KR20070031893A

KR20070031893A - 조직공학적으로 처리된 생체모방 모낭 이식체

Info

Publication number: KR20070031893A
Application number: KR1020067022378A
Authority: KR
Inventors: 토마스 에이치 바로우스; 스티븐 에이 코크란; 브라이언 마셀
Original assignee: 아데란스 리서치 인스티튜트 인코포레이티드
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2005-03-23
Publication date: 2007-03-20

Abstract

본 발명은 천연 모낭 구조를 모방하도록 구조화된 개선된 지지체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특정 조성물의 용도 및 생체 적합성을 목적하는 생흡수율과 결합시킨 지지체의 제조 방법에 관한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명은 생체 모방 모낭 이식체의 제조 방법 및 이식체를 세포로 씨딩하고, 새로운 모간의 성장이 요망되는 피부에 이식체를 이식하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가 양태는 세포를 배양하여 증식시키고, 당해 세포를 배양된 케라티노사이트 또는 기타 유사 세포와 배합된 다수의 생흡수성 지지체 내 할당하는, 모발 증식의 방법에 관한 것이다.

지지체, 생흡수성, 이식체, 케라티노사이트, 모낭, 필라멘트

Description

조직공학적으로 처리된 생체모방 모낭 이식체{Tissue engineered biomimetic hair follicle graft}

서문

남성형 탈모증은 모발 이식 수술에 의해 빈번히 치료되는 통상적인 질환이다. 당해 과정에서 비탈모형 두피부에서 모낭을 취해 탈모형인 부위에 재이식함으로써 모발이 풍성히 보이게 한다. 당해 과정에서 새로운 모발이 창조되는 것은 아니다. 성공 여부는 수확되고 탈모형인 부위에 재이식될 수 있는 모낭의 수에 의해 제한된다. 더욱이 모든 외식된 모낭이 항상 성공적으로 이식되는 것이 아니기 때문에 가장 이용가능하지만 중요한 단점을 가진다.

모낭 내 하위 구조에서 발견되는 특정 유형의 세포가 완전하고 정상적으로 기능하는 모낭 형성을 유도하는 능력을 가진 것으로 공지되어 있다. 당해 세포는 모낭 줄기 세포 및 모낭 전구 세포로서 공지되어 있다. 효과적인 모발 회복 치료에 대한 큰 시장의 관점에서, 모발 증식의 목적으로 당해 세포의 모낭 유도 능력을 개발하고자 하는 많은 시도가 있었다. 외관상으로 유의하게 그럴 듯하지만, 선행 기술의 모든 계획은 임상적으로 미용적으로 허용되는 새로운 탈모증 치료를 제공하는 데 미흡한 것으로 나타났다. 예를 들어, 랫트 수염으로부터 배양된 모유두 진피세포(dermal papilla cell)를 랫트 귀의 피부에 이식하여 이식 부위에서 수염이 성장하였다. 참조[미국 특허 제4,919,664호, R. F. Oliver 및 C.A.B. Jahoda, "Stimulation of hair growth", April 24,1990]. 안드류 메신저 박사(Dr. Andrew Messenger)의 5명의 지원자를 대상으로 한 비공개된 임상 연구에서 지원자의 두피 생검으로부터 절개된 모낭 모유두 진피세포를 배양하였다. 증식되고, 배양 플라스크의 표면을 메운 당해 세포를 플라스크 표면에서 긁어내어 제거하고, 세포를 제공한 각 대상체의 팔 아래의 피부 내 얕은 절개 부위 내로 이식하였다. 세포 이식 부위에서 어떠한 새로운 모발 성장도 관찰되지 않았다. 6개월 후 모든 부위를 생검하였고, 당해 조직학적 검사에서는 두피 모낭 형성 증거가 전혀 없는 정상이었다.

더욱 최근에, 바로우(T. H. Barrows)는 참조에 의해 본원에 혼입되는 문헌[참조: 국제 공보 제WO 02/15952호, Scaffolds for Tissue Engineered Hair", 2002년 2월 28일]에서 생흡수성 물질로 만들어진 다공성 "지지체(scaffold)"로 동일한 유형의 배양된 세포의 이식 방법을 기술하고 있다. 이 경우 후속하는 임상 연구에서는 배양된 세포의 이식으로 사람 대상체의 피부에 새로운 모낭 및 모발 성장의 최초의 기록화된 예를 제시하였다[참조: T. H. Barrows, S. A. Cochran, E. I. Griffin, and A. R. Solomon, "Tissue Engineered Human Hair: Preliminary Clinical Results", TE2002: International Workshop on Tissue Engineering, St. Gallen, Switzerland, 24-27 February, 2002, 당해 문헌은 참조에 의해 본원에 혼입된다]. 고체의 지지체 구조물 없이 주입된 세포는 모낭 생성의 어떠한 증거를 발견하지 못하였다. 그러나, 지지체와 결합하여 이식된 16개의 이식 중 오직 한 경우에서만 실제로 미용적으로 유용한 모간(hair shaft) 성장을 나타내었다. 비록 수많은 세포와 지지체를 결합한 이식 부위에서 모낭 생성의 분명하지 않은 증거가 조직학적으로 나타났지만, 부분적으로 변성된 지지체 파편의 잔사에 대해 지속적인 염증 반응이 또한 존재하였다. 이물질 반응의 당해 유형은 모낭 형성에 해로운 환경을 조성하는 것으로 생각된다[참조: K. S. Stenn, "Compositions and methods for inducing new hair follicle formation and hair growth in a desired orientation", 미국 특허 출원 제10/123,984호, 2002년 4월 17일, 당해 문헌은 참조에 의해 본원에 혼입된다].

따라서 새로운 미용적으로 실용적인 모낭을 생성시킬 수 있을 정도로 모낭 전구 세포를 배양하고, 배양된 세포를 피부 내 이식하는 신뢰성 있고 재현가능한 방법이 여전히 요구되고 있다.

본 발명의 요약

간략히, 본 발명의 한 양태에서, 본 발명은 천연 모낭의 구조를 모방하도록 구조화되고, 경피적 이식용으로 고안된 개선된 지지체에 관한 것이다. 이식 부는 특정 유형의 세포를 씨딩하기 위한 지지체 구조물로서 제공되고, 표피에 접촉하거나 당해 표피를 통해 돌출된 기타 부는 표피 아래로 성장을 위한 부위로서 제공된다. 당해 표피 아래 성장은 이식된 세포와 소통하는 누두부를 생성하는 데 유리하며, 이는 다음으로 새롭게 형성되는 모간의 배출각을 조절하는 데 유용하다.

다른 측면에서, 본 발명의 특정 조성물의 용도 및 목적하는 생흡수율과 생적 합성을 결합시킨 지지체의 제조 방법에 관한 것이다. 당해 유형의 지지체의 실행 특성은 모낭 생성 과정을 용이하게 하거나 향상시키기 때문에 성공적 모낭 유도 이식의 구축에 유의하게 중요하다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 신뢰할만하고 재현가능한 모낭 생성의 개시를 제공하는 배양된 세포의 특정 배합물에 관한 것이다. 배양된 모유두 진피세포(또한 모유두 세포로 공지된) 자체만의 이식 결과는 예측가능하거나 재현가능하지도 않다. 케라티노사이트, 적합하게는 신생아 피부(예: 유아 포피 조직)에서 수득된 케라티노사이트는 또한 모유두 진피세포와 함께 이식되어야 함이 밝혀졌다. 기타 유형의 세포 또한 모낭 형성의 성공율을 향상시키기 위해 모유두 진피 세포/케라티노사이트 배합물과 임의 배합될 수 있다. 임의의 추가 세포는 사람의 태아, 태아 또는 유아의 두피 피부, 유아의 포피, 탯줄 혈, 성인의 골수, 근육, 지방 조직 및 피부에 존재하는 것으로 공지된 많은 줄기 세포 군집에서 선택될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 모낭 생성 과정에 유리한 영향을 주거나 이의 형성을 향상시키는 물질로 콘드로이틴-6-설페이트의 놀라운 발견에 대한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 생체 모방의 모낭 이식체의 제조 방법 및 이를 세포로 씨딩하는 방법 및 이를 새로운 모발의 성장이 요망되는 피부에 이식하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 양태는 수확된 모낭에서의 세포를 배양하여 증식시키고, 당해 세포를 배양된 케라티노사이트 또는 기타 동종 세포와 배합하여 다수의 생분해성 지지체 내 할당시키는 모발 증식의 방법에 관한 것이다. 생성된 세포-씨딩된 생체 모방 이식체의 이식은 선행기술의 가능한 방법보다 더욱 높은 정도의 모발 회복력을 제공한다. 따라서, 본 발명의 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 특히 남성 또는 여성형 탈모 및 기타 모발 손실 상태를 포함한, 모발의 손실을 감소, 억제 또는 치료하는 방법을 제공한다.

도 1은 생흡수성 중합체의 고체 외부 필라멘트(1), 동일하거나 상이한 생흡수성 중합체의 다공성 내부 필라멘트(2), 및 중앙 루멘(3)을 나타내는 본 발명의 공동의 필라멘트의 횡단면도이다.

도 2는 세포의 현탁액을 필라멘트의 루멘 내 삽입함으로써 다공성 내부 필라멘트 내 씨딩된 세포(4)(예: 케라티노사이트) 및 필라멘트의 개구 말단부에 기계적으로 주입함으로써 필라멘트의 루멘 내 씨딩된 세포 종괴(5)(예: 배양된 모두유 진피세포 또는 모낭 조각)를 나타내고 있는, 도 1의 공동의 필라멘트의 횡단면도이다.

