) 및 PLP 염색은 손상되지 않은 부위와 병변의 가장자리에서 관찰되었다.

중추신경계- 및 말초신경계-타입 세포 신경돌기 성장 및 내부 이동의 자극

도 2D에 나타난 바와 같이 SC-I는 고유 슈완 세포와 유사하게 다양한 향신경 인자 유전자를 발현하였다. SC-I 이식이 신경돌기 성장을 자극시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해 재생 신경세포의 성장 추체 내에서 높게 발현되는 GAP43의 수치가 면역형광 염색에 의해 조사되었다(도 5A). 저배율에서 GAP43은 PKH26-양성 회복 조직 내에 풍부하였고, 고배율에서 대부분의 GAP43-발현 섬유는 병변 중심에서 PKH26-표지화된 작은 고리 및 튜브-유사 구조와 근접하여 나란히 놓이거나 혼합되었다. 대조군 척수 손상을 지닌 래트에서 GAP43의 강한 염색은 손상되지 않은 영역 및 병변의 가장자리에서 관찰되었다.

신경세포 재생의 상세한 분석을 위해 5-HT, 감마-아미노부티르산(GABA) 및 칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP)에 대한 면역형광 염색이 수행되었다(도 5B-D). 세로토닌성 하행 신경세포 및 GABA-성 중간신경세포(interneuron)은 병변 주변부에서 발견되었다. CGRP-양성 신경세포는 배측 경계의 좌측 및 우측 모두에 풍부하였다. 이는 아마도 DRG로부터 2차 신경세포의 침윤을 나타낸다.

EGFP-SC-I의 이식에 의하여 형성된 말초신경계-타입 수초의 결절주위성 구조 확인

내인성 슈완 세포에 의한 PKH26-표지화된 세포의 가능한 탐식을 배제시키고 SC-I에 의한 말초신경계-타입 수초 형성을 더욱 확인하기 위해 상기 기재된 실험을 EGFP-발현 형질전환 래트 유래 SC-I를 이용하여 반복하였다. 스페로이드-형성 세포는 EGFP 형질전환 래트의 피하 조직에서 분리하고 슈완 세포-유사 세포로 분화하도록 유도하였다. 슈완 세포로 분화를 확인 후 EGFP-SC-I를 척수 손상의 병변 중심부위에 이식하였다. 이식 4주 후 척수의 세로 절편에서 EGFP-발현 세포는 주입 부위에서 문측 및 미측으로 약 5 mm 이내의 병변 중심에서 검출되었다(도 6A).

EGFP-SC-I가 기능적인 수초 형성세포로서 회복 조직 내에 착상되었는지를 조사하기 위해 이중-형광 염색이 수행하였다. 이식된 EGFP-SC-I는 척수 손상의 회복 조직 내에서 NF200-양성 축삭과 동시-위치하고 외부로부터 축삭을 피복하였다(도 6B).

다음으로 본 발명자들은 결절주위성(paranodal) 구조가 형성되는지 여부를 조사하였다. 결절주위성 구조는 컨탁틴(contactin) 및 컨탁틴-관련 단백질(CASPR)과 같은 축삭 멤브레인 단백질 복합체 함유 단백질이 집중되고 수초 루프(loop)에 대한 접촉 부위를 제공하는 곳에서 형성된다. 면역형광염색 분석에서 신경 섬유를 따라 일정한 간격으로 강한 CASPR-양성 이중체의 밀접한 병치가 검출되었고 대부분의 이중체는 EGFP-발현 빈 튜브-유사 구조에 의해 피막화됨을 나타내었다(도 6C). 일부 위치에서 CASPR-양성 이중체 밴드는 더욱 길고 더욱 확산되게 나타났다.

저배울에서 EGFP-발현 세포의 착상은 이식 부위로부터 문측 및 미측 모두에서 약 5 mm 떨어진 영역에서 발생하는 것으로 나타났다(도 6A). 병변이 이식된 EGFP-SC-I에 의해 회복되었음을 더욱 나타내기 위해 NF200, P0 및 EGFP의 3중-형광 염색을 수행하였다(도 7A). EGFP-양성 영역은 회복 조직 내 NF200-양성 및 P0-양성 영역과 크게 일치하였다. 횡단-절편에서 대부분의 NF200 섬유는 더 큰 작은 고리-유사 P0-양성 구조에 의해 밀접하게 윤곽화되었고, EGFP-양성 세포 소체도 P0-양성 작은 고리와 밀접하게 결합되었다. 또한 NF200 섬유는 밀접하게 나란히 놓인 P0-양성 EGFP-발현 세포체의 의해 피복되어 있었다. 따라서 EGFP-발현 SC-I는 병변 부위로 착상되어 여분의 축삭 상의 말초신경계-타입 수초 재구축에 관여하는 것으로 나타났다.

