KR20040078683A - 심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 알도스테론 길항제및 비스테로이드 소염제의 조합 치료법 - Google Patents

심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 알도스테론 길항제및 비스테로이드 소염제의 조합 치료법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 염증의 치료에 유용한 알도스테론 차단제 및 NSAID의 조합을 개시하고 있다.

Description

심혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 알도스테론 길항제 및 비스테로이드 소염제의 조합 치료법{ALDOSTERONE ANTAGONIST AND NON-STEROIDAL ANTI-INFLAMMATORY AGENT COMBINATION THERAPY TO PREVENT OR TREAT CARDIOVASCULAR DISORDERS}
프로스타글란딘은 염증 과정에 주요한 역할을 하고, 프로스타글란딘의 생성, 특히 PGG2, PGH2및 PGE2의 생성의 억제는 소염제 발견의 공통 타겟이 되었다. 그러나, 프로스타글란딘-유발 동통 및 염증 과정과 연련된 부종을 감소시키는데 활성인 보편적인 비스테로이드 소염제(NSAID)는 염증 과정과 연관되지 않은 그밖의 프로스타글란딘-조절 과정에 영향을 미치는데도 활성이다. 따라서, 가장 보편적인NSAID를 높은 투여량으로 사용하면 치료 가능성을 제한하는, 생명을 위협하는 궤양을 비롯한 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. NSAID에 대한 대안은 코르티코스테로이드의 사용인데, 이는 특히 장기 치료가 수반된 경우 심각한 불리한 결과를 일으키기도 한다.
NSAID는 인간의 아라키돈산/프로스타글란딘 경로에서, 효소 사이클로옥시게나제(COX)를 비롯한 효소를 억제함으로써 프로스타글란딘의 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 최근에, 염증과 관련된 유발성 효소(즉, "사이클로옥시게나제-2(COX-2)" 또는 프로스타글란딘 G/H 신타제 II")를 발견하였다.
몇몇 연구에서는 염증이 심혈관 질환에서 일정한 역할을 하고 있다는 사실을 제안하였다. 예를 들어, 리드커(Ridker) 등의 문헌[New Eng. J. Med., 336, 973-9(1997)]에서는 심혈관 질환에서 염증의 가능한 역할을 기재하고 있다. 보일(J. Boyle)의 문헌[J. Path., 181, 93-9 (1997)]에서는 플라크 파열과 죽상경화 염증의 연관성을 기재하고 있다.
심혈관 질환의 치료 또는 예방에 있어서, 현존 약물 치료법은 항상 효과적이지 않거나 치료를 받는 대상이 잘 참을 수 없다. 따라서, 이러한 필요성을 충족시킬 신규한 약물 치료법이 필요하다. 이에 의해, 본 발명은 심혈관 질환을 치료하거나 예방하는 알도스테론 길항제 및 NSAID의 조합을 이용한 신규한 약물 치료법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 심혈관 질환의 예방 또는 치료에 있어서 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합 치료법의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 심혈관 질환을 예방하거나 치료하는 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 죽상경화증을 비롯한 심혈관 질환을 예방하거나 치료하는데 있어서 알도스테론 길항제 및 비스테로이드 소염제(NSAID) 조합 치료법의 용도에 관한 것이다.
도 1은 안지오텐신(Ang) II 주입된 래트 연구에서 심장수축 혈압의 변화를 도시한다.
도 2는 안지오텐신 II 주입된 래트의 심장에서 혈관 염증의 에플레레논(에폭시멕스레논)에 의한 저지를 도시한다.
도 3은 비히클 주입된 래트의 심장에서 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 발현 결여를 도시한다.
도 4는 Ang II 주입된 래트의 심장에서 COX-2 발현 유도를 도시한다.
도 5는 Ang II 주입된 래트의 심장에서 COX-2 발현 유도의 에플레레논에 의한 저지를 도시한다.
도 6은 비히클 주입된 래트의 심장에서 오스테오폰틴 발현 결여를 도시한다.
도 7은 알도스테론 주입된 래트의 심장에서 오스테오폰틴 발현 유도의 에플레레논에 의한 저지를 도시한다.
도 8은 알도스테론 주입된 래트의 심근에서 오스테오폰틴 상향조절의 에플레레논에 의한 저지를 도시한다.
도 9는 알도스테론 주입된 래트의 심근에서 COX-2 상향조절의 에플레레논에 의한 저지를 도시한다.
도 10은 알도스테론 주입된 래트에서 심근 손상의 에플레레논에 의한 저지를 도시한다.
도 11은 알도스테론 주입된 래트의 관상 동맥벽에서 COX-2 및 오스테오폰틴의 상향조절된 동시 발현을 도시한다.
도 12는 알도스테론-유도된 혈관 염증 및 손상에 관한 기작의 일부를 도시한다.
도 13은 안지오텐신 II가 주입된, 캡토프릴로 치료한 뇌졸중-경향성 자연발생 고혈압 래트에서 에플레레논 치료에 의한 증가된 뇨 단백 배설의 저지를 도시한다.
도 14는 안지오텐신 II가 주입된, 캡토프릴로 치료한 뇌졸중-경향성 자연발생 고혈압 래트에서 에플레레논 치료에 의한 신장 손상에 대한 조직병리학적 점수의 감소를 도시한다.
도 15는 뇌졸중-경향성 자연발생 고혈압 래트에서 에플레레논 치료에 의한 증가된 생존률 및 감소된 뇌 손상을 도시한다.
도 16은 뇌졸중-경향성 자연발생 고혈압 래트에서 에플레레논 치료에 의한 뇌 손상의 감소를 도시한다.
도 17은 에플레레논으로 치료한 알도스테론-주입된 고혈압 래트에서 심근 COX-2의 조기-경시 발현 억제를 도시한다.
도 18은 에플레레논으로 치료한 알도스테론-주입된 고혈압 래트에서 심근 오스테오폰틴의 조기-경시 발현 억제를 도시한다.
도 19는 에플레레논으로 치료한 알도스테론-주입된 고혈압 래트에서 심근 MCP-1의 조기-경시 발현 억제를 도시한다.
도 20은 에플레레논으로 치료한 알도스테론-주입된 고혈압 래트에서 심근ICAM-1 및 VCAM-1의 조기-경시 발현 억제를 도시한다.
도 21은 알도스테론 주입을 이용한 심장수축 혈압 상승, 및 알도스테론 주입 및 에플레레논 치료를 이용한 상기 상승의 강하를 도시한다.
도 22는 대조군 래트, 알도스테론이 주입된 래트, 및 알도스테론이 주입되고 에플레레논으로 치료한 래트에 대한 28일째날 심근 조직병리학적 점수, 및 알도스테론이 주입된 래트, 및 알도스테론이 주입되고 에플레레논으로 치료한 래트에 대한 심장 중량 대 체중의 비율을 도시한다.
도 23은 대조군 래트, 알도스테론이 주입된 래트, 및 알도스테론이 주입되고 에플레레논으로 치료한 래트에 대한 28일 순환 오스테오폰틴 수준을 도시한다.
도 24는 대조군 래트, 알도스테론이 주입된 래트, 및 알도스테론이 주입되고 에플레레논으로 치료한 래트에서 염증성 사이토카인에 대한 28일째날의 상대적인 mRNA 발현을 도시한다.
본 발명은 심혈관 질환의 치료 또는 예방이 필요한 대상의 심혈관 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 NASID(이의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하지만 이들로 한정되지 않음)와 조합한 치료 효과량의 알도스테론 수용체 길항제(이의 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하지만 이들로 한정되지 않음)로 대상을 치료하는 것을 포함한다.
상기 방법은, 대상에서 심장, 신장 및 뇌의 염증-관련 질병, 구체적으로는혈관성 염증-관련 질병을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증-관련 질병을 예방 또는 치료(이로 한정되지 않음)하는데 유용할 것이다. 상기 방법은 고혈압, 심장부전, 심근경색증 이후의 심장부전, 울혈심부전증, 관상동맥질환, 동맥류, 동맥경화증, 심장 이식 죽상경화증을 포함한 죽상경화증, 심근경색증, 색전증, 뇌졸중, 정맥 혈전증을 포함한 혈전증, 불안정 앙기나를 포함한 앙기나, 석회화(예: 혈관 석회화 및 판(valvar) 석회화), 가와사키병(Kawasaki disease) 및 염증(예: 관상 플라크 염증, 클라미디아-유도성 염증을 포함한 세균-유도성 염증 및 바이러스 유도성 염증)의 예방 또는 치료에 유용할 것이다.
상기 방법은 직접 또는 간접적으로 염증을 조절하는 하나 이상의 발현 생성물의 발현을 변경함으로써 염증-관련 질병을 치료 또는 예방(이에 한정되지 않음)하는데 유용하다. 염증-관련 질병, 특히 염증-관련 심혈관 질병은 증가하거나 감소된 발현을 견딜 수 있는 하나 이상의 발현 생성물에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 매개될 수 있다. 상기 발현 생성물은 직접적으로 또는 간접적으로 효과를 나타내는, 함께 또는 단독으로 작용하는 유기 분자, 단백질, DNA계 또는 RNA계 분자, 및 이러한 생성물의 망상구조물 또는 응집물을 포함할 수 있지만 이들로 한정되지 않는다. 둘 이상의 발현 생성물을 포함하는 상기 발현 생성물의 발현 패턴의 변화는 연속해서 또는 동시에 나타날 것이다. 이들 발현 생성물은 대상의 조직 또는 기관에 직접 또는 간접적인 영향을 미쳐, 다른 분자 또는 발현 생성물에 의해 유도되는 치료 효과를 증폭시키거나 유발할 수도 있다. 이들 발현 생성물은 전구-염증성 또는 항-염증성 발현 생성물로서의 이들의 기능에 따라 각각 증가하거나 감소한 발현에 의해 전구-염증성 효과를 나타낼 수 있다.
상기 방법은 알도스테론 길항이 사이클로옥시게나제의 발현을 유도할 수 있는 신장, 특히 반점이 치밀한 곳에서 사이클로옥시게나제의 활성을 억제하면서 또한 사이클로옥시게나제 및 오스테오폰티을 비롯한 감염된 조직에서 발견되는 전구-염증성 성분의 상향조절을 완화함으로써 병을 치료하거나 예방하는데 특히 유용하다. 알도스테론 길항제의 사용은 염증-관련 질병에 의해 유도된 사이클로옥시게나제 발현을 감소시키기도 하지만, 사이클로옥시게나제 활성을 완전히 저지할 수는 없다. 사이클로옥시게나제 활성을 억제하는 NSAID 첨가의 동시-작용은 또한 감염된 조직 또는 기관의 염증을 감소시킬 것이다. 알도스테론 길항제의 사용은 신장에서 콩팥세관고리의 큰 가지쪽으로 올라가는 피질이 밀집한 곳(CTAL) 및 반점이 치밀한 곳에서 사이클로옥시게나제의 상향조절을 유도할 수 있다. 신장에서, 프로스타글란딘, 사이클로옥시게나제의 생성물은 신장 혈류역학 및 염/물 항상성의 조절에 수반된다. 그 결과, 반점이 치밀한 곳 및 신장의 CTAL 영역에서의 사이클로옥시게나제의 비염증성 알도스테론 길항제 유도는 증가된 혈압 및 염 및 물의 정체와 같은 병리학적 결과를 가져올 수 있다. 따라서, 알도스테론 길항제와, 사이클로옥시게나제를 억제하는 NSAID의 동시-투여는 신장에서 사이클로옥시게나제의 알도스테론 길항제 유도에 반응하는 병리학적 신장 반응의 진행을 느리게 하거나 정지시키거나 역전시킬 것이다.
상기 방법에서, 심혈관 질병은 염증 성분과, 알도스테론 또는 사이클로옥시게나제 또는 둘다에 의해 매개될 수 있는 것을 갖는 것으로 공지된 질병을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상기 방법은 또한 사이클로옥시게나제 또는 오스테오폰틴의 상향조절된 발현의 완화를 요하는 알도스테론 길항제 및 NSAID의 조합을 이용한 대상의 치료를 포함한다. 신장, 심장 및 뇌를 포함하지만 이에 한정되지 않는 조직에서 사이클로옥시게나제가 유도되어 전구-염증성 효소의 상향조절된 발현을 일으킬 수 있고, 이는 가벼운 내지 심각한 조직 및 기관 손상을 야기할 수도 있다. 상기 방법에서, 알도스테론 길항제 및 NSAID의 조합 투여를 이용하여 사이클로옥시게나제의 상향조절된 발현을 완화한다. 상기 방법은 또한 전구-염증성 단백질 오스테오폰틴의 상향조절된 발현이 유도되어 가벼운 내지 심각한 조직 및 기관 손상을 일으킬 수 있는, 신장, 심장 및 뇌를 포함하지만 이에 한정되지 않은 조직에서 일어날 수 있는 병을 예방 또는 치료하는데 유용할 것이다. 상기 방법에서, 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합 투여를 이용하여 오스테오폰틴의 상향조절된 발현을 완화한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 전구-염증성 발현 생성물 MCP-1, IL-1, IL-6, VCAM-1 및 ICAM-1 중 어느 하나의 상향조절된 발현이 일어나 가벼운 내지 심각한 조직 및 기관 손상을 일으킬 수 있는, 신장, 심장 및 뇌를 포함하지만 이에 한정되지 않는 조직 및 기관의 병을 예방 또는 치료하는데 유용할 것이다. 상기 방법에서, 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합 투여를 이용하여 MCP-1, IL-1, IL-6, VCAM-1 및 ICAM-1 중 어느 하나의 상향조절된 발현을 완화한다.
발현 생성물의 발현이 완화되어 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합을 이용한 치료에 의해 염증-관련 심혈관 질환을 감소시킬 수 있는 발현 생성물의 비제한적인예는 도 24에 도시되어 있다. 상향조절될 수 있는 전구-염증성 발현 생성물의 비제한적인 예는 하기 (a) 내지 (e) 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 안지오텐신 II 및 엔도텐린에 대한 수용체,
(b) 분자 avβ3(유착, 증식, 이동) 및 CD44(이동)를 활성화하는 단핵세포,
(c) 혈관 염증 인터페론-γ(Inf-γ), 인터루킨-1(IL-1) 및 종양 괴사 인자-a(TNF-a)의 매개체,
(d) 조직 손상 슈퍼옥사이드 라디칼을 생성하는 NADH/NADPH 옥시다제, 및
(e) 활성 조직에서 플라스미노겐 활성자(t-PA)의 감소를 야기하는 프로트롬보성 플라스미노겐 활성자 억제제-1(PAI-1).
