MXPA06003571A - Clasificacion aumatica de muestras citologicas. - Google Patents
Clasificacion aumatica de muestras citologicas.Info
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Abstract
Se provee un metodo automatico para clasificar una muestra citologica. El metodo consiste en examinar la muestra con una o mas longitudes de onda luminosas para obtener un resultado y luego fijar uno o mas senuelos a la muestra en base a si el resultado cumple con un criterio dado. El metodo permite la retroalimentacion rapida de las caracteristicas de la muestra, permitiendo la designacion automatica de la muestra como positiva para una caracteristica dada, y permitiendo tomar las decisiones de remedio inmediatas si la muestra no cumple con los criterios.
Description
CLASIFICACION AUTOMATI CA DE MUESTRAS C1TOLOG1CAS
CAMPO TECNICO Esta invención se refiere a métodos automáticos para clasificar muestras citológicas. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las técnicas de diagnóstico modernas han proporcionado herramientas altamente sensibles capaces de una capacidad de información y rendimiento sin precedentes. Muchas técnicas tales como el método de teñido de Papanicolau, se han adaptado muy bien a los procesos automatizados, que han mejorado aún más su consistencia y confiabilidad. Sin embargo, las técnicas de diagnóstico aún sufren de las limitaciones del ayer en la recolección de muestras y el cumplimiento del paciente. Los procesos de toma de muestras en especial aquellos que son difíciles, altamente invasivos y/o dolorosos, frecuentemente dan como resultados especímenes inadecuados. Típicamente existe un retraso de tiempo entre la obtención de la muestra y el momento en el cual se determina la adecuación de la muestra, tiempo durante el cual el paciente permanece en el lugar de la toma de muestras. Después de determinar que la muestra es inadecuada, el paciente tiene que someterse a la inconveniencia adicional de dolor y recuperación de un segundo procedimiento de toma de muestras. Esto frecuentemente conduce a citas para volver a tomar muestras a las cuales los pacientes no acuden. El peligro de esto es agudo en especial en el caso de pacientes jóvenes que tienen importantes barrearas para someterse a los tratamientos médicos. Frecuentemente esos pacientes jóvenes son los que están más propensos a ser expuestos a enfermedades transmitidas sexualmente, sin embargo son los que menos posibilidades tienen de regresar si su muestra original prueba ser inadecuada. De hecho puede ser difícil o imposible el hacer contacto con los pacientes quienes fueron examinados de una forma anónima o confidencial. SUMARIO DE LA INVENCION Se provee un método automático para clasificar muestras citológicas. El método consiste en estudiar la muestra con una o más longitudes de onda luminosas para obtener un resultado y luego fijar uno o más señuelos a la muestra en base a si el resultado cumple con un criterio dado. El método permite la retroalimentación rápida de las características de la muestra, permitiendo la designación automática de la muestra como positiva para una característica dada, y permitiendo tomar las acciones de remedio inmediatas si la muestra no cumple con los criterios. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se provee un método automático para clasificar una muestra citológica. El método consiste en examinar la muestra con cuando menos una longitud de onda luminosa para obtener un resultado que indique una característica de la muestra. Ese resultado se compara con un criterio adecuado para distinguir muestras que cumplen con un criterio dado. Un señuelo entonces se fija a la muestra indicando si cumple o no con el criterio. El sistema de designación automático permite la determinación rápida de la adecuación de la muestra para un ensayo en particular. El método puede ser usad en conjunto con método de base molecular para examinar la muestra en búsqueda de moléculas biológicas particulares. Antes de que la invención se descrita a mayor detalle, debe entenderse que esta invención no debe limitarse a la metodología, las soluciones o los aparatos descritos particularmente, ya que esos métodos, solucione so aparatos, puede variar obviamente. También debe entenderse que la terminología aquí descrita tiene el propósito de describir modalidades particulares únicamente y no se pretende que limite el alcance de la invención. El uso de las formas en singular tales como "un", "una", "el" etc. , incluyen referencias al plural a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Así por ejemplo la referencia a un "señuelo2 incluye una pluralidad de desifgnadores, la referencia a una "longitud de onda" incluye una pluralidad de longitudes de onda, la referencia a "un objetivo" incluye una pluralidad de objetivos, y similares. Adicionalmente el uso de referencias especificas al plural tal como "dos", "tres", etc., incluyen números mayores del mismo objeto a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Los términos tales como "conectado", "unido" y "asociado", se usan aquí de forma