도 3은 근단(6)은 진피 내, 원단(8)은 아래로 성장한 표피(9)에 의해 둘러싸이도록 피부 내 이식한 얼마 후 도 2의 필라멘트의 횡단면도이다.

도 4는 d,l-락티드 및 글리콜리드(PLGA)의 다공성 공중합체로 제조된 본 발명의 공동의 필라멘트의 스캔 전자 현미경(SEM) 사진이다.

도 5는 튜브의 개구부를 절단함으로써 노출된 도 4의 공동의 필라멘트의 다공성 내부 표면의 스캔 전자 현미경 사진이다.

도 6은 도 1에 도시된 구조를 가진 필라멘트(10)를 나타내는 광현미경 사진으로, 여기서 외부 필라멘트(1)는 고체 PLGA로 제조되고, 다공성 내부 필라멘트(2)는 가교결합된 히알루론산(HAX)으로 제조된다. 도 6은 또한 HAX를 함유하지 않는 PLGA로 제조된 필라멘트(11)을 나타낸다. 2개의 필라멘트를 식품 착색 염료를 사용해 적색으로 염색된 1적의 물(12) 위에 위치시켰다. PLGA 섬유(11)만이 물 상단에 부유했으며, 물이 섬유의 루멘 내로 전혀 침입하지 못한 반면, HAX-함유 PLGA 섬유(10)는 물이 루멘 내로 신속히 침입하여 적색의 섬유가 되었다.

도 7A는 마우스 촉모(수염) 모낭(13) 및 절개된 모낭을 수용하기에 충분한 크기의 내부 직경을 가진 PLGA 공동의 필라멘트(14)의 사진이다.

도 7B는 루멘 내 주입된 모낭(13)을 가진 도 7A의 PLGA 공동의 필라멘트의 사진이다.

도 8은 PLGA 공동의 필라멘트에 함유된 촉모 모낭의 이식 30일 후에 재성장된 면도된 털모(16)를 배경으로 마우스의 등에서 성장하는 것으로 관찰된 마우스 수염(15)의 사진이다.

도 9는 PLGA 공동의 필라멘트(19) 내 함유된 신생 마우스 피부에서 수득된 세포 혼합물을 이식 30일 후에 마우스의 피부 아래 성장하는 모낭 벌브(17) 및 모간(18)의 광현미경 사진이다.

도 10은 신생 흑색 마우스 표피 및 진피에서 수득된 세포로 13일 전 미리 주입된 누드 마우스에서 절개된 피부 근저를 동일한 확대율로 얻어진 2개의 광현미경 사진의 나열 비교도이다. 패널 A는 대조 주입부를 나타내며, 패널 B는 주입 용액 이 5%(w/v)의 콘드로이틴-6-설페이트를 함유하고 이로 인해 대조군보다 더 크고 더 많은 수의 모낭이 생성됨을 제외하고, 정확하게 동일한 수의 세포를 함유하는 주입 부를 나타낸다.

도 11은 또한 신생 흑색 마우스 표피 및 진피에서 수득된 세포로 13일 미리 주입된 누드 마우스에서 절개된 피부 근저를 동일한 확대율로 얻어진 2개의 광현미경 사진의 병렬 비교이다. 패널 A는 도 10의 동일한 대조 주입부를 나타내고, 패널 C는 주입 용액이 또한 20%의 플루로닉(Pluronic^TM F-127) 계면활성제(에틸렌과 프로필렌 옥사이드의 공중합체)을 함유하고 이로 인해 대조군보다 더 큰 모낭이 생성된다는 점을 제외하고는 정확하게 동일한 수의 동일한 세포를 함유하는 동일한 마우스의 주입 부위를 나타낸다.

도 12는 본 발명의 공동의 필라멘트의 횡단면도로, 여기서 루멘(20)은 다공성 플러그(22)에 부착된 밀봉된 말단(21) 방향으로 약간 가늘어진다.

도 13은 끝이 가늘어지는 루멘(20) 내 주입된 세포(24) 및 액체(25)를 함유하는 미세한 피펫 말단(23)을 나타내는 본 발명의 공동의 필라멘트의 횡단면도이다.

도 14는 피펫 말단(23)에서 배출됨으로써 배출된 세포가 루멘(21)의 밀봉된 말단 내로 수집되고 배출된 용액(25)은 다공성 플러그(22) 내 전부 흡수되는 용액(25) 및 세포(24)의 현탁액을 나타내는 본 발명의 공동의 필라멘트의 횡단면도이다.

도 15는 실시예 10의 공동의 필라멘트 지지체 및 본 발명의 당해 양태를 실 시하는 과정에서 만드렐로서 사용된 것과 동일한 10㎕의 피펫 말단(26)의 사진이다. 외장(sheath)(27)은 PLGA로 제조되고, 벌브한 말단(29) 내 함유된 섬유성 물질(28)은 가교결합된 젤라틴/콘드로이틴-6-설페이트 필라멘트로 제조된다. 지지체 외장 내 주입된 피펫 말단을 통해 지지체 내로 챠콜 입자 및 물의 슬러리를 주입시, 챠콜 입자(charcoal particle)(30)가 섬유성 지지체의 근부 내 수집된다

정의

본원에 사용된 하기 나열된 용어는 다음과 같은 의미를 가진다:

"조직 공학"은 신체의 조직과 기관을 대체, 회복, 또는 증강시키는 데 사용하는 세포, 생적합성 지지체, 일반적으로 생흡수성 지지체의 배합물을 제조하는 기술 분야로 정의된다.

"모낭 형성"은 이전에 존재하는 모낭과 이에 추가로 이전에 존재하지 않은 피부 부위에 새로운 모낭이 형성되는 현상으로 정의된다.

"생흡수성"은 신체 내에서 비독성 부산물로 분해되어 신체로부터 배출되거나 대사되는 물질의 특성으로 정의된다.

"지지체(scaffold)"는 살아있는 세포를 함유할 수 있고, 당해 세포를 특화된 배열 내 유지시킬 수 있는 세포독성이 없는 구조를 의미한다.

"필라멘트"는 길이가 직경보다 큰 원통형 구조물을 의미한다.

"섬유"는 물리적 무결한 필라멘트를 나타낸다.

"PLGA"는 락티드와 글리콜리드의 공중합체로 정의된다.

"VEGF"는 혈관의 내피 성장 인자를 의미한다.

"EDC"는 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드를 의미한다.

"TFE"는 2,2,2-트리플루오로에탄올로 정의된다.

"HAX"는 가교결합된 히알루론산을 의미한다.

"만드렐(mandrel)"은 물질의 외부 표면에 적용되어 물질의 형태를 유지하는 데 사용되는 원통형, 끝이 가늘어지거나 원추형인 부재로 정의되며, 당해 부재는 언급된 적용 물질로부터 공동의 필라멘트를 제조하는 과정에서 제거된다.

본 발명의 한 양태에서, 생체 모방 모낭 이식체의 지지체 성분은 내부 루멘이 일반적으로 지지체의 한 말단에서 반대편 말단으로 확장하는 하나 이상의 생흡수성 중합체로 이루어진 공동의 필라멘트이다. 공동의 필라멘트의 내부 벽 또는 외부 벽은 목적하는 용도에 따라 매끄럽거나 다공성일 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 매끄러운 표면을 가진 공동의 필라멘트는 루멘 표면에 한 유형의 세포(예: 사람 포피 케라티노사이트)를 보류시키고, 루멘 내 위치하고 주위의 표면 부착 세포와 접촉하는 다른 유형의 세포(예: 적합하게 세포의 집합된 종괴 형태로, 배양된 성인 모낭 모유두 세포)를 보류시키기 위해 사용된다. 고 다공성, 친수성 내부를 가진 공동의 필라멘트는 자체로는 상대적으로 소수성이여서 수성 용액을 침투시킬 수 없는 하나 이상의 유형의 세포의 현탁액을 필라멘트 내부로 침투시키기 위해 사용된다.

다공성, 친수성 내부는 공동의 필라멘트 외부보다 더욱 빠른 생흡수율 또는 액화율을 나타낼 수 있어, 더욱 서서히 생흡수 필라멘트 벽에 지속적으로 함유되면서, 필라멘트 루멘 내 씨딩된 세포의 재조직화를 촉진시킨다. 다른 경우, 지지체 중합체는 루멘 내부 내지 지지체 외부에서 다양하거나 구배의 생흡수율을 가질 수 있다. 따라서, 내부(즉, 루멘)의 중합체 생흡수성 또는 생흡수율은 외부 또는 외부적으로 위치한 중합체 생흡수율보다 더 높다.

공동의 필라멘트의 제조 및 공동의 필라멘트의 내부를 충전하기 위한 물질로서의 용도 모두에 적합한 생흡수성, 생적합성 물질이 임상 실무 및 생의학 연구에 통상적으로 사용되는 다양한 범위의 생적합성, 합성, 천연 및 반합성 물질로부터 선택될 수 있다. 공동의 필라멘트는 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(디메틸트리메틸렌 카보네이트), 폴리(아미노산), 티로신-유도 폴리(카보네이트), 폴리(카보네이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(파라-디옥사논), 폴리(에스테르), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(무수물), 폴리(오르토 에스테르), 콜라겐, 젤라틴, 혈청 알부민, 단백질, 다당류, 뮤코다당류, 탄수화물, 글리코사미노글리칸, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(아크릴레이트 에스테르), 폴리(메타크릴레이트 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 및 공중합체, 블렌드 및 당해 중합체의 혼합물 외, 가수분해 또는 당해 생흡수성 결합의 분해로 방출시 대사되거나 방출될 수 있는 비분해성 중합체와 블럭 공중합된 생흡수성 결합을 함유하는 올리고머를 포함하는 중합체로 이루어질 수 있다. 표면 개질, 이식체 중합화, 공중합화, 또는 본 발명의 생흡수성 물질의 성장 인자, 세포 부착 결합 부위 잔기 및 세포 시그날링 분자와의 블렌딩은 세포 부착 및/또는 세포 기능, 집합, 또는 모낭 형성 과정의 개시를 촉진시키는 이점이 있을 수 있다.

