MXPA06010380A

MXPA06010380A - Metodo de diagnostico de una predisposicion para desarrollar una enfermedad trombotica y sus usos

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Publication number: MXPA06010380A
Application number: MXPA/A/2006/010380A
Authority: MX
Inventors: Herrmann Matthias; Kozian Detlef; Deleuze Jeanfrancois; Ricard Sylvain; Mace Sandrine
Original assignee: Sanofiaventis Deutschland GMBH
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2007-04-20

Abstract

La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, a sistemas de ensayo y su uso para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, a un variante del promotor P2X1 y su uso para seleccionar un agente antitrombótico, y a métodos para identificar un individuo que puede tratarse profiláctica o terapéuticamente con un agente antitrombótico, o para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico.

Description

MÉTODO DE DIAGNOSTICO DE UNA PREDISPOSICIÓN PARA DESARROLLAR UNA ENFERMEDAD TROMBÓTICA Y SUS USOS La presente invención se refiere a un método de diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, a sistemas de ensayo y su uso para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, a un variante del promotor P2X? y su uso para seleccionar un agente antitrombótico, y a métodos para identificar un individuo que puede tratarse profiláctica o terapéuticamente con un agente antitrombótico, o para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico. Una enfermedad trombótica, como la enfermedad vascular periférica (PVD), accidentes cerebrovasculares e infarto de miocardio, puede ser provocada por placas arterioscleróticas o por agregados de plaquetas sanguíneas. El riesgo de un individuo para desarrollar una enfermedad trombótica parece estar influido, al menos en parte, por un predisposición genética. Sin embargo, los factores genéticos subyacientes aún no se conocen completamente (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 24:1-14, 2004). En la actualidad, sólo un pequeño número de ensayos de diagnóstico está disponible para determinar la predisposición de un individuo a una enfermedad trombótica (Saffroy R., Lemoine A., Haas P., Tindiliere F., Marión S., Debuire B., Rapid automated simultaneous screening of (G1691A) Factor V, (G20210A) prothrombin, and (C677T) methylenetetrahydrofolate reducíase variants by multiplex PCR using fluorescence scanning technology, Genet Test., otoño 2002; 6(3):233-236). Sin embargo, los ensayos conocidos tienen todos el problema de que el riesgo de enfermedad trombótica en un individuo no puede determinarse con fiabilidad. Por tanto, son necesarios nuevos sistemas de ensayo que permitan determinar con fiabilidad la predisposición de un individuo a una enfermedad trombótica, en particular el riesgo de PVD, de accidentes cerebrovasculares o de infarto de miocardio. Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos más fiables de diagnóstico de una predisposición de un individuo para desarrollar una enfermedad trombótica. En particular, resultaría deseable proporcionar un sistema de ensayo para la manipulación conveniente de un método de diagnóstico adecuado, proporcionar un método y un sistema de ensayo para seleccionar nuevos agentes antitrombóticos, proporcionar un método para identificar un agente antitrombótico para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, y proporcionar un método para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico. Según un primer aspecto de la presente invención, el objeto se resuelve proporcionando un método de diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, en el que el método comprende: (a) determinar la secuencia de al menos un alelo del promotor P2X? al menos en una de ias posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1, y/o (b) determinar la cantidad de la proteína P2X? en una muestra de tejido obtenida de un individuo. En la presente ¡nvención, se ha descubierto, de forma sorprendente, que el promotor P2X? aparece en los seres humanos en forma de variantes del promotor P2X? que comprenden variaciones de la secuencia en las posiciones identificadas anteriormente, que se correlacionan en gran medida con una predisposición de sus portadores para desarrollar diversas formas de enfermedad trombótica. La presente invención se basa en el estudio realizado con 1400 pacientes, que, debido al alto número de pacientes, es muy significativo. Por tanto, la presente ¡nvención proporciona, por primera vez, un método de diagnóstico fiable de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. Las modalidades preferidas del método de diagnóstico de la invención se refieren al diagnóstico de formas particulares de enfermedad trombótica que se correlacionan con la presencia de variantes particulares del promotor P2X?. En la presente invención se afirma que las variaciones de nucleótidos individuales en el promotor P2X? se producen con una alta frecuencia en una población dada, en particular con una frecuencia > 1%, y, por tanto, pueden clasificarse como los denominados polimorfismos de un nucleótido (SNP). Por tanto, son muy adecuados como marcadores de diagnóstico de una predisposición de un individuo para desarrollar una enfermedad trombótica. Los polimorfismos de un nucleótido (SNP) en el promotor P2X? tienen un impacto sobre la cantidad de proteína P2X? producida en el respectivo individuo. Por tanto, según la presente invención, una cantidad alterada de la proteína P2X? en una muestra de tejido es el marcador fiable de la predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. El receptor P2X-? es un miembro de los denominados canales iónicos con puertas de ATP de la familia del receptor P2X. Se encuentra en una multitud de tejidos y células humanos, por ejemplo en neuronas, miocitos lisos, y plaquetas sanguíneas (Gene, 2001, vol. 269:167-175; Thromb. Haemost., 1998, vol. 103:858-866). La secuencia de aminoácidos del receptor P2X? está disponible con el número de registro S71927 en la base de datos de proteínas NCBI. En las plaquetas sanguíneas, el P2X? está implicado en la movilización de iones de calcio y en el inicio de la agregación de plaquetas (J. Biol. Chem., 1998, vol. 273:2024-2029). De forma esporádica, se han descrito mutaciones en el gen del receptor P2X? que conducen a una hemorragia anormalmente fuerte en los portadores (J. Biol. Chem., 2002, vol. 275:22611-22614). En miocitos lisos, los receptores P2X? son responsables de la vasoconstricción. En células endoteliales, la activación de P2X? por ATP conduce a la liberación de prostaciclina y monóxido de nitrógeno (NO), que ejercen efectos vasodilatadores y antiproliferativos sobre los miocitos lisos (TIPS, 1998, vol. 19:99-107). Recientemente, se ha descrito la secuencia del promotor del gen P2X? y sus mutantes de delección (Gene, 2001, vol. 269:167-175; número de registro AF177472, base de datos de nucleótidos NCBI). Se ha demostrado que ciertas regiones del promotor contribuyen de manera fundamental en la transcripción del ARNm de P2X-?. Además, se sabe que la proteína P2X? está implicada en procesos trombóticos (J. Exp. Med., 198(4):661-667, 2003). En la presente invención, las referencias a las posiciones dentro de la secuencia de nucleótidos del promotor P2X? se realizan haciendo referencia a SEQ ID NO:1 , que se corresponde con la secuencia disponible con el número de registro AF177472 de la base de datos de nucleótidos NCBI. Preferiblemente, la proteína P2X? comprende la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2, que está disponible con el número de registro S71927 en la base de datos de proteínas NCBl. En la presente invención, se han observado variaciones, previamente desconocidas, de nucleótidos individuales en el promotor P2X?, que se correlacionan con la predisposición de un individuo para desarrollar una enfermedad trombótica. Estas variaciones comprenden ia variación de C a T en la posición 304, de G a C en la posición 764, de T a G en la posición 838, o de T a C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. El orden de mención de los nucleótidos individuales, por ejemplo "de C a T en la posición 304" indica la variación de la base que aparece con mayor frecuencia en una posición dada, a la base observada con menos frecuencia en la misma posición. Según la presente invención, un individuo puede comprender 1 , 2, 3 ó 4 de las variaciones en el promotor P2X? en las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1, puede no comprender variación en las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1, o puede comprender cualquier combinación de cualquiera de las bases C o T en la posición position 304, G o C en la posición 764, T o G en la posición 838, o T o C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1 en cualquiera o ambos alelos del promotor P2X?. En la presente invención, el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica comprende la determinación del riesgo de un individuo para desarrollar una enfermedad trombófica y/o el diagnóstico de una enfermedad trombótica aguda o crónica. Una enfermedad trombótica comprende cualquier forma de trombosis, en particular cualquier forma de formación de un coágulo sanguíneo intravital en arterias o venas, y cualquier síntoma clínico asociado en cualquier parte del cuerpo humano o animal, en particular en cualquier órgano o miembro. Un coágulo sanguíneo comprende en particular agregadps de plaquetas sanguíneas y/o material de placa derivado de placas arterioscleróticas. Una enfermedad trombótica comprende preferiblemente la enfermedad vascular periférica (PVD), infarto de miocardio, preferiblemente infarto de miocardio prematuro, y accidentes cerebrovasculares, en particular comprende ataque isquémico transitorio (TÍA) y/o déficit neurológico isquémico reversible prolongado (PRIND). La PVD comprende, en particular, un problema circulatorio habitual en el que las arterias que transportan la sangre a las piernas o brazos se estrechan o se taponan, y a veces se denomina enfermedad arterial periférica, o PAD. Muchos también denominan al trastorno "endurecimiento de las arterias." El infarto de miocardio prematuro se refiere preferiblemente a cualquier forma de infarto de miocardio que se produce en seres humanos o animales a cualquier edad anterior a la ancianidad. Los métodos de diagnóstico de la invención se refieren preferiblemente a métodos in vitro de diagnóstico, en los que se utiliza una muestra de tejido que se ha retirado del cuerpo de un individuo antes de ejecutar el método de diagnósfico de la invención. Otras modalidades preferidas de la invención se refieren a métodos in vivo de diagnósfico, preferiblemente en los que una muestra de tejido situada en el interior del cuerpo de un individuo se utiliza en métodos de diagnóstico in situ. En la presente invención, una muestra de tejido comprende preferiblemente células, como células sanguíneas, en particular plaquetas sanguíneas, eritrocitos y/o leucocitos, miocitos lisos, células del músculo estriado, células epiteliales de cualquier epitelio, células de tejido conectivo de cualquier tejido conectivo, neuronas, muestras de tejido de la piel, muestras de tejido de mucosa, muestras de tejido de cualquier órgano, y cualquier fluido corporal, en particular sangre completa, o cualquier fracción sanguínea, licor, linfa, orina, saliva y semen. En la presente invención, un individuo comprende cualquier animal vertebrado, preferiblemente cualquier mamífero, preferiblemente un ser humano, de cualquier edad o sexo, en particular, un ser humano o animal recién nacido, pequeño, adolescente, adulto o senescente, cualquier línea celular germinal humana o animal, un oocito o espermatocito humano o animal, un oocito fertilizado humano o animal, cualquier ser humano o animal antes del nacimiento, en particular cualquier embrión o feto humano o animal. En una modalidad preferida del método de diagnósfico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, la presencia en una muestra de tejido de un individuo de al menos un alelo del promotor P2X? que comprende una variación de C a T en la posición 304 de SEQ ID NO:1 es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD). Preferiblemente, la presencia de la variación de C a T en la posición 304 sobre ambos alelos del promotor P2X? es indicativa de un riesgo aún mayor de PVD. En otra modalidad preferida, la presencia en una muestra de tejido de al menos un alelo del promotor P2X? que comprende una variación de G a C en la posición 764 de SEQ ID NO:1 es indicativa de un riesgo mayor de PVD. Preferiblemente, la presencia de la variación de G a C en la posición 764 sobre ambos alelos del promotor P2X? es indicativa de un riesgo aún mayor de PVD. En otra modalidades preferidas, la presencia de la variación de C a T en la posición 304 de SEQ ID NO:1 sobre ambos alelos del promotor P2X-?, o la presencia de la variación de G a C en la posición 764 de SEQ ID NO:1 sobre ambos alelos del promotor P2X? es indicativa de un riesgo reducido de accidentes cerebrovasculares, en particular de un riesgo reducido de ataque isquémico transitorio (TÍA) o de déficit neurológico isquémico reversible prolongado (PRIND).