intercambiable e incluyen tanto la conexión indirecta, la unión, la asociación o conjugación a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cuando se indiquen un rango de valores, debe entenderse que cada valor entero, y cada fracción del mismo entre los límites superiores e inferiores del rango también se describen específicamente, junto con cada subrango entre esos valores. Los límites superior e inferior de cualquier rango pueden incluirse o excluirse independientemente del rango, y cada rango sea que no se incluya o se incluyan los limites también está incluido en la invención. Cuando un valor descrito tenga limites inherentes por ejemplo un componente puede estar presenta a una concentración de 0 a 100%, en cuando el pH de la solución acuosa pueda encontrarse en el rango de 1 a 14, se describen aquellos límites inherentes de forma especifica. Cuando un valor se indica explícitamente, debe entenderse que los valores que los valores de aproximadamente la misma cantidad también están dentro del alcance de la invención, como los rangos que se basan en ellos. Cuando se describe una combinación, cada subcombinación de elementos de esa combinación también se describen específicamente y se encuentran dentro del alcance de la invención. Contrariamente cuando se describen elementos diferentes, Cuando se describa que un elemento de la invención tiene una pluralidad de alternativas, también se describen ejemplos de la invención en los cuales cada alternativa se excluye individualmente o en combinación con las otras alternativas; mas de un elemento de la invención puede tener esas exclusiones, y todas las combinaciones de elementos que tienen esas exclusiones se describen aquí. A menos que se definan de otra forma o el contexto claramente determine lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado normalmente entendido por alguien con experiencia ordinaria en la técnica a la cual se refiere la invención. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí pueden usarse al poner en práctica o examinar la invención, ahora se describen los métodos y los materiales. Los términos "polinucleótidos", "oligonucleótidos, "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se usan de manera intercambiable para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, y pueden incluir ribonucleotidos, desoxiribunuclotidos, sus análogos o sus mezclas. Esos términos se refieren solo a la estructura primaria de la molécula. Así el término incluye ácido desoxiribonucléico de tira triple, doble y sencilla ("ADN"), así como ácido ribonucléico de tira triple, doble y sencilla ("ARN"). También incluye formas del oiinucleótido modificadas por ejemplo por medio de alquilación y/o por medio de recubrimiento, y formas no modificadas. Las condiciones de hibridización adecuadas para un formato de ensayo dado pueden ser determinadas por alguien experto en la técnica; los parámetros no limitantes que pueden ser ajustados incluyen concentraciones de los componentes del ensayo, pH, sales usadas y sus concentraciones, fuerza iónica, temperatura, etc. Más particularmente, los términos, "polinucleótidos", "oligonucleótidos", "ácido nucleico", y "molécula de ácido nucleico", incluyen polidesoxiribonucleotidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa), incluyendo tARN, rARB, hARN, y mARN., ya sea que estén divididos o no divididos, cualquier otro tipo de polinucleótido que sea el glucósido N o C de una base de purina o pirimidina, y otros polímeros que contienen fundamentos alternativos, incluyendo ácido nucleico de péptido (PNA), y otros polímeros de ácidos nucleicos de secuencia específica sintéticos, con la condición de que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permite la formación de pares de bases y de apilamientos de bases, tales como los que se encuentran en el ADN y ARN. No se pretende una distinción en longitud entre los términos "Polinucleótido", "oligonucleotido", "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" y los términos se usan aquí de forma intercambiable. Esos términos se refieren únicamente a la estructura primaria de la molécula. Así esos términos incluyen por ejemplo 3'-desox¡- 2',50-ADN, oligodesoxiribonucleótido N3'P5'fosforamidatos, ARN substituidos 2'-0-alquilo y sus híbridos incluyendo por ejemplo híbridos entre ADSn y/o ARN y/o APN y/o otras formas, y también incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas, alquilación, "tapas", substitución de uno o más de los nucleótidos con un análogo, modificaciones internucleotidos, tales como por ejemplo aquellos con enlaces cargados negativamente (por ejemplo fosforotloatos, fosforoditioatos, etc.) , aquellos que contengan porciones pendientes, tales como por ejemplo proteínas (incluyendo enzimas (por ejemplo nucleasas), toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo acridina, psoralen, etc.) aquellos que contengan quelatos (de por ejemplo metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc. ), aquellos que contengan alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) así como formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleotido. Se apreciara que como se usa aquí, los términos "nucleosido" y "nucleótido", incluirán aquellas partes que no solo contengan las bases conocidas de purina y pirimidina, sino también otras bases heterocíclicas que hayan sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas purinas o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Los nucleosidos o nucleótidos modificados también pueden incluir modificaciones en la porción de azúcar, por ejemplo cuando uno o varios de los grupos hidroxilo son reemplazados con halógeno, grupos alifáticos, o son funcionalizados como éteres, aminas o similares. El términos "unidad nuclootídica" se pretende que abarque los nucleosidos y nucleótidos. Además las modificaciones a las unidades nucleótidicas incluyen el arreglo, anexión, substitución o alternación de otro tipo de los grupos funcionales en la base de purina o pirimidina que forma los enlaces de hidrógeno a una pirimidina o purina complementaria respectiva. La unidad nucleotidica modificada resultante puede opcionalmente formar un par de bases con otras unidades nucieotidas modificadas pero no con los sitios abásicos A, T,C,G, o U. Pueden incorporarse aquellos sitios abásicos que no prevengan el funcionamiento leí polinucleótido; preferentemente el polinucleótidono contiene sitios abásicos. Algunos o todos los residuos en el polinucleótido pueden opcionalmente ser modificados en una o varias formas. "Complementario" o "substancialmente complementario" se refiere a la capacidad de hibridizar un par de bases entre los nucleótidos o ácidos nucléicos, tales como por ejemplo entre un ácido nucleico de péptido sensor y un polinucleótido objetivo. Los nucleótidos complementarios son en general A y T (o A y U) o C y G. Dos polinucleotidos de tira sencilla o APN se dice que son substancialmente complementarios cuando las bases de una tira, óptimamente alineadas y comparadas y con las inserciones o delecciones adecuadas, hacen pares con cuando menos aproximadamente 80% de las bases de la otra tira, cuando menos aproximadamente 90% a 95%, y más preferentemente de aproximadamente 98 a 100%, Alternativamente, existe una complementariedad sustancial cuando un polinucleótido o APN se hibridiza bajo condiciones de hibridización selectivas a su complemento. Típicamente, la hibridización selectiva ocurrirá cuando existe aproximadamente un 65% de complementariedad durante un tramo de cuando menos 14 a 25 bases, preferentemente, cuando menos una complementariedad de aproximadamente 75%, más preferentemente cuando menos 90% de complementariedad. Ver Kanehisa Nucleic Acids Res. 12:203 (1984). El "enlace preferencial" o la "hibridización preferencial" se refiere a una mayor propensión de un polinucleótido o APN a ligarse a su complemento en una muestra en comparación con un polímero no complementario en la muestra. Las condiciones de hibridización típicamente incluirán concentraciones salinas menores a aproximadamente 1 , más generalmente menos de aproximadamente 500 mM y preferentemente menos de aproximadamente 200 mM. En los casos de hibridización entre un ácido nucleico de peptido u otro ácido nucleico similar y un polinucleótido, la hibridización puede realizarse en soluciones que contenga poca o nula sal. Las temperaturas de hibridización pueden ser de hasta 5o C, pero típicamente son mayores a 22° C, más típicamente son mayores a aproximadamente 30° C, y preferentemente mayores a aproximadamente 37° C. Los fragmentos mayores requieren mayores temperaturas de hibridización, para la hibridización específica. Otros factores pueden afectar la estringencia de la hibridización, incluyendo la composición de las bases y la longitud de las tiras complementarias, la presencia de los solventes orgánicos y la extensión del desajuste entre las bases, y la combinación de los parámetros usados es más importante que la medición absoluta de uno solo. Otras condiciones de hibridización que pueden ser controladas incluyen el tipo de amortiguador y la concentración, el pH de la solución, la presencia y la concentración de los reactivos de bloqueo para reducir el ligado base tal como secuencias repetidas o soluciones de proteínas bloqueantes, los tipos y concentraciones de los detergentes, moléculas tales como polímeros que aumentan la concentración relativa de los polinucléotidos, iones metálicos y sus concentraciones, quelantes y sus concentraciones y otras condiciones conocidas en la técnica. El término "aptmero" (o "anticuerpo de ácido nucleico") e usa aquí para referirse a polinucléotidos de tiras sencillas o dobles que reconocen y se ligan con una molécula objetivo deseada en virtud de su forma. Por ejemplo, las publicaciones PCT nos. W092/14843 W091 /19813 y WO 92/045295. "Polipéptido" y "proteínas" se usan aquí de forma intercambiable incluyen una cadena molecular de aminoácidos unidos a través de enlaces de péptidos. Los términos no se refieren a una longitud específica del producto. Así los "péptidos", "oligopéptidos", y "proteínas" se incluyen dentro de la