본 발명의 다른 실시태양에서, 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합을 이용한 치료에 의해 염증-관련 심혈관 질환을 감소시키도록 발현 생성물의 발현이 완화될 수 있는 발현 생성물의 비제한적인 예는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
C-반응성 단백질(CRP)과 같은 급성기반응물질,
인터루킨-6(IL-6), IL-10, IL-12, 가용성 세포내 유착 분자-1(sICAM-1)와 같은 다면발현성 사이토카인,
트로포닌 T 또는 I, 열 충격 단백질 65(HSP65), 아밀로이드, 포스포리파제 A2, 피브리노겐, CD40/CD40L 신호전달 경로, 및
콜라겐-결합 인테그린 a1β1(중간엽세포) 및 a2β1(상피세포)와 같은 유착 매개체.
본 발명의 다른 실시태양에서, 하나 이상의 염증-관련 발현 생성물은 10% 이상의 발현 증가 또는 감소를 통한 알도스테론 수용체 길항제 및 NSAID의 조합 치료에 의해 완화되거나 조절될 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 발현 생성물은 25% 이상의 발현 증가 또는 감소를 통한 알도스테론 수용체 길항제 및 NSAID의 조합 치료에 의해 완화되거나 조절될 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 발현 생성물은 50% 이상의 발현 증가 또는 감소를 통한 알도스테론 수용체 길항제 및 NSAID의 조합 치료에 의해 완화되거나 조절될 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 발현 생성물은 100% 이상의 발현 증가 또는 감소를 통한 알도스테론 수용체 길항제 및 NSAID의 조합 치료에 의해 완화되거나 조절될 수 있다.
심혈관 질병의 예방에 사용되는 아라키돈산의 대사에 있어서 사이클로옥시게나제 경로 억제제는 다양한 기작을 통해 효소 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 사용된 억제제는 효소 활성의 발현을 억제할 수 있다. 염증 손상 부위에서 알도스테론 길항제를 사용한 사이클로옥시게나제-2 발현의 차단은, 특히 NSAID의 높은 투여량으로 장기 예방 치료가 예상되는 비선택적 NSAID의 사용시 일어날 수 있는 위 부작용을 최소화한다는 점에서 매우 유익하다.
투여량 및 치료 요법
투여되는 알도스테론 수용체 길항제 차단제의 양 및 본 발명의 방법에서의 투여량 요법은 나이, 체중, 성별 및 대상의 내과적 질병, 발병 결과의 심중도, 투여 경로 및 빈도, 및 사용된 특정 알도스테론 차단제를 비롯한 다양한 인자에 좌우되고, 이로써 광범위하게 변할 수도 있다. 대상에게 투여되는 1일 투여량이 약 0.001 내지 30㎎/체중1㎏, 바람직하게는 약 0.005 내지 약 20㎎/체중1㎏, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 약 15㎎/체중1㎏, 더욱더 바람직하게는 약 0.05 내지 약10㎎/체중1㎏, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 5㎎/체중1㎏인 것이 적합할 수 있다.
인간 대상에게 투여되는 알도스테론 길항제의 1일 투여량은 전형적으로는 약 0.1 내지 약 2000㎎의 범위일 것이다. 본 발명의 한 실시태양에서, 1일 투여량 범위는 약 0.1 내지 약 400㎎이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 1일 투여량 범위는 약 1 내지 약 200㎎이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 1일 투여량 범위는 약 1 내지 약 100㎎이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 1일 투여량 범위는 약 10 내지 약 100㎎이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 1일 투여량 범위는 약 25 내지 약 100㎎이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 1일 투여량은 5㎎, 10㎎, 12.5㎎, 25㎎, 50㎎, 75㎎ 및 100㎎으로 이루어진 군중에서 선택된다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 1일 투여량은 25㎎, 50㎎ 및 100㎎으로 이루어진 군중에서 선택된다. 대상에서 상당한 이뇨 및/또는 항고혈압 작용을 전혀 나타내지 못하는 알도스테론 차단제의 1일 투여량도 보다 명확히 말하면 본 발명에 포함된다. 1일 투여량은 1일 당 1 내지 4회 분량으로 투여될 수 있다.
알도스테론 차단제의 투약은, 혈압 또는 적합한 대용 표지(예: 나트륨이뇨 펩타이드, 엔도텔린, 및 하기 논의된 그밖의 대용 표지)를 기준으로 결정되고 조정될 수 있다. 알도스테론 차단제 투여 후의 혈압 및/또는 대용 표지 레벨을 본 발명의 방법의 효능을 측정하기 위해 알도스테론 차단제의 투여 전에 상응하는 기준선 레벨과 비교하여, 필요한 경우 적정할 수 있다. 본 방법에 유용한 대용 표지의 비제한적인 예는 신장 및 심혈관 질환의 대용 표지이다.
예방 투약
상기 염증-관련 심혈관 질병의 진단 이전에 알도스테론 차단제를 예방적으로 투여하고, 대상이 염증-관련 심혈관 질병에 민감한 기간 동안 알도스테론 차단제의 투여를 계속하는 것이 유익하다. 따라서, 눈에 띄는 임상적 표시는 없지만 그럼에도 불구하고 병리학적 효과에 민감한 개체에게 알도스테론 차단 화합물을 예방적으로 투여할 수 있다. 이러한 알도스테론 차단제의 예방적 투여량은 관심있는 특정한 병원성 작용을 치료하는데 사용되는 투여량보다 적을 수도 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
심혈관 병리 투약
심혈관 기능의 병리를 치료하기 위한 투약은 나트륨이뇨 펩타이드의 혈액 농도의 측정을 기준으로 결정되고 조정될 수 있다. 나트륨이뇨 펩타이드는 심혈관, 신장 및 내분비의 항상성에 다양한 역할을 하는 구조적으로 유사하지만 유전적으로 구별되는 펩타이드의 한 그룹이다. 심방 나트륨이뇨 펩타이드("ANP") 및 뇌 나트륨이뇨 펩타이드("BNP")는 심근 세포 기원이며 C-형 나트륨이뇨 펩타이드("CNP")는 내피 기원이다. ANP 및 BNP는 3',5'-사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP)를 통해 나트륨이뇨항진, 혈관확장, 레닌 억제, 항유사분열생식 및 루시트로픽(lusitropic) 특성을 매개하는 나트륨이뇨 펩타이드-A 수용체("NPR-A")에 결합한다. 혈액중의 상승된 나트륨이뇨 펩타이드 수준, 특히 혈액 BNP 수준은 일반적으로 혈액 체적 팽창 조건 하에 급성 심근경색증과 같은 혈관 손상 후에 대상에게서 관찰되며 심근경색증 이후의 연장된 기간 동안 상승한 채로 남아있게 된다(Uusimaaet al.:Int. J. Cardiol1999; 69: 5-14).
알도스테론 차단제의 투여 이전에 측정된 기준선 레벨에 비례하는 나트륨이뇨 펩타이드 수준의 감소는 알도스테론의 병리 작용의 감소를 나타내며 따라서 병리 작용의 억제와의 상관관계를 제공한다.
따라서, 목적하는 나트륨이뇨 펩타이드 수준의 혈액 수준은 병리 작용을 치료하는 본 발명의 방법의 효능을 결정하기 위해 알도스테론 차단제의 투여 이전에 상응하는 기준선 레벨과 비교할 수 있다. 이러한 나트륨이뇨 펩타이드 수준 측정치를 기준으로, 알도스테론 차단제의 투약을 심혈관 병리 작용을 감소시키도록 조정할 수 있다.
유사하게, 심장 병리는 순환 및 뇨의 cGMP 수준을 기준으로 확인되고, 적절한 투약이 결정될 수 있다. cGMP의 증가된 혈장 수준은 평균 동맥압의 저하와 병행한다. cGMP의 증가된 뇨 배설은 나트륨이뇨항진과 연관된다.
심장 병리는 또한 감소된 박출율 또는 심근경색증 또는 심장부전 또는 좌심실 비대증의 존재에 의해 확인될 수 있다. 좌심실 비대증은 심장초음파상 또는 자기 공명 영상에 의해 확인되며 치료의 진행 및 투약의 적절성을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 나트륨이뇨 펩타이드 수준, 특히 BNP 수준을 감소시킴으로써 또한 관련된 심혈관 병리를 치료하는데 사용할 수 있다.
신장 병리 투약
신장 기능의 병리를 치료하기 위한 투약은 단백뇨, 미소단백뇨, 감소된 사구체 여과율(GFR) 또는 감소된 크레아티닌 청소의 측정을 기준으로 결정되고 조정될 수 있다. 단백뇨는 24시간 소변 채집시에 0.3g보다 많은 뇨단백의 존재에 의해 확인된다. 미소단백뇨는 면역분석이 가능한 뇨 알부민의 증가에 의해 확인된다. 상기 측정을 기준으로, 알도스테론 차단제의 투약은 신장 병리 작용이 감소하도록 조정할 수 있다.
신경병증 병리 투약
신경병증, 특히 말초 신경병증은 지각 부족 또는 지각 운동 능력의 신경학적 검사를 기준으로 확인되고 투약을 조정할 수 있다.
망막병증 병리 투약
망막병증은 안과학적 검사를 기준으로 확인되고 투약을 조정할 수 있다.
염증 표지
특정 표지는 염증, 전구-염증 상태를 나타내거나 지시하거나 이를 초래할 수 있다. 이러한 표지의 측정은 투여될 알도스테론 차단제의 적절한 투여량의 결정, 또는 투여 후의 알도스테론 차단제의 유효한 투여량의 결정에 유용할 수 있다. 이러한 표지의 비제한적인 예로는 오스테오폰틴; C 반응성 단백질(CRP), 피브리노겐, VIII형 인자, 혈청 구리(담체 단백질 세룰로플라스민), 혈청 철(담체 단백질 페리틴), 플라스미노겐 활성자 억제제-1(PAI-1) 및 지질단백질(a)과 같은 급성기반응물질; 나트륨이뇨 펩타이드; 엔도텔린; VCAM-1; ICAM-1; IL-1β; TNF-α; IL-6; COX-2; 프랙탈킨; MCP-1; 및 트라이글리세라이드가 있다.
본 발명에 유용한 NSAID는 표 1에 목록으로 기재한 화합물(이들 화합물의 유도체도 포함함)을 포함한다. 하기 표 1에 목록으로 기재된 각각 공개된 문헌에는 NSAID의 선택된 양태, 예를 들어 이러한 화합물의 화학적 제법 또는 생물학적 특성이 기재되어 있다. 이들 각각의 문헌의 내용은 본원에 참고로 인용되어 있다.
한 실시태양에서, NSAID는 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택된다.
다른 실시태양에서, NSAID는 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜 및 플루비프로펜으로 이루어진 군중에서 선택된다.
다른 실시태양에서, NSAID는 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센 및 옥사프로진으로 이루어진 군중에서 선택된다.
다른 실시태양에서, NSAID는 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥,서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택된다.
"NSAID"란 용어는 구조적으로 NSAID와 관련되고 실질상 동등한 생물학적 활성을 갖는 임의의 화합물(예: 유도체 및 약학적으로 허용가능한 염)을 포함한다. 예를 들어, 이러한 화합물은 이들의 전구물질도 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"알도스테론 수용체 길항제" 또는 "알도스테론 길항제"란 용어는 알도스테론의 수용체-매개된 활성을 조정하도록 수용체 부위에서 알도스테론 자체의 작용의 경쟁적 억제제로서 알도스테론 수용체와 결합할 수 있는 화합물을 의미한다.
알도스테론 길항제
본 발명의 방법에 사용된 알도스테론 길항제는 일반적으로 스피로락톤형 스테로이드성 화합물이다. "스피로락톤형"이란 용어는 스피로 결합 배열을 통해 전형적으로는 스테로이드 "D" 고리에서 스테로이드 핵에 부착된 락톤 잔기를 포함하는 구조를 특징으로 갖는 것으로 의도된다. 스피로락톤형 알도스테론 길항제 화합물의 아부류는 에플레레논과 같은 에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제 화합물로 이루어진다. 또다른 아부류의 스피로락톤형 길항제 화합물은 스피로노락톤과 같은 비에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제 화합물로 이루어진다.
본 발명의 방법에 사용되는 에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제 화합물은 일반적으로 에폭시형 잔기로 치환된 스테로이드 핵을 가진다. "에폭시형" 잔기란 용어는 2개의 탄소원자 사이의 브릿지로서 산소원자를 갖는 특징을 나타내는 임의의 잔기를 포함하는 것으로 의도되며, 그 예로는 다음의 잔기를 포함한다:
"에폭시-스테로이드성"이란 어구에 사용된 바와 같은 "스테로이드성"이란 용어는, 전형적인 "A", "B", "C" 및 "D" 고리를 갖는, 사이클로펜테노-페난트렌 잔기에 의해 제공된 핵을 의미한다. 에폭시형 잔기는 임의의 부착가능한 또는 치환가능한 위치에서 사이클로펜테노페난트렌 핵에 부착될 수 있는, 즉 스테로이드 핵의 고리 중 하나에 융합될 수 있거나, 또는 상기 잔기가 고리 시스템의 고리원상에 치환될 수 있다. "에폭시-스테로이드성"이란 어구는 하나 또는 다수의 에폭시형 잔기가 부착되어 있는 스테로이드 핵을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합한 에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제는 스테로이드 핵의 "C" 고리에 융합된 에폭시 잔기를 갖는 화합물 부류를 포함한다. 9α,11α-치환된 에폭시 잔기의 존재를 특징으로 하는 20-스피록세인 화합물이 특히 바람직하다. 하기 표 1에서 화합물 1 내지 11은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 전형적인 9α,11α-에폭시-스테로이드성 화합물이다. 이들 에폭시 스테로이드는 그롭(Grob) 등의 미국 특허 제 4,559,332 호에 기재된 절차에 의해 제조될 수 있다. 9,11-에폭시 스테로이드성 화합물 및 그의 염의 제조에 관한 추가적 방법은 Ng 등의 WO 97/21270 호 및 Ng 등의 WO 98/25948 호에 개시되어 있다.