En otras modalidades preferidas, la presencia de C en la posición 304 de SEQ ID NO:1 en lugar de una T sobre al menos un alelo del promotor P2X-?, o la presencia de G en la posición 764 de SEQ ID NO:1 en lugar de C sobre al menos un alelo del promotor P^ es indicativo de un riesgo mayor de accidentes cerebrovasculares. En otra modalidad preferida, la presencia en una muestra de tejido de al menos un alelo del promotor P2X? que comprende una variación de T a G en la posición 838 de SEQ ID NO:1 es indicativa de un riesgo menor de infarto de miocardio prematuro. Además, la presencia en una muestra de tejido de al menos un alelo del promotor P2X1 que comprende una T en la posición 838 de SEQ ID NO:1 es indicativa de un riesgo mayor de infarto de miocardio prematuro. Preferiblemente, la presencia de la variación de T a G en la posición 838 sobre ambos alelos del promotor P2X? es indicativa de un riesgo aún menor de infarto de miocardio prematuro. En la presente invención, el riesgo de un infarto de miocardio prematuro es preferiblemente el riesgo de mujeres que fienen menos de 55 años, o de hombres que tienen menos de 60 años de sufrir un infarto de miocardio. En otra modalidad preferida, la presencia en una muestra de tejido de al menos un alelo del promotor P2X? que comprende la variación de T a C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1 es indicativa de un riesgo mayor de PVD. Preferiblemente, la presencia de la variación de T a C en la posición 1002 sobre ambos alelos del promotor P2X-t es indicativa de un riesgo aún mayor de PVD. En otras modalidades preferidas, la secuencia del promotor P2X? se determina en más de una posición, preferiblemente en dos, en tres o en todas las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1. Preferiblemente, la secuencia de ambos alelos del promotor P2X? se determina en una, dos, tres o todas las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1. Preferiblemente, la secuencia del promotor P2X-?, o de fragmentos de éste, que comprende al menos una de las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1 se determina utilizando cualquier método para el análisis de la secuencia de ácidos nucleicos, en particular cualquier protocolo de secuenciación de ADN basado en el protocolo de secuenciacíón de ADN según Sanger (Current Protocols in Molecular Biology, editado por Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl; hojas sueltas: 0-47 -650338-X; CD-ROM: 0-471-30661-4), en particular utilizando nucleótidos marcados radiactivamente, o utilizando nucleótidos marcados con un tinte fluorescente, en particular que implica una reacción en cadena de polimerasa (PCR), o utilizando un método de secuenciación químico (Pyrosequencing: an accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms, Hum. Mutat., mayo 2002; 19(5):479-485), en particular utilizando pirosecuenciación (Pyrosequencing for SNP genotyping, Methods Mol. Biol., 2003; 212:189-195; Comparison of GenFlex Tag array and Pyrosequencing in SNP genotyping, J. Mol. Diagn., noviembre 2003; 5(4):243-249; Microarrays and genetic epidemiology: a multipurpose tool for a multífaceted field, Genet. Epidemiol., junio 2002; 23(1):4-20, informe), o utilizando espectrometría de masas para el análisis de una secuencia de ácido nucleico (A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms, Nucleíc Acids Res., 15 de diciembre 2003; 31 (24):e155; Digital genotyping using molecular affinity and mass spectrometry, Nat. Rev. Genet., diciembre 2003; 4(12):1001-1008). Además, la secuencia del promotor P2X-?, o de fragmentos de éste, que comprende al menos una de las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO:1 puede determinarse utilizando cualquier método de detección de ácidos nucleicos específico de secuencia, que permite detectar varicaciones de un único nucleótido, en particular cualquiera de estos métodos que impliquen el apareamiento de bases complementarias. Por ejemplo, los variantes del promotor P2X? de la invención pueden detectarse con una reacción en cadena de polimerasa (PCR) que emplea cebadores de oligonucleótidos que permiten la amplificación de un fragmento del promotor P2X? sólo si C o T está presente en la posición 304, si G o C está presente en la posición 764, si T o G está presente en la posición 838, y/o si T o C está presente en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. Los métodos para realizar la PCR son conocidos en la técnica (Current Protocols in Molecular biology; editado por Fred M. Ausubel et al., supra). Además, el denominado análisis TaqMan puede utilizarse para la detección de los variantes del promotor P2X? de la invención (PNAS USA, 88: 7276-7280; Nucí. Acid Res., 21: 3761-3766). Además, puede utilizarse una micromatriz de ADN que permita la detección de un fragmento del promotor P2X? sólo si C o T está presente en la posición 304, si G o C está presente en la posición 764, si T o G está presente en la posición 838, y/o si T o C está presente en la posición 1002 de SEQ ID NO:1 , que un experto en la técnica proporciona con facilidad (Microarrays and genetic epidemiology: a multipurpose tool for a multifaceted field, Genet.