definición de polipéptidos. Los términos incluyen polipéptidos que contienen modificaciones [post-translacionales] del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y sulfataciones. Además, los fragmentos de proteína, análogos (incluyendo aminoácido son codificados por el código genético, por ejemplo homocisteina, ornitina, D-aminoácidos, y creatina), mutantes naturales o artificiales o sus variantes o combinaciones, proteínas de fusión, residuos derivados (por ejemplo alquilación de los grupos amina, acetilaciones, o esterificaciones de grupos carboxilo) y similares se incluyen dentro del significado del polipéptido. Como se usa aquí el término "par ligante" se refiere a moléculas primera y segunda que se ligan específicamente entre sí con mayor afinidad que a otros componentes en la muestra. El enlace entre los miembros del par de enlace típicamente en no covalente. Los pares de enlace ejemplares incluyen partes de enlace inmunologicas (por ejemplo cualquier compuesto hapténico o antigénico en combinación con un anticuerpo correpsondiente o porción ligante o fracción del mismo, por ejemplo digoxigenina y anti-digoxifgenina, fluoresceina y anti-fluoresceina, dinitrofenol y anti-dinitrofenol, bromodesoxiuridina y anti-bromodesoxiurdina, inmunoglobulina de ratón y inmunoglobulina anti-ratón de cabra) y partes ligantes no inmunologicas (por ejemplo biotina-avidina, biotina-estrepatavidina, proteína ligante hormona-hormona (por ejemplo ritoxina y cortisol) agonista o antagonista receptor-receptor (por ejemplo acetilcolina receptora de acetilcolina o un análogo del mismo), proteína IgG A, un carbohidrato de lecitina, cofactor enzima-enzima, inhibidor enzima-enzima, y pares de polinucleótidos complementarios capaces de formar dúplex de ácido nucleico) y similares. Uno o ambos miembros de los pares ligantes pueden conjugarse a moléculas adicionales. El término "anticuerpo" como se usa aquí incluyen anticuerpos obtenidos de preparaciones tanto policlonales como monoclonales, así como moléculas de anticuerpos híbridos (quiméricos) ver por Winter et al. (1991 ), Nature 349-293-299, y la patente norteamericana no. 4,816,567); fragmentos F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímero no covalentes, ver por ejemplo Ibar et al. (1972) Proc Nati Acad. Sci USA 69:2659-2662); y Ehrlich et al (1980) Biochem 19:4091 -4096); moléculas Fv de cadena simple (sFV) (ver por ejemplo Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883); construcciones de fragmentos diméricos y triméricos; minicuerpos (ver por ejemplo Pack et al. (1992) Biochem 321 : 1579-1584; Cumber et al. 81992) J. Immunology 149B: 120-126); moléculas humanizadas de anticuerpos (ver por ejemplo Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan et. al (1988) Science 239:1534-1536; y la publicación de la patente británica no. GB 2,276, 169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualquier fragmento funcional obtenido de esas moléculas, manteniendo esos fragmentos las propiedades ligantes especificas de la molécula madre de anticuerpo. Como se usa aquí el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población homogénea de anticuerpos. El término no está limitado con respecto a la especie o la fuente del anticuerpo, ni se pretenda quede limitada por la forma en la que es realizada. Así el término incluye anticuerpos obtenidos de hibridomas de murina, así como anticuerpos monoclonales humanos obtenidos usando hibridomas humanos o de hibridomas de murina hechos de genes de cadenas de inmunoglobulina humana de expresión de ratón o porciones de los mimos. Ver por ejemplo Cote et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, 1 985, pág. 77. "Multiplexar" aquí se refiere a un ensayo y otro médico analítico en el cual pueden estudiarse simultáneamente múltiples analitos. "Opcional" u "Opcionalmente" significa que el evento o la circunstancia descrita subsecuentemente puede o no ocurrir, y uqe la descripción incluye casos en los cuales el evento o la circunstancia ocurren y casos en los que no. EL método automático de clasificación de muestras puede realizarse en una muestra citoiógica que puede ser obtenida de cualquier forma. Técnicas adecuadas son conocidas en la técnica. La muestra puede ser cualquier fuente de material biológico que pueda ser obtenido de un organismo vivo directa o indirectamente incluyendo células, tejido o fluido. Ejemplos no limitantes de la muestra incluyen sangre, orina, semen, leche, flema, mucosidad, liquido de la pleura, fluido pélvico, fluido sinovia!, fluido de ascitis, lavados de la cavidad corporal, cepillado ocular, raspado cutáneo, frotis bucal, frotis vaginal, frotis de papanicolaou, frotis rectal, un aspirado, una biopsia con aguja, una sección de tejido obtenida por ejemplo por medio de cirugía o autopsia, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, secreciones externas de la piel, del tracto respiratorio, intestinal y genitouranio, lágrimas, saliva, tumores, órganos, un cultivo microbiano, un virus, y muestras de constituyentes del cultivo celular in vitro.