상기 도시된 화합물(1)인 에플레레논(또한 에폭시멕스레논 및 CGP 30 083으로도 공지되어 있음)이 특히 관심의 대상이다. 에플레레논에 대한 화학적 명칭은 프레근-4-엔-7,21-다이카복실산, 9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소, γ-락톤, 메틸 에스터(7α,11α,17α)이다. 이 화학적 명칭은 에플레레논에 대한 CAS 등록 명칭(에플레레논에 대한 CAS 등록 명칭은 107724-20-9)에 해당된다. 미국 특허 제 4,559,332 호에서는 에플레레논을 9α,11α-에폭시-7α-메톡시카보닐-20-스피록스-4-엔-3,21-다이온의 또다른 명칭에 의해 동일한 것으로 간주한다. 이러한 "스피록세인" 명칭은, 예를 들어 미국 특허 제 4,559,332 호의 제2단락 16열 내지 제4단락 48열에 추가로 기재되어 있다. 에플레레논은 알도스테론 수용체 길항제이며 예컨대 스피로노락톤보다 높은 알도스테론 수용체에 대한 특이성을 갖는다. 본 발명의 방법에서 알도스테론 길항제로서 에플레레논을 선택함은 특이성을 덜 갖는 알도스테론 길항제의 사용으로 야기되는 여성형유방증과 같은 특정 부작용을 감소시키는데 유익할 것이다.
본 발명의 방법에 사용하기 적합한 비에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제로는 하기 화학식 I로 정의된 스피로락톤형 화합물 부류를 들 수 있다:
상기 식에서,
는또는이고,
R은 탄소수 5 이하의 저급 알킬이고,
는또는이다.
저급 알킬 잔기는 분지된 기 및 분지되지 않은 기, 바람직하게는 메틸, 에틸 및 n-프로필을 포함한다.
화학식 I 내에서 관심있는 특정 화합물은 다음과 같다:
7α-아세틸티오-3-옥소-4,15-안드로스타다이엔-[17(β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온,
3-옥소-7α-프로피오닐티오-4,15-안드로스타다이엔-[17((β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온,
6β,7β-메틸렌-3-옥소-4,15-안드로스타다이엔-[17((β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온,
15α,16α-메틸렌-3-옥소-4,7α-프로피오닐티오-4-안드로스텐[17(β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온,
6β,7β,15α,16α-다이메틸렌-3-옥소-4-안드로스텐[17(β-1')-스피로-5']-퍼하이드로퓨란-2'-온,
7α-아세틸티오-15β,16β-메틸렌-3-옥소-4-안드로스텐-[17(β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온,
15β,16β-메틸렌-3-옥소-7β-프로피오닐티오-4-안드로스텐-[17(β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온, 및
6β,7β,15β,16β-다이메틸렌-3-옥소-4-안드로스텐-[17(β-1')-스피로-5']퍼하이드로퓨란-2'-온.
화학식 I의 화합물을 제조하는 방법은 1978년 12월 12일자로 위차트(Wiechart) 등에게 허여된 미국 특허 제 4,129,564 호에 기재되어 있다.
관심있는 비에폭시-스테로이드성 화합물의 또다른 부류는 하기 화학식 II로 정의된다:
상기 식에서,
R1은 C1-3-알킬 또는 C1-3아실이고, R2는 H 또는 C1-3-알킬이다.
화학식 II 내에서 관심있는 특정 화합물은 다음과 같다:
1α-아세틸티오-15β,16β-메틸렌-7α-메틸티오-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21,17-카보락톤, 및
15β,16β-메틸렌-1α,7α-다이메틸티오-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21,17-카보락톤.
화학식 II의 화합물을 제조하는 방법은 1988년 12월 6일자로 니키쉬(Nickish) 등에게 허여된 미국 특허 제 4,789,668 호에 기재되어 있다.
관심있는 비에폭시-스테로이드성 화합물의 또다른 부류는 하기 화학식 III의 구조로 정의된다:
상기 식에서, R은 저급 알킬이며, 바람직한 저급 알킬 기로는 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸이 있다. 관심있는 특정 화합물로는 다음을 들 수 있다:
3β,21-다이하이드록시-17α-프레그나-5,15-다이엔-17-카복실산 γ-락톤,
3β,21-다이하이드록시-17α-프레그나-5,15-다이엔-17-카복실산 γ-락톤 3-아세테이트,
3β,21-다이하이드록시-17α-프레근-5-엔-17-카복실산 γ-락톤,
3β,21-다이하이드록시-17α-프레근-5-엔-17-카복실산 γ-락톤 3-아세테이트,
21-하이드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-17-카복실산 γ-락톤,
21-하이드록시-3-옥소-17α-프레그나-4,6-다이엔-17-카복실산 γ-락톤,
21-하이드록시-3-옥소-17α-프레그나-1,4-다이엔-17-카복실산 γ-락톤,
7α-아실티오-21-하이드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-17-카복실산 γ-락톤, 및
7α-아세틸티오-21-하이드록시-3-옥소-17α-프레근-4-엔-17-카복실산 γ-락톤.
화학식 III의 화합물을 제조하는 방법은 1966년 6월 21일자로 파체트(Patchett)에게 허여된 미국 특허 제 3,257,390 호에 기재되어 있다.
관심있는 비에폭시-스테로이드성 화합물의 또다른 부류는 화학식 IV로 표시된다:
상기 식에서,
E'는 에틸렌, 비닐렌 및 (저급 알카노일)티오에틸렌 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택되고,
E"는 에틸렌, 비닐렌, (저급 알카노일)티오에틸렌 및 (저급 알카노일)티오프로필렌 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R은, E' 및 E"가 각각 에틸렌 및 (저급 알카노일) 티오에틸렌 라디칼인 경우 수소 및 메틸 라디칼로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 제외하고는, 메틸 라디칼이고,
E' 및 E"는 1종 이상의 (저급 알카노일)티오 라디칼이 존재하도록 선택된다.
화학식 IV 내에서 비에폭시-스테로이드성 화합물의 바람직한 부류는 하기 화학식 V로 표시된다:
더욱 바람직한 화학식 V의 화합물은 1-아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-안드로스트-4-엔-3-온 락톤이다.
화학식 IV 내에서 비에폭시-스테로이드성 화합물의 또다른 바람직한 부류는 하기 화학식 VI로 표시된다:
화학식 VI 내에서 더욱 바람직한 화합물은 다음을 포함한다:
7α-아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-안드로스트-4-엔-3-온 락톤,
7β-아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-안드로스트-4-엔-3-온 락톤,
1α,7α-다이아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-안드로스타-4,6-다이엔-3-온-락톤,
7α-아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-안드로스타-1,4-다이엔-3-온 락톤,
7α-아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-19-노안드로스트-4-엔-3-온 락톤, 및
7α-아세틸티오-17α-(2-카복시에틸)-17β-하이드록시-6α-메틸안드로스트-4-엔-3-온 락톤.
화학식 IV 내지 VI에서, "알킬"이란 용어는 1 내지 약 8개의 탄소를 함유하는 선형 및 분지형 알킬 라디칼을 포함하는 것으로 의도된다. "(저급 알카노일)티오"란 용어는 화학식의 라디칼을 포함한다.
하기 구조식 및 명칭을 갖는 스피로노락톤 화합물이 특히 관심의 대상이다:
"스피로노락톤": 17-하이드록시-7α-머캅토-3-옥소-17α-프레근-4-엔-21-카복실산 γ-락톤 아세테이트.
화학식 IV 내지 VI의 화합물을 제조하는 방법은 1961년 12월 12일자로 셀라(Cella) 등에게 허여된 미국 특허 제 3,013,012 호에 기재되어 있다. 스피로노락톤은, 정제 당 25㎎, 50㎎ 및 100㎎의 투여량의 정제 투여 형태로, 미국 일리노이스주 스코키 소재의 지.디. 설 앤 캄파니(G.D. Searle 및 Co.)에 의해 "알닥톤(ALDACTONE)"이란 상표명으로 시판된다.
또다른 부류의 스테로이드성 알도스테론 길항제로는 CAS 등록 번호 67392-87-4의 드로스피레논, [6R-(6α,7α,8β,9α,10β,13β,14α,15α,16α,17β)]-1,3',4',6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,20,21-헥사데카하이드로-10,13-다이메틸스피로[17H-다이사이클로프로파[6,7:15,16]사이클로펜타[a]페난트렌-17,2'(5'H)-퓨란]-3,5'(2H)-다이온을 예로 들 수 있다. 드로스피레논의 사용 및 제조 방법은 특허 GB 1550568(1979) 호, 우선권 DE 2652761(1976) 호에 기재되어 있다.
정의
"치료" 또는 "치료하는"이란 용어는 병리적 심혈관 징후의 발병을 억제 또는 전환시킬 수 있는 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합의 일정량을 필요한 사람에게 투여하는 것을 포함한다.
"예방" 또는 "예방하는"이란 용어는 개체에서 임상적으로 명백한 단계의 심혈관 질병의 개시를 예방하거나 임상적으로 명백한 심혈관 질병의 개시를 전적으로 예방하는 것을 포함한다. 이는 심혈관 질병의 발병 위험에 있는 대상의 예방적 치료를 포함한다.
"치료-효과"란 어구는 부작용을 피하면서 질병의 심중도 및 발생 빈도의 개선 목적을 달성시킬 수 있는, 조합으로 주어진 2가지 약물의 양을 한정하는 것으로 의도된다.
치료 목적에 있어서 "대상"이란 용어는 심혈관 질병에 걸리기 쉽거나 이로부터 고통받는 임의의 인간 또는 동물 대상(바람직하게는 포유동물, 소과, 돼지과,양과 또는 말과와 같은 가축, 및 개과 및 고양이과와 같은 동료 동물을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 포함하고, 바람직하게는 인간 대상이다. 대상은, 예컨대 다이어트로 인해 세균성 또는 바이러스성 감염에 노출 위험이 있고, 통상적인 표지가 존재하고, 유전적으로 심혈관 질병에 걸리기 쉬운 상태에 있을 수 있다.
"알도스테론 길항제" 및 "알도스테론 수용체 길항제"란 용어는 알도스테론과 광물부신겉질호르몬 수용체의 결합을 억제시켜 알도스테론의 생물학적 효과를 차단하는 화합물을 포함한다.
"비스테로이드 소염제" 또는 "NSAID"란 용어는 화합물의 구조에서 스테로이드 고리가 없고, 조직 또는 기관에서 염증 반응을 예방하거나, 줄이거나, 억제하는 화합물을 포함한다.
"전구-염증성"이란 용어는 조직 또는 기관에서 염증 반응을 유도하거나, 활성화하거나, 높이는 체내에서 생성된 분자를 특성으로 나타낸다.