고배율에서 P0 및 EGFP의 이중-형광 관찰(도 7B)은 대부분의 EGFP-발현 세포가 P0-양성 빈 튜브-유사 및 작은 고리-유사 구조 주위에 피복됨을 나타내었고, 이는 EGFP-SC-I에 의한 치밀한 수초 형성을 나타낸다. 여러 위치에서 P0-양성 튜브-유사 구조의 주기적 단절이 관찰되었고, 이는 아마도 도 6C에서 나타난 결절 구조를 반영한다. 따라서 PKH26-표지화된 SC-I를 이용하여 나타난 바와 같이 EGFP-SC-I는 회복된 병변 부위에 착상되어 랑비에르 결절-유사 구조를 지닌 말초신경계-타입 수초 형성에 관여하였다.

본 발명에서 본 발명자들은 네스틴-발현 뉴로-스페로이드(neurospheroid)-유사 세포가 피하 지방 조직의 다분화능 지방 조직-유래 줄기세포로부터 유효하게 생성되고(세포의 약 60∼80%) 시험관 내에서 슈완 세포로 분화될 수 있음을 발견하였다. 이러한 유도된 슈완 세포는 압축 척수 손상의 병변 중심에서 성공적으로 착상되어, NF200-양성 중추신경계 축삭에 말초신경계-타입 수초를 형성하였다. 세포 운명, 생존, 결절주위성 구조 및 조직 회복 시 역할은 PKH26-표지화된 SC-I 및 EGFP-발현 SC-I 모두의 이중-면역형광 염색에 의해 확인되었다. 더욱이 대조군 SC-N과 마찬가지로 SC-I도 여러 향신경 인자를 발현함을 나타내었고, 이는 내인성 치료 반응을 자극하는 SC-I의 추가적인 역할을 나타냈다. 따라서 피하 지방 조직으로부터 유도된 슈완 세포는 중추신경계 및 말초신경계 손상 회복을 목표로 한 세포 치료로 사용가능함을 보여준다.

피하 지방 조직 유래 스페로이드-형성 세포는 모낭에 존재하는 신경 능선-유사 전구세포인 것으로 보고된 바 있는 다분화능 SKP와 발생상으로 상이한 것으로 판단된다. SKP에 의해 나타난 신경 능선세포와는 대조적으로 피하 지방 조직 유래 세포는 분리 직후(따라서 배양 없이) Sox10 및 p75와 같은 신경 능선세포 마커 및 P0, L1 및 GFAP와 같은 슈완 세포 마커에 대해 음성적이었고 스페로이드 및 슈완 세포 형태 유도 후에만 발현되었다(도 2). 분석된 신경 능선세포 마커 중 S100은 모든 단계의 유도에서 지속적으로 발현되었다. 상기 주지된 바와 같이 S100은 지방 조직, BMSC 및 다른 조직에서도 발현된다. mRNA 발현은 지속적이었으나 S100 단백질은 슈완 세포 유도 후에만 면역형광에 의해 검출 가능하였다(도 2). 더욱이 최초 스페로이드-형성 세포는 단층 세포 확장 후에도 지방세포 및 골세포로 분화될 수 있는 능력을 지녔고, 이는 이들 세포가 다분화능 지방 조직-유래 줄기세포의 고유 특성을 지님을 나타낸다. 따라서 피하 지방 조직에서 분리한 스페로이드 형성하고 SC-I로 분화 유도되는 전구세포는 종전 보고된 신경 능선-유사 SKP 및 내인성 슈완 세포 또는 슈완 세포 전구체와 구별된 다분화능 지방 조직-유래 줄기세포일 것으로 추정된다.