Epidemioi., junio 2002; 23(1):4-20; High-density genechip oligonucleotide probé arrays, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2002; 77: 21-42). Además, pueden utilizarse ensayos de hibridación de transferencia Southern utilizando sondas de ácidos nucleicos que permitan la detección de polimorfismos de un nucleótido de los variantes del promotor P2X? de la invención. Preferiblemente, la secuencia del promotor P2X? se determina en un protocolo de secuenciación de ADN o en un método que implica una reacción en cadena de polimerasa, preferiblemente en un análisis TaqMan PCR, utilizando al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304 de SEQ ID NO:1 , utilizando al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764 de SEQ ID NO:1 , utilizando al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838 de SEQ ID NO:1 , y/o utilizando al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO: 10 para determinar la secuencia del promotor P2X-? en la posición 1002 de SEQ ID NO:1.

La SEQ ID NO:3 se corresponde con la posición 62490-62507 de la secuencia de NCBI AC005940.3. La SEQ ID NO:4 es la hebra antisentido a la posición 472-289 de SEQ ID NO-.1. La SEQ ID NO:5 se corresponde con la posición 618-635 en SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:6 es la hebra antisentido a la posición 775-784 de SEQ ID NO.L La SEQ ID NOJ se corresponde con la posición 818-837 en SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:8 es la hebra antisentido a la posición 1003-1022 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:9 se corresponde con la posición 818-837 en SEQ ID NO:! La SEQ ID NO:10 es la hebra antisentido a la posición 1003- 1022 de SEQ ID NO:1. En otra modalidad del método de la ¡nvención de diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, una cantidad alterada de la proteína P2Xf en una muestra de tejido es indicativa de la predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. En la presente invención, la determinación de la cantidad de la proteína P2X? en una muestra de tejido comprende preferiblemente la determinación de su cantidad, o la determinación de su presencia en una muestra de tejido. Preferiblemente, la determinación de la cantidad de la proteína P2X? en una muestra de tejido comprende cualquier método para detectar una proteína individual, por ejemplo un análisis de la transferencia Western o un ensayo ELISA utilizando antisuero anti-P2X? o un anticuerpo anti-P2X?, en particular utilizando un anticuerpo monoclonal anti-P2X? o un fragmento de un anticuerpo anti-P2X-?, en particular la proteína P2X? en una muestra de tejido utilizando un anticuerpo de una única cadena o un fragmento de anticuerpo producido de forma enzimática o recombinante (Current Protocols in Immunology; editado por: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Waren Strober; hojas sueltas: 0-471-52276-7; CD-ROM: 0371-30660-30666). La invención ¡ncluye el uso de cualquier antisuero anti-P2X? o anticuerpo anti-P X?, en particular cualquier anticuerpo monoclonal anti-P2X? o un fragmento de anticuerpo anti-P2X?, en particular cualquier anticuerpo de una única cadena o un fragmento de anticuerpo producido de forma enzimática o recombinante, en los métodos y sistemas de ensayo de la invención. En modalidades preferidas, la cantidad de ARNm de P2X? es indicativa de la cantidad de proteína P2X?. Preferiblemente, la cantidad de proteína P2X? se determina midiendo la cantidad de ARNm de P2X-¡. Preferiblemente, la presencia de ARNm de P2X-? es indicativa de la presencia de la proteína P2X-?. Preferiblemente, el ARNm de P2X? en el sentido utilizado en la presente comprende la secuencia complementaria con al menos parte del promotor P2X? y/o incluye al menos parte de la región codificadora del gen P2X-?. Preferiblemente, se determina la cantidad de un ARNm precursor o del ARNm maduro o de un fragmento de éste. Preferiblemente, la cantidad o presencia del ARNm se determina mediante un análisis de la transferencia Northern (Current Protocols in Molecular Biology; editado por Fred M. Ausubel et al., supra), en un análisis PCR que comprende una etapa inicial de transcribir de forma inversa la molécula de ARN, en un análisis de presentación diferencial (Comparative gene-expression analysis; Trends Biotechnol., febrero 1999; 17(2):73-78), o en un análisis de la diferencia representacional (Comparative gene-expression analysis; Trends Biotechnol., 1999, supra). En otras modalidades preferidas, la actividad de la proteína P2X? en una muestra de tejido es indicativa de su cantidad. Preferiblemente, la actividad de la proteína P2X? se determina en un ensayo de actividad P2X? (Journal Biol. Chemistry, publicado el 29 de diciembre, 2003, antes de publicarse como manuscrito n° M308964200). Preferiblemente, la actividad de la proteína P2X? se determina en una célula humana ó animal. Según otro aspecto de la presente invención, las variaciones en el promotor P2X? de la presente invención permiten proporcionar un sistema de ensayo para la determinación conveniente de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de ensayo que comprende al menos una sonda de ácido nucleico u oligonucleófido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304, preferiblemente para detectar C o T en la posición 304, para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764, preferiblemente para detectar G o C en ia posición 764, para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838, preferiblemente para detectar T o G en la posición 838, o para determinar la secuencia del promotor P2X-? en la posición 1002, preferiblemente para detectar T o C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1 en una muestra de tejido obtenida de un individuo. Preferiblemente, el oligonucleótido es al menos un cebador de PCR, preferiblemente se proporciona un conjunto de cebadores de PCR, que permite amplificar un fragmento del promotor P2X-? sólo si C o T está presente en la posición 304, si G o C está presente en la posición 764, si T o G está presente en la posición 838, y/o si T o C está presente en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. Un experto en la técnica proporciona con facilidad este oligonucleótido o conjunto de cebadores de PCR (Current Protocols in Molecular Biology; editado por Fred M. Ausubel et al., supra). En una modalidad preferida, el sistema de ensayo comprende al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304 de SEQ ID NO:1 , al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764 de SEQ ID NO:1 , al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838 de SEQ ID NO:1 , y/o al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 para determinar la secuencia del promotor P2X-? en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. En otra modalidad preferida, el sistema de ensayo comprende una micromatriz de ADN, que preferiblemente permite la detección de un fragmento del promotor P2X? sólo si C está presente en la posición 304, sólo si T está presente en la posición 304, sólo si G está presente en la posición 764, sólo si C está presente en la posición 764, sólo si T está presente en la posición 838, sólo si G está presente en la posición 838, sólo si T está presente en la posición 1002 y/o sólo si C está presente en la posición 1002 de SEQ ID NO:1, que un experto en la técnica proporciona con facilidad (Microarrays and genetic epidemiology: a multipurpose tool for a multifaceted field, Genet. Epidemiol., junio 2002; 23(1):4-20; High-density genechip oligonucleotide probé arrays, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2002; 77: 21-24). En otra modalidad preferida, el sistema de ensayo comprende una sonda de ácido nucleico marcada para su utilización en un ensayo de hibridación de transferencia Southern que permite la detección de un fragmento del promotor P2X? sólo si C está presente en la posición 304, sólo si T está presente en la posición 304, sólo si G está presente en la posición 764, sólo si C está presente en la posición 764, sólo si T está presente en la posición 838, sólo si G está presente en la posición 838, sólo si T está presente en la posición 1002 y/o sólo si C está presente en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. Un experto en la técnica es capaz de realizar estos experimentos (Current Protocols ¡n Molecular Biology; editado por Fred M.

Ausubel et al., supra). Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico está marcada radiactivamente, está marcada fluorescentemente, o puede detectarse inmunológicamente, en particular está marcada con digoxigenina (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim). Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del sistema de ensayo mencionado anteriormente, que comprende al menos una sonda de ácido nucleico o oligonucleótido para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. Con respecto al uso del sistema de ensayo, también se aplica a las modalidades definidas anteriormente para el método de ia invención de diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombófica. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de ensayo que comprenden al menos un antisuero anti-P2X-?, un anticuerpo anti-P2X1, o un fragmento de anticuerpo anti-P2X? para determinar la presencia, preferiblemente la cantidad, de la proteína P2X? en una muestra de tejido obtenida de un individuo. Preferiblemente, el sistema de ensayo comprende al menos un anticuerpo monoclonal anti-P2X? o un fragmento de anticuerpo anti-P2X-?, en particular un anticuerpo de una única cadena o un fragmento de anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo de una única cadena o un fragmento de anticuerpo producido de forma enzimática o recombinante (referencias). Preferiblemente, el sistema de ensayo de la invención incluye cualquier antisuero anti-P2X? o anticuerpo anti-P2X?, en particular cualquier anticuerpo monoclonal anti-P2X? o cualquier fragmento de anticuerpo anti-P2X-?, preferiblemente cualquier anticuerpo de una única cadena o un fragmento de anticuerpo producido de forma enzimática o recombinante. En la presente invención, la proteína P2X-? comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2, que está disponible con el número de registro S71927 en la base de datos de proteínas NCBI. Preferiblemente, la cantidad de proteína P2X? en una muestra de tejido se determina utilizando cualquier método para detectar la presencia o medir la canfidad de una proteína individual, por ejemplo un análisis de la transferencia Western o un ensayo ELISA. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del sistema de ensayo que comprende al menos un antisuero anti-P2X?, un anticuerpo anti-P2X-1, o un fragmento de anticuerpo anti-P2X? para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. Otros aspectos de la presente invención se refieren a la detección de nuevos compuestos profilácticos y terapéuticos para una enfermedad trombótica, con la ayuda de los variantes del promotor P2X? de la invención. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un variante del promotor P2X? que comprende un fragmento de ADN que comprende al menos una de las posiciones 304, 764, 838 y/o 1002 de SEQ ID NO:1.