"하이드리도"란 용어는 단일 수소원자(H)를 의미한다. 이 하이드리도 라디칼은 예컨대 산소원자에 부착되어 하이드록실 라디칼을 형성할 수 있거나, 2개의 하이드리도 라디칼은 탄소원자에 부착되어 메틸렌(-CH2-) 라디칼을 형성할 수 있다. 단독으로 또는 "할로알킬", "알킬설포닐", "알콕시알킬" 및 "하이드록시알킬"과 같은 다른 용어 내에서 사용되는 경우, "알킬"이란 용어는 탄소수 1 내지 약 20, 바람직하게는 탄소수 1 내지 약 12의 선형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 알킬 라디칼은 탄소수 1 내지 약 10의 "저급 알킬" 라디칼이다. 탄소수 1내지 약 6의 저급 알킬 라디칼이 가장 바람직하다. 이러한 라디칼의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, 아이소부틸, s-부틸, t-부틸, 펜틸, 아이소-아밀, 헥실 등을 포함한다. "알켄일"이란 용어는 1개 이상의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 탄소수 2 내지 약 20, 바람직하게는 탄소수 2 내지 약 12의 선형 또는 분지형 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 알킬 라디칼은 탄소수 2 내지 약 6의 "저급 알켄일" 라디칼이다. 알켄일 라디칼의 예로는 에텐일, 프로펜일, 알릴, 프로펜일, 부텐일 및 4-메틸부텐일을 들 수 있다. "알카인일"이란 용어는 탄소수 2 내지 약 20, 바람직하게는 2 내지 약 12의 선형 또는 분지형 라디칼을 의미한다. 더욱 바람직한 알카인일 라디칼은 탄소수 2 내지 약 10의 "저급 알카인일" 라디칼이다. 탄소수 2 내지 약 6의 저급 알카인일 라디칼이 가장 바람직하다. 이러한 라디칼의 예로는 프로파길, 부타인일 등을 들 수 있다. "알켄일", "저급 알켄일"이란 용어는 "시스" 및 "트랜스" 배향, 다르게는 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. "사이클로알킬"이란 용어는 탄소수 3 내지 12의 포화 카보사이클릭 라디칼을 포함한다. 더욱 바람직한 사이클로알킬 라디칼은 탄소수 3 내지 약 8의 "저급 사이클로알킬" 라디칼이다. 이러한 라디칼의 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 및 사이클로헥실을 들 수 있다. "사이클로알켄일"이란 용어는 탄소수 3 내지 12의 불포화 카보사이클릭 라디칼을 부분적으로 포함한다. 보다 바람직한 사이클로알켄일 라디칼은 탄소수 4 내지 약 8의 "저급 사이클로알켄일" 라디칼이다. 이런 라디칼의 예로는 사이클로부텐일, 사이클로펜텐일, 사이클로펜타다이엔일 및 사이클로헥센일을 포함한다. "할로"란 용어는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드와 같은 할로겐을 의미한다. "할로알킬"이란 용어는 알킬 탄소원자 중 임의의 하나 이상이 상기 정의된 할로로 치환된 라디칼을 포함한다. 구체적으로는 모노할로알킬, 다이할로알킬 및 폴리할로알킬 라디칼이 포함된다. 일례로, 모노할로알킬 라디칼은 요오도, 브로모, 클로로 또는 플루오로 원자를 라디칼 내에 가질 수 있다. 다이할로 및 폴리할로알킬 라디칼은 둘 이상의 동일한 할로 원자 또는 상이한 할로 라디칼의 조합을 가질 수 있다. "저급 할로알킬"은 탄소수 1 내지 6의 라디칼을 포함한다. 할로알킬 라디칼의 예로는 플루오로메틸, 다이플루오로메틸, 트라이플루오로메틸, 클로로메틸, 다이클로로메틸, 트라이클로로메틸, 트라이클로로메틸, 펜타플루오로에틸, 헵타플루오로프로필, 다이플루오로클로로메틸, 다이클로로플루오로메틸, 다이플루오로에틸, 다이플루오로프로필, 다이클로로에틸 및 다이클로로프로필을 포함한다. "하이드록시알킬"이란 용어는 1 내지 약 10개의 탄소원자-이들 중 임의의 하나는 하나 이상의 하이드록실 라디칼로 치환될 수 있다-를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 라디칼을 포함한다. 보다 바람직한 하이드록시알킬 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자 및 1개 이상의 하이드록실 라디칼을 갖는 "저급 하이드록시알킬" 라디칼이다. 이런 라디칼의 예로는 하이드록시메틸, 하이드록시에틸, 하이드록시프로필, 하이드록시부틸 및 하이드록시헥실을 포함한다. "알콕시" 및 "알킬옥시"란 용어는 각각 탄소수 1 내지 약 10의 알킬 부분을 갖는 선형 또는 분지형 옥시-함유 라디칼을 포함한다. 보다 바람직한 알콕시 라디칼은 탄소수 1 내지 6의 "저급 알콕시" 라디칼이다. 이런 라디칼의 예로는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 및 3급-부톡시를 포함한다. "알콕시알킬"이란 용어는 알킬 라디칼에 부착된 하나 이상의 알콕시 라디칼을 갖는 모노알콕시알킬 및 다이알콕시알킬 라디칼을 형성하는 알킬 라디칼을 포함한다. "알콕시" 라디칼은 플루오로, 클로로 또는 브로모와 같은 하나 이상의 할로 원자로 추가적으로 치환되어 할로알콕시 라디칼을 제공할 수 있다. 보다 바람직한 할로알콕시 라디칼은 1 내지 6개의 탄소원자 및 1개 이상의 할로 라디칼을 갖는 "저급 할로알콕시" 라디칼이다. 이런 라디칼의 예로는 플루오로메톡시, 클로로메톡시, 트라이플루오로메톡시, 트라이플루오로에톡시, 플루오로에톡시 및 플루오로프로폭시를 포함한다. "아릴"이란 용어는, 단독으로 또는 조합되어, 1, 2 또는 3개의 고리-이들 고리는 매달린 방식으로 함께 부착되거나 융합될 수 있다-를 함유하는 카보사이클릭 방향족 시스템을 의미한다. "아릴"이란 용어는 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인데인 및 바이페닐과 같은 방향족 라디칼을 포함한다. 아릴 잔기는 또한 치환가능한 위치에서 알킬, 알콕시알킬, 알킬아미노알킬, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노카보닐알킬, 알콕시, 아르알콕시, 하이드록실, 아미노, 할로, 니트로, 알킬아미노, 아실, 사이아노, 카복시, 아미노카보닐, 알콕시카보닐 및 아르알콕시카보닐중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환될 수 있다. "헤테로사이클릴"이란 용어는 포화된, 부분적으로 불포화된 및 불포화된 헤테로원자-함유 고리형 라디칼(여기서, 헤테로원자는 질소, 황 및 산소중에서 선택될 수 있다)을 포함한다. 포화된 헤테로사이클릴 라디칼의 예로는 1 내지 4개의 질소원자를 함유하는 포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기(예: 피롤리딘일, 이미다졸리딘일, 피페리딘일, 피페라진일 등); 1 또는 2개의 산소원자 및 1 내지 3개의 질소원자를 함유하는 포화된 3 내지 6원헤테로모노사이클릭 기(예: 모폴리닐 등); 1 또는 2개의 황원자 및 1 내지 3개의 질소원자를 함유하는 포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기(예: 티아졸리딘일 등)를 포함한다. 부분적으로 불포화된 헤테로사이클릴 라디칼의 예로는 다이하이드로티오펜, 다이하이드로피란, 다이하이드로퓨란 및 다이하이드로티아졸을 포함한다. "헤테로아릴"이란 용어는 불포화된 헤테로사이클릴 라디칼을 포함한다. 또한, "헤테로아릴" 라디칼이라 불리는 불포화된 헤테로사이클릴 라디칼의 예로는 1 내지 4개의 질소원자를 함유하는 불포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기, 예컨대 피롤릴, 피롤리닐, 이미다졸릴, 피라졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피라진일, 피리다진일, 트라이아졸릴(예: 4H-1,2,4-트라이아졸릴, 1H-1,2,3-트라이아졸릴, 2H-1,2,3-트라이아졸릴 등), 테트라졸릴(예: 1H-테트라졸릴, 2H-테트라졸릴 등) 등; 1 내지 5개의 질소원자를 함유하는 불포화된 축합 헤테로사이클릭 기, 예컨대 인돌릴, 아이소인돌릴, 인돌리진일, 벤즈이미다졸릴, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 인다졸릴, 벤조트라이아졸릴, 테트라졸로피리다진일(예: 테트라졸로[1,5-b]피리다진일 등) 등; 산소원자를 함유하는 불포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기, 예컨대 피나닐, 푸릴 등; 황원자를 함유하는 불포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기, 예컨대 티엔일 등; 1 또는 2개의 산소원자 및 1 내지 3개의 질소원자를 함유하는 불포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기, 예컨대 옥사졸릴, 아이소옥사졸릴, 옥사다이아졸릴(예: 1,2,4-옥사다이아졸릴, 1,3,4-옥사다이아졸릴, 1,2,5-옥사다이아졸릴 등) 등; 1 또는 2개의 산소원자 및 1 내지 3개의 질소원자를 함유하는 불포화된 축합 헤테로사이클릭 기(예: 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사다이아졸릴 등); 1 또는 2개의 황원자 및 1 내지 3개의 질소원자를 함유하는 불포화된 3 내지 6원 헤테로모노사이클릭 기, 예컨대 티아졸릴, 티아다이아졸릴(예: 1,2,4-티아다이아졸릴, 1,3,4-티아다이아졸릴, 1,2,5-티아다이아졸릴 등) 등; 1 또는 2개의 황원자 및 1 내지 3개의 질소원자를 함유하는 불포화된 축합 헤테로사이클릭 기(예: 벤조티아졸릴, 벤조티아다이아졸릴 등) 등을 포함한다. 또한 상기 용어는 헤테로사이클릴 라디칼이 아릴 라디칼과 융합된 라디칼을 포함한다. 이런 융합된 바이사이클릭 라디칼의 예로는 벤조퓨란, 벤조티오펜 등을 포함한다. 상기 "헤테로사이클릴 기"는 알킬, 하이드록실, 할로, 알콕시, 옥소, 아미노 및 아킬아미노와 같은 1 내지 3개의 치환기를 가질 수 있다. "알킬티오"란 용어는 2가 황원자에 부착된 탄소수 1 내지 약 10의 선형 또는 분지형 알킬 라디칼을 함유하는 라디칼을 포함한다. 보다 바람직한 알킬티오 라디칼은 탄소수 1 내지 6의 알킬 라디칼을 갖는 "저급 알킬티오" 라디칼이다. 이런 저급 알킬티오 라디칼의 예로는 메틸티오, 에틸티오, 프로필티오, 부틸티오 및 헥실티오이다. "알킬티오알킬"이란 용어는 2가 황원자를 통해 탄소수 1 내지 약 10의 알킬 라디칼에 부착된 알킬티오 라디칼을 함유하는 라디칼을 포함한다. 보다 바람직한 알킬티오알킬 라디칼은 탄소수 1 내지 6의 알킬 라디칼을 갖는 "저급 알킬티오알킬" 라디칼이다. 이런 저급 알킬티오알킬 라디칼의 예로는 메틸티오메틸을 포함한다. "알킬설피닐"이란 용어는 2가 -S(=O)- 라디칼에 부착된, 탄소수 1 내지 10의 선형 또는 분지형 알킬 라디칼을 함유하는 라디칼을 포함한다. 보다 바람직한 알킬설피닐 라디칼은 탄소수 1 내지 6의 알킬 라디칼을 갖는 "저급 알킬설피닐" 라디칼이다. 이런 저급 알킬설피닐 라디칼의 예로는 메틸설피닐, 에틸설피닐, 부틸설피닐 및 헥실설피닐을 포함한다. 단독으로 또는 알킬설포닐과 같이 다른 용어와 결합되어 사용되는 "설포닐"이란 용어는 각각 2가 라디칼인 -SO2-를 의미한다. "알킬설포닐"은 설포닐 라디칼에 부착된 알킬 라디칼(여기서, 알킬은 상기 정의된 바와 같다)을 포함한다. 보다 바람직한 알킬설포닐 라디칼은 탄소수 1 내지 6의 "저급 알킬설포닐" 라디칼이다. 이런 저급 알킬설포닐 라디칼의 예로는 메틸설포닐, 에틸설포닐 및 프로필설포닐을 포함한다. "알킬설포닐" 라디칼은 플루오로, 클로로 또는 브로모와 같은 하나 이상의 할로원자로 추가 치환되어 할로알킬설포닐 라디칼을 제공할 수 있다. "설파밀", "아미노설포닐" 및 "설폰아미딜"이란 용어는 NH2O2S-을 의미한다. "아실"이란 용어는 유기산에서 하이드록실을 제거한 후의 잔기에 의해 제공된 라디칼을 의미한다. 이런 아실 라디칼의 예로는 알카노일 및 아로일 라디칼을 포함한다. 이런 저급 알카노일 라디칼의 예로는 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 아이소부티릴, 발레릴, 아이소발레릴, 피발로일, 헥사노일, 트라이플루오로아세틸을 포함한다. 단독으로 또는 "알콕시카보닐"과 같이 다른 용어와 함께 사용되는 "카보닐"이란 용어는 -(C=O)-를 의미한다. "아로일"이란 용어는 상기 정의된 카보닐 라디칼을 갖는 아릴 라디칼을 포함한다. 아로일의 예로는 벤조일, 나프토일 등을 포함하고, 상기 아로일에서의 아릴은 추가적으로 치환될 수 있다. 단독으로 또는 "카복시알킬"과 같이 다른 용어와 함께 사용되는 "카복시" 또는 "카복실"이란 용어는 -CO2H를 의미한다. "카복시알킬"이란 용어는 카복시 라디칼로 치환된 알킬 라디칼을 포함한다. 상기 정의된바와 같은 저급 알킬 라디칼을 포함하는 "저급 카복시알킬"가 보다 바람직하고, 이는 알킬 라디칼상에서 할로로 추가적으로 치환될 수 있다. 이런 저급 카복시알킬 라디칼의 예로는 카복시메틸, 카복시에킬 및 카복시프로필을 포함한다. "알콕시카보닐"이란 용어는 산소원자를 통해 카보닐 라디칼에 부착된, 상기 정의된 바와 같은 알콕시 라디칼을 함유하는 라디칼을 의미한다. 탄수소 1 내지 6의 알킬 부분을 갖는 "저급 알콕시카보닐"이 보다 바람직하다. 이런 저급 알콕시카보닐(에스터) 라디칼의 예로는 치환 또는 비치환된 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 프로폭시카보닐, 부톡시카보닐 및 헥실옥시카보닐을 포함한다. "알킬카보닐", "아릴카보닐" 및 "아르알킬카보닐"이란 용어는 카보닐 라디칼에 부착된, 상기 정의된 바와 같은 알킬, 아릴 및 아르알킬 라디칼을 갖는 라디칼을 포함한다. 이런 라디칼의 예로는 치환 또는 비치환된 메틸카보닐, 에틸카보닐, 페닐카보닐 및 벤질카보닐을 포함한다. "아르알킬"이란 용어는 아릴-치환된 알킬 라디칼, 예컨대 벤질, 다이페닐메틸, 트라이페닐메틸, 페닐에틸 및 다이페닐에틸을 포함한다. 상기 아르알킬에서 아릴은 할로, 알킬, 알콕시, 할로알킬 및 할로알콕시로 추가적으로 치환될 수 있다. 벤질 및 페닐메틸이란 용어는 상호교환될 수 있다. "헤테로사이클릴알킬"이란 용어는 포화 및 부분적으로 불포화된 헤테로사이클릴-치환된 알킬 라디칼, 예컨대 피롤리딘일메틸, 및 헤테로아릴-치환된 알킬 라디칼, 예컨대 피리딜메틸, 퀴놀릴메틸, 티에닐메틸, 퓨릴에틸 및 퀴놀릴에틸을 포함한다. 상기 헤테로아르알킬에서 헤테로아릴은 할로, 알킬, 알콕시, 할로알킬 및 할로알콕시로 추가적으로 치환될 수 있다. "아르알콕시"란 용어는 산소원자를 통해 다른 라디칼에 부착된 아르알킬 라디칼을 포함한다. "아르알콕시알킬"이란 용어는 산소원자를 통해 알킬 라디칼에 부착된 아르알콕시 라디칼을 포함한다. "아르알킬티오"란 용어는 황원자에 부착된 아르알킬 라디칼을 포함한다. "아르알킬티오알킬"이란 용어는 황원자를 통해 알킬 라디칼에 부착된 아르알킬티오 라디칼을 포함한다. "아미노알킬"이란 용어는 하나 이상의 아미노 라디칼로 치환된 알킬 라디칼을 포함한다. "저급 아미노알킬" 라디칼이 보다 바람직하다. 이런 라디칼의 예로는 아미노메틸, 아미노에킬 등을 포함한다. "알킬아미노"란 용어는 1 또는 2개의 라디칼로 치환된 아미노 기를 의미한다. 탄소수 1 내지 6의 알킬 부분을 갖는 "저급 N-알킬아미노" 라디칼이 바람직하다. 적당한 저급 알킬아미노는 모노 또는 다이알킬아미노, 예컨대 N-메틸아미노, N-에틸아미노, N,N-다이메틸아미노, N,N-다이에틸아미노 등일 수 있다. "아릴아미노"란 용어는 N-페닐아미노와 같이 1 또는 2개의 아릴 라디칼로 치환된 아미노기를 의미한다. "아릴아미노" 라디칼은 라디칼의 아릴 고리상에서 추가적으로 치환될 수 있다. "아르알킬아미노"란 용어는 아미노 질소원자를 통해 다른 라디칼에 부착된 아르알킬 라디칼을 포함한다. "N-아릴아미노알킬" 및 "N-아릴-N-알킬-아미노알킬"이란 용어는 1개의 아릴 라디칼, 또는 1개의 아릴 및 1개의 알킬 라디칼로 각각 치환되고, 알킬 라디칼에 부착된 아미노기를 갖는 아미노기를 포함한다. 이런 라디칼의 예로는 N-페닐아미노메틸 및 N-페닐-N-메틸아미노메틸을 포함한다. "아미노카보닐"이란 용어는 화학식 -C(=O)NH2의 아미드기를 의미한다. "알킬아미노카보닐"이란 용어는 아미노 질소원자 상에서 1 또는 2개의 알킬 라디칼로 치환된아미노카보닐 기를 의미한다. "N-알킬아미노카보닐", "N,N-다이알킬아미노카보닐" 라디칼이 바람직하다. 상기 정의된 바와 같은 저급 알킬 부분을 갖는 "저급 N-알킬아미노카보닐", "저급 N,N-다이알킬아미노카보닐" 라디칼이 보다 바람직하다. "알킬아미노알킬"이란 용어는 아미노알킬 라디칼에 부착된 1개 이상의 알킬 라디칼을 갖는 라디칼을 포함한다. "아릴옥시알킬"이란 용어는 2가 산소원자를 통해 알킬 라디칼에 부착된 아릴 라디칼을 갖는 라디칼을 포함한다. "아릴티오알킬"이란 용어는 2가 황원자를 통해 알킬 라디칼에 부착된 아릴 라디칼을 갖는 라디칼을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용된 화합물은 유리 염기 또는 이의 약학적으로 허용가능한 산 부가 염의 형태로 존재할 수 있다. "약학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 알칼리 금속 염을 형성하기 위해 그리고 유리 산 또는 유리 염기의 부가 염을 형성하기 위해 통상적으로 사용되는 염을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 것이면, 염의 성질은 중요하지 않다. 본 발명의 화합물의 적당한 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무기산 또는 유기산으로부터 제조될 수 있다. 이런 무기산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 탄산, 황산 및 인산을 포함한다. 적당한 유기산은 지방족, 지환족, 방향족, 아르알리패틱(araliphatic), 헤테로사이클릭, 카복실 및 설폰 부류의 유기산, 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코브산, 글루쿠론산, 말레산, 푸마르산, 피루브산, 아스파트산, 글루탐산, 벤조산, 안트라닐산, 메실산, 4-하이드록시벤조산, 페닐아세트산, 만델산, 엠보산(파모산), 메탄설폰산,에탄설폰산, 벤젠설폰산, 판토텐산, 2-하이드록시에탄설폰산, 톨루엔설폰산, 설파닐산, 사이클로헥실아미노설폰산, 스테아르산, 알겐산, b-하이드록시부티르산, 살리실산, 갈락타르산 및 갈락투론산중에서 선택될 수 있다. 적당한 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 아연으로 제조된 금속 염, 또는 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 클로로프로케인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민(N-메틸글루카민) 및 프로케인으로 제조된 유기 염을 포함한다. 이런 모든 염은, 예컨대 적당한 산 또는 염기와 화합물을 반응시킴으로써 상응하는 화합물로부터 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다.