공동의 필라멘트로서 또는 공동의 필라멘트의 충전 물질로 사용되기 적합한 천연적으로 발생하는 중합체(생체중합체, 생체물질)는 콜라겐, 젤라틴, 세룰로스 유도체, 전분, 덱스트린, 키토산, 리포단백질, 콜라겐과 젤라틴의 재조합 사람 형태, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 알부민, 기타 혈청 단백질, 다당류, 뮤코다당류, 및 신체 내 자연적으로 발생하는 기타 생체 중합체를 포함한다. 적합한 생중합체는 천연 형태 또는 예를 들어 용해도를 감소시키기 위해 독성이 허용되는 가교결합제와 가교결합시킴으로써 개질된 형태로 사용될 수 있다. 충전 물질은 섬유, 겔, 및 다공성 구조를 포함한 다양한 물리적 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어 세포는 피브린노겐 용액과 배합되어, 트롬빈에 노출시 생흡수성 겔로 전환될 수 있다.

다른 접근은 에틸렌 옥사이드 및 플루로닉 F-127(제조원: BASF Corp., 뉴저지주 마운트 올리브)로 공지된 프로필렌 옥사이드의 공중합체의 용도를 포함한다. 당해 계면활성제는 냉각 온도에서 신체 온도로 가온시 살아있는 세포와 혼화성이고, 임계 농도 이상에서 겔을 형성한다. 따라서, 공동의 필라멘트는 예를 들어 일차로 알코올 중 플루로닉 F-127 용액으로 처리되고, 다음으로 알코올을 증발시켜 이의 루멘 표면에 친수성 코팅을 부여한다. 세포의 현탁액을 함유하는 플루로닉 F-127의 냉 용액을 다음으로 필라멘트의 루멘 내로 침투 또는 주입시키고, 가온된 환경에 위치시켜, 플루로닉 F-127을 겔화하여 세포가 필라멘트에서 제거되는 것을 방지한다. 기타 생적합성 겔 형성 물질은 콜라겐, 젤라틴, 혈청 알부민, 마트리겔(Matrigel^TM) 기저막 매트릭스(BD Biosciences, San Jose, CA) 및 공유적으로 반응하여 겔 망상 구조를 형성하는 말단기를 가진 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함한다.

본 발명의 구조에 대한 기타 용도가 계획되었다. 예를 들어, 기타 성분을 첨가 또는 비첨가하여, 많은 공동의 필라멘트를 단지 묶음으로써, 이를 통해 지속적으로 공동을 형성하는 완제품으로 3차원의 물질을 수득할 수 있다. 당해 구조는 조직 공학 연골 분야에서 유용하다. 연골이 무혈성이고, 연골 조직 공학에 사용된 지지체가 적합하게 영양분에 용이하게 접근할 수 있는 내부 구조를 가지고 있기 때문이다. 더욱이, 당해 지지체의 씨딩은 장치를 통해 직접 진행되는 공동에 의해 용이하다. 더욱이, 바이오메카니즘적인 로딩의 축에 따라 공동을 개시함으로써, 씨딩된 콘드로사이트는 적절히 반응하도록 자극되고, 천연 관절 연골의 원주 구조 내로 조직화될 것이다.

히알루론산은 조직 공학 적용 분야에 유용하고 조직 공학 연골을 위한 상기 지지체에 적합한 생체 물질로 공지되어 있다. 적합한 물질은 참조에 의해 본원에 혼입되는 문헌[참조: K. Tomihata and Y. Ikada, "Crosslinking of hyaluronic acid with water-soluble carbodiimide", J.Biomed. Mater. Res., 37, 243-251 (1997)]에 기술된 바와 같이 히알루론산을 축합제, 적합하게 EDC와 자가 가교결합시켜 수득된다. 또는, 히알루론산은 참조에 의해 본원에 혼입되는 문헌[참조: "Modification of Natural Polymers: Hyaluronic Acid" by Y. Luo, K. R. Kirker, and G. D. Prestwich, Chapter 45 in Methods of Tissue Engineering A. Atala and R. P. Lanza, eds., Academic Press, 2002, pp. 539-553]에 기술된 방법을 포함하여 다양한 기타 접근법으로 가교결합될 수 있다.

또는, 히알루론산을 참조에 의해 본원에 혼입되는, 문헌[참조: 미국 특허 제4,851,521호, "Esters of Hyaluronic Acid", by Francesco della Valle and Aurelio Romeo (1989년 7월 25일)]에 기재된 바와 같은 에스테르화에 의해 본 발명의 용도를 위한 불용성 물질로 전환시킬 수 있다. 당해 유형의 적합한 물질은 히알루론산의 벤질 에스테르이다. 생체 내에서 수일 내 에스테르 결합을 가수분해시 생성물이 가용성 히알루론산으로 재전환되기 때문에, 트랜스-에스테르화가 적합한 가교결합 방법으로, 기타 가교결합제 및 첨가된 가교결합 형성 분자가 또한 사용될 수 있다. 아민 말단의 가교결합 분자, 예를 들어, 지방족 디아민, 디아미노산 에스테르(예: 리신의 알킬 에스테르) 및 아민-말단의 폴리(에틸렌 글리콜)이 적합하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

히알루론산을 가교결합시키는 많은 화학적 방법이 생성 지지체의 효능을 향상시키기 위해 히알루론산 구조에 생체 활성 분자의 공유적 부착을 용이하게 하는 데 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 Arg-Gly-Asp(RGD)의 세포 부착 도메인 서열을 포함하는 펩티드가 가교결합된 히알루론산 지지체에 세포가 부착되는 것을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.

조직 공학적으로 처리된 모낭을 위한 지지체 제조에 있어 히알루론산의 사용은, 지지체가 분해되는 동안 혈관이 새롭게 형성되는 모낭의 성장을 돕거나 기타 유리한 목적을 위해 방출되는 방식으로 성장 인자 및 혈관신생 인자를 지지체에 부착하는 것이 바람직할 수 있다. 소분자가 지지체에 공유적 부착하는 것 이외, 단백질, 글리코단백질과 같은 고분자량 분자, 및 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴 등과 같은 기타 생중합체가 물리적으로 또는 정전기적으로 구조에 결합하여, 더 개선된 물리적 순도, 세포 부착력, 또는 생체 활성을 제공할 수 있다. 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 더마탄 설페이트, 버시칸 등을 포함한 기타 글리사미노글리칸이 또한 히알루론산을 대신하여 본 발명에서 유리하게 사용될 수 있다.

조직공학적으로 처리된 모낭의 지지체 제조에 적합한 물질은 콘드로이틴-6-설페이트이다. 모낭 생성 과정에서 콘드로이틴-6-설페이트의 놀랍게도 유리한 작용이 도 6에 도시되어 있다. 적합한 조성물은 콘드로이틴-6-설페이트 및 EDC와 가교결합된 젤라틴의 혼합물로, 실시예 9에 나타낸 바와 같이 포로겐(porogen)으로서 세바스산(sebacic acid) 입자를 사용하여 미세 다공성을 부여하거나, 실시예 10에 나타낸 바와 같이 섬유 물질로 전화시켜 미세 다공성을 부여한다.

모낭 형성은 표피 세포(즉, 케라티노사이트)와 진피 세포(즉, 진피 섬유아세포 또는 진피/모유두 세포)의 상호 작용을 필요로 한다. 화상 환자의 치료에 사용되는 조직공학적으로 처리된 살아있는 세포 등가물의 제조시 사용되는 진피 및 표피 세포는, 이용이 용이하기 때문에 빈번히 사람 유아 포피 조직에서 현재 수득되고 있다. 당해 피부 등가물은 임상적으로 가치는 크지만 모낭이 결여되어 있다. 따라서, 일반적인 케라티노사이트 또는 당해 유래로부터의 케라티노사이트는 새로운 모낭 형성을 유도하는 것이 필요한 조직 공학 이식체의 제조에 있어, 일반적으로 어떤 특별한 가치를 갖는 것으로 생각되지 않았다. 참조에 의해 본원에 혼입되는 문헌[참조: Cooley and Vogel(WO 99/01034)]에서 "바람직하게 표피 세포는 치료 대상인 동일한 환자로부터 유래한다.."가 기재되어 있다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러, 성인 두피에서 유래한 케라티노사이트가 특히 신뢰할만 한 것은 아니며, 유아 포피에서 유래한 케라티노사이트가 실제로는 모유두 진피 세포와 배합하여 모낭 형성을 유도하는 능력에 있어 더욱 효과적임을 밝혀내었다. 당해 발견의 원인은 공지되어 있지 않으나(임의의 특별한 이론과 결합하는 것을 바라지 않는다), 본 발명의 발명자는 표피 줄기 세포, 표피 케라티노사이트의 매우 작은 소집단이 모낭 형성을 개시하는 데 필요하고, 소아 표피는 당해 유래 세포가 성인 표피에서보다 더 풍부하다. 따라서, 유아에서 유래한 기타 유래의 줄기 세포가 유용할 수 있다. 예를 들어, 탯줄로부터 수득된 혈액이 유용한 줄기 세포 유래일 수 있고, 또한 배아 또는 확립된 배아 줄기 세포주에서 수득된 세포, 또는 확립된 기관 제공 과정 하에서 유아 포피 피부로부터 수득된 세포가 유용한 줄기 세포 유래일 수 있다.