Preferiblemente, el variante del promotor P2X? comprende T o C en la posición 304, C o G en la posición 764, T en la posición 838, y/o C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. Preferiblemente, el variante del promotor P2X? comprende las regiones del promotor P2X? que han demostrado contribuir a la transcripción del ARNm de P2X! (Gene, 2001 , vol. 269:167-175). Otro aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de ensayo que comprende el variante del promotor P2X? de la invención, en el que el variante del promotor dirige la síntesis de un producto detectable. Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del sisíema de ensayo que comprende un variante del promotor P2X? de la invención para seleccionar un agente antitrombótico. Preferiblemente, un agente antitrombótico se ¡dentfica por su capacidad para contrarrestar el efecto de un variante del promotor P2X? concreto, cuando se compara con un promotor P2X? de tipo salvaje. Según otro aspecto de la invención que se refiere a la detección de nuevos compuestos profilácticos y terapéuticos para una enfermedad trombótica, en el que los variantes del promotor P2X-? de ia invención se utilizan con ventaja, se proporciona un método para seleccionar un agente antitrombótico. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para seleccionar un agente antitrombótico, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un variante del promotor P2X? de la invención, preferiblemente un variante del promotor P2X? que comprende T o C en la posición 304, C o G en la posición 764, T en la posición 838, o C en la posición position 1002 de SEQ ID NO:1, (b) poner en contacto el variante del promotor P2X? con un compuesto de ensayo, y (c) determinar la actividad del variante del promotor P^. Preferiblemente, un agente antitrombótico es un agente activo para la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad trombótica, preferiblemente de PVD, accidentes cerebrovasculares, preferiblemente TÍA, PRIND, y/o infarto de miocardio, preferiblemente infarto de miocardio prematuro. En otras modalidades, el método de selección se adapta a una selección de alta transferencia de compuestos de ensayo. Preferiblemente, el método implica determinar la actividad del variante del promotor P2X? en presencia de un compuesto de ensayo, y compararla con la actividad del variante del promotor P2XÍ en ausencia del compuesto de ensayo. Preferiblemente, el método implica el uso del sistema de ensayo de la invención para seleccionar un agente antitrombótico, como se describe en la presente. Un compuesto de ensayo es preferiblemente una molécula pequeña que es un candidato para ser una molécula efectora que potencia o inhibe la actividad de un componente del aparato transcripcional de una célula, y en particular un candidato para ser un efector de molécula pequeña que interacciona con un componente del aparato de transcripción basal, en particular que interacciona con los factores de transcripción general o basal implicados en los mecanismos de unión al ADN e inicio de la transcripción. Preferiblemente, el compuesto de ensayo es cualquier compuesto químico, como un compuesto que aparece en la naturaleza o un compuesto sintetizado de forma química que es idéntico o similar a un compuesto que aparece en la naturaleza, o cualquier compuesto sintetizado de forma química que no aparece en la naturaleza. Un compuesto que aparece en la naturaleza preferiblemente es un compuesto que puede detectarse o aislarse a partir de un organismo multicelular o unicelular, en particular en un animal, una planta, un hongo, una levadura, una bacteria o cualquier otro organismo que contiene células, o en un virus. Un compuesto sintetizado de forma química que no aparece en la naturaleza se sintetiza preferiblemente mediante química combinatoria. Preferiblemente, comprende una estructura básica derivada de un compuesto que aparece en la naturaleza, preferiblemente de un candidato para ser una molécula efectora que puede unirse a un factor de transcripción o un componente del aparato transcripcional basal de una célula. Preferiblemente, el compuesto de ensayo es un compuesto de ensayo bioquímico o químico, por ejemplo en forma de un banco de compuestos químicos. Según la presente invención, el término "banco de compuestos químicos" se refiere a una pluralidad de compuestos químicos que han sido ensamblados a partir de cualquiera de múltiples fuentes, que incluyen moléculas sintetizadas de forma química y productos naturales, o que han sido generados mediante técnicas de química combinatoria. Preferiblemente, el compuesto de ensayo es cualquier compuesto de bajo peso molecular. De forma ventajosa, un banco de compuestos químicos es especialmente adecuado para una selección de alta transferencia. Puede estar compuesto de compuestos químicos de una estructura particular o compuesto de una especie particular, como una planta. En una modalidad preferida, la actividad del promotor P2X? que comprende T en la posición 304 de SEQ ID NO:1 , en particular en una célula que comprende T en uno o ambos alelos del promotor P2X-?, se determina y se compara con la acfividad del promotor P2X? que comprende C en la posición 304, y se identifica un agente antitrombótico como un compuesto de ensayo que invierte el efecto de T en la posición 304 sobre la actividad del promotor P2X-?. Preferiblemente, el agente antitrombótico identificado de esta manera puede utilizarse para la prevención o la terapia de la enfermedad vascular periférica (PVD). En otra modalidad preferida, la actividad del promotor P2X? que comprende C en la posición 304 de SEQ ID NO:1 , en particular en una célula que comprende C en uno o ambos alelos del promotor P2X?, se determina y se compara con la actividad del promotor P2X? que comprende T en la posición 304, y se identifica un agente antitrombótico como un compuesto de ensayo que invierte el efecto de C en la posición 304 sobre la actividad del promotor P2X?. Preferiblemente, el agente antitrombótico identificado de esta manera puede utilizarse para la prevención o la terapia de accidentes cerebrovasculares, preferiblemente de TÍA o PRIND. En otra modalidad preferida, la actividad del promotor P2X? que comprende C en la posición 764 de SEQ ID NO:1, en particular en una célula que comprende C en uno o ambos alelos del promotor P2X?, se determina y se compara con la actividad del promotor P2X? que comprende G en la posición 764, y se identifica un agente antitrombótico como un compuesto de ensayo que invierte el efecto de C en la posición 764 sobre la actividad del promotor P2X?. Preferiblemente, el agente antitrombótico identificado de esta manera puede ufilizarse para la prevención o la terapia de PVD. En otra modalidad preferida, la actividad del promotor P2X? que comprende G en la posición 764 de SEQ ID NO:1, en particular en una célula que comprende G en uno o ambos alelos del promotor P2X-?, se determina y se compara con la acfividad del promotor P2X? que comprende C en la posición 764, y se identifica un agente antitrombótico como un compuesto de ensayo que invierte el efecto de G en la posición 764 sobre la actividad del promotor P2X?. Preferiblemente, el agente antitrombótico identificado de esta manera puede utilizarse para la prevención o la terapia de accidentes cerebrovasculares, preferiblemente de TÍA o PRIND. En una modalidad preferida, la acfividad del promotor P2X? que comprende T en la posición 838 de SEQ ID NO:1, en particular en una célula que comprende T en uno o ambos alelos del promotor P2X-?, se determina y se compara con la actividad del promotor P2X? que comprende G en la posición 838, y se identifica un agente antitrombótico como un compuesto de ensayo que invierte el efecto de T en la posición 838 sobre la actividad del promotor P2X-?. Preferiblemente, el agente antitrombótico identificado de esta manera puede utilizarse para la prevención o la terapia del infarto de miocardio, preferiblemente del infarto de miocardio prematuro. En otra modalidad preferida, la acfividad del promotor P2X? que comprende C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1 , en particular en una célula que comprende C en uno o ambos alelos del promotor P2X-?, se determina y se compara con la actividad del promotor P2X-? que comprende T en la posición 1002, y se identifica un agente antitrombótico como un compuesto de ensayo que invierte el efecto de C en la posición 1002 sobre la actividad del promotor P2X-?. Preferiblemente, el agente antitrombótico identificado de esta manera puede utilizarse para la prevención o la terapia de PVD. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para la fabricación de un medicamento que comprende al menos un agente antitrombótico para la profilaxis o tratamiento de una enfermedad trombótica, preferiblemente de PVD, de accidentes cerebrovasculares, en particular TÍA o PRIND, y/o del infarto de miocardio, preferiblemente del infarto de miocardio prematuro, en el que el agente antitrombótico se detecta utilizando los variantes del promotor P2X? de la invención, preferiblemente en el que el agente antitrombótico se detecta en el método de la invención para seleccionar un agente antitrombótico. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para identificar un agente antitrombótico que puede utilizarse para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, que comprende las etapas de: (a) identificar un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, utilizando el método de la presente invención para identificar un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, y (b) identificar un agente antitrombótico para el tratamiento de dicho indiviuo, utilizando el método de la invención para seleccionar un agente antitrombótico. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico, que comprende las etapas de: (a) identificar un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, utilizando el método de la presente invención para identificar un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, (b) identificar un agente antitrombótico para el tratamiento de dicho individuo, utilizando el método de la presente invención para seleccionar un agente antitrombótico, y (c) seleccionar una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz de dicho agente antitrombótico para dicho individuo. Además, la invención se refiere a cualquier otro uso de los variantes del promotor P2X? de la invención, en el que se diagnostican enfermedades trombóticas o su predisposición, o se proporcionan tratamientos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los variantes del promotor P2X? de la invención para el desarrollo de un método o sistema de ensayo para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombófica, un método o sistema de ensayo para seleccionar un agente antitrombótico, un método o sistema de ensayo para identificar un individuo que puede tratarse con un agente antitrombótico, o un método o sistema de ensayo para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico. A continuación, la ¡nvención se describe con más detalle haciendo referencia a las secuencias de aminoácidos, las secuencias de ácidos nucleicos y los ejemplos. Sin embargo no se pretende limitar la invención por los detalles de los ejemplos. En lugar de esto, la invención se refiere a cualquier modalidad que comprende detalles que no se mencionan de forma explícita en los ejemplos de la presente, pero que un experto en la técnica descubrirá sin mucho esfuerzo. Descripción de las secuencias La SEQ ID NO:1 comprende la secuencia de ADN del promotor P2X? disponible con el n° de registro AF177472 de la base de datos de nucleótidos NCBI. La SEQ ID NO:2 comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína P2X? disponible con el n° de registro S71927 en la base de datos de proteínas NCBI. La SEQ ID NO:3 comprende la secuencia de un primer oligonucleótido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:3 se corresponde con la posición 62490-62507 de la secuencia de NCBI AC005940.3. La SEQ ID NO:4 comprende la secuencia de un segundo oligonucleótido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304 de SEQ ID NO:1, que está colocada en la dirección 3' con relación a SEQ ID NO:3 sobre la cadena complementaria. La SEQ ID NO:4 es la hebra antisentido a la posición 472-289 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:5 comprende la secuencia de un primer oligonucleófido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:5 se corresponde con la posición 618-635 en SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:6 comprende la secuencia de un segundo oligonucleótido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764 de SEQ ID NO:1, que está colocada en la dirección 3' con relación a SEQ ID NO:5 sobre la cadena complementaria. La SEQ ID NO:6 es la hebra antisentido a la posición 775-784 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:7 comprende la secuencia de un primer oligonucleótido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:7 se corresponde con la posición 818-837 en SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:8 comprende la secuencia de un segundo oligonucleótido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838 de SEQ ID NO:1, que está colocada en la dirección 3' con relación a SEQ ID NO:7 sobre la cadena complementaria. La SEQ ID NO:8 es la hebra antisentido a la posición 1003-1022 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:9 comprende la secuencia de un primer oligonucleótido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:9 se corresponde con la posición 818-837 en SEQ ID NO:1. La SEQ ID NO:10 comprende la secuencia de un segundo oligonucleófido para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 1002 de SEQ ID NO:1, que está colocada en la dirección 3' con relación a SEQ ID NO:9 sobre la cadena complementaria. La SEQ ID NO: 10 es la hebra antisentido a la posición 1003-1022 de SEQ ID NO:1. Descripción de las eiemplos Abreviaturas utilizadas para los variantes del promotor P?X^ Se utilizan la siguientes abreviaturas, en las que las posiciones indicadas se refieren a las posiciones de los nucleótidos en SEQ ID NO:1: P2X? C304C se refiere a un grupo de personas que portan una cifidina (C) en la posición 304 sobre ambos alelos del gen P2X-|. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X?- P2X1 C304T se refiere a un grupo de personas que portan una citidina (C) en la posición 304 en un alelo del gen P2X?, y una timidina (T) en la posición 304 en el otro alelo del gen P2X-?. Estas personas son heterocigóticas para este variante de P2X?. P2X1 T304T se refiere a un grupo de personas que portan una timidina (T) en la posición 304 sobre ambos alelos del gen P2X?. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X?- P2X1 G764G se refiere a un grupo de personas que portan una guanosina (G) en la posición 764 sobre ambos alelos del gen P2X-|. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X?. P2X? C764G se refiere a un grupo de personas que portan una citidina (C) en la posición 764 en un alelo del gen P2X?, y que portan una guanosina (G) en la posición 764 en el otro alelo del gen P2X-?. Estas personas son heterocigóticas para este variante de P2X-?. P2X? C764C se refiere a un grupo de personas que portan una cifidina (C) en la posición 764 sobre ambos alelos del gen P2X?. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X-?. P2X? T838T se refiere a un grupo de personas que portan una timidina (T) en la posición 838 sobre ambos alelos del gen P2X?. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X-|. P2X? T838G se refiere a un grupo de personas que portan una timidina (T) en la posición 838 en un alelo del gen P2X?, y una guanosina (G) en la posición 838 en el otro alelo del gen P2X-?. Estas personas son heterocigóticas para este variante de P2X?. P2X? G838G se refiere a un grupo de personas que portan una guanosina (G) en la posición 838 sobre ambos alelos del gen P2X-|. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X-?. P2X? T1002T se refiere a un grupo de personas que portan una timidina (T) en la posición 1002 sobre ambos alelos del gen P2X?. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X?. P2X? T1002C se refiere a un grupo de personas que portan una timidina (T) en la posición 1002 en un alelo del gen P2X-?, y una citidina (C) en la posición 1002 en el otro alelo del gen P2X?. Estas personas son heterocigóticas para este variante de P2X-?. P2X? C1200C se refiere a un grupo de personas que portan una citidina (C) en la posición 1002 sobre ambos alelos del gen P2X?. Estas personas son homocigóticas para este variante de P2X-?. Los cuatro polimorfismos de un nucleótido (SNP) identificados en las regiones del promotor P2X? se investigaron en un grupo de 1404 pacientes para determinar la asociación de estas variaciones genéticas con los síntomas clínicos de estos pacientes. Detección de polimorfismos de un nucleótido (SNP) mediante análisis de la secuencia de ADN Se amplificaron regiones genómicas dentro del promotor del gen P2X? ufilizando los siguientes cebadores de oligonucleótidos: 1. Para la detección de la variación del nucleótido de C a T en la posición 304 en la secuencia del promotor P2X? se utilizaron los siguientes cebadores, que se derivan de la secuencia AC005940.3: AC005940.3 es el número de una secuencia depositada en la base de datos NCBI de un clon genómico, que comprende las secuencias cadena arriba del promotor P2X-?. Basándose en esta secuencia es posible diseñar un oligonucleótido que puede utilizarse para la amplificación de esa región, que permite la identificación de los variantes del promotor P2X? en la posición 304. Por contraste, AF177472.1 es el número de la secuencia del gen P2X-? que se ha depositado en la base de datos NCBI y que comprende la región del promotor y partes de la región codificadora.