슈완 세포-유사 세포는 신경 능선세포 이외의 세포로부터 분화되고, 따라서 지방 조직으로부터 직접 또는 스페로이드-형성 세포 또는 골수 기질 세포의 발달 후 분화되는 것으로 종전 보고된 바 있다. 그러나 종전 연구에서 세포는 슈완 세포-유사 표현형의 부분적 획득만을 나타내었고, 말초신경계 또는 중추신경계 손상 후 세포의 생체 내에서 수초를 형성시키거나 생체 내에서 내인성 치료 반응을 자극시키는 능력은 조사되지 않았다. 따라서 연구의 임상적 적용에 대한 의문은 남아있다. 이에 반해 본 발명은 나아가 체내 이식 실험으로 유도 분화된 세포가 중추신경계 축삭에 수초를 형성하고, CASPR-발현 결절주위성 구조도 형성함을 증명하였다(도 6 및 7). 이는 SC-I가 손상된 말초신경계 및 중추신경계 조직의 세포치료에서 고유 슈완 세포를 대체하여 사용할 수 있음을 보여 준다.

본 발명에 나타난 바와 같이 지방 조직에서 분리된 60∼80%의 세포는 유도 배지 내에서 스페로이드를 형성하였고, 이러한 능력은 단층 배양 후에도 5 계대까지 보유되었다. 스페로이드 배양 시 세포 확장은 공간적으로 제한되기 때문에 대량으로 세포 확장은 제한된다. 그러나 단층 배양과 스페로이드 배양을 결합하는 방법으로 이러한 단점을 극복하고 대량의 스페로이드 형성능력을 가진 세포를 확보할 수 있게 되였다. 스페로이드 배양시 느린 성장은 스페로이드 배양 동안 PDGF 수용체, EGF 수용체 및 p75 NGF 수용체와 같은 성장 인자 수용체의 발현 부재에 의해 유발되는 것으로 판단된다(도 2). 네스틴 발현의 공간적 차이도 스페로이드 내에서 관찰되었다. 그러나 스페로이드 내 성장 인자 수용체 발현과 네스틴 발현과의 상호관계는 본 발명에서 더욱 깊이 연구되지 않았다.

여러 신경세포- 및 슈완 세포-관련 유전자는 슈완 세포 발달이 시작되기 전에 스페로이드 유도의 첫 번째 단계 후 이미 발현되었다(도 1 및 2). 이는 스페로이드 유도 배지와 같은 후생유전학적 영양 환경은 지방 조직-유래 줄기세포의 전환분화(transdifferentiation)에 중요한 필수 조건임 보여준다. 스페로이드 유도 없이 이러한 줄기세포로부터 직접적인 슈완 세포 유도는 비효율적이었고, 고유 슈완 세포는 스페로이드를 형성하지 않았다. 따라서 첫 단계에 스페로이드를 유도함으로서 슈완 세포 유도 효율은 증가되었고, 거의 모든 세포는 슈완 세포-유사 표현형을 나타내었다.

슈완 세포로의 유도는 Sox10, p75, S100β, Krox20, L1 및 P0을 포함한 여러 슈완 세포 마커의 발현을 모니터링함으로써 평가되었다. Sox10을 제외한 모든 마커는 슈완 세포 및 다른 조직 내에서 발현된다. 예를 들어 p75도 중간엽 줄기세포(MSC) 및 지방 조직-유래 줄기세포(ADSC)에 대한 마커이고, S100β 및 Krox20 모두는 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC) 내에서 발현된다. 유사하게 PLP/DM20 및 PMP22는 여러 다른 조직 내에서 검출되었다. 그러나 Sox10 발현은 모든 단계의 슈완 세포 발달에 필요하다. 따라서 초기에 분리한 지방 조직 유래 세포에서 Sox10 발현 부재는 말초 신경 유래 고유 슈완 세포에 의한 오염을 배제시킨다.

