JP7248590B2 - 二分化または多分化オルガノイド - Google Patents
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Description
国際公開第WO 2014/033322 A1号パンフレットは、前駆細胞を分化させることによる膵内胚葉の産生方法を記載している。
国際公開第WO 2011/055855 A1号パンフレットは、培養幹細胞において分化を誘導する方法を記載している。
米国特許出願第US 2016/312181 A1号公報は、幹細胞からの神経細胞の分化を記載している。
フィーダー依存性ヒト人工多能性幹細胞(hiP-SC)(Systems Biosciences社、カタログ番号SC101A-1)を、多能性検証済で汚染のない状態でSystems Biosciences社から入手した。フィーダー依存性hiPSCは、ゼラチンコーティングした(PBS中0.1%ゼラチン)6ウェル培養プレート上で、照射済マウス胚線維芽(MEF)フィーダー細胞(MTI-GlobalStem社、カタログ番号6001G)をヒト胚幹細胞(hESC)培地:20 ng/mL bFGF (IMBA institute Molecular Biology Service社のコア施設により製造)、3.5μL/500 mL 培地の2-メルカプトエタノール、20%ノックアウト血清(Invitrogen社製)、1% GlutaMAX (Invitrogen社製)、1%MEM-NEAA (Sigma社製)および3% FBSを含有するDMEM/F12培地(Invitrogen社製)を使って培養した。フィーダー未使用のH9ヒト胚幹細胞(hESC)は、検証済正常核型および汚染の無い状態でWiCell社から入手した。フィーダー未使用のhESCは、hESC適格マトリゲル(Corning社製、カタログ番号354277)でコーティングした6ウェルプレート上で、mTeSR1(Stemcell Technologies社製)を使って培養した。全ての幹細胞は5%CO2インキュベーター中37℃に維持した。hPSCを培養し分裂させるためには以前に説明された通りの標準手順を用いた(Lancaster & Knoblich Nat Protoc 9, 2329-2340 (2014))。全ての細胞系を汚染について日常的に試験し、マイコプラズマ陰性であることを確かめた。
細胞のユビキタス蛍光標識のため、TALEN技術(Hockemeyer他、Nat. Biotechnol. 27, 851-857 (2009))を用いて以前に実施された通りに、鋳型としてAAVS1 SA-2A-Puro ドナーベクターを使ってhPSCのセーフ・ハーバー(安全領域)AAVS1遺伝子座中にレポーター構成物を挿入した。コアのニワトリHS4インシュレーターの隣接タンデムリピート配列(2xCHS4)を含む改変型骨格を構築した。その隣接インシュレーター配列の間に蛍光レポーター発現カセットを挿入した。次の発現構成物をiPSC中に挿入した:(1) 2xCHS4-EF1α-eGFP-SV40-2xCHS4、(2) 2xCHS4-EF1α-tdTomato-SV40-2xCHS4。フィーダーフリーのH9 hESCSには、2xCHS4-CAG-eGFP-WPRE-SV40-2xCHS4構成物を挿入し、タイムラプス撮影実験用にGFP発現を増強した。
脳オルガノイドは、国際公開第WO2014/090993号、Lancaster & Knoblich, Science 345, 1247125-1247125 (2014)およびLancaster & Knoblich, Nat Protoc 9, 2329-2340 (2014) に記載の従来のプロトコルに従って、わずかな変更を伴って作製した。該プロトコルの神経系誘導段階の間に、次の処置の1つ:1) 対照、薬剤無し、2) 腹側、2.5μM IWP2(Sigma社製、カタログ番号I0536) と100 nM SAG(Millipore社製、カタログ番号566660)、3) 背側、5μM CycA(Calbiochem社製、カタログ番号239803)を使って、薬剤パターン形成処置を適用した。薬剤原液は次のように調製した:IWP2 (DMSO中5mM)、SAG (H2O中1 mM)およびCycA (DMSO中5 mM)。マトリゲル(Corning, カタログ番号356235)中に包埋後、オルガノイドを25 mLの分化培地の入った10 cm細胞培養皿中で増殖させ、最初の培地交換後、5~7日ごとに培地を交換しながら軌道振盪器上で維持した。プロトコルの40日目に、オルガノイドがマトリゲル液滴の外側に増殖し始めた時点で、分化培地に1%マトリゲルを補足した。