La muestra puede ser recolectada o colocada en una solución usada para la citología en base a líquidos o un medio que rompa las células y disuelve una porción o todos los componentes moleculares en una solución. En una modalidad la muestra puede contener una solución conservadora tal como la solución PreservCyt® (Cytyc corp): La muestra puede contener una solución conservadora adecuada para conservar las células y los tejidos a las temperaturas ambientes. La solución puede contener un alcohol y preferentemente un amortiguador, y puede usarse para la conservación in vitro de células mam íferas a temperaturas ambientes después de una biopsia, y antes del teñido u otra forma de análisis. La solución puede hacerse tal como se describe en la patente norteamericana no. 5,256,571 de Hurley et al., publicada el 26 de octubre de 1993. La solución de conservación puede contener un alcohol miscible con agua y preferentemente un agente anti-aglomerante y un agente amortiguante. El constituyente de alcohol está presente en una cantidad suficiente para fijar células o tejidos de muestras mientras que aún permite un enlace aceptable del sensor a su objetivo. El alcohol típicamente es un alcohol alquilo inferior (con de 1 a 6 átomos de carbono), y puede ser un alcohol con de 1 a 4 átomos de carbono y puede seleccionarse del grupo consistente de metanol, etanol e isopropanol. El alcohol puede estar presente en una cantidad mayor a aproximadamente 4% y menos a aproximadamente 60% y puede ser de aproximadamente 45% o más, y aproximadamente 55% o menos. En otra variación, el alcohol está presente en una cantidad de cuando menos aproximadamente 20 por ciento en solución. El agente anti-aglomerante puede estar presente en una cantidad suficiente para prevenir que las células se aglomeren en la solución. Cualquier agente anti-aglomerante efectivo en la solución de conservación alcohólica puede usarse y puede ser por ejemplo un agente quelante seleccionado por ejemplo del grupo consistente en ácido etilenodiaminotetraácetico (EDTA) y sus sales, tales como sales disódicas, tripotásiuas y tetrasódicas. Otros agentes considerados útiles como agentes anti-aglomerantes incluyen cuminina, heparina, estreptoquinasa, y aquellos agentes encontrados en las composiciones de lisis o anticoagulantes, cualquier agente amortiguante que pueda mantener la solución de conservación en cualquier pH deseado durante el uso puede usarse. Los agentes amortiguantes ejemplares incluyen PBS, tris, acetato de sodio, y ácido cítirico. También puede usarse EDTA y sus sales como agente amortiguante. El agente amortiguante puede se runo que mantenga el pH de la solución dentro de un rango de entre aproximadamente cuatro y aproximadamente siete durante la duración de la conservación. De acuerdo con esto un amortiguador preferido es un amortiguador de acetato, tal como acetato de sodio, acetato de magnesio, acetato de calcio y sus combinaciones. Un detergente también puede usarse en la solución. El detergente puede ser no iónico, cationico, anionico o zwitterionico. Mezclas de detergentes también pueden ser usadas. Clases ejemplares de detergentes incluyen sulfatos de alcohol éter, sulfatos alcohólicos, alcanolamidas sulfonatos de alquilo, óxidos de amina, detergentes anftéricos, detergentes aniónicos, derivados de betaina, detergentes cationicos, disulfonatos, ácido dodecilbenceno sulfónico, alcoholes etoxilados, alquil fenoles etoxilados, ácidos grasos etoxilados, hidrotropos de ésteres de glicerol, sulfatos de laurilo, mono y diglicéridos, detergentes no iónicos, ésteres de fosfato, detergentes cuaternarios y derivados de sorbitano. la clasificación automática de la muestra es la característica clave de la invención. Este permite que el proveedor de servicios de salud o el técnico de laboratorio rápidamente determinen si la muestra cumple con un criterio dado, permitiendo por ejemplo el desarrollo de la prueba de diagnóstico adicional en la muestra sin comprometer el ensayo pretendido, por ejemplo el procedimiento de teñido de Papanicolaou o una variante del mismo. El método automático también permite tomar las acciones remedíales si la muestra no cumple con los criterios. La muestra se provee para un análisis automático en un recipientes; los recipientes adecuados son conocidos en la técnica. El recipiente puede ser cualquier recipiente capaz de retener una muestra citológica que se encuentre en solución, y permite el examen óptico de la solución para determinar su adecuación para uno o más criterios. El recipiente puede ser cerrado, puede ser un frasco celular tal como los adecuados para usarse con el procesador ThinPrep® 2000 (Cytyc Corp). Una o más superficies del recipiente y/o sus anexos (por ejemplo una tapa) son suficientemente transparentes a la luz usada para examinar la muestra de tal forma que pueda determinarse el resultado. La muestra puede ser clasificada para una pluralidad de criterios diferentes usando diferentes métodos de investigación. La muestra puede ser investigada usando diferentes longitudes de onda de luz, diferentes técnicas ópticas, y sus combinaciones. La muestra puede ser investigada en su absorbencia, transmitancia, fluorescencia, difracción , etc. , y sus combinaciones. La muestra puede ser mezclada antes de la interrogación, y la mezcla puede realizarse manual o automáticamente; el aparato puede incorporar una capacidad de mezclado para realizar esta función. La muestra puede ser investigada con una de una variedad de longitudes de onda de luz incluyendo ultravioleta, visible, infrarroja, infrarroja cercana, infrarroja lejana, ultravioleta, ultravioleta cercana, ultravioleta lejana, ultravioleta extrema, UV-A, y UV-B. La fuente luminosa, en combinación con filtros opcionales puede proporcionar una o más longitudes de onda precisas de luz, puede proporcionar rangos de longitudes de onda, o combinaciones de las mismas y más de una fuente luminosa diferente pueden usarse. Puede usarse cualquier fuente de luz capaz de producir