MXPA06003477A - Uso terapuetico de antagonistas de alfavbeta3 y alfavbeta6 integrinas como agentes antifibroticos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a la inhibicion de av integrinas, en especial av??3 y av??6 integrinas, por antagonistas especificos, con preferencia antagonistas no peptidicos, compuestos relacionados y compuestos con especificad comparable, que regulan hacia abajo la fibrogenesis al inhibir la migracion celular y la produccion de moleculas profibrogenicas (por ejemplo, colagenos, TIMP-1) y citoquinas (por ejemplo, CTGF) por celulas estrelladas/miofibroblastos hepaticos activados, epitelios y endotelios activados. Estos antagonistas solos o en combinacion con otros agentes pueden prevenir, mitigar o incluso revertir eficazmente el desarrollo de fibrosis avanzada, como ser la fibrosis/cirrosis del higado y la fibrosis de otros organos, tales como pulmones, rinones, intestino, pancreas, piel y arterias.

Description

USO TERAPEUTICO DE ANTAGONISTAS DE ALFAVBETA3 Y ALFAVBETA6 INTEGRINAS COMO AGENTES ANTIFIBRÓTICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la inhibición de ov integrinas, especialmente a?ß3 y a?ß6 integrinas, a través de antagonistas específicos, con preferencia, antagonistas no peptídicos tales como EMD 409915 y EMD 409849, compuestos relacionados y compuestos con especificidad comparable, que regulan hacia abajo la fibrogénesis al inhibir la migración celular y la " producción de moléculas profibrogénicas (por ejemplo, colágenos, TIMP-1) y citoquinas (por ejemplo, CTGF, ?d?ß1,2) por células estrelladas hepáticas activadas, miofibroblastos activados y epitelios y endotelios activados por f broblastos. Estos antagonistas, solos o en combinación con otros agentes, pueden prevenir, mitigar o incluso revertir efectivamente el desarrollo de fibrosis avanzadas tales como fibrosis/ cirrosis hepática y fibrosis de otros órganos, tales como pulmones, ríñones, intestino, páncreas, piel y arterias. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células estrelladas hepáticas activadas y los miofibroblastos (HSC/MF) desempeñan un papel central en el desarrollo de enfermedades hepáticas crónicas. Depositan un exceso de componentes de matriz extracelular que lleva a fibrosis y, finalmente/ a cirrosis. Se define la cirrosis como EEF:170110 la distorsión de la arquitectura hepática, con severas anomalías vasculares y funcionales. Las consecuencias son hipertensión portal con desarrollo de ascitis y sangrado de várices esofágicas, encefalopatía hepática y propensión a infecciones que suelen ser letales. Ciertos receptores intercelulares y, en especial, entre la célula y la matriz, principalmente las integrinas, presentan marcada regulación hacia arriba en los endotelios . activados y HSC/MF, y transmiten señales migratorias, de promoción del crecimiento y otras señales profibrogenicas . En consecuencia, la activación de la a?ß3 integrina media la activación y la migración de HSC/MF en respuesta a las citoquinas profibrogenicas tales como PDGF-AB/BB, y regula hacia arriba su expresión de citoquinas profibrogénicas como CTGF, un factor que estimula la síntesis de colágeno de forma autocrina y paracrina. De modo similar, se observa una notable regulación hacia arriba de la a?6ß6 integrina en células epiteliales activadas, en particular en los epitelios proliferantes -de los conductos biliares de hígados fibróticos que, además, promueve la fibrogénesis al desencadenar la liberación de proteínas de la membrana basal y de otras proteínas profibrogénicas y factores de crecimiento -que activan HSC/MF. El tratamiento -de enfermedades fibróticas del hígado y cirrosis con antagonistas específicos de a?ß3 y a?߀ integrinas puede bloquear la migración y la activación de las células endoteliales, HSC/MF y epiteliales, y así mitigar o incluso revertir la fibrogénesis . Dado que, análogamente al hígado, las células símil miofibroblastos y epiteliales activadas tienen un papel central en la patogénesis de otras enfermedades fibróticas progresivas, también se pueden usar antagonistas específicos de a?ß3 y a?6ß6 integrinas para tratar trastornos fibróticos de otros órganos, por ejemplo, páncreas, intestino, pulmones, corazón, ríñones, arterias o la piel. Las integrinas son una familia de receptores celulares transmembrana que median las interacciones entre células, y entre las células y la matriz extr celular. La pérdida de contactos mediados por integrinas suelen conducir a la apoptosis. Los receptores de integrina se componen de una subunidad a y una subunidad ß, cfue pueden aparecer en al menos 24 combinaciones diferentes, cada una con sus propias especificidades de unión y propiedades de señal. La subfamilia de cadenas ß3 consiste en dos integrinas, allbp3 y a?ß3. allbp3 se expresa en plaquetas y megacariocitos, y participa en la formación de trombos. a?ß3 es una integrina no plaquetaria expresada por células endoteliales, miofibroblasticas y algunas inflamatorias (1-3) . La cadena de ߀ integrinas se encuentra sobre todo en células epiteliales y ciertos fibroblastos/miofibroblastos activados, y sólo forma un heterodímero con la subunidad av (4) . Varios informes han demostrado que la expresión elevada de a?ß3 parece estar estrechamente asociada con transformación oncogénica y la progresión de tumores, es decir con las propiedades invasivas y metastásicas de las células tumorales humanas . Se cree que la expresión inducida de a?ß3 integrina sobre la superficie de las células endoteliales es esencial para la migración y la proliferación de las células endoteliales y la tubulogénesis (5) . En años recientes, se ha tornado evidente que se requiere la adhesión a la matriz extracelular mediada por integrinas de las proteínas de la matriz - extracelular (ECM) para el crecimiento y la supervivencia de la mayoría de los tipos celulares (2) . La alteración de la adhesión detiene las células en la fase Gl y causa apoptosis. Se halló que la a?