'-GAAAAGCCCATGACACCC-3' 5'-CAACACGGGACAGAGAAC-3' 2. Para la detección de la variación del nucleótido de G a C en la posición 764 en la secuencia del promotor P2X? se utilizaron los siguientes cebadores, que se derivan de SEQ ID NO:1: '-GATGTGGTGCTGGTCTTG-3' 5'-GCTGGCATCTCTATCCCCCA-3' 3. Para la detección de la variación del nucleótido de T a G en la posición 838 en la secuencia del promotor P2X? se utilizaron los siguientes cebadores, que se derivan de SEQ ID NO:1: '-GGAACTCAGAGCCTCCTTCC-3' 5'-GGCAAGATGGAGCTCTGGCC-3' 4. Para la detección de la variación del nucleótido de T a C en la posición 1002 en la secuencia del promotor P2X? se utilizaron los siguientes cebadores, que se derivan de SEQ ID NO:1: '-GGAACTCAGAGCCTCCTTCC-3' 5'-GGCAAGATGGAGCTCTGGCC-3' Las regiones genómicas se amplificaron utilizando los cebadores de oligonucleótidos identificados anteriormente en el protocolo PCR indicadao a continuación. Los reactivos utilizados son de Applied Biosystems (Foster City, EEUU): 20 ng de ADN genómico; 1 unidad de TaqGold ADN polimerasa; 1 x tampón Taq polimerasa; 500 µM de dNTP; MgCI22,5 mM; 200 nM de cada par de cebadores de amplificación (secuencia de 1. y 2.); H2O hasta 5 µl.