본 발명의 표피/진피 세포의 구축의 진피 성분은 모발 회복 치료를 받은 대상체로부터 수득된 절개된 모낭으로부터 수득될 수 있다. 그러나, 기타 가능성은 기관 제공자, 적합하게 유아의 두피에서 세포를 수득하는 것이다. 지지체 내부에 씨딩되는 세포는 진피 모유두, 진피 외장, 매트릭스, 및 내부 및 외부 루트 외장을 포함하는 단편으로부터 선택된 모낭 단편의 배양물로부터 수득될 수 있다. 또는, 세포는 손상되지 않은 두피 피부로부터 제조된 세포의 혼합물, 또는 당해 세포의 수용체가 제공자인 일반적인 모발 회복 수술로부터 제공자의 조직의 모낭 단위 절개 후 남아있는 진피 및 모낭 조직의 두피로부터 단지 배양될 수 있다.

이들의 유래와는 상관없이, 표피 세포는 루멘 내부 벽에 부착하거나 근접하여 공동의 필라멘트의 루멘 내 적합하게 포함되거나, 이의 다공성 구조 내 포함된다. 모발 함유한 두피의 생검으로 수득되고 배양으로 증식된, 생체 모방 이식체를 제공받는 사람 유래의 모낭 전구 세포는, 필라멘트 루멘의 근부 내 주로 함유되며, 이는 벌브한 모낭에 해당한다. 따라서, 이식체는 진피 및 표피 성분 모두가 서로 정확한 관계로 존재하도록 자가 함유되며, 이는 이식된 세포가 손상되지 않은 표피 또는 이식된 이식체 아래로 성장하는 표피 세포와 상호 작용하는 요구를 미연에 방지한다. 차례로, 이는 새로운 모낭 형성의 신뢰성과 재현가능성을 제공한다.

또는, 진피 및 표피 세포는 임의로 줄기 세포를 추가하여 혼합물로 배합될 수 있고, 이식 직전 지지체 내 씨딩될 수 있다. 당해 경우, 세포는 동일 반응계에서 조합되고 재조직화될 수 있다. 세포 전달의 당해 방법에서 적합한 지지체 배열이 도 12 내지 14에 제시되었다. 당해 양태에서, 지지체는 한 밀봉된 말단을 가진 공동의 필라멘트로서 제조되어, 액체를 흡수하는 저장소로 제공되는 다공성 스폰지 유사 구조를 형성한다. 따라서, 세포 및 용액의 현탁액을 공동의 필라멘트 루멘 내로 주입시, 당해 용액을 필라멘트의 밀봉된 말단에서 집중 부위로 세포의 수집을 야기하는 저장소 말단 내로 투입한다. 세포를 함유하는 지지체는 다음으로 모낭 이식체가 통상의 모발 회복 수술 과정에서 이식되는 것과 동일한 방법으로 피부 내 자상 부위 내 즉시 이식된다. 당해 양태의 지지체 제조 방법은 실시예 9에 나타내었고, 이는 다음 단계를 포함한다:

1. 피펫 팁 조각 또는 기타 적합한 용액 전달 수단으로 동일한 치수를 가진, 끝이 가늘어지는 만드렐을 제공하는 단계,

2. 만드렐보다 더 길어 초과된 길이가 만드렐 자체의 용적에 대략 상당하는 빈 용적을 생성함으로써, 공동체(cavity)에 주입으로 단계 1의 만드렐을 수용하는 양 말단이 개방된 성형 공동체를 제공하는 단계,

3. 용매(B)에 용해되는 생흡수성 물질(A) 및 용매(D)에는 가용성이나, 용매(B)에는 불용성인 포로겐 입자(C)의 혼합물을 제공하는 단계,

4. 단계 2에서 제조된 공동체을 단계 3에서 제조된 혼합물을 충전시키고, 단계 1의 만드렐을 주입하는 단계,

5. 용매(B)를 제거하고 성형 공동체로부터 성형된 부위를 추출하는 단계,

6. 단계 5에서 제조된 성형된 부위를 용매(D) 내 위치시켜 파로겐 입자를 제거하는 단계,

7. 단계 6에서 제조된 성형된 부위를 용매(F)에 용해된 가교결합제(E)의 용액에 위치시키는 단계,

8. 신선한 용매(F) 또는 기타 적합한 용매로 세척하고 생성 지지체를 건조시키는 단계,

9. 단계 8의 지지체를 수용성 성분(G)의 수성 용액으로 임의로 재수화시키고, 물을 증발시켜 보호 코팅을 생성시키는 단계,

10. 용매(I) 중 생흡수성 물질(H)의 용액을 제조하는 단계,

11. 단계 9의 지지체를 단계 10의 용액으로 코팅하고 용매(I)를 증발시키는 단계,

12. 지지체를 물에 침액, 신선한 물로 세척 및 물을 증발시킴으로써 물질(G)의 보호 코팅을 제거하는 단계.

상기 단계에 포함되는 적합한 공정에서, A는 콘드로이틴-6-설페이트 및 젤라틴의 혼합물이고, B는 물이고, C는 63μ미만의 세바스산 입자이고, D는 아세톤, E는 EDC이며, F는 아세톤:물의 9:1 용적비의 혼합물이다.

실시예 10에 나타낸 양태를 야기하는 상기 과정의 변형은 다음 단계를 포함한다:

1. 만드렐의 말단이 약간 연장되어 날카로운 끝을 제공하는 것을 제외하면, 피펫 팁 조각 또는 기타 적합한 용액 전달 수단으로 동일한 치수를 가진, 끝이 가늘어지는 만드렐을 제공하는 단계,

2. 단계 1의 만드렐을 수용성 중합체(A)로 코팅하는 단계,

3. 단계 1의 만드렐 말단에 용액 내 세포의 현탁액으로부터 세포의 분리에 적합한 투과성, 생흡수성 여과 성분(B)를 부착시키는 단계(당해 여과 성분은 용매(D)에 가용성인 제거가능한 보호 코팅(C) 내 실질적으로 싸여있다),

4. 만드렐 및 상기 여과 성분(B) 전체를 용매(F)에 용해된 필름-형성 생흡수성 중합체(E)로 코팅하는 단계,

5. 단계 4의 용매(F)를 제거하여, 만드렐과 부착된 단계 3의 말단을 덮는 생흡수성 중합체 필림의 연속 층을 형성하는 단계,

6. 만드렐에 이의 부착 지점 말단의 여과 물질을 덮는 당해 필름의 작은 조각을 제거함으로써 단계 5의 필름을 개방시키는 단계,

7. 단계 6의 생성물을 물에 침액시켜 중합체(A)를 실질적으로 제거하는 단계,

8. 용매(D)에 침액시킴으로써 보호 코팅 물질(C)을 실질적으로 제거하는 단계,

9. 만드렐을 생성물로부터 제거하고 물질(A) 및 물질(C)를 완전히 제거하기 위해 필요한 만큼 단계 7 및 8을 계속하는 단계.

상기 공정의 적합한 양태에서, A는 계면활성제, 예를 들어 플루로닉 F-127이고, B는 콘드로이틴-6-설페이트 및 가교결합된 젤라틴으로 이루어진 섬유 물질이고, C는 캐러멜화된 사탕수수이고, D는 물, E는 PLGA, 및 F는 디클로로메탄이다.

본 발명의 양 말단이 개방된 긴 공동의 필라멘트 지지체를 제조하는 적합한 방법은, 후속으로 다양한 성분이 침전시 용해로 제거되는, 만드렐로서 나일론 모노필라멘트의 사용이 포함한다.

생체 물질에 손상 없이 제거될 수 있는 기타 물질로부터 제조된 섬유는 또한 당해 공정에서 유용한 것으로 계획되었다. 또는, 공동의 필라멘트 용융 압출은 본 발명의 공동의 필라멘트를 제조하는 데 사용될 수 있는 입증된 기술이다.

본 발명의 공정에서, 미세한 나일론 섬유는 우선 섬유에 부착할 점성 용액의 형태로 생흡수성 물질의 적용을 보장하는 입자로 코팅된다. 당해 입자는 나일론 용액을 사용하는 나일론 섬유 또는 폴리스티렌과 같은 기타 중합체에 적용, 부착, 또는 결합한다. 나일론(또는 기타 중합체) 입자는 미세한 나일론 섬유에 견고히 부착하여 섬유를 점성의 수성 용액, 예를 들어 히알루론산 용액으로 후속으로 코팅하는 것을 보조하며, 그렇지 않은 경우 나일론 표면에 부착하지 않을 것이다. 입자로서 사용이 적합한 성분은 세바스산으로, 이는 실질적으로 물(히알루론산 용매) 및 TFE(나일론 용매)에 불용성이며, 아세톤(히알루론산 및 나일론의 용매는 아님)에는 잘 용해된다. 입자는 또한 당해 입자의 제거시 생성된 공동성 필라멘트상에 다공성 루멘 표면을 제공한다. 치료, 가교결합, 또는 물에 불용성인 코팅된 생흡수성 물질을 제공한 후, 나일론 및 나일론에 부착된 당해 입자는 적합한 용매로 제거된다. 바람직한 경우, 상이한 생흡수성 물질의 추가 코팅이 다음으로 적용될 수 있다. 당해 제조 단계에서, 나일론 및 제거되는 나일론 결합 입자로, 용매의 폭 넓은 선택은 당해 제2의 물질을 적용하는 데 사용될 수 있다. 적합한 제2의 물질은 락티드 및 글리콜리드의 공중합체(이하에서는 PLGA로 칭함)로, 이로써 당해 공정에서 내부는 HAX, 외부는 PLGA를 가진 공동의 필라멘트를 제공한다.