各薬剤パターン化処置群については、8~12個のオルガノイドを2 mLのRNアーゼフリー試験管の中に30~40日目に収集し、操作全体を通して氷上で冷却した。オルガノイドを氷冷PBS中で3回洗浄し、次いで該オルガノイドを冷却したCell Recovery Solution(Corning社製、カタログ番号354253)中で4℃にて1時間インキュベートすることによりマトリゲルを溶解させた。溶解したマトリゲルを冷PBS中で3回すすぐことにより除去した。Rneasyミニキット(Quiagen社製)を使ってRNAを抽出した。cDNA合成は、2μgの全RNAとSuperscript II (Invitrogen社製) 酵素を使って製造元のプロトコルに従って実施した。qPCR 反応は、Sybr Green マスターミックス(Promega社製)を用い、次の反応プロトコルを使ってBioRad 384-ウェル装置(CXF384)上で実施した:1) 95℃で3分、2) 95 ℃で10秒、3) 62 ℃で10秒、4) 72℃で40秒、5) 2)に戻って40サイクル、6) 95℃で1分、7) 50 ℃で10秒。定量は、参照(リファレンス)遺伝子としてTBPを使ってΔCt値を算出することによりエクセル上で行った。データは、TBPに比較した発現レベル〔2-ΔCt〕として表した。
オルガノイド融合体をVibratome薄片化することによりスライス培養物を作製した。オルガノイド融合組織を4%低融点アガロース(Biozyme社製、カタログ番号850080)中に包埋し、氷冷PBS(Ca2+/Mg2+不含有)中で切片にし、200~250μm切片を作製した。その切片を、6ウェル細胞培養プレート中のMillicellオルガノタイプ用インサート(Millipore社製、カタログ番号PICM01250)上に移行した。タイムラプス撮影のため、切片を1~2日間培養した後、回転版共焦点顕微鏡(VisiScore)を使った撮像に実装した。切片を培養物から切り取り、膜の中に挿入し、次いでガラス底の培養皿の上に反転して配置した。切片の上に細胞培養用インサートを配置し、真空グリースを使ってそれを皿に接着させることにより固定化した。薬剤処置には、長期スライス培養をまず初めに分化培地(+5%FBS)中で一晩培養した。次いで培地を新鮮培地(対照)またはCXCR4阻害剤AMD3100(Sigma社製、#A5602)を含む培地と交換し、更に3週間培養した後、組織固定法と更なる免疫蛍光法に供した。
オルガノイド組織を所望の日齢にて収集し、PBS中で3回すすぎ、そして4%PFA中で4℃にて一晩固定した。翌日、組織をPBS中で3回すすぎ、PBS中30%ショ糖を使って4℃にて一晩凍結防止処置した。次いで組織を30%ショ糖/PBSとO.C.T.低温包埋培地(Sakura製、カタログ番号4583)の1:1混合物中で2~4時間インキュベートした。次いで、2~4個のオルガノイドの群をショ糖/OCT混合物からCryomold(登録商標)(サクラファインテック製)へと移し、そしてO.C.T.で満たした。包埋組織をドライアイス上で凍結させ、次いでクリオスタット切片化まで長期保管のため-80℃に維持した。凍結したオルガノイド組織をクリオスタット(Leica製)を使って20μm片にスライスし、Superfrost Ultra Plus(商標)スライド上に集めた。各スライドが組織1ブロックあたり8~10枚の切片を含むまで、10番目ごとのスライスを連続して収集した。それらの切片を一晩乾燥し、免疫蛍光標識に使用し、染色に使用するまで-20℃で保存した。
蛍光細胞培養イメージングは、Zeiss Axio Vert. A1広視野顕微鏡とAxiocam ERc 5sカメラ(Zeiss, Zeiss GmbH)を使用し、Zeiss プラン・ネオフルアール(Plan-Neofluar)2.5×/0.085とZeiss LD A-Plan 10×0.25 Ph1対物レンズを使用して実施した。tdTomato とGFPチャネルの両方を別々に記録し、ImageJのFijiパッケージを使って疑似カラー化しマージした。