SC-I 이식은 척수 손상 회복을 촉진시키는 것으로 나타났다(도 3). 이는 SC-I에 의한 신경세포 축삭 재생, 재수초화 및 SC-I에서 방출된 향신경 인자의 작용으로부터 야기된 내인성 전구세포의 손상 부위로 이동과 분화 등에 의하여 달성되었다. 이식한 SC-I는 말초신경계 타입의 수초 형성에 직접적으로 관여하고 SC-I도 고유 슈완 세포와 마찬가지로 NGF, BDNF, CTNF 및 GDNF와 같은 향신경 인자를 발현하는 것으로 나타났기 때문에 양 메커니즘 모두가 회복 촉진에 관여하였다(도 1). 예측된 바와 같이 이식된 PKH26-표지화된 세포보다 더 많은 p75-양성 세포가 이식부위에 존재하였다. 그러나 이식된 SC-I에 의한 직접적인 재수초화와 비교하여 내인성 슈완 세포가 척수 손상 회복에 기여하는 정도도 조사되어야 한다.

병변 부위 내 이식된 SC-I에 의한 조직학적 개선과 비교 시 BBB 득점에 의해 추정된 행동 기능 개선은 다소 적은 것으로 나타났다. 이는 척수 손상 시 유의적인 기능 복구는 슈완 세포 이식에 의해서만 달성되기는 다소 어려움을 보여준다. 그러나 척수 손상의 기능적 회복 개선에 상승적으로 작용하는 병변 부위 내 초기 세포 사멸과 2차적인 세포 사멸을 억제 및 보호하고, 축삭 성장을 자극하고, 신경 줄기세포와 같은 다른 세포 구성성분을 제공하는 방법과 다중 결합하여 적용 시 더욱 긍정적인 치료효과를 회득할 수 있다. 본 발명의 슈완 세포 이식의 유의성은 척수 손상의 병변 부위 내 세포 운명의 측면에 주로 한정된다.

항-희소돌기아교세포 수초 당단백질(OMG), 콘드로이친 황산 프로테오글리칸(CSPG)는 회복 병변의 중심 및 주변부 모두에서 강하게 발현되어 조직 내 축삭 성장 및 신장을 저해하여 후지 운동의 개선을 방해한다. 최적의 임상 결과를 달성하기 위해 콘드로이티나제 ABC(chondroitinase ABC)와 같은 물질 및 초기 염증 제어를 매개하는 약물을 슈완 세포 치료법과 결합하여 사용할 필요성이 있다. 따라서 중추신경계 기능의 완전한 복구는 슈완 세포 이식 단독에 의해 충분히 달성될 수 없는 신경 네트워크를 포함한 복잡한 환경의 재-개발을 필요로 한다. 그럼에도 불구하고 SC-I는 수초의 합성에 의해 박탈된 축삭을 보호하고 내인성 중추신경계 세포를 동원함으로서 척수 손상 회복에 유익한 역할을 하는 것으로 판단된다. 축삭 유도 지지체(scaffold)와 함께 신경 세포, 슈완 세포 및 향신경 인자를 병합하여 이용한 향후 연구는 척수 손상 후 기능 복구를 더욱 개선시킬 것이다.

PKH26 염료는 생체 내에서 세포를 추적하는데 널리 사용되고 있으나 일부 염료는 전이되어 병변 부위 내에서 대식세포를 탐식하거나 내인성 슈완 세포를 이동시키는 것으로 나타났다. 그러나 본 발명의 데이터는 NF200-양성 축삭과 관련한 작은 고리 및 튜브-유사 구조를 포함한 특정 세포 돌기의 형태적 특성을 기반으로 대식세포를 PKH26-표지화된 이식 SC-I에 의해 형성된 수초와 명백하게 구별하였다(도 4). PKH26 표지화 데이터의 가능한 오역을 배제시키기 위해 대부분의 실험은 EGFP-SC-I를 이용하여 반복되었고, 유사한 결과가 보여줬다. PKH26을 이용하여 달성된 원형질막 표지화와는 대조적으로 EGFP 단백질은 세포질 및 세포핵 위치하여 있다. 이는 SC-I 수초 형성 후 EGFP가 수초의 치밀한 다층의 막 구조보다는 주로 세포 소체에 집중되도록 하고, 분석 시 EGFP의 다소 협소한 분포 및 P0-양성의 치밀한 수초 근방으로부터 마커 배제를 나타내는 것으로 판단된다.

결론적으로 피하 지방 조직 유래 스페로이드-형성 세포는 신속하고 유효한 슈완 세포 유도에 이용되었고, 이러한 세포는 중추신경계 및 말초신경계 손상 치료제로서의 전망을 보여준다.