Programa de amplificación por PCR para hallar el genotipo 1 ciclo comprende: 95°C durante 10 min; seguido de 2 ciclos, comprendiendo cada uno: 95°C durante 30 seg, seguido de 70°C durante 30 seg; seguido de 2 ciclos, comprendiendo cada uno: 95°C durante 30 seg, seguido de 65° C durante 30 seg; seguido de 2 ciclos, comprendiendo cada uno: 95°C durante 30 seg, seguido de 60°C durante 30 seg; seguido de 40 ciclos, comprendiendo cada uno: 95°C durante 30 seg, seguido de 56°C durante 30 seg, seguido de 72°C durante 30 seg; seguido de 1 ciclo que comprende: 72°C durante 10 min, seguido de 4°C durante 30 seg.

Programa de amplificación por PCR para la secuenciación 1 ciclo comprende: 96°C durante 2 min; seguido de 30 ciclos, comprendiendo cada uno: 96°C durante 10 seg, seguido de 55°C durante 10 seg, seguido de 65°C durante 4 min; seguido de 1 ciclo que comprende: 72°C durante 7 min, seguido de 4°C durante 30 seg.

Análisis de los productos de la secuenciación: Las secuencias se analizaron en primer lugar utilizando el programa informático Sequence Analysis Software (Applied Biosystems, Foster City, EEUU) para obtener los datos brutos. Los datos brutos se procesaron con Phred, Phrap, Polyphred y Consed. Phred, Phrap, Polyphred y Consed son programas informáticos desarrollados por Phil Green de Washington University (http://www.genome.washington.edu). Ejemplo: Resultados obtenidos con un grupo de 1404 pacientes La tabla 1 indica las características del grupo de pacientes en los que se analizaron los variantes genéticos en las posiciones 304, 764, 838 y 1002 de SEQ ID NO:1 en la región del promotor de P2XL Tab. 1 * Medianas y quartiles (Q1 - Q3) La tabla 2 indica la distribución de los variantes de P2X? en el grupo analizado de pacientes haciendo referencia a las posiciones indicadas según SEQ ID NO:1 en la región del promotor P2X-?.

Tab. 2 La tabla 3 indica la asociación de los variantes de P2X? indicados según SEQ ID NO:1 con los puntos finales clínicos en el grupo analizado de pacientes. El número de pacientes en los que se obsersevó el punto final clínico indicado se ofrece en porcentaje.

Tab. 3 En el grupo analizado de pacientes se observó un riesgo mayor de PVD, dependiendo de la presencia y número de alelos que comprenden una T en la posición 304 o, respecfivamente, la presencia y el número de alelos que comprenden C en la posición 764 en el promotor del gen P2X?. Además, se observó un riesgo menor de accidentes cerebrovasculares/PRIND/TIA en pacientes que portan P2X? T304T o P2X-? C764C. Un riesgo mayor de la aparición de un infarto de miocardio prematuro (definido como infarto de miocardio en mujeres < 55 años y hombres < 60 años) depende de la presencia y el número de alelos que comprenden una T en la posición 838 en el promotor del gen P2X?. Además, un riesgo mayor de la aparición de PVD depende de la presencia y el número de alelos que comprenden una C en la posición 1002 en el promotor del gen P2X-?. Basándose en estos análisis de asociación se puede concluir que las variaciones genéticas en la región promotora del gen P2X? fienen un impacto importante sobre la aparición y la frecuencia de enfermedades cardiovasculares y trombóticas.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método de diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, que comprende: (a) determinar la secuencia de al menos un alelo del promotor P2X? al menos en una de las posiciones 304, 764, 838 ó 1002 de SEQ ID NO: 1, y/o (b) determinar la cantidad de la proteína P2X-?, en una muestra de tejido de un individuo.

2.- El método según la reivindicación 1 , en el que una T en la posición 304 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD).

3.- El método según la reivindicación 1, en el que una C en la posición 764 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD).

4.- El método según la reivindicación 1 , en el que una T en la posición 304 sobre ambos aleios, o una C en la posición 764 sobre ambos alelos es indicativa de un riesgo menor de accidentes cerebrovasculares, en particular de ataque isquémico transitorio (TÍA) o déficit neurológico isquémico reversible prolongado (PRIND).