脳オルガノイド融合体のGFP-標的領域に移動するGFP+細胞の数を、Fijiの「Cell Counter」プラグインを使って手動でカウントした。オルガノイド融合体中のGFP-領域を、ROIツールを使って輪郭を取り、その面積を「measure」機能を使って計算した。細胞計数をその面積により除算し、移動したGFP+細胞の密度を決定した。移動の経時変化(図2E、F)とオルガノイド融合体混成(図3B、C)実験について、組織低温切片の共焦点スキャン画像を定量に使用した。長期スライス培養実験(図6D、E)については、GFP-領域を含む広視野5倍画像を、細胞計数に使用した。
全てのグラフと統計分析は、Prism 7(GraphPad)を使って作成した。2つの群のみを比較する場合(図1C、6E)は、対応のない両側スチューデントt検定を実施し、多数の群を比較するその他のデータの場合には、post-hocテューキー検定を用いる一方向性ANOVAを使用した(図2F、3C)。統計的有意性を試験する前にサンプルを正規性検定した。サンプルサイズを予め決定する際には統計法は使用しなかった。実験に用いるサンプルサイズは、有意性を示した同様の設定による以前の経験に基づいて推定した。実験は無作為化せず、研究者は盲目試験されなかった。
脳オルガノイド法(国際公開第WO2014/090993号;Lancaster他;Lancaster & Knoblich、全て前掲)は、背側前脳と腹側前脳を含む多数の異なる脳領域を産生することができる。しかしながら、該方法は固有のパターン化に頼るため、一部の領域の産生は可変的で低頻度であり、特により腹側の(NKX2-1+)介在ニューロン前駆体領域はそうである。腹側前脳介在ニューロン前駆体領域の一貫性と収量を増加させるため、本発明者らは腹側薬剤処置(図1A)を含めた。更にWNT阻害とSHHシグナル伝達強化の組み合わせを用いて、吻側-腹側前脳アイデンティティを増強した。腹側オルガノイドのqPCR分析は、前脳マーカーFOXG1の発現の有意な増加を明らかに示した(図1B、1C)。背側前脳マーカーTBR1は検出できなくなる一方で、対照オルガノイドと比較して腹側オルガノイドにおいて腹側前脳マーカーDLX2が著しく増加した(図1B、C)。この脳オルガノイド組織の好結果の腹側化を更に確かめるために、本発明者らは、異なるサブタイプの介在ニューロンを産生する腹側前脳の神経節隆起(GE)サブ領域の特異的マーカーの発現を調べた。GSX2は背側-外側GE(LGE)と尾側GE(CGE)において発現され、NKX2-1は腹側-内側GE(MGE)において発現され、一方でLHX6は、更に腹側由来MGE(vMGE)介在ニューロンを産生するMGEのサブ領域において発現される(図1B)。GSX2は対照オルガノイド中で発現されたが、腹側オルガノイド中で更に増加した(図1C)。NKX2-1とLHX6の発現は、対照オルガノイドでは検出されなかったが、腹側オルガノイドでは大きく増加した(図1C)。最終的に、免疫染色は、対照と腹側オルガノイドではFOXG1の広範囲発現を示すが、腹側オルガノイドのみが腹側前脳マーカーNKX2-1を発現するという、qPCR結果を確証した(図1D)。興味深いのは、対照オルガノイドは前駆体(PAX6)と早生ニューロン(TBR1)の両方のための背側前脳マーカーを広範囲に発現したことである(図1E)。対照的に、腹側オルガノイドはPAX6+またはTBR1+組織のごく小さい領域のみを含んでいた(図1E)。従って、これらの結果は、腹側薬剤処置により、背側組織の外側で腹側脳オルガノイドが好結果に産生されたことを確証する。
単一組織で完全な背側-腹側アイデンティティを再現するために、オルガノイド「融合」と名付けたオルガノイド組織共培養法を開発した。対照オルガノイドは、主に背側前脳組織を産生した(図1C、E)。しかしながら、スムーズンド(Smoothened; Smo)受容体阻害剤シクロパミンA(CycA)によるSHH活性の阻害は、hPSCsからの2Dニューロン分化における背側前脳アイデンティティを高めることができる。従って、背側アイデンティティをサポートするために、脳オルガノイドプロトコルの神経誘導過程中にオルガノイドをCycAで処置した(図2A)。このアプローチでは、胚様体(EB)が個別に識別され、背側(CycA)または腹側(IWP2+ SAG)の前脳オルガノイド中にパターン形成される(図2A、B)。差次的処置の後、腹側と背側のEBが単一マトリゲル液滴内に一緒に包埋され(図2A)、時間が経つにつれてオルガノイドが一緒に増殖して融合する(図2B)。融合した腹側::背側オルガノイドの免疫染色により、片側が腹側マーカーNKX2-1に対して非常に陽性であり、反対側が背側マーカーTBR1に対して陽性である連続組織の産生が明らかになった(図2C)。従って、オルガノイド融合法により、脳の発生中に起こるのと同様の配置で背側と腹側の前脳領域を並置させることができる。