una longitud de onda útil para estudiar a la muestra con respecto a un criterio de interés: una pluralidad de fuentes luminosas pueden utilizarse en tal aparato automático. Las fuentes de luz ejemplares incluyen, una lámpara infrarroja, por ejemplo una lámpara con un filamento consistente de un serpentín de Kanthal o Nichrome opcionalmente unido a una ventana de transmisión de zafiro, selenuro de zinc o fluoruro de calcio, una lámpara de calor, un diodo emisor de luz, una fuente de fibra "óptica, una lámpara visible, una lámpara visible de pulsos; una lámpara de deuterio; una lámpara de xenón; un láser de gas de onda continua (CW), incluyendo pero sin limitarse a cualquiera de las líneas láser de iones de argón (457, 488, 514, etc. nm) o un láser de HeCd; un láser de diodo de estado sólido tal como láser de base (doble) en GaN y GaAs o la salida doble o triple de los láser a base de YAG o YLF; y un láser en pulsos. Un resultado obtenido al examinar la muestra se compara con un criterio. El criterio se fija para permitir la clasificación satisfactoria de la muestra en base a los resultados de la investigación. Los criterios pueden ser absorbencia, transmitancia, reflectancia, grado de difracción, luminiscencia, fluorescencia, emisión, o retroreflexión, y puede tener una longitud de onda particular o una selección de longitudes de onda. El criterio puede ser un número absoluto, y puede estar almacenado de cualquier forma en el dispositivo incluyendo en el software, en una memoria fija y/o en una memoria programable. El criterio puede ser un valor relativo que se obtiene al comparar una o más muestras del control por medo el aparato. El criterio puede ser un valor de umbral mínimo o máximo. Una pluralidad de criterios diferentes pueden usarse para clasificar la muestra en una pluralidad de formas diferentes, y puede aplicarse simultáneamente, secuencialmente o en combinaciones de las miasmas. Por ejemplo el criterio puede ser una absorbencia a una longitud de onda particular de la luz. El criterio puede ser selectivo para un tipo de célula específico, por ejemplo células endocervicales, cuya presencia en un frotis de papanicolaou indica muestras del cervix. Para determinar el número de concentración de células en una muestra, una absorbencia a una longitud de onda particular de luz puede usarse; una longitud de onda adecuada por ejemplo en el rango visible o infrarrojo puede determinarse empíricamente al comparar el espectro de absorción de la solución en la cual la muestra debe suspenderse en la presencia o ausencia de células. Los componentes particulares de la muestra por ejemplo los tipos particulares de células, pueden ser detectadas por cualquier medio adecuado, por ejemplo al usar un ensayo competitivo tal como ligado con un miembro ligado a un fluoroforo y el otro a un sofocador; la competencia para ligar a un miembro del par de enlace libera el fluoroforo del sofocador, proporcionando así una señal fluorescente que puede ser detectada. Esto puede ser realizado con un anticuerpo específico para un antigeno presente en un tipo de célula de interés. Las mucosidades pueden detectarse usando un ensayo competente usando aglutinina de germen de trigo etiquetada fluorescentemente (Oregon Green o rodamina de tratrametilo; Molecular Probes), una lecitina que se ligue específicamente a los residuos de ácido N-acetilneuramínico (ácido siálico) presentes en las mucosidades. La presencia de sangre en la muestra puede detectarse por ejemplo a una longitud de onda de 405-420 nm. La comparación de los resultados obtenidos de la investigación óptica da como resultado la unión automática de un señuelo a la muestra. La muestra puede ser un señuelo positivo o un señuelo de manipulación. El señuelo positivo indica que la muestra cumple con los criterios. Por ejemplo el señuelo positivo pude indicar que un número suficiente de células, que pueden ser de un tipo seleccionado están presentes en la muestra. El señuelo positivo puede indicar que están presentes en la muestra suficientes células para permitir el desarrollo de los métodos adicionales en la muestra más allá del método pretendido para el cual se designo la muestra; por ejemplo el ejemplo positivo puede indicar que la extracción de una alícuota de la muestra para las pruebas moleculares pueden realizarse antes de someter a la muestra a la preparación automática de los portaobjetos. Esto es extremadamente deseable, porque los métodos automáticos se consideran susceptibles a la contaminación cruzada entre muestras, y por lo tanto la extracción de ia muestra restante de un frasco que ya ha sido sometido al procesamiento automático se considera no confiable. Los citologos preferirían que la adecuación de la muestra sea determinada antes de la preparación automática de la muestra de tal forma que la muestra sin contaminar podría ser retirada y sometida a otras pruebas tal como las pruebas de HPV (virus del papiloma humano) molecular. El señuelo de manipulación indica que la muestra debe ser sometida a una manipulación para volverla adecuada para las pruebas pretendidas. Por ejemplo el señuelo de manipulación puede indicar que no están presentes suficientes células o suficientes células de un tipo particular, en la muestra y así pueden ordenar la adquisición de una muestra adicional. El señuelo de manipulación puede indicar que la muestra debe ser tratada para volverla aceptable. Por ejemplo cuando ia muestra contiene excesiva sangre o no cumple con un criterio de un nivel satisfactorio de sangre, puede unirse un señuelo de manipulación a la muestra indicando que se ha realizado una etapa de pre-tratamiento. La etapa de pre-tratamiento puede ser un tratamiento con ácido acético. Cunado la muestra contiene mucosidades en exceso, o para tratar la muestra con un agente reductor de la mucosidad, por ejemplo un agente reductor tal como ditriotreitol. El señuelo de manipulación puede indicar otros tratamientos tales como filtrado de la muestra, o lavado de la muestra.