ß3 integrina juega un papel fundamental durante la angiogénesis, inhibiendo la apoptosis de las células endoteliales (6) . La sobreexpresión de a?ß3 en células de ovario de hámsteres chinos incentiva la actividad •Rho y la formación de fibras de estrés (7) , factores que están relacionados con la adhesión, la migración y la activación. La regulación hacia arriba del sistema receptor de PDFG(BB) -??T?ß (BB) desempeña un papel importante durante la fibrogénesis , es decir, la formación de novo y el depósito de matriz extracelular (ECM) en órganos tales como el hígado (8) . El receptor PDGF£ activado se puede coinmunoprecipitar junto con la ?ß3 (9) integrina, y recientemente se ha demostrado que a?ß3 interactúa con el motivo RGD del péptido asociado a la latencia (LAPpi) del factor de crecimiento de transformación beta (TGFP) (10) , que puede tener implicancias en cáncer y en numerosas enfermedades inflamatorias y fibróticas, donde la expresión de ambas proteínas juega un papel importante . a?ß3 es esencial para la migración de células musculares lisas y endoteliales, y la formación de vasos sanguíneos en el tejido de granulación. Hasta el momento, el papel potencial de a?ß3 en la fibrosis hepática y la fibrosis de otros -órganos ha permanecido inexplorada en gran medida (11-19) . La a?ß6 integrina se encuentra predominantemente en las células epiteliales y fibroblásticas activadas. Muestra una notable regulación hacia arriba durante la lesión tisular (20-22) . Los ratones carentes de esta subunidad de integrina presentan una sorprendente resistencia a la inducción de fibrosis pulmonar (20) . La activación y la proliferación de las células epiteliales del conducto -biliar son hallazgos regulares en la lesión hepática crónica y la fibrosis, y los epitelios proliferantes de los conductos biliares son una fuente importante de factores profibrogénicos ' tales como TGFpi, GFP2 y CTGF, y ciertas proteínas ECM en la fibrosis hepática, en particular la fibrosis biliar (23, 24).

Se considera que HSC/MF y miofibroblastos son los principales tipos celulares responsables del depósito en exceso de ECM durante la fibrogénesis hepática activa. Se ha demostrado que sintetizan y liberan varios tipos de colágeno, en especial los colágenos tipos I y III formadores de fibrillas de los tejidos cicatrizales, laminina-2, fibronectina y TIMP-1, el principal inhibidor de colagenasas y otros (12-19, 25-27) . La migración de estas células es crucial por su acumulación en sitios de lesión hepática. Después de la activación, los HSC/MF cultivados migran en respuesta a diversos estímulos, entre ellos factores de crecimiento tales como PDGF-AB, PDGF-BB, sustancias vasoactivas tales como endotelina-1, y quimiocinas tales como proteína quimiotáctica de monocitos (MCP-1) (28-30) . HSC/MF expresa numerosas integrinas, cuyos ligandos son, sobre todo, moléculas de ECM que transducen señales extracelulares desde la ECM hacia las células, en concordancia con citoquinas/factores de crecimiento (señales cruzadas) (1-3) . Varias actividades de HSC/MF pueden ser reguladas por integrinas, entre ellas la proliferación celular, la contracción, la migración y la síntesis de ECM (1-3) . Además, las integrinas también pueden activar el GFP latente y, asi, amplificar la actividad fibrogéni-ca de esta citoquina clave (1?, 22). En consecuencia, la modulación farmacológica de la interacción entre -HSC/MF y la ECM circundante interfiere con las señales de integrinas y es una estrategia potencial para limitar la fibrosis hepática y de otros órganos. Si bien la migración de HSC/MF in vivo es difícil de medir, las sustancias que inhiben la migración de HSC/MF in vi tro son importantes candidatos para reducir su acumulación en el hígado lesionado. Además, la inhibición de la activación, la migración y la proliferación de las células endoteliales y epiteliales y endoteliales del conducto biliar luego pueden suprimir la fibrogénesis en el hígado con lesión crónica. A continuación se ilustra el impacto clínico de las enfermedades fibrosantes crónicas, como se ejemplifica con la fibrosis hepática. El escenario es similar para todas las enfermedades fibrosantes, tales como las que afectan los pulmones, los ríñones, el intestino, el páncreas, la piel o las arterias. Se estima que tan solo en Alemania, con una población de 100 millones, unos 500.000 sufren de cirrosis hepática, el estadio final de las enfermedades hepáticas crónicas, y que la tasa de mortalidad anual debida a cirrosis es de entre 50.000 y 100.000 personas (12, 31). Se puede definir la cirrosis como la distorsión de la arquitectura hepática por una acumulación excesiva de matriz extracelular (ECM) que genera nodulos celulares hepáticos anormales, esclerosis perisinusoidal y desvío de sangre por fuera de los hepatocitos etabólicamente activos. Los pacientes con cirrosis entran fácilmente en un estado de enfermedad hepática descompensada, con todas las consecuencias del deterioro de la función de síntesis hepática (trastornos de la coagulación, síntesis defectuosa de albúmina y nutrientes) , lo que causa hemorragias generalizadas, edema, hipertensión portal que conducen a ascitis y hemorragias de várices esofágicas, una propensión a infecciones severas y el desarrollo de encefalopatía hepática. En sí misma, la cirrosis predispone a una muy elevada prevalencia de carcinoma primario de células hepáticas. Mientras que en el oeste alrededor de la mitad de los casos de cirrosis se debe al abuso del alcohol, la otra mitad tiene causas múltiples, tales como (en orden de magnitud decreciente) hepatitis virales crónicas C y B, trastornos autoinmunes (cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune clásica, colangitis esclerosante primaria) , enfermedades metabólicas (hemocromatosis, enfermedad de ilson, deficiencia de a?