본 발명에 있어서, 중추 또는 말초 신경계 손상을 치료하기 위한 본 발명의 슈완 유사세포 유효 용량은 1ㅧ10⁴ 내지 1ㅧ10⁷ 세포/kg 일 수 있다. 그러나 이 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 증상의 경중도에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 치료제는 비경구, 국소 투여에 의해 인체에 적용될 수 있으며, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 뇌 척수액 내 투여 등의 방법으로 투여될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효 성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시킬 수 있으며, 이 때 생리식염수 등의 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1) 피하 피부 조직의 분리 및 스페로이드 배양

모든 동물 실험은 경희대학교 실험동물운영위원회에 의해 승인되었다. 성체 수컷 Sprague-Dawley(SD) 래트(7∼8주령) 또는 EGFP 형질전환 수컷 래트(7주령; 두 래트 스트레인 모두 Japan SLC, Shizuoka, Japan에서 구입)는 마취하고, 피하조직은 진피 아래에서 조심스럽게 절개하여 채취하였다. 외과용 가위로 약 2 ㎣ 크기로 잘게 자르고 0.15%(w/v) 콜라게네이즈 타입 I(Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ)로 37℃에서 1시간 동안 처리되었다. 콜라게네이즈는 10%(v/v) FBS(Lonza, Walkersville, MD)를 함유한 동일한 부피의 DMEM/F12(WelGENE, Daegu, Korea)의 첨가에 의해 불활성화되었다. 40-㎛ 세공 크기의 필터(BD Biosciences, Mississauga, Ontario) 통과 후 세포는 N2 서플먼트(Gibco, Grand Island, NY), 20 ng/ml EGF(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN), 20 ng/ml bFGF(R&D Systems Inc.) 및 2 ㎍/ml 헤파린(Sigma-Aldrich, St, Louis, MO)을 지닌 DMEM/F12(3:1 비율, v/v)로 구성된 스페로이드 유도 배지 내에 재현탁하여 75 ㎠ 플라스크에 파종(seeding)하였다. 배지는 3일마다 교체하였다. 7∼10일 후 스페로이드는 원심분리에 의해 채취되었고 불로 소독한 파스퇴르 피펫(Corning, Austin, TX)을 이용하여 단일 세포로 분리하였다. 분리한 세포를 10%(v/v) FBS을 함유한 DMEM/F12(3:1 비율, v/v) 배지로 세포를 희석한 후 5 X 10⁵ 세포수/T75 플라스크 밀도로 단층배양을 하였다. 90% 융합(confluence)시 세포는 채취되고 1:3의 비율로 계대(Passage) 5까지 계대 배양하였다. 스페로이드를 재형성하기 위하여 세포는 스페로이드 유도 배지로 3일간 및 G5 서플먼트(Gibco), 2 ㎍/ml 라미닌(Sigma-Aldrich) 및 2 ㎍/ml 헤파린을 지닌 뉴로버살(neurobasal) 배지(Gibco) 내에 3∼4일간 배양하였다. 이들 스페로이드는 슈완 세포 유도에 사용하였다.

(실시예 2) 지방형성 및 골형성 분화

스페로이드-형성하는 세포를 단층 배양하여 대량 확보한 후 특정 분화 유도 배지를 사용하여 세포 분화 능력을 검증하였다. 지방형성 분화의 경우 세포는 2.0 X 10⁴ 세포수/㎠로 플레이트하고 10%(v/v) FBS, 0.5 μM 이소부틸-메틸크산틴(IBMX), 1 μM 덱사메타손, 10 μM 인슐린 및 200 μM 인도메타신으로 보충된 DMEM으로 구성된 지방형성 분화 배지(Cambrex, Verviers, Belgium) 내에서 2주간 배양하였다. 지방형성 분화는 지질 소적(lipid droplet) 형성에 의해 입증된 바와 같이 Oil-Red O 염색에 의해 확인하였다. 골형성 분화의 경우 세포는 10%(v/v) FBS, 0.1 μM 덱사메타손, 50 μM 아스코르베이트-2-포스페이트 및 10 mM 베타-글리세로포스페이트로 보충된 DMEM으로 구성된 골형성 분화 배지(Cambrex) 내에서 2주간 배양하였다. 골형성 분화는 광화작용에 의해 나타난 바와 같이 Alizarin Red S 염색에 의해 확인하였다.