5.- El método según la reivindicación 1 , en el que una C en la posición 304, o una G en la posición 764 es indicativa de un riesgo mayor de accidentes cerebrovasculares.

6.- El método según la reivindicación 1 , en el que una T en la posición 838 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de infarto de miocardio prematuro. 7 - El método según la reivindicación 1 , en el que una C en la posición 1002 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD). 8.- El método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la secuencia del promotor P2X? se determina en dos, tres o todas las posiciones 304, 764, 838 ó 1002. 9.- El método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la secuencia se determina mediante secuenciación de ADN según Sanger, y/o mediante amplificación por PCR de un fragmento del promotor P2X? que comprende al menos una de las posiciones 304, 764, 838 ó 1002, en particular en un análisis TaqMan PCR. 10.- El método según la reivindicación 9, en el que al menos un oligonucleófido que comprende la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 se utiliza para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304 de SEQ ID NO:1, al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 se utiliza para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764 de SEQ ID NO:1 , al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 se utiliza para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838 de SEQ ID NO:1, y/o al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 se utiliza para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. 11.- El método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende pirosecuenciación, secuenciación de ADN con la ayuda de espectroscopia de masas, una hibridación de micromatriz de ADN, o un análisis de la transferencia Southern. 12.- Ei método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que una cantidad alterada de la proteína P2XÍ es indicativa de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. 13.- El método según la reivindicación 1 ó 12, en el que un antisuero anti-P2X?, un aníicuerpo anti-P2X? o un fragmento de anticuerpo anti- P2X? se utiliza para determinar la cantidad de la proteína P2X?, en particular en un análisis de la transferencia Western o en un análisis ELISA. 14.- El método según la reivindicación 1 ó 12, en el que la cantidad de ARNm de P2X? se determina y es indicativa de la cantidad de la proteína P2X?. 15.- El método según la reivindicación 14, en el que la cantidad de moléculas de ARNm se determina mediante un análisis de la transferencia Northern, mediante un análisis PCR que comprende una etapa inicial de transcribir de forma inversa la molécula de ARNm, mediante un análisis de presentación diferencial, o mediante un análisis de la diferencia representacional. 16.- El método según la reivindicación 1 ó 12, en el que la actividad de la proteína P2X? se determina y es indicativa de la cantidad de la proteína P2X-?. 1

7.- El método según la reivindicación 16, en el que la actividad de la proteína P2X? se determina en una célula humana o animal. 1

8.- Un sistema de ensayo que comprende al menos una sonda de ácido nucleico u oligonucleótido que permite la determinación de la secuencia del promotor P2X? en la posición 304, la secuencia en la posición 764, la secuencia en la posición 838, o la secuencia en la posición 1002 de SEQ ID NO:1 en una muestra de tejido obtenida de un individuo. 1

9.- El sistema de ensayo según la reivindicación 18 que comprende al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 304 de SEQ ID NO:1, al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 764 de SEQ ID NO:1 , al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8 para determinar la secuencia del promotor P2X? en la posición 838 de SEQ ID NO:1 , y/o al menos un oligonucleótido que comprende la SEQ ID NO:9 o SEQ ID NO:10 para determinar la secuencia del promotor P2X1 en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. 20.- El uso del sistema de ensayo según la reivindicación 18 ó 19 para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. 21.- El uso según la reivindicación 20, en el que una T en la posición 304 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD). 22.- El uso según la reivindicación 20, en el que una C en la posición 764 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD). 23.- El uso según la reivindicación 20, en el que una T en la posición 304 sobre ambos alelos, o una C en la posición 764 sobre ambos alelos es indicativa de un riesgo menor de accidentes cerebrovasculares, en particular de ataque isquémico transitorio (TÍA) o déficit neurológico isquémico reversible prolongado (PRIND). 24.- El uso según la reivindicación 20, en el que una C en la posición 304, o una G en la posición 764 es indicativa de un riesgo mayor de accidentes cerebrovasculares. 25.- El uso según la reivindicación 20, en el que una T en la posición 838 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de infarto de miocardio prematuro. 26.- El uso según la reivindicación 20, en el que una C en la posición 1002 sobre al menos un alelo, preferiblemente sobre ambos alelos, es indicativa de un riesgo mayor de enfermedad vascular periférica (PVD). 27.- Un sistema de ensayo que comprende al menos un antisuero anti-P2X-?, un anticuerpo anti-P2X?, o un fragmento de anticuerpo anti-P2X? para determinar la canfidad de la proteína P2X-? en una muestra de tejido obtenida de un individuo. 28.- El uso del sistema de ensayo según la reivindicación 27 para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica. 29.- El uso según la reivindicación 28, en el que una cantidad alterada de la proteína P2X? es indicativa de un individuo que puede tratarse profiláctica o terapéuticamente con un agente antitrombótico. 30.- Un variante del promotor P2X? que comprende al menos una de T o C en la posición 304, C o G en la posición 764, T en la posición 838, y/o C en la posición 1002 de SEQ ID NO:1. 31.- Un sistema de ensayo que comprende el variante del promotor P2X? según la reivindicación 30, en el que el variante del promotor dirige la síntesis de un producto detectable. 32.- El uso del sistema de ensayo según la reivindicación 31 para la selección de un agente antitrombótico. 33.- Un método de selección de un agente antitrombótico, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar un variante del promotor P2X? según la reivindicación 30, (b) poner en contacto el variante de! promotor P2X1 con un compuesto de ensayo, y (c) determinar la actividad del variante del promotor P2X-?. 34.- El método según la reivindicación 33 ó 34 que está adaptado a una selección de alta transferencia de compuestos de ensayo. 35.- Un método para identificar un agente antitrombótico que puede utilizarse para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, que comprende las etapas de: (a) identificar un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, utilizando el método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 17, y (b) identificar un agente antitrombótico para el íratamiento de dicho individuo, utilizando el método según al menos una de las reivindicaciones 33 ó 34. 36.- Un método para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico, que comprende las etapas de: (a) identificar un individuo que tiene una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, utilizando el método según al menos una de las reivindicaciones 1 a 17, (b) identificar un agente antitrombótico para el tratamiento de dicho individuo, utilizando el método según al menos una de las reivindicaciones 33 ó 34, y (c) seleccionar una dosis terapéutica o profilácticamente eficaz de dicho agente antitrombótico para dicho individuo. 37.- El uso del variante del promotor P2X? según la reivindicación 30 para el desarrollo de un método o sistema de ensayo para el diagnóstico de una predisposición para desarrollar una enfermedad trombótica, un método o sistema de ensayo para seleccionar un agente antitrombótico, un método o sistema de ensayo para identificar un individuo que puede tratarse con un agente antitrombótico, o un método o sistema de ensayo para adaptar una dosis terapéutica o profiláctica de un agente antitrombótico.