조합
본 발명은 또한 알도스테론 길항제 및 NSAID를 포함하는 조합에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 상기 조합은 알도스테론 길항제 및 NSAID를 포함하는 약학 조성물이다. 한 예시적인 비제한적인 예로는 에플레레논 및 디클로페낙을 포함하는 약학 조성물이다.
약학 조성물
본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 아주반트 또는 희석제(본원에서는 총괄적으로 "담체(carrier)" 물질로 지칭됨), 및 필요한 경우 다른 활성 성분과 함께 치료 효과량의 알도스테론 길항제 및 NSAID 조합을 포함하는, 심혈관 질병을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 활성 화합물은 당해 기술분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적당한 경로에 의해, 바람직하게는 이런 경로에 적당한 약학 조성물의 형태로, 목적하는 치료에 유효한 투여량으로 투여될 수 있다. 예컨대, 활성 화합물 및 조성물은 경구, 혈관내, 복강내, 비강내, 기관지내, 피하, 근육내 또는 국소(에어로졸을 포함) 투여될 수 있다.
알도스테론 길항제 및 NSAID 조합의 투여는 개별적인 제형으로 연속적으로 실시할 수 있거나, 단일 제형 또는 개별적인 제형으로 동시 투여에 의해 달성될 수도 있다. 상기 투여는 경구 경로에 의해, 또는 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해 달성될 수 있다. 제형은 환약(bolus) 형태, 수성 또는 비수성 등장성 멸균 주사 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 이런 용액 및 현탁액은 윤활제, 보존제, 표면활성제 또는 분산제중 하나 이상과 함께, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제, 또는 젤라틴이나 하이드록시프로필-메틸 셀룰로즈 같은 결합제를 갖는 멸균 분말 또는 과립으로부터 제조될 수 있다.
경구 투여용으로, 약학 조성물은 예컨대 정제, 캡슐, 현탁액 또는 액체의 형태일 수 있다. 약학 조성물은 특정 양의 활성 성분을 함유하는 투여 유닛 형태로 바람직하게 제조된다. 이런 투여 유닛의 예로는 정제 또는 캡슐이 있다. 이들은 약 1 내지 약 1000㎎, 약 5 내지 약 500㎎, 약 10 내지 약 250㎎, 또는 약 25 내지 약 150㎎의 각 활성 성분의 양을 함유할 수 있다. 포유류를 위해 적당한 1일 투여량은 환자의 상태 및 그밖의 인자에 따라 폭넓게 변할 수 있다. 그러나, 약 0.01 내지 30㎎/체중1㎏, 특히 약 1 내지 15㎎/체중1㎏의 투여량이 적당할 수 있다.
또한, 활성 성분들을 조성물로서 주사에 의해 투여할 수 있는데, 이 경우 예컨대, 염수, 덱스트로스 또는 물을 적당한 담체로서 사용할 수 있다. 각 활성 성분의 적당한 1일 투여량은 치료할 질환에 따라 수회 투여량으로 약 0.01 내지 15㎎/체중1㎏/1일이다. 바람직한 일일 투여량은 약 1 내지 10㎎/체중1㎏이다. 예방 치료법을 사용할 것으로 지적된 화합물은 일반적으로 약 0.1 내지 약 15㎎/체중1㎏/1일 범위의 1일 투여량으로 투여되는 것이 바람직할 것이다. 보다 바람직한 투여량은 약 1 내지 약 15㎎/체중1㎏/1일의 범위일 것이다. 가장 바람직한 투여량은 약 1 내지 약 10㎎/체중1㎏/1일의 범위이다. 적당한 투여량은 1일당 다수의 분할-투여량(sub-dose)으로 투여될 수 있다. 이런 분할-투여량은 유닛 투여 형태로 투여될 수 있다.
한 실시태양에서, 알도스테론 수용체는 약 1 내지 약 200㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, NSAID는 약 1 내지 약 800㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, 이는 약 200:1 내지 약 1:800 범위의 알도스테론 길항제-대-NSAID 비를 나타낸다.
다른 실시태양에서, 알도스테론 수용체 길항제는 약 5 내지 약 400㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, NSAID는 약 1 내지 약 200㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, 이는 약 400:1 내지 약 1:40 범위의 알도스테론 길항제-대-NSAID 비를 나타낸다.
다른 실시태양에서, 알도스테론 수용체 길항제는 약 10 내지 약 200㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, NSAID는 약 5 내지 약 100㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, 이는 약 40:1 내지 약 1:10 범위의 알도스테론 길항제-대-NSAID 비를 나타낸다.
다른 실시태양에서, 알도스테론 수용체 길항제는 약 20 내지 약 100㎎ 범위의 양으로 존재할 수 있고, NSAID는 약 10 내지 약 80㎎ 범위의 양으로 존재할 수있고, 이는 약 10:1 내지 약 1:4 범위의 알도스테론 길항제-대-NSAID 비를 나타낸다.
대상에게 투여되거나 약학 조성물에 함유된 NSAID는 변할 수 있고, 일반적으로는 사용된 특정 NSAID, 고유 효능, 생체이용률 및 조성물의 대사 불안정성과, 중간 방출물 또는 연속 방출물을 위해 제형화되었는지의 여부에 좌우될 것이다. 특정 NSAID의 투여량 범위의 비제한적인 예는 하기에 목록으로 기재되어 있다.
종래 기술분야의 숙련자는 치료할 대상의 반응에 따라, 투여량이 적정 위 또는 아래가 된 후, 이 투여량 범위를 상기 치료를 수행하는 적합한 출발점으로서 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 조합 치료로서 질병 증상을 치료하기 위한 투여량 요법은 환자의 유형, 나이, 체중, 성 및 의학적 증상, 질병의 심중도, 투여 경로 및 사용된 특정 화합물을 포함하는 다양한 인자에 따라 선택되고, 이로써 폭넓게 변할 수 있다.
하기, 본 발명의 조합의 비제한적인 예가 목록으로 기재되어 있고, 여기서 조합은 첫번째 양의 알도스테론 수용체 길항제 및 두번째 양의 NSAID를 포함하고, 첫번째 양과 두번째 양은 합해서 치료 효과량의 알도스테론 수용체 길항제 및NSAID를 포함한다.
치료 목적을 위해, 본 방법의 조합 치료의 활성 성분을 보통 지시된 투여 경로에 적합한 하나 이상의 아주반트와 조합한다. 경구 투여되는 경우, 성분은 락토스, 수크로스, 전분 분말, 알칸산의 셀룰로즈 에스터, 셀룰로즈 알킬 에스터, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 산화마그네슘, 인산 및 황산의 나트륨 및 칼슘 염, 젤라틴, 아카시아 검, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 및/또는 폴리비닐 알콜과 혼합한 후, 편리한 투여를 위해 정제화하거나 캡슐화할 수 있다.이런 캡슐 또는 정제는 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 중 활성 화합물의 분산액으로 제공될 수 있는 바와 같이 제어-방출형 제형을 함유할 수 있다. 비경구 투여용 제형은 수성 또는 비수성 등장성 멸균 주사 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다. 이런 용액 및 현탁액은 경구 투여용 제형에서 사용하기 위해 언급했던 하나 이상의 담체 또는 희석제를 갖는 멸균 분말 또는 과립으로부터 제조될 수 있다. 성분은 물, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 옥수수유, 면실유, 땅콩 오일, 참기름, 벤질 알콜, 염화나트륨 및/또는 다양한 완충액에 용해시킬 수 있다. 다른 아주반트 및 투여 방식은 약학 분야에 널리 폭넓게 공지되어 있다.
본 발명은 상기 기재된 치료 및/또는 예방 방법을 수행하는데 사용하기 적합한 키트를 추가로 포함한다. 한 실시태양에서, 상기 키트는 이미 확인된 하나 이상의 에폭시-스테로이드성 알도스테론 길항제를 포함하는 첫번째 투여량 및 표 1에서 확인된 NSAID를 포함하는 두번째 투여량을 본 발명의 방법을 수행하는데 충분한 양으로 함유한다. 바람직하게, 첫번째 투여량과 두번째 투여량은 합해서 치료 효과량의 화합물을 포함한다. 다른 실시태양에서, 키트는 키트의 함량이 대상에 의해 어떻게 사용될 수 있는지를 언급한 서면으로 기재된 지시사항을 추가로 포함한다. 상기 서면으로 기재된 지시사항은, 예를 들어 대상이 원하지 않는 부작용을 유도하지 않으면서 치료 효과를 얻는데 유용할 것이다. 다른 실시태양에서, 서면으로 기재된 지시사항은 키트용 약물 관리 기관에 의해 승인된 제품 라벨의 전부 또는 일부를 포함한다.
활성 화합물의 결정 형태
취급이 용이하고, 형태가 재현가능하고, 쉽게 제조되고, 안정하고, 비흡습성인 각각의 활성 화합물의 형태를 선택하는 것이 특히 유용하다. 비제한적인 예로서 알도스테론 길항제 에플레레논에 대한 몇몇 결정 형태가 확인되었다. 이들로는 H형, L형, 다양한 결정성 용매화물 및 비결정성 에플레레논을 포함한다. 이들 형태, 이들 형태를 제조하는 방법, 및 조성물 및 악제를 제조하는데 있어서의 이들 형태의 용도는, 본원에 참고로 인용된 다음의 공개문헌, WO 01/41535 및 WO 01/42272에 개시되어 있다.
대상 집단
특정 그룹은 알도스테론의 작용을 조정하는 질환에 걸리기 더 쉽다. 알도스테론에 민감한 이들 그룹의 일원은 전형적으로 또한 염-민감성이고, 여기서 개개의 혈압은 일반적으로 높고, 각각 증가된 나트륨 소모량 및 감소된 나트륨 소모량을 갖는 그룹에 속한다. 본 발명은 실제로 이들 그룹으로 제한되는 것으로 간주되지 않지만, 특정 대상 그룹이 본 발명의 알도스테론 차단제인 항염증성 소염제로 치료하는데 특히 적합할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 치료 또는 예방으로부터 이득을 얻을 수 있는 대상은 일반적으로 하기 (a) 내지 (u)의 특성 중 하나 이상을 나타내는 인간 대상이다:
(a) 대상에 의한 염화나트륨의 평균 1일 섭취량은 약 4g 이상이고, 특히 이 상태를 주어진 1년 기간에 걸쳐 매달 1번 이상의 간격에 있어서 임의의 1달 동안 만족시킨다. 대상에 의한 나트륨의 평균 1일 섭취량은 바람직하게는 약 6g 이상, 더욱 바람직하게는 약 8g 이상, 더욱더 바람직하게는 약 12g 이상이다.