生体内での脳の発生中に、GABA作動性介在ニューロンは、背側前脳の標的に移動する前に腹側前脳前駆体領域から起こる。この方向性が融合オルガノイドで再現されるかどうかをテストするために、個々の組織構成成分のアイデンティティを変化させた(図3)。1つのオルガノイドをGFPで、もう1つをtdTomatoで一貫して標識し、origin :: target(GFP :: tdTomato)アレンジメントで融合の輪郭を描いた。このパラダイムを使用して、脳のオルガノイド融合の起点と標的領域の背側/腹側のアイデンティティを差別的に制御するときに移動する細胞の数を分析した。腹側::対照と腹側::背側融合体の全載イメージングは、tdTomato+組織内のGFP+スポットの発生を示した(図3A)。逆に、対照::対照または背側::背側融合ではスポットはほとんど観察されなかった(図3A)。この差は、オルガノイド融合組織の免疫染色された輪状切片を分析する際に更に顕著であった。移動細胞の最大量は腹側::対照および腹側::背側の融合で起こり、最少の移動は背側::背側の融合で起こった(図3B、C)。腹側::対照融合体の移動細胞の平均密度は腹側::背側融合体と有意な差は認められなかったが、腹側::背側融合体はより一貫して大量の移動細胞を含んでいた(図3C)。これらのデータは、腹側組織から背側のオルガノイド組織への方向に偏った最初の移動の観察を確証し、融合したオルガノイド間の移動がニューロン内の移動に似ていることを強く示唆している。最後に、この実験は、腹側::背側融合オルガノイドがオルガノイド組織間で最も堅牢な移動を生じることを示している。
実施例12では、腹側::背側オルガノイド融合体での移動が介在ニューロンの移動に類似していることが示唆されたため、まず、移動するGFP+細胞が、GABA合成の鍵酵素であるGAD1を発現しているかどうかを調べることにより、移動細胞がGABA作動性であるかどうかを試験した。免疫染色により、標的オルガノイドに移動したGFP+細胞がGAD1を広く発現していることが明らかになった(図4A~C)。驚くべきことに、オルガノイド全体を視覚化すると、GAD1がGFP+移動細胞と同様のパターンで発現された(図4A)。更に、GAD1の発現は、オルガノイドの辺縁に近い領域で強く現れ(図4B)、移動細胞の起点から遠く離れている。従って、介在ニューロンは、オルガノイド融合体内で腹側から背側領域へと移動することができる。
移動性GFP+細胞は成熟ニューロンになることができ(図4E)、主にGABA作動性介在ニューロンであるように見えるため(図4A、B)、次にどの介在ニューロンサブタイプが生産されるかを試験した。介在ニューロンは特に不均一であり、複数の分子マーカーを使用して、腹側前脳内の異なる前駆細胞亜集団によって生成される様々なサブタイプを識別することができる。ヒトでは、介在ニューロンの大部分はMGEのNKX2-1+領域から生成される。移動するGFP+細胞がMGE由来の介在ニューロンサブタイプを生成するかどうかをテストした。ヒトでは、SOX6は、MGEおよびこの領域から発生する未熟形および成熟形の介在ニューロンに発現される。オルガノイド融合体では、GFP+移動細胞GAD1+でもあるGFP+細胞の間に多数のSOX6+ MGE介在ニューロンが観察された(図5A)。従って、MGE由来介在ニューロンは脳オルガノイド融合体内で生成されうる。この発見を確認するために、MGE由来介在ニューロンのマーカーの発現も調べた。GFP+移動介在ニューロン(GAD1+またはVGAT+)により、ソマトスタチン(SOM)(図5B)、神経ペプチドY(NPY)(図5C)、カルビンジンD-28k(CB)(図5D)およびパルブアルブミン(PV)(図5E)の発現が観察された。従って、オルガノイド融合組織では、多数のMGE由来の介在ニューロンサブタイプを生成させることが可能である。