-antitripsina, tirosinemia, glucogenosis) , fibrosis quís-tica, fibrosis inducida por fármacos (por ejemplo, metotrexato) , anomalías congénitas (fibrosis hepática congénita, atresia biliar, síndrome de Alagille) , complicaciones posoperatorias (cirrosis biliar secundaria) o enfermedades vasculares (síndrome de Budd Chiari) . Estas cifras y las causas de cirrosis hepática se pueden extrapolar con facilidad a otros países occidentales. Las cifras pueden ser aún mayores en países no occidentales, con una mayor proporción de hepatitis virales B y C. El tratamiento causal de estas enfermedades hepáticas es limitado (12, 31). En consecuencia, incluso las mejores terapias farmacológicas disponibles sólo pueden eliminar el virus B en el 40% de los pacientes y el virus C en el 30-40- 50% de los pacientes con hepatitis virales crónicas. Estas terapias siempre incluyen interferón durante 6-12 meses, por lo que son costosas y tienen significativos efectos secundarios . Un problema sanitario creciente es la epidemia de hepatitis C (32) que se torna crónica en el 80-90% de las __personas infectadas, , y que tienen una prevalencia . de entre el 0,5 y el 1% en Europa Occidental, entre el 1 y el 1,5% en los EEUU, de aproximadamente el 2% en Europa Oriental y Asia, y de hasta el 20% en algunos países como Egipto. En ciertas enfermedades hepáticas tales como los trastornos autoinmunes se pueden tratar los síntomas, o quizás retardar ligeramente su progresión hacia la cirrosis, por agentes tales como corticosteroides (en la hepatitis autoinmune clásica) y ácido ursodesoxicólico (en la cirrosis biliar primaria) . Otras se pueden prevenir si se descubren en un estadio temprano. Son ejemplos la venesección en la hemocromatosis y los agentes quelantes tales -como D-penicilamina en la enfermedad de Wilson. Debido a la escasez de donantes y los altos costos, sólo es posible el trasplante de hígado en pocos casos seleccionados de enfermedad hepática de estadio terminal . Los estímulos adversos mencionados, por ejemplo hepatotoxinas tales como alcohol, virus hepatotrópicos, reacciones inmunes contra el hígado, enfermedades metabólicas y estasis biliar, pueden desencadenar fibrogénesis hepática, es decir la síntesis y el depósito excesivos de- matriz extracelular (ECM) . En las enfermedades hepáticas agudas tales como hepatitis viral autolimitada, la fibrogénesis se equilibra con fibrólisis, es decir la eliminación del exceso de ECM. No obstante, la repetición de agresiones de suficiente severidad o influencias nocivas adicionales, por ejemplo, hepatitis C crónica combinada con el consumo de alcohol que tienen lugar en muchas enfermedades hepáticas crónicas desvían el metabolismo de ECM hacia la fibrogénesis, lo que da por resultado fibrosis o cirrosis (12-19, 32) . En la fibrogénesis, el daño del hepatocito o del epitelio del conducto biliar lleva a la activación de las células mononucleares, la liberación de factores fibrogénicos y la activación de las células del mesénquima hepático. Se cree que la célula, de Kupffer activada, es decir el macrofago específico del hígado, y también el epitelio proliferante del conducto biliar son las fuentes principales de citoquinas y factores de crecimiento potencialmente fibrogéni-cos que finalmente se dirigen hacia el HSC/MF activado y, que estos tipos celulares son responsables del depósito excesivo de ECM en el hígado (12-19, 32) . Como ya se mencionó, ambas células se correlacionan en todos los demás órganos mesenquimoepiteliales y vasculares (14, 33-44). Ante la activación por los factores de crecimiento fibrogénicos y una alteración del entorno normal de la matriz tridimensional, el HSC/MF habitualmente quiescente sufre una transformación a un fenotipo celular caracterizado por un elevado potencial proliferativo y la capacidad para producir un exceso de moléculas de ECM. Esta transformación suele estar caracterizada por la adquisición de la actina a del músculo liso del marcador del miofibroblasto y juega un papel central en un programa de protección dirigido al rápido cierre de una herida potencialmente letal. Por lo general autolimitado, si el agente ofensivo sólo está presente durante un corto período, este programa puede conducir a fibrosis y cirrosis cuando se activa continuamente. Nuevamente se hace hincapié en que las células y los factores conducentes a fibrosis y cirrosis hepática son casi idénticos a los subyacentes a los procesos que conducen a fibrosis y cicatrización de otros órganos . En consecuencia, en muchas enfermedades crónicas hepáticas (12-19, 32) y de otros órganos, tales como el corazón, los ríñones, los pulmones, las arterias, la piel, el intestino y el páncreas (14, 33-44), que llevan a fibrosis, no se puede prevenir el daño constante, sino sólo mitigarlo, en el mejor de los casos. Además, por lo general los pacientes se presentan con un estadio ya avanzado de deterioro estructural y funcional. Se requiere el desarrollo de tratamientos que detengan la progresión de la fibrosis de los órganos, o incluso revertir la cicatrización avanzada. Estos tratamientos deberían estar disponibles de forma oral, ser razonablemente económicos y carecer de efectos secundarios indeseables. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención consiste, en proporcionar un método para el tratamiento de condiciones patológicas en las cuales fibroblastos, células miofibroblásticas y miofibroblastos activados, y células epiteliales y endot-eliales activadas producen y/o inducen un exceso de matriz extracelular, para dar por resultado una cicatrización no deseada. Esto se refiere a fibrosis y cirrosis hepática, pero también a fibrosis de otros órganos tales como pulmones, ríñones, intestino, páncreas, piel y arterias que pueden estar sujetas a procesos patológicos casi idénticos . Otro objeto de esta invención consiste en proveer composiciones de importancia para el tratamiento de condiciones patológicas por las cuales se inhiben los fibroblastos, las células miofibroblásticas y los miofibroblastos activados, además de las células endoteliales y epiteliales activadas, por lo que se inhibe la cicatrización, al menos en parte.