상기에서, 당해 공정의 상세한 단계는 다음과 같다:

1. 수용성 물질(W)을 제공하는 단계,

2. 용매(A)에 가용성인 섬유 물질(X)을 제공하는 단계,

3. 용매(B)에 가용성인 생흡수성 물질(Y)을 제공하는 단계,

4. 용매(C)에 가용성인 입자(P)를 제공하는 단계,

5. 용매(D)에 가용성인 생흡수성 물질(Z)을 제공하는 단계,

6. 용매(N)에 가용성인 중합체(M)를 제공하는 단계,

7. 용매(N) 중 중합체(M) 용액을 제조하는 단계,

8. 단계 2의 섬유를 단계 7의 용액으로 코팅하는 단계,

9. 단계 4의 입자(P)를 단계 8의 코팅된 섬유에 코팅하고, 용매(N)을 증발시켜, 이로써 당해 입자를 당해 섬유에 결합시키는 단계,

10. 용매(B) 중 물질(Y)의 용액을 제조하는 단계,

11. 단계 10의 용액을 단계 9의 외피로 덮힌 섬유 입자에 코팅하고 용매(B)를 증발시키는 단계,

12. 물질(Y)이 수용성인 경우, 물질(Y)을 가교결합시킴으로써 수 불용성을 부여하는 단계,

13. 중합체(M)를 용매(N)로 용해 및 세척하여 단계 12의 코팅된 섬유로부터 제거하는 단계,

14. 입자(P)를 용매(C)로 용해 및 세척하여 단계 13의 코팅된 섬유로부터 제거하는 단계,

15. 섬유(X)를 용매(A)로 용해 및 세척하여 단계 14의 코팅된 섬유로부터 제거하는 단계,

16. 수중 물질(W)의 용액을 제조하는 단계,

17. 필요하다면, 단계 16의 용액의 보호 코팅을 단계 15의 필라멘트에 적용하고 물을 증발시키는 단계,

18. 용매(D) 중 생흡수성 물질(Z)의 용액을 제조하는 단계,

19. 단계 17의 섬유를 단계 18의 용액으로 코팅하고 용매(D)를 증발시키는 단계,

20. 필라멘트를 수중 침액, 신선한 물로 세척, 필라멘트를 건조시킴으로써 물질(W)의 보호 코팅을 제거하는 단계,

21. 필라멘트를 적합한 길이로 절단하고 무균화하는 단계,

22. 적합한 용적의 적합한 용액 중 세포의 현탁액을 필라멘트의 루멘 내 침투시킴으로써 필라멘트를 적합한 세포로 씨딩하는 단계,

23. 필라멘트의 한쪽 말단에 주입함으로써 추가의 세포 구성물로 필라멘트를 로딩시키는 임의 단계,

24. 모간 성장이 요망되는 피부를 절개하고, 피부 내 포함된 세포 구성물을 함유하는 말단 및 상기 피부에 경피적으로 확장되는 말단을 가진, 단계 22 또는 23의 필라멘트를 절개 부위에 이식하는 단계.

상기 단계를 포함하는 적합한 공정에서, W는 캐러멜화된 사탕수수이고, X는 나일론, A는 TFE, Y는 히알루론산(나트륨 염), B는 물, P는 세바스산(입자 크기 10 내지 500μ, 바람직하게 50 내지 200μ), Z는 PLGA, D 및 N은 디클로로메탄, M은 폴리스티렌, C는 아세톤이다. PLGA에 다공성을 부여하는 것이 바람직한 경우, D는 글리세롤 및 TFE의 용액으로 특정될 수 있다. TFE의 증발시, PLGA 및 글리세롤 상은 끊임없이 연속적인(bicontinuous) 에멀젼으로 분리된다. 물에 용해시켜 글리세롤을 제거함으로써 미세다공성 구조물에 잔류하는 PLGA 코팅을 부여한다.

연골 조직 공학 적용을 위한 지지체를 제조하기 위해서, 기타 성분의 첨가 또는 비첨가로 상기 단계 11의 많은 수의 섬유가 부착제로서 단계 10의 추가의 코팅 용액을 함께 사용하여 다발이 될 수 있다. 만드렐 섬유를 용해시키기 전에, 당해 다발은 섬유를 용해시키고 공정 단계를 완성시켜 목적 생성물을 수득할 수 있는 디스크로 절단될 수 있다.

실시예 1. PLGA는 이식된 모낭 생존 및 모발 성장을 손상시키지 않는다.

d,l-락티드 및 글리콜리드(52:48)의 공중합체(PLGA)는 제조원[CCA, Purac Biochem bv, Gorinchem, The Netherland(Purasorb

PLGA, 클로로포름중의 고유 점도 1.06dl/g)]으로부터 구입하였고 디클로로메탄(10% w/v)중에 용해시켰다. 사탕수수를 용융시키고 캐러멜이 될때까지 가열하였고 목적하는 크기의 필라멘트가 용융물로부터 인출될 수 있는 지점까지 냉각되도록 방치하였다. 필라멘트를 고형화될때까지 냉각시키고, 즉시 염화나트륨 분말로 보호된 표면에 위치시켜 이들이 보다 점성이 되는 것을 방지하였다. 공동 필라멘트는 PLGA 용액을, 분말의 염 외피 캐러멜화된 당의 필라멘트상에 코팅시켜 제조하였다. 디클로로메탄을 증발시키고 코팅된 필라멘트를 물에 가함으로써 당 및 염을 용해시켜 제거하였다. 촉모(수염) 모낭을, IACUC 승인하에 대학(Mercer University)(Atlanta, GA)에서 안락사된 C57B16 마우스(Charles River)로부터 절개하였다. 절개된 수염을 동계 마우스의 면도된 배 피부상의 경사진 절개부상에 재이식하였다. 이어서 처음에 삽입되어 공동 PLGA 필라멘트의 루멘에 깔끔하게 맞는 절개된 모낭을 사용하여 당해 과정을 반 복함으로써, 모낭이 중합체에 의해 완전히 둘려싸이도록 한다(도 7). 30일 후, 이식된 마우스를 안락사시키고 피부를 절개하고 장방형 판지상에 펼치고 포르말린으로 고정하고 파라핀 포매, 절단 및 광학 현미경 분석을 위한 H & E 염색과 같은 통상적인 방법으로 처리하였다.

30일 후, 8개의 대조군 모낭 이식체중 7개는 성장하는 촉모 모간인 것으로 밝혀졌다. 또한 3개의 PLGA/모낭 이식체중 2개는 성장하는 모간인 것으로 밝혀졌다(도 8). 조직학적 분석은 PLGA내에 외피의 존재 또는 부재하에 재생된 이식 모낭에 어떠한 이상을 밝히지 못했다.

실시예 2. 미세 다공성 PLGA 공동 필라멘트의 제조

글리세롤(글리세린 U.S.P) 및 PLGA(Resomer^TM RG504, Boehringer Ingelheim, Germany) 용액은 글리세롤 대 PLGA의 비가 80:20(w/w)가 되도록 TFE(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)중에서 제조하였다. 당해 용액을, 코팅 중간에 건조를 위한 시간을 할애하면서 수층의 캐러멜화된 사탕수수 필라멘트(상기 실시예 1에서 제조된 바와 같음)상에 코팅하였다. 글리세롤 및 PLGA 둘다에 대한 용매인 TFE의 증발은 용질의 농도를 글리세롤이 더 이상 혼합가능한 상태로 있지 않을때까지 증가시킨다. PLGA/TFE로부터의 글리세롤 상 분리는 끊임없이 연속적인 에멀젼을 형성시켰다. 이어서 코팅된 필라멘트를 물에 가하여 임의의 잔류 TFE 뿐만 아니라 당 및 글리세롤을 신속하게 용해시키고 생성된 미세 다공성 PLGA를 걸러내었다. 수득한 다공성 공동 필라멘트를 물로 세정하고 건조기에서 완전히 건조될때까지 방 치시켰다. 무수 PGLA 공동 필라멘트의 다공성 구조는 도 4 및 5에 제공된 SEM 사진에서 나타낸다.

실시예 3. 친수성 PLGA 공동 필라멘트의 제조

에틸렌 옥사이드 및 프로필렌 옥사이드의 공중합체인 대략 5%(w/v)의 플루로닉 F-127 계면활성제(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 용액을 조심스럽게 가열하면서 무수 에탄올에서 제조하였다. PLGA의 공동 필라멘트는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 플루로닉 F-127의 투명한 무색 용액이 PLGA 필라멘트중 하나에 침투시키고 에탄올을 완전히 증발시켰다. 적색의 식품 착색 염료 소적을 유리 플레이트상에 위치시켰다. 15mm 길이의 플루로닉 F-127 처리된 PLGA 공동 필라멘트 및 동일한 직경의 15mm 길이의 비처리된 대조군 필라멘트를, 필라멘트의 각 말단이 액체 표면에 닿도록 하여 염료와 접촉시켰다. 플루로닉 F-127 처리된 필라멘트는 염료 수용액을 이의 전체 길이에 걸쳐 신속하게 흡수하는 반면, 비처리된 필라멘트는 단지 염료를 4mm의 길이까지 서서히 흡수하였다.