(b) 대상에 의한 1일 염화나트륨 섭취량이 약 3g/1일 미만 약 10g/1일 이상 증가할 때 대상은 약 5% 이상, 바람직하게는 약 7% 이상, 더욱 바람직하게는 약 10% 이상의 심장수축 혈압 및/또는 심장확장 혈압의 증가를 나타낸다.
(c) 대상에서 혈장 알도스테론(ng/dL) 대 혈장 레닌(ng/㎖/hr)의 활성 비는 약 30, 바람직하게는 약 40, 더욱 바람직하게는 약 50, 더욱더 바람직하게는 약 60보다 크다.
(d) 대상은 낮은 혈장 레닌 수준을 갖고, 예를 들어 대상에서 오전의 혈장 레닌 활성은 약 1.0ng/dL/hr 미만이고/이거나 대상에서 활성 레닌 값은 약 15pg/㎖ 미만이다.
(e) 대상은 상승한 심장수축 및/또는 심장확장 혈압에 민감하거나 이로부터 고통을 겪는다. 일반적으로, 대상의 심장수축 혈압(예를 들어, 고정형 커프 수은 혈압계에 의해 측정됨)은 약 130㎜Hg 이상, 바람직하게는 약 140㎜Hg 이상, 더욱 바람직하게는 약 150㎜Hg 이상이고, 심장확장 혈압(예를 들어, 고정형 커프 수은 혈압계에 의해 측정됨)은 약 85㎜Hg 이상, 바람직하게는 약 90㎜Hg 이상, 더욱 바람직하게는 약 100㎜Hg 이상이다.
(f) 대상의 뇨 나트륨 대 칼륨 비(mmol/mmol)은 약 6 미만, 바람직하게는 약 5.5 미만, 더욱 바람직하게는 약 5 미만, 더욱더 바람직하게는 약 4.5 미만이다.
(g) 대상의 뇨 나트륨 수준은 60mmol/1일 이상이고, 특히 이 상태를 주어진 1년 기간에 걸쳐 매달 1번 이상 간격에 있어서 임의의 1달 간격 동안 만족시킨다. 대상의 뇨 나트륨 수준은 바람직하게는 약 100mmol/1일 이상, 더욱 바람직하게는 약150mmol/1일 이상, 더욱더 바람직하게는 200mmol/1일 이상이다.
(h) 대상에서 하나 이상의 엔도텔린, 특히 혈장 면역반응 ET-1의 혈장 농도는 상승한다. ET-1의 혈장 농도는 바람직하게는 약 2.0pmol/L 초과, 더욱 바람직하게는 약 4.0pmol/L 초과, 더욱더 바람직하게는 약 8.0pmol/L 초과이다.
(i) 대상은 ACE 억제제로 치료하기 실질적으로 어려운 혈압을 갖는다. 특히 대상의 혈압은, 어떠한 항고혈압 치료도 받지 않은 대상의 혈압에 비해 10㎎/1일의 에날라프릴에 반응하여 약 8㎜Hg 미만, 바람직하게는 5㎜Hg 미만, 더욱 바람직하게는 3㎜Hg 미만으로 낮다.
(j) 대상은, 증가된 나트륨 잔류량의 결과로서 증가된 혈액량이 혈압에 기여하는 혈액량-증량 고혈압 또는 혈액량-증량 경계 고혈압, 즉 고혈압을 갖는다.
(k) 대상은 비조절 개체로서, 상기 개체는 신장 혈류 속도 및/또는 알도스테론의 부신 생성시 나트륨 섭취량의 증가 또는 안지오텐신 II 투여에 둔한 양의 반응을 나타내는데, 특히 상기 반응은 보편적인 지리적 집단(예를 들어, 대상의 혈통 지역 또는 대상이 거주하는 지역으로부터 얻은 개체 샘플)으로부터 얻은 개체 샘플의 반응보다 적을 때, 상기 반응은 바람직하게는 상기 집단 평균의 40% 미만, 더욱 바람직하게는 30% 미만, 더욱더 바람직하게는 20% 미만일 때 나타난다.
(l) 대상은 신장 기능장애, 특히 감소된 사구체여과율, 마이크로알부민혈증 및 단백뇨로 이루어진 군 중 1종 이상으로부터 선택된 신장 기능장애를 갖거나 이에 민감하다.
(m) 대상은 심혈관 질환, 특히 심장부전, 좌심실확장 기능장애, 비대심장근육병증및 확장기 심장부전으로 이루어진 군 중 1종 이상으로부터 선택된 심혈관 질환을 갖거나 이에 민감하다.
(n) 대상은 간 질환, 특히 간경화증을 갖거나 이에 민감하다.
(o) 대상은 부종, 특히 말초 조직 부종, 간 또는 비장 울혈, 간 복수, 및 호흡기 또는 폐 울혈로 이루어진 군 중 1종 이상으로부터 선택된 부종을 갖거나 이에 민감하다.
(p) 대상은 인슐린 내성, 특히 I형 또는 II형 당뇨병 및/또는 글루코즈 과민을 갖거나 이에 민감하다.
(q) 대상은 나이가 55세 이상, 바람직하게는 약 60세 이상, 더욱 바람직하게는 약 65세 이상이다.
(r) 대상은 전체적으로는 또는 부분적으로는 아시(특히 일본)종 그룹, 아메리칸 인디언종 그룹, 및 흑인종 그룹 중에서 선택된 1종 이상의 인종 그룹의 일원이다.
(s) 대상은 염 민감성과 연관된 하나 이상의 유전자 표지를 갖는다.
(t) 대상은 비만으로, 바람직하게는 25% 초과의 체지방, 더욱 바람직하게는 30% 초과의 체지방, 더욱더 바람직하게는 35% 초과의 체지방을 갖는다.
(u) 대상은 염 민감성이거나 염 민감성이었던 1명 이상의 1촌, 2촌 또는 3촌 친척을 갖는데, 여기서, 1촌 친척은 1명 이상의 동일 부모를 공유하는 부모 또는 친척을 의미하고, 2촌 친척은 1명 이상의 동일 조부모를 공유하는 조부모 및 친척을 의미하고, 3촌 친척은 1명 이상의 증조부모를 고유하는 증조부모 및 친척을 의미한다. 바람직하게, 이러한 개체는 4명 이상의 염-민감성 1촌, 2촌 또는 3촌 친척을갖고, 더욱 바람직하게는 8명 이상, 더욱더 바람직하게는 16명 이상, 더더욱 바람직하게는 32명 이상의 상기와 같은 친척을 갖는다.
반대로 달리 언급하지 않으면, 상기 목록으로 기재된 값은, 바람직하게는 2개 이상의 측정치를 기준으로 한 평균 값, 더욱 바람직하게는 1일 평균 값을 나타낸다.
바람직하게, 치료가 필요한 대상은 2가지 이상의 상기 특성, 또는 3가지 이상의 상기 특성, 또는 4가지 이상의 상기 특성을 만족시킨다.
생물학적 평가
인간 심혈관 질병은 혈관 고혈압 또는 심근경색증(MI)에 의해 종종 개시되는 복합 증상이다. 심혈관 질환에 대한 치료의 가능한 효능을 측정하기 위해서, 여러 분석법에서 성분의 잠재능을 측정하는 것이 중요하다. 따라서, 분석 "A"에서는 안지오텐신 II 주입을 사용하여 혈관 염증을 수반한 고혈압 래트 모델에서 알도스테론 길항제 에플레레논(에폭시멕스레논)의 효능을 측정하였다. 분석 "B"에서는, 혈관 염증을 수반한 고혈압을 유발하기 위해 알도스테론 주입을 사용하여 래트 모델내 알도스테론 길항제 에플레레논(에폭시멕스레논)의 효능을 평가하는 연구를 기술하였다. 분석 "C"에서는, 혈관 염증을 수반한 고혈압을 유발하기 위해 알도스테론 주입을 사용하여 래트 모델에서 알도스테론 길항제 에플레레논(에폭시멕스레논)의 효능을 평가하는 추가의 연구를 기술하였다.
추가로, 인간의 알도스테론 길항제 연구를 평가하기 위해서 임상시험을 사용할 수 있다. 문헌[Americal Journal of Cardiology 78, 902-907 (1995)]에 기술된RALES 003 연구 또는 문헌[New England Journal of Medicine 341, 709-717(1999)]에 기술된 RALES 004 연구를 비롯한, 이러한 치료 시험에 대한 다수의 예가 공개되어 있다.
분석 A: 생체내 안지오텐신 II 주입 모델
프로토콜
방법:
·수컷 위스타르 래트(n=50, 10/그룹; BW=200g)
·음용할 1% NaCl
·실험 그룹
1. 대조군
2. 안지오텐신 II(25ng/분, 알제트 미니펌프에 의한 피하 투여)
3. 안지오텐신 II(25ng/분, 피하 투여)+에플레레논 100mpk
4. 안지오텐신 II(25ng/분, 피하 투여)+부신절제화+덱사메타손(12㎍/㎏/d, 피하 투여)
5. 안지오텐신 II(25ng/분, 피하 투여)+부신절제화+덱사메타손(12㎍/㎏/d, 피하 투여)+알도스테론(40㎎/㎏/d, 알제트 미니펌프에 의한 피하 투여)
·매주 테일 커프(tail cuff)에 의해 측정한 SBP
·매일 24시간 음식 및 음료 섭취량 및 뇨 배설량을 측정함
·뇨 전해질을 측정하기 위해서 매일 뇨 샘플을 수거함.
·4주후 피를 뽑아내 희생함. 알도스테론 및 코르티코스테론 함량을 측정하기 위한 EDTA-함유 튜브 및 혈청 전해질을 측정하기 위한 건조 튜브에 혈액을 수집함.
·심장은 헤마토실린과 에오신으로 염색하고 형태학적 이상(즉, 괴저, 혈관 손상)을 측정하기 위해서 분석하였다.
결과
혈압: 심장수축 혈압은 안지오텐신 II 주입을 수여받은 모든 동물에게서 증가하였다. 비히클을 수여받은 동물에 비해 에플레레논 및 부신절제화는 혈압을 감소시키지 않았다. 알도스테론 주입은 안지오텐신 II/염, 부신절제된 래트내 혈압을 증가시켰다. 도 1은 심장수축 혈압의 증가를 입증하였다.
전해질 배설: 매일의 뇨 Na+배설 및 뇨 K+배설(U Na+/K+비) 사이의 비율은 나트륨 뇨 배설 항진 지수로서 사용되었다. 뇨 Na+/K+비는 치료를 개시하기 전에 모든 그룹에 대해서 유사하고, 염의 함량이 높은 음식을 개시하면서 모든 동물에서 유사하게 증가하였다. 뇨 Na+/K+비는 안지오텐신 II 주입을 수여받은 동물에게서 17일까지 변화하지 않았으며, 17일이 되어서야 뇨 Na+/K+비가 비히클 주입 래트에 비해 안지오텐신 II 주입을 수여받은 동물에서 상당히 증가하였다. 유사한 결과가 주입후 14일로부터 뇨 Na+/K+비의 증가를 나타내는, 에플레레논을 수용받은 안지오텐신 II-주입 동물에게 일어났다. 그러나, 어떠한 시점에서도 비히클로 처리된 안지오텐신 II 주입 래트에 비해서 에플레레논-처리된 래트가 높은 뇨 Na+/K+비를 나타내지 않았다. 사실상, 21일째에 상당한 차이가 관찰되었는데, 이 시점에서, 안지오텐신 II 주입된 경우 비히클 처리된 래트는 에플레레논 처리된 동물에 비해 높은 뇨 Na+/K+비를 나타내었으며, 이는 이러한 실험 조건하에서 에플레레논은 상당한 이뇨효과 또는 나트륨이뇨 효과를 유발하지 못함을 나타낸다. 알도스테론 주입을 하거나 하지 않은 부신절제된 동물은 항상 부신-무손상 동물에 비해 높은 뇨 Na+/K+비를 나타내었다.
심근 손상: 10마리의 안지오텐신 II/염-처리된 동물중 7마리에서는 관상동맥내 혈관 염증 변화가 발달하였다. 이러한 변화는, 주로 대식세포에 의한 혈관주위 공간의 백혈구 침윤에 의해 특징화되었다. 중막의 섬유소성괴사 또한 일부 동맥에서 관찰되었다. 일부 경우에서, 환부가 광범위한 경우, 이들은 주변 심장근육과 관련된 심근 괴사가 있었다. 이러한 경우에 실질조직 출혈이 관찰되었고, 이는 심근 괴사의 발견과 일관성이 있는 것이다. 이러한 혈관 염증성 환부는, 이러한 동물이 비히클-처리된 안지오텐신 II 주입된 래트와 같이 고혈압을 앓고 있었음에도 불구하고, 에플레레논을 수여받은 10개의 안지오텐신 II 주입 동물중 단지 1마리에서만 관찰되었다(도 2 참조). 유사하게, 부신절제술은 심장내 혈관 염증성 환부를 억제한다. 그러나, 알도스테론의 대치는, 안지오텐신 II 주입한, 부신-무손상, 비히클 처리 래트에서 관찰되는 심각한 심장 및 심근 염증 및 손상을 회복시켰다.
사이클로옥시게나제-2-특이적 항체에 의한 안지오텐신 II 주입된 래트로부터의 심장의 면역염색법은, 동맥 주변의 염증 영역에서의 효소, 주로 단핵세포/거식세포의 존재를 확인하였다. 또한, 사이클로옥시게나제-2-염색법은 혈관 주변의 공간에서 형태적 변경 또는 염증성 응집괴의 증거가 없는 경우에도, 관상동맥의 중막의 평활근에서 관찰되었다(도 4 참조). 에플레레논 처리 및 부신절제화는 안지오텐신 II-주입된 래트로부터의 심장에 있어서 사이클로옥시게나제-2의 발현을 뚜렷하게 감소시키거나 대부분의 경우 완전히 억제하였다(도 3 및 5 참조). 안지오텐신-II, 부신절제화화 래트내에서 알도스테론을 대치하면, 관상동맥내 사이클로옥시게나제-2의 존재를 회복하였다.