Se halló que las enfermedades y las condiciones patológicas antes mencionadas se pueden tratar con éxito mediante inhibidores de integrinas, con preferencia inhibidores de o integrinas, con mayor preferencia antagonistas de a?ß3 y a?ß6, donde se incluyen moléculas peptídicas y no peptídicas. Con preferencia, los inhibidores de integrinas EMD 409915 y EMD 409849 son fármacos muy poderosos en dicho contexto, que son conocidos en el arte previo o que se pueden preparar con facilidad de acuerdo con técnicas estándar. EMD 409915 es .ácido 3-benzo [1, 2 , 5] tiadiazol-5-il-3-{ 6- [2- (6-metilamino-piridin-2-il) -etoxi] ~lH-indol-3-il}-propiónico. EMD 409849 es ácido 3-{3-benciloxi-2- [5- (piridin-2-ilamino) -pentanoilamino] -propanoilamino}-3- (3 , 5-dicloro-fenil) -propiónico. Estos antagonistas, solos o en combinación con otros agentes, pueden prevenir, mitigar o incluso revertir efectivamente el desarrollo de fibrosis avanzada, tal como la fibrosis/cirrosis hepática y la fibrosis de otros órganos tales como pulmones, ríñones, intestino, páncreas, piel y arterias . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Efecto de EMD 409915 10"9 - 10"6 M sobre a) células . CFSC-2G, una línea de ratas HSC, y b) HSC/MF primario de rata tratado con PDGF-BB (10 ng/ml) . La migración celular se evaluó dentro de las 20 h. Los datos representan uno de = 3 experimentos independientes compuestos por triplicado, y se muestran como medias + SEM (% relativo a la reducción inicial del ancho de raspado) . Fig. 2. Efecto de EMD 409915 10"10 - 10~6 M sobre la migración de células HSC/MF estimulada con suero fetal bovino (FCS) . La migración celular se evaluó después de 20 h. Los datos representan uno de = 3 experimentos independientes compuestos por triplicado, y se muestran como medias ± SEM (% relativo a la reducción inicial del ancho de raspado) . Fig. 3. Síntesis de ADN medida por la incorporación de -Brdü-en HSC/MF-estimulados mediante PDGF-BB (10 ng/ml) durante 24 h, en presencia de EMD 409915 10"6 - 10"8 M. Los datos representan uno de 3 experimentos independientes compuestos por cuadruplicado, y se muestran como medias + SEM (unidades arbitrarias) . Fig. 4. Síntesis de ADN medida por la incorporación de BrdU en HSC/MF estimulados mediante 10% de FCS en presencia de EMD 409915 10"S - 10"8 M. Los datos representan uno de > 3 experimentos independientes compuestos por cuadruplicado, y se muestran como medias + SEM (unidades arbitrarias) . Fig. 5. Expresión de CTGF en células CFSC-2G tratadas con EMD 409915 10~6 - 10"8 M en presencia de PDGF-BB (10 ng/ml) durante 24 h. Los datos representan uno -de > 3 experimentos independientes compuestos por cuadruplicado, y se muestran como medias + SEM (unidades arbitrarias) . Figs . Sa, 6b y 6c. Expresión de fig.6a) procolágeno al(I), fig.6b) TGFpi y fig.6c) CTGF en fibrosis hepática biliar secundaria. Medida mediante PCR de tiempo real en ARN total proveniente de hígados de rata: ratas con operación falsa (Sham) y ratas con fibrosis debida a oclusión del conducto biliar durante 6 semanas (EDL) . Cada barra representa muestras de ARN hepático provenientes de tres animales diferentes; los datos se muestran como medias + SEM (unidades arbitrarias) . Figs. 7a y 7b . Expresión de fig. 7a) beta 3 integrina y fig.7b) beta 6 integrina en fibrosis hepática. Medida mediante PCR de tiempo real en ARN total proveniente de hígados de rata: ratas con operación falsa (Sham) y ratas con fibrosis debida a oclusión del conducto biliar durante 6 semanas (BDL) . Cada barra representa muestras de ARN hepático provenientes de tres animales diferentes; los datos se muestran como medias ± SEM (unidades arbitrarias) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Métodos Aislamiento y cultivo de HSC El hígado se perfundió brevemente in sítu a través de la vena portal, mediante una cánula de 16-18 G con HBSS libre de calcio (Gybco, RU) durante 5 ndn, seguido de 0,1% de Pronase E (Sigma) , y luego con 0,025% de colagenasa tipo IV (Sigma) en medio de Eagle modificado por Dulbecco durante 10-15 min cada uno. Se extrajo el hígado digerido, se cortó con cuidado y se siguió la incubación con 0,04% de pronasa, 0,025% de colagenasa, 0,002% de DNAsa (Sigma) en medio de Eagle modificado por Dulbecco, suplementado con HEPES 25 m a 37° C durante por 10 a 30 min bajo agitación suave. Tras la filtración con gasa de nylon de 100 µ??, se extrajeron las células parenquimáticas mediante centrifugación a baja velocidad. La fracción de HSC se extrajo de la interfaz de gradiente, tras enriquecer con una centrifugación en dos etapas mediante un gradiente de 11 y 13% de Nycodenz (Sigma) a .l-.-500-.~g-—durante- 1-5- -min sin -frenar, y se siembra con una densidad de 0,5 x 10s/cm2 en DMEM suplementado con 10% de FCS, penicilina y estreptomicina. El medio se cambió tras 24 h, y luego cada 48 horas. La viabilidad de las células aisladas se evaluó mediante exclusión con azul tripán, y de rutina fue mayor del 95-98%. Se confirmó la pureza de los aislamientos de HSC por su típico aspecto morfológico: gotas de lípidos en el citoplasma, que muestra autofluorescencia verdosa con excitación a 390 nm y forma similar a una estrella. Se evaluó la contaminación con células de Kupffer por la capacidad para incorporar perlas de látex de 3 µp?, que fue inferior al 3-5% tras el aislamiento, y es casi indetectable después del primer pasaje. Para los experimentos se usaron células entre el primer y el tercer pasaje, si no se especifica lo contrario.