Los señuelos pueden ser unidos a la muestra de cualquier manera, ya sea físicamente, electrónicamente o de múltiples formas. La unión física puede lograrse por ejemplo al colocar un marcador en el recipiente de la muestra o al fijar una etiqueta que refleje la designación en el recipiente de la muestra. Un aparato pude incorporar un aparato de impresión, grabado, grabado al agua fuerte u otros aparatos para marcar directamente el recipiente. El señuelo puede ser fijado electrónicamente al recipiente, por ejemplo en una memoria electrónica, que puede estar unida al recipiente por medio de correlación con un número de muestra, la posición de una muestra, o un código u otra designación en el recipiente de la muestra. Así pueden realizarse método conjuntamente con la recolección de muestras, proporcionando distintas ventajas. Los métodos particulares pueden realizarse en una instalación para el cuidado de la salud, permitiendo de determinación de la adecuación de la muestra antes de que el paciente salga de las instalaciones, y puede realizarse en el punto de toma de muestra permitiendo que se realicen los métodos al mismo tiempo que se obtengan las muestras. Así puede obtenerse una muestra adicional en ese momento sin que se requiera que el paciente regrese. Un ejemplo de un sistema para la clasificación automática para usarse con la invención presenta una fuente de excitación y un arreglo detector, y opcionalmente uno o más filtros diseñados para reducir el número de longitudes de onda a las cuales la muestra se expone y/o que se observan desde la muestra, medios para comparar un resultado de la muestra con un criterio, medios para unir un señuelo positivo a la muestra y medios para unir un señuelo de manipulación a la muestra. Los medios para comparar el resultado pueden comprender un dispositivo electrónico, que puede se runa computadora, que puede recibir una señal de un arreglo detector y compararla con un criterio que puede ser un valor almacenado en una memoria, que puede se runa memoria fija o una memoria dinámica y puede ser proporcionada por medio de hardware o de software, o el valor puede ser obtenido por medio de comparación a una señal obtenida de una muestra de control. Los medios para unir los señuelos a la muestra también pueden presentar dispositivos electrónicos, que pueden ser una computadora y pueden presentar una impresora capaz de marcar directamente el frasco de la muestra o puede imprimir una etiqueta que se fija al recipiente, o puede designar la muestra para su manipulación electrónicamente al fijar un señuelo de manipulación a un código, por ejemplo un código de barras ya presente en el recipiente o al unir un señuelo de manipulación a una posición en el dispositivo en el cual se encuentra la muestra. El término "fijar" incluye una unión física a la muestra y/o su recipiente, una unión electrónica a una representación de la muestra y/o su recipiente, o ambos. Los medios para comparar, los medios para fijar un señuelo positivo, y los medios para fijar el señuelo de manipulación pueden ser operados desde un único dispositivo electrónico tal como una única computadora. Un aparato que realiza el método de la invención puede ser independiente o puede estar integrado con componentes adicionales capaces de realizar otros métodos sobre la muestra. Por ejemplo, las muestras pueden ser procesadas adicionalmente después de su designación por medio de un procesador automático de muestras y puede mostrarse por medio de un sistema formador de imágenes automático, y puede opcionalmeníe se incorporado en ese sistema. Los sistema automáticos ejemplares incluyen el sistema de formación de imágenes ThinPrep® de Cytye Corporation, el perfilador TriPath FocalPoint™ , el sistema ChromaVision Acis®, el sistema de formación de imágenes CompuCyt iCyte, el sistema de formación de imágenes aplicado CytoVision™, y el sistema de formación de imágenes Veracel Verasys. Los métodos pueden incorporarse en los dispositivos de procesamiento de muestras tales como los descritos en las patentes norteamericanas nos. 5,185,084, 5,266,495, 6,010,909, 6225, 125 y 5,942,700. La toma de muestras puede realizarse conjuntamente con métodos bioquímicos y/ moleculares para analizar la muestra, por ejemplo los métodos para detectar una especie objetivo en la muestra usando un compañero de enlace tal como una molécula sensora. Esos métodos pueden realizarse en un formato hecho conjuntamente con el examen óptico, o puede realizase después de la separación de una porción de la muestra. Esos métodos pueden analizar la muestra de un objetivo que puede ser cualquier componente de la muestra que se desee detectar. Cuando el objetivo es una célula o un componente o producto celular, la célula pude ser de cualquier origen, incluyendo procarionte, eucarionte o archea. La célula puede estar viva o muerta. Si se obtiene de un organismo multicelular, la célula puede ser de cualquier tipo de células. La célula puede ser una familia celular cultivada o un aislado primario, la célula puede ser de un mamífero, anfibio, reptil, planta, levadura, bacteria, espiroqueta o protozoario. La célula puede ser una célula normal, una célula mutada, una célula manipulada genéticamente, una célula tumoral, etc. El objetivo puede ser un agente infeccioso, una enfermedad, un marcador de infección, una proteína, un anticuerpo, una antígeno, etc. El sensor puede ser cualquier sustancia que puede ligarse selectivamente a su objetivo cuando está presente en la muestra. Ejemplos no limitantes del sensor incluyen un polinucleótido tal como se describe antes, incluyendo un ácido nucleico de péptido y un aptámero, y un anticuerpo tal como se describe antes. También