오스테오폰틴(초기에 T-세포 활성화-1, Eta-1로서 공지됨)은, 단핵세포의 화학주성, 활성화 및 이동을 매개하는 전구-염증성 특성을 갖는 분비된 당단백질이다. 안지오텐신 II-주입된 염수-음용 래트로부터의 심장을 오스테오폰틴-특이적 항체로 면역염색하면 관상동맥의 중막내 오스테오폰틴의 존재가 확인되었다. 에플레레논 처리 및 부신절제화는 안지오텐신 II를 주입한 염수-음용 래트의 심장에서의 오스테오폰틴 발현을 억제하였다(도 6 및 도 7). 알도스테론의 대치는 부신절제된 동물내 오스테오폰틴 발현을 회복시켰다.
분석 B: 생체내 알도스테론 주입 모델
프로토콜 2:
방법:
·수컷 스프라그 돌리 래트(n=3; BW=250g)
·음용할 1% NaCl
·미니-펌프의 이식동안 수행되는 단일신장절제
·실험 그룹
1. 대조군
2. 알도스테론(0.75㎎/시, 알제트 미니펌프에 의한 피하 투여)
2. 알도스테론(0.75㎎/시, 알제트 미니펌프에 의한 피하 투여)+에플레레논 100mpk, 경구 투여
1. 알도스테론(0.75㎎/시, 알제트 미니펌프에 의한 피하 투여)+ 음용할 유체내 0.6% KCl
·음용할 용액내 0.3% KCl만 수용되는 그룹 1, 그룹 2 및 그룹 3
·복부 대동맥에 삽입된 라디오-원격측정 검침에 의해 측정한 SBP
· 4주후 희생
→ 심장은 수거하여 중간-심실에서 횡단면으로 반으로 양분하였다: 상부 반은 포르말린에 보관하였다. 하부 부분은 생화학적 분석을 위해서 액체 질소에 재빨리 냉동하였다.
· 심장은 헤마토실린 및 에오신 및 콜라겐 특이적 염료 피크로-시리우스 레드로 염색하고, 조직내 콜라겐 체적 분획의 측정 및 형태학적 이상(즉, 괴저, 혈관 손상)에 대해 분석하였다.
· 하이드록시프롤린 농도는 냉동시킨 심장에서 측정하였다.
· 오스테오폰틴 및 COX-2의 측정은 정량적인 RT-PCR(타크만(Taqman))에 의해 평가하였다. 오스테오폰틴은 또한 면역 조직화학에 의해 심장에서 확인하였다.
결과
혈압: 심장수축 혈압은 알도스테론 주입을 수여받은 모든 동물에서 증가하였다. 에플레레논 처리는 상당히 감소하였지만 혈압을 정상화된 것은 아니었다. 도 21은 이러한 결과를 그래프로 나타내었다.
심근 손상: 염수-음용 단일신장절제된 래트는 심근 손상을 갖지 않았다. 조직내 콜라겐 체적 분획의 조직학적 측정 또는 하이드록시프롤린 농도의 생화학적 측정에 의한 조직내 콜라겐의 측정은 알도스테론/염 처리를 수여받은 동물내에서의 심근 섬유화의 부재를 입증하였다. 그러나, 알도스테론/염-처리 래트로부터의 헤마토실린-에오신-염색된 심장을 검사하면, 심각한 혈관 염증 환부를 나타내었다. 이러한 환부는 프로토콜 1에서 기술한 것과 동일하였다. 에플레레논을 투여하면, 혈압을 정상화하지는 못했지만, 알도스테론-주입되고 염수-음용하고 단일신장절제된 래트에 있어서 혈관 염증의 변화를 완전히 억제하였다(도 10). 식이 칼륨을 증가시키는 것은, 알도스테론-유도 손상의 발달에 상당한 영향을 미치지는 못하는데, 이는 이러한 동물이 마찬가지로 비히클을 수여받은 알도스테론/열 처리 래트와 유사한 수준의 손상부를 나타낸 바와 같다.
혈청 오스테오폰틴 수준은 28일째에 측정하였고, 각각에 그룹(NaCl 1%를 음용시킨 래트, 알도스테론과 함께 NaCl 1%를 음용시킨 래트, 및 알도스테론 및 에플레레논과 함께 NaCl 1%를 음용시킨 래트)에 대해 평가하였다. 도 23은 에플레레논 처리 래트에서의 순환 오스테오폰틴의 뚜렷한 감소를 나타낸다.
또한, 이러한 동물로부터의 심장에 대해 오스테오폰틴 면역염색을 수행하였다. 오스테오폰틴은 알도스테론을 수여받지 않은 것으로 염수-음용 단일신장절제된 동물에서는 검출되지 않았다. 그러나, 오스테오폰틴은 알도스테론 주입을 수여받은 동물내 관상동맥의 중막에서 명백히 확인되었다. 에플레레논 처리는 알도스테론 주입 래트로부터의 심장중 오스테오폰틴 발현을 억제한다(도 8 및 18). 음식물중 칼륨의 증가는 오스테오폰틴 발현을 감소시키지 않았다. 정량적 RT-PCR에 의한 오스테오폰틴 mRNA의 정량은 비히클을 받은 알도스테론/염 처리한 래트의 심장에서 이 시토카인의 현저한(7배) 상향조절을 나타내었다(상대적인 mRNA 발현: 1.7±0.2 대 12.25±1.7, P<0.0001). 이 효과는 에플레레논에 의하여 억제되었다(상대적인 mRNA 발현: 2.5±0.6, P<0.0001 대 알도스테론/염+비히클 군). 심장에서 발병된 알도스테론-유도의 혈관 염증에서 사이클옥시게나제-2의 역할과 일관되게, COX-2 mRNA 발현은 알도스테론/염+비히클 처리한 래트에서 3배 증가하였다(상대적인 mRNA 발현: 1.2±0.12 대 3.7±0.46, P<0.0001). 오스테오폰틴 발현에의 영향과 유사하게, 에플레레논은 알도스테론/염 처리한 래트에서 COX-2 발현의 증가를 억제하였다(상대적인 mRNA 발현: 1.8±0.36, P<0.01 대 알도스테론/염+비히클 군, 도 9 및 17 참조). 상기 방식과 유사하고, MCP-1 발현 및 IL-6 발현은 에플레레논 치료에 의해 약화되었다(도 24).
상기 데이터는 알도스테론이 고혈압 래트의 심장에서 혈관 염증 발현을 매개함을 나타낸다. 이 표현형은 동맥 매질중 혈관 평활근 세포에서 시토카인 오스테오폰틴 및 효소인 사이클옥시게나제-2의 상향조절과 관련되어 있는데, 이는 관찰되는 혈관주위 염증 및 그로 인한 관상동맥 및 심근의 허혈/괴사 손상을 매개한다.이론에 의한 뒷받침은 없으나, 이는 심부전, 관상동맥 질환, 자가 면역 또는 바이러스성 심근염, 결절성 동맥주위염, 발작 및 신장경화증과 같은 질환에서 관찰되는 혈관 변형을 매개하는 기작으로 생각된다. 도 11은 오스테오폰틴 및 사이클로옥시게나제-2가 관상동맥벽의 유사 영역에서 발현됨을 나타낸다. 이론은 본 발명에서 어떠한 역할도 하지 않지만, 도 12는 이 모델에 대하여 제안된 기작을 나타내고 있다. 이러한 실시예에서, 에플레레논 처리는 프로토콜 1번에서 나타낸 바와 같이, 부신절제술과 유사한 정도로 심장에서의 혈관 염증을 억제한다. 에플레레논의 효과는 프로토콜 1번에서 나타낸 바와 같이 심장수축 혈압에서 현저한 감소와 상당히 무관하였다. 또한 안지오텐신 II/염 처리한 고혈압 래트에서 에플레레논의 이뇨 또는 나트륨뇨 배설항진의 감소는 선택적인 알도스테론 길항제의 보호 효과는 상피 조직에의 강력한 효과와 무관함을 나타내었다. 더욱이, 상승된 음식중 칼륨이 에플레레논의 효과를 모방할 수 없었다는 사실은 에플레레논이 칼륨 저장성을 통하여 이로운 효과를 제공한다는 가능성에 배제된다. 그러므로, 본 발명자들은 알도스테론이 상피 조직중 전해질 항상성에 본 호르몬의 효과 또는 혈압에 대한 효과에 무관한, 관상혈관 구조에 직접적인 악영향을 미칠 수 있다고 제안한다. 인간에의 에플레레논의 투여는, 본 실험에서 제시되는 바와 같이, 심장, 신장 및 뇌를 포함하나 이에 한정되지 않는, 혈관이 발달된 기관에 항염증성 작용에 의한 이점을 제공할 수 있다.
분석 C: 추가적인 생체내 알도스테론 주입 연구
분석 B의 과정이 추가적인 연구에서 확장되었다. 단일신장절제된 스프라그-돌리 래트에 1%NaCl-0.3%KCl을 제공하고 다음의 처리중의 하나를 실시하였다: 비히클; 알도스테론 주입; 또는 에플레레논(100㎎/㎏/일)과 조합한 알도스테론 주입. 알도스테론/염 처리는 30일후 래트에서 심각한 고혈압을 유도하였고, 에플레레논에 의하여 상당히 감소하였다. 각 처리군에서 동물로부터의 심근 조직을 처리 7, 14 또는 30일후 검사하였다. 조직병리학적 분석은 14일에 시작한 혈관 염증 손상은 주위 심근으로 확장되어 국소 허혈/괴사성 변화를 일으킴을 나타내었다. 전구염증성 분자의 발현 및 발전적 상향조절후 손상이 일어난다. 전구염증성 분자 및 관련 혈관 및 심근 손상의 상향조절은 에플레레논 처리에 의하여 현저히 약화되었다. 이러한 데이터는 에플레레논이 혈압을 감소시키고 심장에서 알도스테론 유도의 혈관성 염증 손상에 대하여 말단-기관 보호를 제공하는데 효과적임을 나타낸다.
동물
미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재의 할란 스프라그-돌리 인더스트리스(Harlan Sprague-Dauley Industries)의 수컷 스프라그-돌리 래트(230 내지 250g의 무게)를 22±1℃의 온도에서 12시간-명/ 12시간-암의 일일 순환으로 방에 수용하였다(n=96). 동물을 도착후 1주간 적응시키고 위스콘신주 마디슨 소재의 할란(Harlan) TEKLAD사의 TECLAD 22/5 사료 및 수도물에 자유로운 접근을 가능하게 하였다.
실험 프로토콜
외과수술전 동물을 개별적으로 칭량하고 다음의 군중 하나로 배치하였다: (I) 고염 대조군(비히클/일반 사료/1% NaCl 및 0.3% KCl 식수, 3개 시점 군에 대하여 n=31), (II) 알도스테론 대조군(알도스테론/일반 사료/1% NaCl 및 0.3% KCl 식수, 3개 시점에 대하여 n=28), (III) 100㎎/㎏/일 에플레레논(알도스테론/에플레레논 사료/1% NaCl 및 0.3% KCl 식수, 3개 시점에 대하여 n=30). 알도스테론 과잉에 관련한 저칼륨혈증의 가능성을 방지하기 위하여 염화칼륨 보조제를 식염수에 첨가하였다.
치료
외과수술시, 비히클(9% 에탄올/87% 프로필렌 글리콜/4% dH2O) 또는 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼(Sigma Chemical)사의 d-알도스테론 1.0㎎/mL를 함유하는 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 알자 코포레이션(Alza Corp.)의 알제트(Alzet) 2002 삼투성 미니펌프를 목에 피하 삽입하였다. 알도스테론을 0.75㎎/시간의 용량으로 투여하였다. 에플레레논을 사료 1㎎/g의 농도로(100㎎/㎏/일의 양으로 수송되는 것으로 계산됨) 미국 위스콘신주 마디손 소재의 할란 TEKLAD사의 TEKLAD 22/5 사료에 합하였다. 이전의 분석 작업으로 이 사료 중의 에플레레논의 안정성 및 조제후 얻어지는 균일성이 입증되었다. 각 군에서 처리 후 7, 14 또는 30일후 동물을 희생시켰다.
외과수술 과정
처리후 7 또는 14일에 죽인 동물을 단일신장절제하고 알제트 미니펌프를 이식하였다. 다음의 과정에 따라 30일간 처리한 동물의 한쪽 신장을 절제하고, 알제트 미니펌프를 설치하고, 방사선 원격측정 장치(미국 미네소타주 세인트 폴 소재의데이터 사이언스 인코포레이션(Data Sciences Inc.)의 모델#TA11PA-C40)를 이식하였다. 동물을 미국 미네소타주 멘도타 하이츠 소재의 솔베이 애니몰 헬스 인코포레이션(SOLVAY Animal Health Inc.)의 5% 아이소플루레인으로 마취하였는데, 이는 미국 뉴욕주 오차드 파크 소재의 매트릭스 메디칼 인코포레이션(Matrix Medical, Inc.)의 VMS 마취 장비를 사용하여 O2중에서 수송된다. 외과수술동안 1 내지 2%의 아이소플루레인으로 마취를 유지하였다. 외과수술 부위의 털을 깎고, 놀바산으로 세정하고, 베타인을 분사하였다. 11# 스칼펠 블레이드(scalpel blade)를 사용하여 피부를 통하여 갈비뼈의 기저로부터 치골 영역까지 문측-미향 절개를 하였다. 2번째 절개는 복벽의 근육을 통하여 이루어져 복강을 노출시켰다. 좌측 신장의 요도, 신장 동맥 및 정맥을 단리하여, 4-0 견사로 묶고, 신장을 절제하여 제거하였다. 기관을 조심스럽게 조직 견인기로 치환하여 복부 동맥을 노출시켰다. 장골 동맥으로 향하는 복부 동맥의 분지의 문측 1.5cm 마디에서 과잉의 결합 조직을 제거하고 4-0 견사를 사용하여 동맥에 인접한 앵커(anchor)를 만들었다. 그 후 미세 혈관 클립을 세척한 영역의 양 끝에 놓아 과잉의 혈류를 억제하였다. 굽은 21 게이지 바늘을 사용하여, 복부 동맥을 관통시켰다. 방사선 원격측정 장치의 캐뉼러를 삽입하고 4-0 견사 앵커를 이용하여 동맥에서 안정화시켰다. 기관을 재배치하고 원격측정 장치를 기관 위에 놓았다. 4-0 견사로 비-단속 봉합 패턴을 사용하여, 복벽을 폐쇄하고, 그 후 4-0 견사를 사용하여 피부를 단속 봉합 패턴으로 폐쇄하였다. 동물에 미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 사노피 윈드롭 파마슈티칼스(SanofiWinthrop Pharmaceuticals)의 마취제 마카인(Marcaine) HCl 100㎕를 봉합부 주위에 주입하고 미국 인디애나주 인디아나폴리스 소재의 엘리 릴리 앤드 캄파니(Eli Lilly & Co.)의 항생제 만돌(Mandol)을 근육내 주사하였다. 수술후 조치는 흉골 횡와가 회복될 때까지 마취로부터 회복되는 동안 동물을 가온 패드에서 모니터링하는 것을 포함하였다. 수술 부위의 통증 및 감염의 증상에 대하여 동물을 매일 모니터링하였다. 수술후 계속적인 불편함을 보이는 동물에 미국 버지니아주 리치몬드 소재의 리케트 앤드 콜만 파마슈티칼스 인코포레이션(Rickett & Colman Pharmaceuticals, Inc.)의 부프레노핀 0.1 내지 0.5㎎/㎏을 피하투여로 처치하였다. 그 후 동물에 수돗물 및 미국 위스콘신주 마디손 소재의 할란 TEKLAD사의 TEKLAD 22/5 사료를 공급하였다.