실시예 4. PLGA 코팅된 HAX 필라멘트의 제조

세바스산(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)을 사발 및 막자를 사용하여 분쇄하고 체질하여 입자 크기가 63 μ초과이고 212 μ미만인 입자를 수득하였다. 1m 길이의 미세 모노필라멘트 나일론 섬유(직경 0.003 인치, 세익스피어 모노필라멘트 디비젼, 콜럼비아, SC)를 TFE중의 나일론 용액(10% w/v)으로 코팅하는 즉시, 섬유를, 용액을 함유하는 피펫에 통과시키면서 피펫 말단 출구에 위치하는 세바스 산 입자를 통과하도록 하여 세바스산 입자로 외피를 형성시킨다. 섬유를 한쪽 말단에 현탁시키고 수직 상태로 매달려 있도록 한다. 히알루론산 나트륨 염 용액은 180mg의 나트륨 히알루로네이트 분말(1.4 x 10⁶ 분자량, Lifecore Biomedical, Chaska, MN)을 10ml의 물과 배합하고 이를 수화시키고 실온에서 밤새 용해시켜 제조하였다. 용액을 잘 혼합하고, 수동으로 젤라틴 액체 비드가 섬유를 따라 하향 이동하도록 하여 섬유상에 코팅시켰다. 히알루로네이트 용액의 박막 코팅층을 건조시킴에 이어서 2개의 추가의 코팅물을 적용하였고 이때, 코팅물 사이에 건조시키기 위한 시간을 할애하였다. 이어서 섬유를 대략 4cm의 길이로 절단하고 10%(v/v) 물 함유 아세톤중에 0.2%(w/v)의 N,N'-이소프로필에틸아미노카보디이미드(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 함유하는 바이엘에 위치시켰다. 실온에서 3시간 후, 용액을 버리고 순수한 아세톤으로 대체하였다. 아세톤을 버리고 잔류 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 이어서 바이엘에 TFE(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)를 채우고 실온에서 밤새 방치하였다. TFE를 버리고 새로운 TFE로 대체하고 몇시간 후 이것을 버리고 아세톤으로 대체하였다. 아세톤을 버리고 잔류 아세톤을 증발시켜 제거하여 HAX 필라멘트를 수득하였다.

사탕수수를 이것이 용융되고 캐러멜될때까지 교반시키면서 시험 튜브중에서 외부 불꽃을 사용하여 가열하였다. 암 갈색 용융물을 붓고 방치하여 고형화시켰다. 이를 물(대략 20% w/v)에 용해시켜 시럽을 제조하였다. 무수 HAX 필라멘트를 시럽에 위치시키는 즉시 이들은 신속하게 액체를 흡수하여 직경이 명백하게 증가하게 된다. 필라멘트를 시럽으로부터 제거하고 부분적으로 건조시켰다. 이어서 이 들을 분말 염화나트륨(< 63 μ)으로 코팅하고 건조기에 위치시켜 밤새 건조시켰다. 딱딱한 취성의 황색 필라멘트를 디클로로메탄(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)중의 10%(w/v)의 PLGA(Purasorb

PDLG, 클로로포름중의 고유 점도 1.06 dl/g 용액, CCA Purac Biochem bv, Gorinchem, The Netherlands)에 침지시키고 용매를 증발시켰다. 코팅된 필라멘트를 이어서 물에 침수시켜 황색 소실에 의해 입증되는 바와 같이 당 및 염을 용해시킨다. 이어서 필라멘트를 건조기에 다시 넣고 완전히 건조시킨다. HAX를 함유하지 않는 PLGA의 대조군 공동 필라멘트를 실시예 1의 방법에 의해 제조하였다. 이들 필라멘트가 수성 유체를 흡수하는 능력은 한쪽 말단을 적색 식품 착색 염료를 함유하는 한 방울의 물에 침지시켜 시험하였다. 적색의 물은 HAX를 함유하는 필라멘트의 루멘으로 신속하게 침투시키고 이를 완전히 채움으로써 필라멘트가 적색이 되도록 한다. 그러나, HAX를 함유하지 않는 필라멘트는 물을 흡수하지 않고 물과 반발력이 있어 물 표면상에 부유한다.

실시예 5. PLGA 공동 필라멘트 지지체에 함유된 마우스 세포로부터 생체내 모낭 생성 및 모간 성장

표피 및 피부 세포를 이전에 기술된 바와 같이 신생 마우스 새끼로부터 분리하였다[문헌참조: S.M Prouty, L. Lawrence, et al.(1996). "Fibroblast-dependent induction of a murine skin lesion with similarity to human common blue nevus." Am J Pathol 148(6): 1871-85), 본원에 참조문헌으로서 인용됨]. 공개된 과정으로부터 2개의 이탈된 과정은 C57/B16 마우스(Charles River Laboratories)를 사용한다는 것과 트립신 보다는 디스파제(Gibco)를 사용하여 신생 마우스 피부로부터의 표피의 분리를 촉진시키는 과정이다. 세포의 2개의 집단인 피부 및 표피를 별도로 분리하고 이들을 재조합하여 피부 세포 대 표피(또한 표피 버드로서 공지됨)의 비율이 100:1이 되도록 하였다. 이어서 이러한 세포 조합물을 5분 동안 900rpm에서 방사시켰다. 수득한 펠렛을 PBS중에서 재현탁시켜 mm당 총 세포가 10 x 10⁶ 이상인 세포 농도를 수득하는 즉시, 실시예 1에서 논의된 방법에 따라 단순히 섬유를 세포 현탁액에 침수시켜 PLGA 공동 필라멘트에 로딩시켰다. 이어서 이들 세포 씨딩된 필라멘트를, 19 게이지 피하 주사바늘로 피부를 천공하고 개방 사면의 절반이 노출될때까지 바늘을 후퇴시키고 공동 필라멘트 이식체를 개방 부위에 삽입함에 이어서 필라멘트를 피부 하부에 밀착시키면서 바늘을 완전히 빼냄에 의해 누드(Nu/Nu) 마우스의 배 피부 아래에 이식시켰다. 이식 후 3주째에, 마우스를 해부하고 피부를 절개하였다. 모낭형 구조 및 모간이 필라멘트 이식 부위에서 피부의 피하 측면상에 PLGA 지지체 물질과 연합되어 있는 것으로 관찰되었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 잘 형성된 모낭 벌브 및 긴 모간이 당해 광학현미경에서 확인될 수 있다. 지지체 물질은 육안으로 확인하기가 곤란한데 그 이유는 그것이 무색이고 부분적으로 분해되어 있기 때문이다.

실시예 6. 세포 현탁액중에 첨가제로서 콘드로이틴-6-설페이트의 사용

실시예 5에 기재된 방법은 누드 마우스로 주사하기 전에 세포 현탁액에 첨가된 다수의 가용성 물질을 평가하기 위해 사용하였다. 정확하게 동일한 수의 각각의 세포 유형을 동일한 마우스상에 위치하는 대조군 및 시험 물질 주사 부위 둘다에 주사하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 세포의 주사 후 13일째에 피하 공간에 서 형성된 모낭이 초기 5% 농도의 콘드로이틴-6-설페이트(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 존재하에 정확하게 동일한 배율에서 보다 명백하게 비대해졌다.

실시예 7. 세포 현탁액내 첨가제로서 플루로닉 F-127의 용도

실시예 6의 실험을 콘드로이틴-6-설페이트 대신에 20% 플루로닉 F-127 계면활성제(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 사용하여 반복하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포 주입 후 13일째에 피하 공간에 형성된 모낭이 어떠한 플루로닉 F-127 계면활성제가 주사된 유체에 존재하지 않는 대조군 주입 부위의 모낭 보다 정확하게 동일한 배율에서 명백하게 비대해졌다.

실시예 8. 가교결합된 젤라틴 공동 필라멘트의 제조

돼지 피부 젤라틴(300 bloom, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 온수에 용해시켜 5%(w/v)의 용액을 수득하였다. 당해 용액을, 실시예 4에 기재된 바와 같은 세바스산 입자로 외피가 형성된 미세 나일론 필라멘트에 도포하였다. 도포 사이에 코팅동안에 건조시키기 위한 시간을 할애하면서 여러 코팅물을 도포하였다. 이어서 섬유를 대략 4cm 길이로 절단하고 10%(v.v)의 물 함유 아세톤중에 0.2%(w/v)의 EDC(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 함유하는 바이엘에 위치시켰다. 실온에서 3시간 후, 용액을 버리고 순수한 아세톤으로 대체하였다. 아세톤을 버리고 잔류 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 이어서 바이엘에 TFE(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)를 채우고 실온에서 밤새 방치시켰다. TFE를 버리고 새로운 TFE로 대체하고 여러 시간 후 이를 버리고 아세톤으로 대체하였다. 아세톤을 버리고 잔류 아세톤을 증발시켜 제거하여 수불용성 젤라틴 공동 필라멘트를 수 득하였다.