pueden usarse combinaciones de diferentes sensores, que pueden permitir la detección y el análisis de una pluralidad de objetivos en la muestra. En una variación, el sensor puede ser un APN que se liga específicamente a un polinucleótido objetivo del cual se sospecha está presente en la muestra. Diferentes etiquetas pueden usarse en diferentes sensores secundarios específicos para diferentes objetivos que permiten una detección multiplexada. Las técnicas de inserción pueden usarse para detectar el enlace de un objetivo a un sensor. Por ejemplo, cuando el sensor es un anticuerpo específico par aun objetivo, un segundo anticuerpo etiquetado que no interfiere con el enlace del anticuerpo sensor puede usarse para permitir la detección del enlace del objetivo. De manera similar, también puede ser usado un polinucleótido que se liga a una porción del objetivo o el complejo sensorrobjetivo sin que se interrumpa ese complejo. Las etiquetas útiles para detectar un complejo sensonobjeto incluyen cualquier substancia que pueda ser detectada, directa o indirectamente en asociación con un objetivo presente en la muestra después de ligar el sensor al objetivo. Etiquetas ejemplares incluyen un cromoforo, un lumiforo, un fluoroforo, un cromogeno, un hapteno, un antígeno, un isótopo radioactivo, una partícula magnética, una nanopartícula metálica tal como una nanopartícula de oro o plata, una enzima, y un miembro de un par de enlace.
Claims (1)
- REIVI N DICACIONES 1 . Un método automático para clasificar una muestra citológica, que cons iste en : proporcionar una muestra citológica en solución en un recipiente; exa minar ó pticamente u na solución con cuando menos una longitud de onda de luz; comparar un res ultado de ese examen con un criterio. fijar un señ uelo positivo a una muestra si l os resultados cumplen con el criterio; y fijar un señuelo de manipulación a la muestra si el resultado no cumple con el criterio. 2. El método de la reivindicación 1 , en el cual el señuelo positivo designa la muestra como satisfactoria para realizar el ensayo pretendido. 3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el cual el ensayo pretendido consiste en preparar un portaobjetos con esa muestra. 4 El método de la reivindicación 3, en el cual la muestra es satisfactoria si contiene suficientes células. 5. El método de la reivindicación 4, en el cual las células son de un tipo deseado. 6. El método de la reivindicación 1 , en el cual el señuelo positivo designa la muestra como satisfactoria para la preparación automática del portaobjetos. 7. El método de la reivindicación 1 , en el cual el señuelo positivo designa la muestra como adecuada para permitir la extracción de una porción de la muestra antes de realizar un ensayo pretendido. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el cual el señuelo de manipulación designa la adquisición de una muestra adicional. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, en el cual el señuelo de manipulación designa un tratamiento de la muestra. 10. El método de la reivindicación 9, en el cual el tratamiento consiste en agregar ácido acético a la m uestra. 1 1 . El método de la reivindicación 9, en el cual el tratamiento consiste en agregar un agente reductor a la muestra. 12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , en el cual el criterio indica una concentración de las células. 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , en el cual el criterio indica una concentración de células de un tipo particular en la muestra. 14. El método de la reivindicación 13 en el cual las células son células endocervicales. 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 , en el cual el criterio indica un nivel de mucosidades en la muestra. 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 , en el cual el criterio indica un nivel de sangre en la muestra. 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 , en el cual el criterio indica un nivel de sangre en la muestra. 18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, en el cual la muestra se mezcla antes de examinar ópticamente la solución. 19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , en el cual el señuelo positivo consiste una marca en el recipiente. 20. El método de la reivindicación 1 9, en el cual el señuelo positivo comprende una designación en una memoria electrónica. 21 . El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -20 en el cual el señuelo de manipulación consiste de una marca en el recipiente. 22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -20 en el cual el señuelo de manipulación consiste de una designación en una memoria electrónica. 23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -22 en el cual la muestra se selecciona del grupo consistente de sangre, orina, semen, leche, flema, mucosidad, liquido de la pleura, fluido pélvico, fluido sinovial, fluido de ascitis, lavados de la cavidad corporal, cepillado ocular, raspado cutáneo, frotis bucal, frotis vaginal, frotis de papanicolaou, frotis rectal, un aspirado, una biopsia con aguja, una sección de tejido obtenida por ejemplo por medio de cirugía o autopsia, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, secreciones externas de la piel, del tracto respiratorio, intestinal y genitouranio, lágrimas, saliva, tumores, órganos, un cultivo microbiano, un virus, y muestras de constituyentes del cultivo celular in vitro. 24. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 -23, en el cual la muestra presenta alcohol soluble en agua en una cantidad efectiva para conservar la esterilidad de la solución frente a cuando menos un contaminante.
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