(실시예 3) 슈완 세포 분화

스페로이드는 트립신/EDTA을 이용하여 단일 세포로 분리시킨 후 10%(v/v) FBS 및 35 ng/ml 올트랜스 레티노산(all-trans retinoic acid)(Sigma-Aldrich)를 함유한 α-MEM 배지(Gibco)에 현탁하고 후폴리-L-라이신(Sigma-Aldrich)-코팅된 디쉬에 플레이트하여 4일간 배양하였다. 4일 후 10%(v/v) FBS, 5 μM 포스콜린(forskolin)(Sigma-Aldrich), 10 ng/ml bFGF(R&D Systems Inc.), 5 ng/ml PDGF-aa(R&D Systems Inc.) 및 200 ng/ml 헤레글린 1(heregulin1)-베타-1(R&D Systems Inc.)을 함유한 α-MEM으로 구성된 슈완 세포 유도 배지로 전액 교체하여 8일간 배양하였다. 이 후 세포는 추가로 10 ng/ml 뉴로트로핀(neurotrophin)-3(NT-3)(R&D Systems Inc.)를 함유한 동일한 배지 내에서 20일간 계대 배양하였다.

(실시예 4) 래트 성체 슈완 세포의 배양

래트 성체 슈완 세포의 배양은 종전 보고된 방법을 다소 변경하여 수행하였다(Morrissey, T.K. et al., J. Neurosci. 11, 2433-2442, 1991; Haastert, K. et al., Nat. Protoc. 2, 99-104, 2007). 간단하게 좌골 신경을 성체 수컷 SD 래트 또는 EGFP 형질전환 래트(7주령, Japan, SLC)의 후지에서 채취하였다. 미세 forceps를 사용하여 신경외막, 결합 조직 및 혈관을 좌골 신경으로부터 박리한 후 부검 현미경(Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 미세가위(microscissor)를 사용하여 1 X 1 mm 크기로 절단하였다. 절단한 조직(체외이식편)을 차례로 60-mm 배양 디쉬에 플레이팅한 후 4∼5 ml 10%(v/v) FBS를 함유한 DMEM/F12(3:1)를 첨가하고 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. 외부로 이동하면서 증식하는 섬유아세포가 체외이식편 주변에 융합되어 자랄 때까지 신선한 배지를 주 1회 공급하였다. 그 후 체외이식편을 새로운 배양 디쉬로 이동하였다. 이러한 과정은 일반적으로 3∼4주간 소요되고 체외이식편으로부터 섬유아세포 이동이 중지되고 슈완 세포 이동이 증가될 때까지 반복하였다. 3~ 4주 후 1 mM EDTA를 함유한 0.25%(w/v) 트립신용액에서 파스퇴르 피펫을 사용하여 체외이식편을 파괴하고 37℃ 수조 내에서 10분간 방치하였다. 분리한 세포 및 세포외 기질 혼합물을 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지와 혼합한 후, 원심 분리하였다. 형성된 침전물(pellet)을 10% FBS, 2 ㎛ 포스콜린(forskolin) 및 50 ng/ml 헤레글린 1-베타-1을 함유한 α-MEM 에 현탁하고 폴리-L-라이신-코팅된 디쉬 상에 플레이트 하였다. 배지를 주 1회 교환하였고 계대 3까지 세포를 계대 배양하였다. 최종 배양한 슈완 세포 순도는 대략 >90%이었다.

(실시예 5) 면역형광 염색

세포를 커버 슬립 상에 플레이트하고 10 ng/ml NT3을 함유한 슈완 세포 유도 배지 내에서 4일간 배양된 후 0.1 M PBS 내 4%(v/v) 포름알데히드 용액 pH 7.4(Sigma-Aldrich)로 30분간 고정하고 PBS 내 0.2% (v/v) Triton X-100(USB Corporation, Cleveland, OH)으로 투과하였다. 비-특이적 항원은 PBS 내 10%(v/v) 염소 혈청(Vector Laboratories, Burlingame, CA)으로 1시간 동안 블로킹한 후 1차 항체(Ab)로 4℃에서 밤새 반응시켰다. 항체 희석은 하기와 같다: 항-O4(Chemicon, Temecula, CA; MAB345; 1:500), 항-A2B5(Chemicon MAB312; 1:500), 항-p75(Chemicon MAB365; 1:200), 항-아교섬유산성단백질(GFAP)(Chemicon MAB360; 1:200), 항-S100(Chemicon MAB079-1; 1:100) 및 항-비멘틴(Chemicon MAB3400; 1:200). 세포를 PBS로 3회 세척하고 FITC-컨쥬게이트된 2차 항체(Chemicon AP124F; 1:200)로 1시간 동안 방치하여 반응 시킨 후 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유한 Vectashield 봉입제(Vector, Burlingame, CA; catalog no. H-1200)로 표본을 제작하였다. 염색결과는 Leica CTL4000 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다.