接線方向に移動する皮質介在ニューロンの移動動態は、タイムラプス撮影実験を使って広く立証されている。この挙動は、放射状グリア線維に沿って移動する皮質細胞の放射状移動のもの、または直線状に移動する細胞のもの、例えばLGE由来嗅球介在ニューロンに観察される鎖状移動とは異なる。オルガノイド融合体での移動性GFP+細胞の挙動が皮質介在ニューロンのものと類似しているかどうかを調べるために、本発明者らは腹側-背側オルガノイド融合体のスライス培養物における移動性GFP+細胞のタイムラプス記録を実施した(図6A)。オルガノイド融合体のGFP+腹側由来領域は、GFP- 背側ターゲット領域から容易に識別可能であった(図6A)。よって、背側オルガノイド融合体領域中に移動した、まばらに標識されたGFP+細胞の形態を容易に視覚化することができた。3日間に渡り、静止細胞と運動性細胞の両方が観察され(図6B)、驚くべきことに、長距離に拡張する軸索に似た動的ニューロン過程も観察できた。興味深いのは、移動性細胞が胚性マウス皮質の境界域(MZ)と中間域(IZ)における移動性介在ニューロンの動態と完全に類似している動態を示したことである。先導プロセスは通常は分岐状であり、移動方向は分岐動態により決定される。例えば、本発明において、将来の移動の方向に分枝を伸長する一方で別の方向に伸びる分枝を撤回する細胞の例が多数観察された(図6B)。加えて、細胞は頻繁な方向の急変を伴って多方向に移動し、これは皮質内の接線方向に移動する皮質介在ニューロンにより示される多方向性の遊走挙動に似ている。
腹側/GFP::背側オルガノイド融合体の背側領域内において移動性GFP+細胞が観察された。観察された細胞は一方向で移動している。先導するプロセスは分枝状であり、異なる分枝が動的に伸びていき、見たところ互いに独立に後退している。細胞体が前方に移動するにつれて末尾プロセスが続き、複数回すると先導プロセスが末尾プロセスになる。細胞が前方に移動するにつれ、1つの先導プロセスが拡張され、そして残りのプロセスは無くなる。次いで細胞が前方に進行するにつれて全体的な移動動態サイクルが繰り返される。
融合した脳オルガノイドを使用した細胞移動(遊走)アッセイを開発した。腹側-背側オルガノイド融合体は、腹側前脳由来の皮質抑制性介在ニューロンに似たロバスト(堅牢)な長距離細胞移動を示す。脳オルガノイド融合体において、腹側から背側前脳領域への相当多くの移動が観察された。オルガノイド融合体内の移動細胞は、GABA作動性マーカー(GAD1/VGAT)を発現する。移動したGFP+細胞は、様々な介在ニューロンのサブタイプを産生できる。更に、移動性GFP+細胞によるRELN発現の欠如により、腹側前脳由来介在ニューロンのアイデンティティが支持される。融合オルガノイドにおけるGFP+細胞の移動動態は、皮質内で接線方向に移動する介在ニューロンによって示される特徴的な移動挙動に類似している。最後に、オルガノイド融合体における細胞移動は、発生中のマウス皮質における接線方向に移動する介在ニューロンで観察されるように、CXCR4阻害剤によって阻害された。要約すると、本発明者らは、背側前脳領域の腹側からのヒト皮質介在ニューロンの移動を再現した。更に、これらの細胞が未熟と成熟の両方の神経細胞マーカーを提示するという観察結果は、それらが背側皮質前脳のターゲット領域にいったん到達すると成熟を開始する能力を示す。これは、以前の単独オルガノイド法で達成できたものよりも増強された細胞多様性のレパートリーを含む、発生中のヒト皮質回路を再現する魅力的な機会を表している。
Claims (19)
- 少なくとも2つの神経組織型を有する二分化または多分化神経組織のインビトロ産生方法であって、目的の分化段階に発生している第一の神経組織を提供し;前記第一の神経組織の目的の分化段階とは異なる目的の分化段階に発生している第二の神経組織を提供し;前記第一および第二の神経組織を増殖による融合に十分な近位に配置し;前記第一および第二の神経組織とを増殖させ、そして互いに融合できるようにし;それにより異なる分化段階を有する前記第一および第二の神経組織を含む二分化または多分化神経組織を産生することを含む、方法。
- 前記第一および/または前記第二の神経組織が、多能性幹細胞のインビトロ培養から誘導される、請求項1に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項2に記載の方法。
- 前記第二の神経組織を異なる目的の分化段階に発生させることから分離して、前記第一の神経組織を目的の分化段階に発生させることを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも前記第一および/または第二の神経組織が、神経前駆細胞およびニューロンを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一の神経組織の分化段階が、腹側前脳前駆組織または吻側-腹側前脳組織を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第二の神経組織の分化段階が、腹側