Además, se usaron las líneas de células HSC CFSC-2G (moderadamente activadas, cortesía del Dr. M. Rdjkind, Washington DC, EE.UU.). Experimentación en animales: ratas Wistar machos adultos, de peso promedio 206 ± 19 g, fueron sometidas a un procedimiento microquirúrgico bajo un microscopio de cirugía (OPMI 6-S, Zeiss, Alemania) (45-47): 1. incisión de la línea media abdominal, tras anestesia con 100 mg/kg de clorhidrato de cetamina (Ketanest®, Parke-Davis, Alemania) y 10 mg/kg de clorhidrato de 5 , 6-dihidro-2- (2 , 6-xilidino) -4H-1 , 3-tiazina (Rompun®, Bayer, Alemania); 2. disección del conducto biliar común, inserción "de un catéter de teflón (Abbocath®-T 26 G, Venisystems, EE.UU.) y colocación de una ligadura distal completa y proximal incompleta con seda 5-0 (Perma-hand®, Ethicon, Alemania) ; 3. inyección retrógrada de amidotrizoato de sodio (Ethibloc®, Ethi-con, Alemania) en una dosis de 0,Q2 ml/100 g de peso corporal; 4. extracción del catéter, cierre de la ligadura proximal, escisión del conducto biliar entre las ligaduras y cierre de la herida. Después de ocluir el conducto biliar (BDO) , los animales recibieron alimentación normal (Altromin®, Lage, Alemania) y se les permitió libre acceso a agua. La mortalidad temprana (entre 1 h y 3 días) en ratas con BDO se debió a filtración de -bilis y ascendió al 9%. Dado que en este model-o recién hay evidencias de fibrosis significativa después de dos semanas con BDO, los animales que murieron antes no se tuvieron en cuenta para el análisis estadístico. Tras 6 semanas se sacrificaron las ratas bajo anestesia con ketanest/rompun, por punción del ventrículo derecho y exsanguinación. Se pesaron el hígado y el bazo, y piezas de 1-2 g de los lóbulos izquierdo y derecho se fijaron en formalina al 4% o por congelación rápida en nitrógeno líquido para realizar el análisis histológico y las determinaciones de ARNm e hidroxiprolina (HYP) . Ensayo de raspado: se estimó la migración celular a través de l reducción de la superficie- de raspado.. Se sembraron las células en una placa de 24 cavidades con una densidad de 60.000 células/cavidad. Después de lograr la confluencia se sometieron las células a inanición en medio libre de suero durante 24 h, antes de realizar un raspado a través de la monocapa de células, con la punta de una pipeta estéril. Después se pretrataron las células de la herida con el inhibidor de av£3 integrina en concentraciones crecientes (10" 10 - 10"6 M) durante 30 min y luego se trataron con PDGF-BB a una concentración de 10 ng/ml , en ausencia de suero . Se midió la reducción de la superficie de raspado en tres puntos distintos por cavidad, mediante un ocular especial con micr-ómetro de red tras 15-20 h. Incorporación de Brdü: Para evaluar la proliferación celular de novo se determinó la síntesis de ADN como incorporación de BrdU. Se sembraron las células con una densidad de 20.000 células/cavidad en placas de 96 cavidades con medio de cultivo que contiene suero fetal bovino al 10% (FCS) . Tras 24 h se cambió el medio a 0% de FCS durante las siguientes 24 h, seguido de incubación con medio que contenía PDGF-BB en una concentración de 10 ng/ml, inhibidor de a?ß3 integrina (10~9 - 10~6) o sin inhibidor durante 20 h. Durante las últimas horas de incubación se marcaron las células con pulsos de BrdU y se midió la incorporación mediante un kit de ELISA (Roche) y un _ lector de microplaca_._ PCR de tiempo real : Se aisló el ARN total de los lisados celulares mediante el equipo comercial de ARN puro (PeqLab, Erlangen, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se obtuvieron plantillas de ADNc por transcripción inversa de 0,5 mg de ARN total . Se cuantificaron los niveles de transcripción relativos por PCR-RT de tiempo real con el sistema LightCycler (Roche) , mediante 1,5 µ? de la dilución de la plantilla de ADNc en un volumen de reacción total de 15 µ? que incluyó Taq ADN- polimerasa, mezcla dNTP, buffer de reacción y MgCl2 3,0 mM provisto por el "LightCycler FastStart DNA Master Hybri-dization Probes Kit" (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada transcripción medida se usó una serie de diluciones 1:2 a 1:32 de una muestra como estándar. Se analizaron- los datos con el software LightCycler, mediante la opción "máximo proporcional de la segunda derivada" . Los genes house.keepi.ng· de ß-2 microglobulina o GAPDH se amplificaron en una reacción paralela para la normalización de los resultados.