(실시예 6) RT-PCR 분석

각 배양 단계 세포는 1 mM EDTA를 함유한 0.25%(w/v) 트립신으로 처리하여 분리한 후 RNase mini kit(Queagen, Valencia, CA)를 사용하여 mRNA는 추출하였다. cDNA는 제조사의 지침에 따라 Superscript Ⅲ first-strand synthesis system(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 합성하였다. PCR은 Perfect PreMix version 2.1(TaKaRa, Otsu, Japan)을 이용하여 수행하였다.

(실시예 7) 압박 척수 손상 및 세포 이식

체중 250∼300 g의 성체 암컷 SD 래트를 케타민((80 mg/kg; Yuhan, Seoul, Korea) 및 럼푼(rompun)(7.4 mg/kg; Bayer, Seoul, Korea)을 복강 내 주사하여 마취하였다. T9-T11에서 경질막에 손상 주지 않도록 조심하여 척추후궁절제술을 진행하였다. 클립(20-30 g; Fine Surgical Tools, Foster City, CA)을 사용하여 척수를 양쪽에서 동시에 1분간 좌우 방향으로 측면으로 압축하였다. 배뇨가 복귀될 때까지 수작업으로 매일 2회 배뇨시키고, 세파졸린(Chong Keun Dang Pharma, Seoul, Korea)이 1주일 동안 격일로 복강 내 주사하였다. 슈완 세포 이식은 척수 손상 9일 후 실시하였다. 이식한 세포를 추적하기 위해 세포를 PKH26(Sigma-Aldrich)로 표지화하고, PBS 내에 1 X 10⁵/㎕로 희석하였다. 척수 손상 동물은 무작위로 시험군과 대조군으로 분류하였다. PKH26-표지화된 세포는 정위적 주입 기기(Stoelting Co., Wood Dale, IL) 및 나노리터 주사기 펌프(KD Scientific Inc, Hillstone, MA)를 이용하여 이식하였다. 총 5 ㎕의 세포 현탁액 및 PBS는 29-게이지 바늘을 부착한 10 ㎕ Hamilton 주사기(Hamilton Co., Reno, NV)를 이용하여 척수 후 정맥 측면에서 1.5∼2.0 mm 깊이로 병변 중심부위에 주사하였다. 주사는 1 ㎕/분의 속도로 5분간 진행하였다. 주사 후 세포 누출을 최소화하기 위해 바늘을 철회 전 2분간 그대로 유지하였다. 이러한 절차는 문측 및 미측 부위로 씻겨 내려가는 것을 방지한다. 이식 3일 전 시작하여 실험 종료까지 매일 수술 한 래트에 사이클로스포린(Chong Keun Dang Pharma)을 1 mg/100 g 체중 용량으로 복강 내 주사하였다.

(실시예 8) BBB 후지 득점 시험

후지 운동 기능은 BBB 운동 평가 척도를 이용하여 평가하였다. 좌측 및 우측 후지의 득점을 평균화하였다. BBB 시험은 수술전(수술 당일) 및 수술 후 주 1회로 실험 절차를 모르는 3명의 관찰자에 의해 수행되었다. 모든 데이터는 평균±SEM으로 표기하였다. 각각의 이식-후 기간의 두 그룹 간의 평균 BBB 득점의 차이는 Student t-테스트를 이용하여 평가하였다. P<0.05 수치는 통계적으로 유의적인 것으로 간주되었다.