または背側前脳へ分化しない背側前脳組織または神経外胚葉を含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記第一および第二の神経組織を増殖による融合に十分な近位に配置し、そして前記第一および第二の神経組織を増殖させ、そして互いに融合できるようにする段階が、浮遊培養において実施される、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二分化または多分化神経組織が神経板に発生するように分化される、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一および第二の神経組織を少なくとも100μmのサイズに増殖させる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第一および第二の神経組織を少なくとも150μmのサイズに増殖させる、請求項10に記載の方法。
- 前記第一および第二の神経組織を少なくとも200μmのサイズに増殖させる、請求項11に記載の方法。
- 前記第一および/または第二の神経組織が、前記第一および第二の神経組織の群以外のものによっては発現されない検出可能マーカーを発現する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 異なる分化段階の少なくとも2つの神経組織型を有する二分化または多分化神経組織であって、前記神経組織型の少なくとも1つが腹側神経組織を含み、そして少なくとも別の1つの組織型が実質的に非腹側であるが腹側神経組織からの移動細胞を含み、前記移動細胞が実質的に非腹側組織の細胞の5%以下を占め、前記二分化または多分化組織が100μm~10 mmの最長寸法を有する、前記二分化または多分化神経組織。
- 前記神経組織型の少なくとも1つが、前記二分化または多分化神経組織の別の組織型により発現されない検出可能マーカーを発現する、請求項14に記載の二分化または多分化神経組織。
- 前記検出可能マーカーが蛍光マーカーである、請求項15に記載の二分化または多分化神経組織。
- 球状体の形または組織切片の形である、請求項14、15または16に記載の二分化または多分化神経組織。
- 二分化または多分化神経組織の分化に影響を及ぼす候補化合物を試験またはスクリーニングする方法であって、請求項14~17のいずれか一項に記載の神経組織を候補化合物と接触させ、そして前記接触させた組織を培養に維持し、そして前記候補化合物と接触させていない前記組織と比較して、前記組織の任意の差次的変化を観察することを含む、方法。
- 請求項1~13のいずれか一項に記載の方法におけるキットの使用であって、前記キットが(i)WNT阻害剤および/またはSHHエンハンサーと(ii)SHH阻害剤を含む、キットの使用。
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HUP2200189A2 (hu) * | 2022-05-30 | 2023-12-28 | Biotalentum Tudasfejlesztoe Kft | Új, riportert stabilan expresszáló humán indukált pluripotens õssejt |
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Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013509859A (ja) | 2009-11-05 | 2013-03-21 | 独立行政法人理化学研究所 | 幹細胞の分化誘導方法 |
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US10087417B2 (en) * | 2015-04-22 | 2018-10-02 | William J. Freed | Three-dimensional model of human cortex |
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WO2015076388A1 (ja) | 2013-11-22 | 2015-05-28 | 国立研究開発法人理化学研究所 | 終脳又はその前駆組織の製造方法 |
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