Los juegos de sondas Tag an y cebadoras se diseñaron mediante el software Primer Express software (Perkin Elmer) en base a secuencias publicadas . Los cebadores con sentido y antisentido (cada uno a 0,5 µ?) y la sonda 5' -fosforilada 0,125 µ? con marca en el extremo 5' con el -colorante reportero (FA ) y en el extremo 3' con la molécula de atemperación (TAMRA) ""se "sintetizaron "en MWG~ Biotech" AG (Ebersberg, Alemania) . Los conjuntos de cebadores utilizados para medir la expresión de los genes blanco específicos se resumen en la tabl : Molécula blanco Cebador 5' Sonda TaqMan marcada con 5-FAM + Cebador 3' verde 3-TAMRASYBR) 1 ????-1 TCGTCITGTT TTCTG AACrCGGACCTGGTTATA CGCTGGTATAAGGTGGTCTCGAT <JCTATCATTJ AGG ATAGCTT TGFpl AGAAG CAGC ACCGCAACAACGCAATCTATGACA TCCCGAATGTCK1ACGTATIGA GGCGTGCTAA AAAGCA CTGF ATCCCTGGAA CTCCCCCGCCAACCGCAAGAT O^ACTGCrrTGGAAGGACTCGC CCCACACAAG P2-¾iicrogbb, CCGATGTATA AACCGTCAGCTGGGACCGAGACAT CAGATGATTCAGAGCrCCATAGA TGCTTGCAGA GTA •GTTAA P3-½tegrina TCCAAGTGCG Verde SYBR CAGACTGTAGCCTGCATGATGG GCAGGTGG P6-int¾tina CATTTGGATT GATATTCCAAGACAGTTGACAIGG CAAGCACATT 1TGC Para la cuantificacion de los niveles de transcripción de estado estable de ß3 y ß6 integrinas se usó PCR de tiempo real con verde SYBR como fluoroforo (Molecular Probes, Eugene, OR) . Para distinguir el producto específico de PCR de los productos no específicos y los dímeros cebadores, se realizaron análisis de las curvas de fusión. Dado que los diferentes productos de ADN se funden a distintas temperaturas, es posible distinguir los productos genuinos de los dímeros cebadores o los productos no específicos. Todos los experimentos se realizaron en cultivos de células de la línea celular símil miofibroblastos CFSC-2G (línea de células HSC derivada de hígado cirrótico de rata) y HSC/MF primario de rata. Para investigar el efecto del inhibidor de a?ß3 integrina sobre la migración celular se sembraron en placas de 24 cavidades, y luego de alcanzar la confluencia las sometió a inanición en ausencia de FCS durante 24 h. Se hicieron raspados y se trataron las células con 10 ng/ml de PDFG-BB en presencia o ausencia de inhibidor de ?ß3 10"6 - 10~9 M.-Se midió la velocidad de migración tras 17-20 h, como reducción del ancho del raspado inicial . El inhibidor ?ß3 mostró una fuerte inhibición dependiente de la dosis de la migración celular inducida por PDGF-BB en la superficie raspada. Se observó la abrogación completa de la migración con 10"6M en todos los tipos celulares utilizados (Fig. 1) . Sorprendentemente, no hubo efecto sobre el inhibidor de ?ß3 integrina sobre la migración celular estimulada por FCS (Fig. 2) , lo cual se podría deber a la estimulación de otras vías aparentemente más normales que intervienen en la migración desencadenada por FCS. EMD 409915 no mostró inhibición significativa de la migración, incluso con concentraciones reducidas de FCS (0,25%) {datos no mostrados) . Estas observaciones sugieren que la migración de HSC/MF inducida por PDGF tiene una fuerte dependencia específica de a?ß3. En consecuencia, puede ser atractivo bloquear la migración de HSC/MF en el hígado fibrótico y otros órganos fibróticos de forma muy específica, sin interferir en grado significativo con la migración "normal" usando la inhibición de ß3 integrina. Para controlar si el inhibidor de a?ß3 mostraba efectos similares sobre la proliferación celular, se sometieron las células a inanición en medio libre de suero durante 24 h y luego se trataron con PDGF-BB a una concentración de 10 ng/ml y el inhibidor de a?ß3 10"8 - 10"6 M durante 24 h. En estas condiciones, el inhibidor de a?ß3 no tuvo efecto sobre la proliferación celular estimulada por PDGF-BB en todos los tipos celulares (Fig. 3) . La misma ausencia de efecto se observó para la proliferación celular estimulada por suero (Fig. 4) . Para investigar si el inhibidor de a?ß3 integrina tuvo algún efecto sobre la expresión de ECM en ARNm de HSC/MF, se midió la expresión de un espectro de las principales moléculas profibrogénicas y antifibrogénicas tales como procolágeno al (1)1, TGFfil, ???ß2, MMP-3, MMP-13 , MMP-2 , factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF) y TIMP-1 mediante PCR de tiempo real . Ante la confluencia se sometieron a inanición las células durante 24 h en un medio libre de suero, luego se pretrataron con el inhibidor a?ß3 durante 30 min y se estimularon con PDFG-BB (10 ng/ml) durante las siguientes 24 h. Tal como se muestra en la Fig. 5, el inhibidor de a?ß3 reguló hacia debajo, de una forma dependiente de la dosis, la expresión de CTGF en las células CFSC-2G, con una inhibición máxima a lCf6 M. No hubo cambio en los niveles de transcripción de otras moléculas de ECM (datos no mostrados) . Para investigar los patrones de expresión de integrina en la fibrosis hepática se usó el modelo de rata de obstrucción biliar completa durante seis semanas, que causan cirrosis con acumulación de entre 4 o 10-12 veces del colágeno hepático relativo (por g de hígado) y absoluto (por hígado total) , respectivamente. Después de 6 semanas de oclusión de los conductos biliares se observó una notable regulación hacia arriba de la expresión de ARNm de procolágeno al (I) , TGFpi, TGFP2 y CTGF (25, 10, 200 y 190 veces, respectivamente) , en comparació -con - animales con falsa cirugía- (Fig. -6) . _ Al mismo tiempo hubo moderada regulación arriba del ARNm de a?