실시예 9. 가교결합된 콘드로이틴-6-설페이트/젤라틴 지지체의 제조

세바스산(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)을 사발과 막자를 사용하여 63 μ체를 통과하는 입자로 분쇄하였다. 1회용 10㎕의 피펫 팁(Eppendorf epTIPS^TM, Brinkman Instruments, Westbury, NY)을 3개의 동등한 조각으로 절단하였다. 근부의 조각을 버리고 중간의 조각을 세바스산 분말로 충전시켰다. 콘드로이틴-6-설페이트(80mg) 및 돼지 피부 젤라틴(80mg)을 2.0ml의 온수에 용해시켰다. 당해 용액을, 세바스산으로 충전된 피펫 팁 부분의 보다 큰 구멍에 맞는 스테인레스 강을 장착한 주사기로 로딩하였다. 이어서 당해 용액을 충전된 세바스산에 주사하여 유체가 충전동안 이동하면서 공기가 분말로부터 방출되도록 한다. 이어서 피펫 팁으로부터 절단된 말단부의 조각을 충전된 조각에 삽입하였다. 개방된 말단으로부터 압출되는 과량의 페이스트를 닦아내었다.

조립된 조각을 건조기에 밤새 저장하여 완전히 건조시켰다. 이어서 이들을 9:1(v/v)의 아세톤:물의 0.2%(w/v) 용액에 위치시켰다. 약 1시간 후, 2개 조각의 피펫 팁을 약하게 격리시키고 성형된 생성물을 분사시키고 추가로 3시간동안 EDC 용액에 복귀시키는 즉시 가교결합된 지지체를 1시간동안 순수한 아세톤중에 침액시키고, 이어서 건조시켰다.

실시예 10. PLGA 및 가교결합된 젤라틴/콘드로이틴-6-필라멘트의 피펫 팁 외장 지지체

콘드로이틴-6-설페이트 및 돼지 피부 젤라틴(각각 100mg)을 2.0ml의 탈이온 온수에 용해시키고 26게이지 바늘을 통해, 높은 저장고에서 비이커로 흐르는 아세톤으로 채워진 실리콘 고무 튜브로 서서히 주입하였다. 수득한 미세한 백색 필라멘트를 수거하고 약 4시간동안 9:1(v/v)의 아세톤:물의 0.2%(w/v)의 EDC 용액에 위치시켰다. 이어서 필라멘트를 순수한 아세톤으로 세정하고 건조시켰다. 물중에 30% 캐러멜화된 사탕수수 용액을 무수 필라멘트에 첨가하고 필라멘트가 완전히 포화될때까지 침액시켰다. 소다발의 포화된 섬유 매쓰를 내부 직경이 1.0mm인 Teflon^TM 튜브에 위치시키고 건조기에서 완전히 건조시켰다. 갈색 당을 함유하는 실린더형 필라멘트를 튜브로부터 방출시키고 에펜도르프 피펫 팁(10㎕의 epTIPS^TM, Brinkman Instruments, Inc., USA) 말단을 통해 돌출된 30게이지 바늘 상단에 탑재하였다. 부착된 당 내포 필라멘트를 갖는 피펫 팁을 디클로로메탄중의 플루로닉 F-127의 30%(w/v) 용액에 침지시키고 건조시킴에 이어서 디클로로메탄중의 15%(w/v)의 PLGA 용액에 침지시키고 팁이 아래를 향하도록 매달아서 건조시켰다. 건조된 PLGA 말단부를 가위로 절단하고 전체 피펫 팁을 물에 위치시켰다. 몇 분 후, PLGA 필름은 수화된 플루로닉 F-127 계면활성제 코팅으로 인해 피펫 팁으로부터 용이하게 박리되었다. 수득한 지지체를 추가로 캐러멜화된 당의 갈색이 소멸할때까지 추가로 적셨다.

PLGA 외장내에 함유된 섬유 물질이 여과 매체로서 작용하는 능력 및 모낭 유도성 세포를 수거하고 이식하는 수단으로서의 능력을 시험하기 위해, 물중의 챠콜 입자 슬러리(100 내지 400 메쉬, Norit CA1 활성탄, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 10㎕의 피펫 팁으로 이동시키고 팁을 PLGA 지지체 외장으로 삽입하고 슬러리를 피펫으로부터 지지체 말단을 통해 방출시킨다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 챠콜 입자는 물이 통과됨으로써 수거되는 섬유 물질의 기부 말단에서 명백하게 육안으로 확인될 수 있다.

실시예 11. 조직 공학 연골을 위한 다발의 공동 필라멘트 HAX 지지체

나트륨 히알루로네이트(MW 1.4 x 10⁶ 돌턴, 제품 번호 80081, LifeCore Biomedical, Inc., Chaska, MN 55318)를 탈이온수에 용해시키고 투석 튜브에 위치시키고 탈이온수 100ml당 1g으로 양이온 교환 셀룰로스(Dowex AG 50W-X4, 제조원: BIO-RAD Laboratories, Inc., Hercules, CA사로부터 구입)에 대해 투석하고 2일 동안 4℃에서 자석 막대로 교반시켰다. 용액을 투석 튜브로부터 제거하고 동결 건조시켜 솜털 모양의 백색 고체를 수득하고 이를 탈이온수에 재용해시켜 3.4%(w/v)의 히알루론산을 함유하는 점성 용액을 수득하였다.

나일론 모노필라멘트 실(직경 0.003인치, SN-38 WonderThread^TM, Shakespeare Monofilament Division, Columbia, SC)을 3m 길이로 일렬로하여 구형의 일부가 절단된 1회용 전달 피펫(cat. no. 231, Samco Scientific Corp., San Fernando, CA)을 통해 섬유를 관통시키고 슬러리를 구형 개구부를 통해 피펫으로 주입함에 이어서 이를 섬유(처음 구형)의 길이를 따라 아래로 향하게 하여 피펫 팁이 균일한 슬러리 침착을 위한 오리피스로 작용하도록 함에 의해 대략 5%(w/v) 폴리스티렌(절단된 1회용 배양 접시 단편) 용액중에서 세바스산 분말(<63 μ) 슬러리 로 코팅하였다. 디클로로메탄의 증발 즉시, 코팅된 섬유는 엷은 백색이고 코팅되지 않은 섬유 보다 현저히 강한 느낌을 갖는다. 이어서 상기 히알루론산 용액을 유사한 방식으로 코팅된 섬유에 도포하였다. 히알루론산 각각의 코팅물을 적용하는 사이에 대략 1시간의 건조 시간을 가지면서 5개의 코팅물을 도포하였다. 이어서 섬유를 주의깊게 상향 코일을 형성하도록 하고 10%(v/v)의 탈이온수를 함유하는 아세톤중에 0.2%(w/v)의 EDC 용액을 함유하는 덮여진 접시에 위치시키고 당해 액체에 침강시키면서 밤새 적신다. 이어서 이들을 순수한 아세톤중에 세정하고 다시 일렬로 하여 이번에는 대략 10개의 섬유를 함께 묶어 하나의 연속 줄을 형성하도록 하였다. 줄을 손으로, 즉, 3개 손가락의 접촉부에 형성된 틈에 줄을 위치시킴과 함께 한손의 엄지와 처음 2개의 손가락 사이에 소량의 점성 용액을 유지하고 손을 줄 길이의 아래로 향하도록 함에 의해 히알루론산 용액으로 코팅하였다. 여러 코팅물을 각각의 도포 사이에 건조를 위한 시간을 할애하면서 도포하였다. 이어서 코팅된 줄에 코일을 형성시키고 상기한 바와 같은 덮여진 EDC 용액 접시에 위치시키고 밤새 적셨다. 이어서 순수한 아세톤으로 세정하고 건조시켰다.

줄을 4cm 길이로 절단하고 각각의 조각을 풍부한 양의 히알루론산 용액으로 코팅하였다. 코팅된 조각을 함께 다발로 묶음에 이어서 다발 주위에 각각의 매듭을 묶어 직경이 0.009 인치인 나일론 모노필라멘트(Shakespeare)로 때렸다. 각각의 매듭이 단단히 죄여지고 묶임으로써 과량의 히알루론산 용액이 건조하기 위해 한쪽말단에 의해 매달린 다발로부터 방출되었다. 과량의 용액을 말단으로부터 흘리고 1일 후 다발은 단단하고 가벼운 조성이 되었다. 이어서 이를 레이져 날로 3mm 의 직경 디스크로 절단하고, 히알루론산을 가교결합시키고 또 다른 하룻밤동안 디클로로메탄중에 세바스산을 용해시켜 폴리스티렌의 용해를 완료하기 위해 상기 언급된 새로운 배치의 EDC 용액을 밤새 방치하였다. 이어서 이들을 TFE에 위치시켜 나일론을 용해시켰다. TFE를 1시간동안 새로운 TFE로 대체하고 디스크를 당해 TFE에 밤새 적셨다. 이들을 이어서 새로운 TFE로 세정함에 이어서 아세톤을로 세정하고 건조시켰다. 건조 디스크를 50% 글루타르알데하이드(Acro no. 41096-5000, 제조원(Fisher Scientific Co., Fairlawn, NJ)로부터 구입) 수용액에 위치시키고 문헌[참조: "Polypeptide resurfacing method improves fibroblast's adhesion to hyaluronan strands" by M. Hu, E.E. Sabelman, S. Lai, E.K. Timek, F. Zhang, V. R. Hentz, and W. C. Lineaweaver, in Journal of Biomedical Materials Research, vol. 47 pages 79-84 (1999), 본원에 참조로서 인용됨]에서 추천된 바와 같은 실온에서 72시간동안 적셨다. 이러한 처리에 의해 EDC 가교결합된 HAX를, 조직 공학 연골 적용에 보다 적합한 보다 느리게 분해하는 물질로 전환시켰다. 글루타르알데하이드로부터 디스크를 제거하는 즉시 이들을 탈이온수로 수회 세정함에 이어서 밤새 물에 적셨다. 이어서 이들을 다시 세정하고 세포 씨딩 및 생물반응기 연구에 사용하기 전에 멸균제인 70%(v/v)의 이소프로판올/물 용액에 위치시켰다.