(실시예 9) 조직학 및 면역조직화학

래트는 조직학적 조사를 위해 세포 이식 4주 및 8주 후에 희생되었다. 래트를 마취 한 후 1 U/ml의 헤파린을 함유한 PBS 200 ml을 좌심실 내에 관류하고 뒤이어 0.1 M PBS 내 얼음-냉각된 4%(v/v) 파라포름알데히드(PFA) 300 ml가 관류하였다. 절제한 척수를 4%(v/v) PFA에 담가 4℃에서 24시간 동안 방치 후 30%(w/v) 슈크로스 용액으로 교체하여 추가로 3일간 담갔다. 병변 부위는 OCT 화합물(Sakura, Tokyo, Japan)을 사용하여 블로킹한 후 배측에서 복측 방향으로 수평으로 20 ㎛ 두께로 동결 박절하였다.

면역형광 분석을 위해 절편은 0.1 M PBS 내 0.3%(v/v) Triton X-100 내에 1시간 동안 투과하고 10%(v/v) 일반 염소 혈청 또는 10% (v/v) 말 혈청으로 1시간 동안 블로킹하였다. 그 후 4℃에서 하기 1차 항체와 밤새 반응시켰다: 항-GFAP(Chemicon MAB360; 1:200), 항-콘드로이친 황산 프로테오글리칸(CSPG)(Chemicon MAB5284; 1:200), 항-p75(Chemicon MAB365; 1:500), 항-뉴로필라멘트 200 kDa(NF200)(Chemicon MAB5262; 1:200), 항-β-튜불린-Ⅲ(Chemicon CBL412; 1:200), 항-수초 염기성 단백질(MBP)(Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, SC-I3914; 1:50), 항-P0(Santa Cruz SC-I8531; 1:50), 항-희소돌기아교세포 수초 당단백질(OMG)(Santa Cruz SC14525; 1:50), 항-섬유결합소(Chemicon AB2040; 1:80), 항-PLP(AbCam, Cambridge, UK; AB9311; 1:1000), 항-5-HT(세로토닌)(Immunostar, Hudson, WI; 20080; 1:10,000), 항-감마-아미노부티르산(GABA) (Chemicon, AB131; 1:1000), 항-칼시토닌 유전자-관련 펩타이드(CGRP) (Chemicon AB5920; 1:10,000), 항-S100β(Vector VP-S276; 1:200), 항-컨탁틴(contactin)-관련 단백질 Caspr(CASPR)(AbCam AB34151; 1:150). 이후 절편을 항-FITC(Vector FI-2000; 1:200), 항-Texas Red(Vector TI-1000 또는 TI-5000; 1:200) 또는 항-AMCA(Vector CI-5000; 1:200)-컨쥬게이트된 2차 항체로 상온에서 1시간 동안 반응 시켰다. 그 후 DAPI(Vector H-1200) 함유 Vectashield 봉입제로 표본을 제작하고 Leica CTR 4000 형광 현미경 또는 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경(Carl Zeiss, Jena, Germany)하에서 관찰하였다.

Claims (7)

1. 피하 지방조직의 다분화능 지방줄기세포를 N2, EGF 및 bEGF를 함유한 스페로이드-유도 배지에서 배양 분리시킨 네스틴-발현 뉴로-스페로이드 형성세포를 시험관 내 분화 유도 배지에서 분화시킨 슈완 유사세포
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 슈완 유사세포는 생체 내에서 NF200-양성 중추신경계 축삭(axon) 주변에 PO-포함 말초 신경계 타입 수초를 형성시킴을 특징으로 하는 슈완 유사세포
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 슈완 유사세포는 생체 내에서 손상된 부위로 희소돌기아교세포의 내부 이동을 유발시킴을 특징으로 하는 슈완 유사세포
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 슈완 유사세포는 NGF, BDNF, CTNF 및 GDNF와 같은 향신경인자를 발현시킴을 특징으로 하는 슈완 유사세포
   
5. 제 1항의 슈완 유사세포를 유효성분으로 함유하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 슈완 유사세포는 생체 내 고유 슈완 세포와 같이 O4, A2B5, GFAP, p75, S100β 및 Sox10을 발현시킴을 특징으로 하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물
   
7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물은 파킨슨씨병, 뇌졸중, 근위축성 척수측쇄경화증, 척수손상, 운동신경손상 또는 외상에 의한 말초신경손상질환에 유효함을 특징으로 하는 중추 또는 말초 신경계 손상 치료제 조성물

Images