ß3 (Fig. 7a) , mientras se observó una notable sobreexpresión (180 veces) de la subunidad ß6 de integrina en los hígados cirróticos (Fig. 7b) . Esta fuerte regulación hacia arriba de la ß6 integrina nunca se detectó en enfermedades fibróticas ni particularmente en fibrosis hepática. Las células responsables de esta regulación hacia arriba son principalmente células epiteliales del conducto biliar en proliferación (pero también HSC/miofibroblastos activados) , las células que secretan grandes cantidades de citoquinas profi rogénicas tales como TGF{3 y CTGF y que, en consecuencia, son blancos importantes para la terapia de la fibrosis hepática, además de HSC/ F activados. Por otra parte, nuestros recientes experimentos piloto en el modelo de fibrosis de rata inexorablemente progresivo de la oclusión de los conductos biliares (5-6 animales por grupo) sugieren que la inhibición específica de ß6 integrina por EMD 409849 puede aliviar significati amente la fibrosis hepática biliar secundaria al reducir el colágeno hepático total en un 50-70%, después de 5-6 semanas de oclusión del conducto biliar. En conjunto, estos datos demuestran que la inhibición específica de las a?ß3 y a?ßd integrinas por péptidos de bajo peso molecular, y en particular por sus análogos no peptidicos, es una poderosa herramienta . para _ aliviar, _ bloquear , _i.nclu.so revertir la fibrosis hepática y de otros órganos, cuyo tratamiento aún es en gran parte esquivo (11-19, 33-44). En consecuencia, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención y/o sus sales fisiológicamente aceptables, y/o sus derivados fisiológicamente aceptables se pueden utilizar para la producción de composiciones o preparaciones farmacéuticas, al darles la forma de dosificación adecuada junto con al menos un excipiente o auxiliar y, si -se desea, con uno o más compuestos activos diferentes. Las composiciones o las preparaciones así obtenidas se pueden utilizar como medicamentos en la medicina humana o veterinaria. Los excipientes son sustancias orgánicas o inorgánicas adecuadas para la administración enteral (por ejemplo, oral o rectal) o parenteral, y no reaccionan con los compuestos a usar de acuerdo con la presente invención, por ejemplo agua, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, triacetato de glicerol y otros glicéridos de ácidos grasos, gelatina, lecitina de soja, hidratos de carbono tales como lactosa o almidón, estearato de magnesio, talco o celulosa. Para la administración oral, se usan en particular comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, jarabes, jugos o gotas . En especial son de interés los comprimidos recubiertos y las cápsulas con cubierta entérica o vainas de cápsulas. Para la administración rectal se usan supositorios, y para la administración parenteral se usan soluciones, con preferencia soluciones oleosas o acuosas, y también suspensiones, emulsiones o implantes. Los compuestos para usar de acuerdo con la invención también se pueden liofilizar, y los liofilizados obtenidos se usan, por ejemplo, para la producción de preparaciones para inyección. Las composiciones o las preparaciones indicadas se pueden esterilizar y/o pueden contener auxiliares tales como conservantes, estabilizantes y/o agentes humectantes, emulsionantes, sales para afectar la presión osmótica, sustancias buffer, colorantes y/o saborizantes . De ser necesario, también pueden contener uno o más compuestos activos, por ejemplo una o más vitaminas, diuréticos, compuestos antiinflamatorios, antidiabéti-cos, analgésicos, antiflogísticos o compuestos distintos de los usados de acuerdo con la invención, tales como los compuestos que no son objeto de la presente invención, que se pueden usar en el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de los trastornos, los cuadros clínicos y/o los síntomas descritos en la presente, por ejemplo para mejorar o incentivar aún más el efecto terapéutico y/o la tolerancia de los compuestos. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se pueden obtener o producir de acuerdo con los métodos conocidos en el arte, o de forma análoga a estos métodos. Por lo general, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se producen por métodos no químicos, por ejemplo mezclando los ingredientes activos con, por ejemplo, excipientes, auxiliares, coadyuvantes y portadores fisiológicamente aceptables, y convirtiendo la mezcla en la forma de dosificación buscada, por ejemplo en comprimidos, a través de métodos de moldeado, o en soluciones, disolviendo los ingredientes activos en un solvente. En general, los ingredientes activos se convierten en una composición farmacéutica junto con uno o más excipientes, por ejemplo un excipiente sólido, líquido y/o semilíquido, o uno o más auxiliares y, si se desea, en combinación con uno o más ingredientes activos diferentes. Estas preparaciones se pueden usar como medicamentos en medicina humana o veterinaria.