Claims

조직공학적으로 사용되기 위해 개조된, 내부 루멘을 한정하는 필라멘트를 포함하는 생흡수성 구조물.
제1항에 있어서, 모낭의 조직 공학에 사용되기 위해 개조된 구조물.
제1항에 있어서, 골, 연골 및 골연골 조직으로 이루어진 그룹에서 선택된 조직 공학 적용의 사용을 위해 개조된, 복수의 다발의 구조물.
제1항에 있어서, 필라멘트가 루멘을 한정하는 내부 표면을 가진 내부 층, 및 외부 층을 포함하는 구조물.
제1항에 있어서, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(디메틸트리메틸렌 카보네이트), 폴리(아미노산), 티로신-유도 폴리(카보네이트), 폴리(카보네이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(파라-디옥사논), 폴리(에스테르), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(무수물), 폴리(오르토 에스테르), 콜라겐, 젤라틴, 혈청 알부민, 단백질, 다당류, 뮤코다당류, 탄수화물, 글리코사미노글리칸, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 및 이들의 공중합체, 블렌드 및 혼합물, 및 생흡수성 결합의 가수분해 또는 분해로 방출시 대사되거나 방출될 수 있는 비분해성 중합체와 블럭 공중합된 생흡수성 결합을 함유하는 올리고머로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 생흡수성 물질을 포함하는 구조물.
제4항에 있어서, 외부 층은 실질적으로 다공성이 아니지만, 내부 층은 다공성인 구조물.
제4항에 있어서, 내부 층이 콜라겐, 젤라틴, 세룰로스 유도체, 전분, 덱스트린, 키토산, 리포단백질, 콘드로이틴-6-설페이트, 콜라겐과 젤라틴의 재조합 사람 형태, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 알부민, 혈청 단백질, 다당류, 뮤코다당류 및 신체 내 자연적으로 생성되는 천연 생체 중합체, 및 이들의 공중합체, 블렌드 및 혼합물, 및 이들의 가교결합된 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 생체 물질을 포함하는 구조물.
제4항에 있어서, 외부 층이 락티드와 글리콜리드의 공중합체를 포함하고, 내부 층이 가교결합된 히알루론산 및 콘드로이틴-6-설페이트로 이루어진 그룹에서 선택된 생흡수성 물질을 포함하는 구조물.
a. 제1의 생흡수성 물질과 포로겐(porogen)을 함유하는 성형된 구조물을 제조하는 단계,

b. 포로겐을 단계 a의 성형된 구조물에서 제거하는 단계,

c. 생흡수성 물질을 가교결합시키는 단계,

d. 성형된 구조물을 제2의 생흡수성 물질로 코팅시키는 단계를 포함하는, 제4항의 생흡수성 구조물의 제조 방법.
제9항에 있어서, 제1의 생흡수성 물질이 콘드로이틴-6-설페이트 및 젤라틴의 혼합물을 포함하고, 포로겐이 세바스산 입자를 포함하는 제조 방법.
필라멘트가 모낭 단편, 모유두 진피 세포(dermal papilla cell), 진피 초상 세포(dermal sheath cell), 매트릭스 세포, 내모근초 및 외모근초로부터 수득된 세포; 성인 또는 유아 유래의 표피 세포; 성인 또는 유아 유래의 진피 세포; 배아, 탯줄 혈 세포, 골수 세포, 지방 조직 세포, 근육 세포, 피부 세포, 및 이들의 임의 조합물에서 유도된 줄기 세포로 이루어진 그룹에서 선택된 세포로 씨딩된 제2항의 구조물을 포함하는 모낭 성장 유도용 이식체.
제11항에 있어서, 세포가 필라멘트에 씨딩되기 전, 배양으로 증식되는 이식체.
제11항에 있어서, 표피 세포가 필라멘트 루멘의 벽에 씨딩되고, 모낭 세포는 필라멘트의 한쪽 말단에 주입되는 이식체.
제13항에 있어서, 모낭 세포가 모유두 진피 세포를 포함하는 이식체.
제14항에 있어서, 표피 세포를 필라멘트의 내부 루멘에 씨딩하고, 배양된 모유두 진피 세포의 종괴(clump)를 필라멘트의 루멘의 한쪽 말단에 주입하는 이식체.
a. 두피 모낭 세포를 수득하는 단계,

b. 모낭 세포를 이의 수를 증가시키기 위해 배양하는 단계,

c. 제2항에 따른 구조물을 제공하는 단계,

d. 표피 세포를 단계 c의 구조물에 씨딩하는 단계,

e. 단계 b에서 수득된 모낭 세포를 단계 d의 표피 세포 함유 구조물에 씨딩하는 단계,

f. 단계 e의 구조물을 새로운 모발 성장이 요망되는 피부에 이식하는 단계를 포함하는 모발의 성장 또는 회복 방법.
제16항에 있어서, 단계 d의 세포가 사람 유아 포피로부터 수득되는 방법.
제17항에 있어서, 단계 d의 세포가 배아, 탯줄 혈, 골수, 지방 조직, 근육, 피부, 및 이들의 임의 배합물로부터 수득된 줄기 세포로 보충되는 방법.
제17항에 있어서, 단계 a의 세포가 모유두 진피, 진피 초상, 매트릭스 및 내 모근초 및 외모근초를 포함하는 단편에서 선택된 모낭 단편으로 배양된 방법.
제16항에 있어서, 구조물이 콘드로이틴-6-설페이트를 포함하는 방법.
a. 섬유를 입자로 코팅하는 단계,

b. 단계 a의 입자-코팅된 섬유를 생흡수성 물질의 용액으로 코팅하는 단계,

c. 생흡수성 물질을 물에 불용성이게 하는 단계,

d. 섬유 및 입자를 제거하는 단계를 포함하는, 생흡수성 구조물의 제조 방법.
제21항에 있어서, 생성된 구조물을 제2의 생흡수성 물질로 코팅하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 섬유가 나일론이고, 입자가 세바스산이며, 생흡수성 물질이 히알루론산인 방법.
제22항에 있어서, 섬유가 나일론이고, 입자가 세바스산이고, 생흡수성 물질이 히알루론산이며, 제2의 생흡수성 물질이 락티드와 글리콜리드의 공중합체인 방법.
a. 골 또는 연골 전구 세포를 수득하는 단계,

b. 제3항의 구조물을 단계 a의 세포로 씨딩하는 단계,

c. 단계 b의 구조물을 새로운 골 또는 연골 조직 성장이 요망되는 부위에 이식하는 단계를 포함하는, 골 및 연골을 성장시키는 방법.
제25항에 있어서, 구조물이 가교결합된 히알루론산을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 폴리(디메틸트리메틸렌 카보네이트), 폴리(트리메틸렌 카보네이트), 폴리(아미노산), 티로신-유도 폴리(카보네이트), 폴리(카보네이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(파라-디옥사논), 폴리(에스테르), 폴리(에스테르-아미드), 폴리(무수물), 폴리(오르토 에스테르) 및 이들의 공중합체, 블렌드 및 혼합물 및, 생흡수성 결합의 가수분해 또는 분해로 방출시 대사되거나 방출될 수 있는 비분해성 중합체와 블럭 공중합된 생흡수성 결합을 함유하는 올리고머로 이루어진 그룹에서 선택된 생흡수성 물질을 포함하며, 천연 형태로 또는 가교결합 시약, 단백질, 탄수화물, 글리코사미노글리칸, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(아크릴레이트 에스테르), 폴리(메타크릴레이트 에스테르), 폴리(비닐 알코올), 및 이들의 공중합체, 블렌드 및 혼합물로 가교결합시킴으로써 불용성 형태로, 내부 (루멘) 표면이 세룰로스 유도체, 전분, 덱스트린, 키토산, 리포단백질, 콜라겐과 젤라틴의 재조합 사람 형태, 콘드로이틴-6-설페이트, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 라미닌, 알부민, 기타 혈청 단백질, 다당류, 뮤코다당류, 및 체내에서 자연적으로 생성되는 기타 생체 중합체로 이루어진 그룹에서 선택된 생흡수성 물질로 코팅된 구조물.
제27항에 있어서, 물질이 락티드와 글리콜리드의 공중합체를 포함하는 구조물.
제28항에 있어서, 생흡수성 구조물이 에틸렌옥사이드와 프로필렌옥사이드의 공중합체로 코팅된 구조물.
a. 끝이 가늘어지는 만드렐을 수용성 중합체로 코팅하는 단계,

b. 생흡수성 물질은 만드렐의 팁에 부착시키는 단계,

c. 만드렐 및 생흡수성 물질을 필름-형성 생흡수성 중합체로 코팅하는 단계,

d. 만드렐을 구조물로부터 제거하는 단계를 포함하는, 제2항의 구조물의 제조 방법.
제30항에 있어서, 생흡수성 물질이 콘드로이틴-6-설페이트와 가교결합된 젤라틴으로 이루어진 섬유 물질을 포함하고, 필름-형성 생흡수성 중합체가 락티드와 글리콜리드의 공중합체를 포함하는 방법.