Los excipientes adecuados son sustancias orgánicas o' inorgánicas apropiadas para la administración enteral (por ejemplo oral) , parenteral o tópica, y no reaccionan con los compuestos nuevos, por ejemplo agua, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, alquilenglicoles, polietilenglicoles, triacetato de glicerol, gelatina, hidratos de carbono tales como lactosa o almidón, estearato de magnesio, talco o vaselina. Para la administración oral son particularmente adecuados comprimidos, pildoras, comprimidos recubiertos, cápsulas, polvos, gránulos, jarabes, jugos o gotas, para la administración rectal son adecuados supositorios, para la administración parenteral son adecuadas soluciones, con preferencia soluciones oleosas o acuosas, además suspensiones, emulsiones o implantes, y para la aplicación tópica son adecuados ungüentos, cremas o polvos. Los compuestos nuevos también se pueden liofilizar, y el liofilizado obtenido se usa, por ejemplo, para la obtención de preparaciones inyectables. Las preparaciones indicadas se pueden esterilizar y/o pueden comprender auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizantes y/o agentes humectantes, emulsionantes, sales para modificar la presión osmótica, sustancias amortiguadoras, colorantes, saborizantes y/o una pluralidad de otros ingredientes activos, por ejemplo una o más vitaminas . Para la administración como aerosol para inhalación es posible utilizar atomizadores en los cuales el ingrediente activo está disuelto o suspendido en un gas propelente o mezcla de gases propelentes (por ejemplo C02 o clorofluorocarbonos) . El ingrediente activo se usa aguí con ventaja de forma micronizada, en cuyo caso pueden estar presentes uno o más solventes adicionales fisiológicamente aceptables, por ejemplo etanol. Las soluciones para inhalación se pueden administrar mediante la ayuda de- inhaladores convencionales . En consecuencia, los antagonistas se administran, con preferencia, en dosis de entre aproximadamente 0,001 mg y 200 -mg, con-mayor- preferencia entre aproximadamente 0,01 mg y 100 mg, con mayor preferencia aún entre aproximadamente 0,01 mg y 50 mg, y en particular entre 0,01 y 30 mg, por unidad de dosis. Con preferencia, la dosis diaria es superior o igual a aproximadamente 0,0001 mg/kg, con mayor preferencia superior o igual a aproximadamente 0,001 mg/kg, con mayor preferencia aún superior o igual a aproximadamente 0,005 mg/kg, superior o igual a aproximadamente 0,01 mg/kg, o superior o igual a aproximadamente 0,01 mg/kg. Con preferencia, la dosis diaria es, con preferencia, inferior o igual a aproximadamente 30 mg/kg, con mayor preferencia inferior o igual a aproximadamente 20 mg/kg, con mayor preferencia aún inferior o igual a aproximadamente 15 mg/kg, inferior o igual a aproximadamente 5 mg/kg o inferior o igual a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal . REFERENCIAS 1. Hood JD, Cheresh DA. Role of integrins in cell invasión and migration. Nat. Rev. Cáncer 2002; 2: 91-100. 2. Schuppan D, Ruehl M, Somasundaram R, Hahn EG. Matrix as a modulator of hepatic fibrogenesis. Sem. Liver Dis. 2001; 21: 351-72. 3. Carloni V, Romanelli RG, Pinzani M, Laffi G, Gentilini P.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido- en las siguientes reivindicaciones : 1. Uso de un antagonista de av integrina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de condiciones patológicas en un mamífero, en donde intervienen fibroblastos o miofibroblastos activados. 2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, donde el antagonista de av integrina es un antagonista a?ß3. 3. Uso de conformidad con la reivindicación 1, donde el antagonista de av integrina es un antagonista a?ß6. 4·. Uso de conformidad con la reivindicación 2 o 3, donde el antagonista de av integrina se selecciona del grupo formado por (i) ácido 3-benzo [1,2, 5] tiadiazol-5-il-3-{6- [2- (6-metilamino-piridin-2-il) -etoxi] -lH-indol-3-il }-propiónico, y (ii) ácido 3-{3-benciloxi-2- [5- (piridin-2-ilamino) entanoil-amino] -propanoilamino}-3- (3, 5-dicloro-fenil) -propiónico. 5. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la condición patológica es fibrosis o una enfermedad fibrótica. 6. Uso de conformidad con la reivindicación 5, donde la fibrosis es una enfermedad fibrotica hepática. 7. Uso de conformidad con la reivindicación 6, donde dicha enfermedad fibrotica hepática es cirrosis hepática. 8. Uso de conformidad con la reivindicación 5,- donde dicho antagonista inhibe la migración y/o la activación de HSC/MF inducida por PDGF. 9. Uso de conformidad con la reivindicación 5, donde dicho antagonista inhibe la cicatrización.