혈압 분석
방사선 원격측정한 동맥 혈압을 미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 데이터 사이언시즈 인터내셔널(Data Sciences International)사의 DATAQUEST A. R. T 버전 1.1-골드(Gold) 소프트웨어로 계산하였다. 24시간 기간동안 각 동물에 대하여 매 5분마다 10초 판독하는 수집 속도 세트로 데이터 지점을 수집하였다. 사용된 24시간 기간은 오전 6:00로부터 오전 6:00까지였다.
희생
각 실험 시간 지점의 종료시, 동물을 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼사의 펜토바비탈 65㎎/㎏을 복강내 투여로 마취하고 미국 뉴저지주 하이츠타운 소재의 메틀러-톨레도 인코포레이션(Mettler-Toledo, Inc.)의 메틀러(Mettler) PM6000 저울을 사용하여 무게를 칭량하였다. 복강을 열어 복부 동맥을 노출하였다. 16 게이지 바늘을 복부 동맥에 삽입하고 12cc 시린지에 혈액을 취하였다. 약물 농도 분석을 위하여 혈액 시료를 즉시 미국 머릴랜드주 엘크톤 소재의 테루모 메디칼 코포레이션(Terumo Medical Corp.)의 유리 혈청 수집 관으로 옮겼다. 시료 수집이 완료될 때까지 시료를 습윤 얼음위에 놓고 4℃에서 3000회/분으로 15분간 원심분리하였다.
혈액을 취한 후, 심장 및 신장을 단리하여 제거하고 저온 인산 완충 식염수로 세척하고 건조 블롯팅하였다. 신장을 즉시 장축을 따라 면도칼로 양분하고 미국 미시간주 칼라무주 소재의 리차드-알렌 사이언티픽(Richard-Allen Scientific)사의 NBF의 10%의 중성 완충 포르말린에 넣었다. 심장에 대하여, 우측 심실(RV)을 좌측 심실(LV)로부터 절제하고, 미국 뉴저지주 하이츠타운 소재의 메틀러-톨레도 인코포레이션의 메틀러 AE163 저울을 사용하여 두 심실의 무게를 칭량하고, RV를 10% NBF에 넣었다. LV 정점의 2mm 관상 판를 제거하고 유전자 발현 분석을 위하여 드라이 아이스/아이소펜탄으로 냉동하고 LV의 잔여부분은 고정을 위하여 10% NBF에 넣었다. 3 내지 4일후 최종 습윤 트리밍을 완료하였는데, 이때 제 2의 2mm 관상 판을 하이드록시프롤린 분석을 위하여 제거하고 제 3의 2mm 판을 조직학을 위하여 적도 영역으로부터 제거하였다.
조직 처리 및 염색
심장의 적도 영역을 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재의 샨돈/립쇼 인코포레이션(Shandon/Lipshaw Inc.)의 하이퍼센터(Hypercenter) XP의 자동 조직 처리기를사용하여 파라핀에 일반적으로 처리하고 정점 측이 아래로 향하게 하여 샨돈/립쇼 인코포레이션의 샨돈 임베딩 센터(Shandon Embedding Center)의 신선한 파라핀에 담그었다. 미국 텍사스주 휴스톤 소재의 레이카 인코포레이션(Leica Inc.)의 레이카(Leica) RM2035 회전식 박편 절단기를 사용하여 5개의 10㎛ 절편을 각 조직의 블록으로부터 절단하고 미국 펜실바니아주 피츠버그 소재의 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)의 슈퍼프로스트/플러스(Superfrost/Plus) 현미경 슬라이드 위에 장착하였다. 10개의 ㎛ 절편을 콜라겐 특이적인 염료인 피크로시리우스 레드(Picrosirius Red) F3BA(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼사의 포화 피크르산 및 미국 콘넥티컷주 워터베리 소재의 팔츠 앤드 바우어 인코포레이션(Pfaltz & Bauer, Inc.) C. I. #35780의 0.1%(w/v) 시리우스 레드(Sirius Red) F3BA)로 염색하였다(6). 장착한 조직을 물로 수화하였다. 그 후 슬라이드를 15분간 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼사의 0.2%(w/v) 포스포몰리브드산으로 증류수중 배양하고, 110분간 0.1% 피크로시리우스 레드 F3BA 염료에 옮기고, 1분간 95% 에탄올 수용액/1% 아세트산(v/v)중에 넣은 후, 100% 에탄올에서 1분 배양하고, 1분간 자일렌중에서 처리하였다. 슬라이드를 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)사의 퍼마운트 히스톨로지컬 마운팅 미디어(Permount Histological Mounting Media)를 사용하여 1번 커버 유리로 덮었다. 5㎛ 절편이 장착된 두 슬라이드를 각 동물에 대하여 얻었다. 한 슬라이드는 H&E 염료로 처리하고 다른 하나는 피리오딕 애시드 시프(Periodic Acid Schiff)(PAS) 염료로 처리하였다. H&E 및 PAS는 심장의 병리학적 수치 계산을 위하여 사용되었다.
조직병리학적 분석
상기한 바와 같이 약간의 변형으로 심근 손상의 대략적인 정량을 실시하였다(7). 간단히 말해서, 0 내지 4의 점수를 사용하여 심근 손상의 정도를 기록하였다. 0점은 손상이 없음을 나타내었다. 1점은 심근 손상없이 혈관 및 혈관 주위의 염증 손상의 존재를 나타내었다. 2점은 심근 괴사의 분명한 영역이 관찰되는 경우의 점수였다. 심근 괴사는 핵농축 또는 핵용해와 같은 심근세포의 괴저성 변화, 비수축성 가장자리 물결무늬 섬유 및 세포질의 과다 호산구 증가증 또는 심근세포막 파괴의 명백한 증거의 존재로 정의하였다. 두 개 이상의 분리된 괴사 영역이 발견되었을 때(2개의 다른 분리된 영역의 존재를 포함함), 심장은 3점을 받았다. 4점은 50% 이상의 좌심실을 손상시킨 넓은 영역의 괴사가 확인된 심장에 주어졌다.
영상 분석
미국 머릴랜드주 가이더버그 소재의 온코 인코포레이션(Oncor Inc.)의 비디오메트릭 150 영상 분석 시스템(Videometric 150 Image Anaysis System)으로 간질 콜라겐을 정량하기 위하여 피크로시리우스 레드 F3BA 염색된 슬라이드를 사용하였다. 간단히 말해서, 미국 뉴욕주 가든 시티 소재의 니콘 인코포레이션(Nikon Inc.)의 니콘 옵티포트(Nikon Optiphot) 현미경에 부착된 니콘 인코포레이션의 니콘 이 플랜(Nikon E Plan) 10/0.25; 160/- 오브젝티브(Objective)를 사용하여 영상을 캡쳐하였다. 일본 도시바 코포레이션(Toshiba Corp.)의 모델#IK-T30T의 도시바 3 CCD 컬러 비디오 카메라는 현미경으로부터 V150 비디오 보드를 갖는 386 컴퓨터로 영상을 RGB 포맷으로 보였다. 온코 인코포레이션의 V150 비디오 보드/V150 소프트웨어 장치는 305배 배율로 일본 도쿄 소재의 소니 코포레이션의 모델#PVM-1342Q의 소니 트리니트론(Trinitron) 컬러 비디오 모니터상에서의 디스플레이 및 분석을 위하여 RGB 영상을 HIS(색조, 명암, 채도) 포맷으로 변환하였다. 영상이 일단 영상 모니터상에 디스플레이되면, 측정되는 픽셀의 색조, 명암 및 채도는 역치로 불리는 공정에 의하여 정의되었다. 그 후 V150 장치는 역치 한계에 있는 픽셀만을 측정하였다. 시스템을 미국 펜실바니아주 19034 포트 워싱턴 소재의 EM 사이언시즈(Sciences)사의 마이크로미터 단위로 표준화하였고, 데이터를 ㎟ 또는 □m2로 나타내었다. 각 측정후, 데이터를 ASCII 파일 포맷으로 자동 저장하였고 최종 합산을 위하여 마이크로소프트 엑셀 버전 7.0으로 옮겼다.
면역조직화학
5개의 ㎛ 절편을 자일렌중에서 탈파라핀화하였고(2회, 5 내지 10분의 배양), 다음과 같은 에탄올중 3분 배양에 의하여 재수화하였다: 100% 에탄올중 2회 배양후 95% 알콜중 2회 배양 및 70% 알콜중 1회 배양. 수화된 경우, 절편을 수돗물로 1분간 헹구고 증류수로 1분간 헹구었다. 슬라이드를 3.0% H2O2중 15분간 넣은 후 증류수로 5분 헹굼에 의하여 내인성 과산화수소 활성이 억제되었다. 항원 복구를 위해 pH 6.0의 시트르산을 사용하여 슬라이드를 처리하였다. 슬라이드를 가열하여 비등시키고, 25℃에서 20분간 냉각하고, 증류수로 헹구었다. 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 DAKO 코포레이션의 DAKO 자동 염색기를 사용하여 슬라이드를 염색하였다. 염색하기 전, 슬라이드를 헹구고 20분간 차단 완충액에서 배양하였다. 차단 완충액은 미국 캘리포니아주 버링게임 소재의 벡터 랩스(Vector Labs)의 벡타스테인 ABC 키트(Vectastain ABC kit)로 기술되고 미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 NEN 라이프 사이언스 프로덕츠(NEN Life Science Products)사의 Cat#NEL700A의 NEN TSA 비오틴 시스템 키트(NEN TSA Biotin System kit)의 TNB 10ml 및 제 2 항체에 대응하는 정상 혈청 3방울을 함유한다.
염색에 사용되는 제 1 항체는 다음을 포함한다: 1:100으로 희석된 오스테오폰틴(미국 아이오와주 아이오와 시티 소재의 아이오와 대학교의 디벨롭멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크(Developmental Studies Hybridoma Bank)의 Cat#MPIIIb10의 마우스 단일클론성); 1:500으로 희석된 ED-1(미국 캘리포니아주 테메큘라 소재의 케미콘 인터내셔널 인코포레이션(Chemicon International Inc.)의 MAB1435의 마우스 단일클론성 항-마크로파지 당단백); 1:300으로 희석된 CD-3(미국 캘리포니아주 카피네리아 소재의 DAKO 코포레이션의 A0452의 래빗 폴리클론성-친화성 정제된 항체인 항-T-세포); 1:100으로 희석된 ICAM-1(미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)의 M-19:sc-1511의 염소 폴리클론성-친화성 정제된 항체); 1:100으로 희석된 VCAM-1(산타 크루즈 바이오테크놀로지의 C-19:sc-1504의 염소 폴리클론성-친화성 정제된 항체). 슬라이드를 제 1 항체로 60분간 배양한 후, 25℃에서 30분간 5㎕/㎖의 최종 농도로 항체를 비오틴화하였다. 염색을 벡터 래보러토리스(Vector Laboratories)사의 벡스타틴 ABC-AP 키트 및 미국 캘리포니아주 카핀테리아 소재의 다코(DAKO) 코포레이션의 다이아미노벤지딘 염료로 가시화하였다. 슬라이드를 물로 헹구고 약 30초간 헤마톡실린으로 반대-염색하였다. 미국 미주리주의 세인트 루이스 소재의 시그마 케미칼사의 동형-일치된 IgG를 제 1 항체의 음성 대조군으로 사용하였다.
오스테오폰틴 mRNA를 위한 동일반응계 혼성화
래트 오스테오폰틴(젠뱅크 억세션(GenBank accession)#NM 008608-1)의 서열에 기초하여 RNA 탐침을 제조하였다. 간단히 말해서, 래트 오스테오폰틴의 cDNA 절편을 다음의 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의하여 제조하였다: 전향 프라이머, 5'-TGG CAC ATT TGT CTT; 역향 프라이머 3'-AGC CCA TCC AGTC. 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation)의 TA 클로닝 키트를 사용하여 cDNA 절편을 PCR II 플라스미드에 삽입하였다. 37℃에서 60분간 탐침을 100㎕중 다음을 함유하는 시험관내 전사 반응에서 표지하였다: rRNasin(2U), DNase(0.5U), TE 완충액(1X), rGTP(10mM), rCTP(10mM), rATP(10mM), rUTP(10mM), (미국 위스콘신주 마디손 소재의 프로메가(PROMEGA)사), 5㎕(50μCi)33P-UTP(미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 엘킨 펠머(Elkin Pelmer)사) 및 적절한 RNA 중합효소(Sp6 RNA 중합효소(20U㎕); T7 RNA 중합효소(15U㎕), 프로메가사). 미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 아미콘(Amicon)사의 마이크로콘(Microcon) YM-50 마이크로농축기를 사용하여 유리 표지를 반응으로부터 제거하였다. 절편을 자일렌중 탈파라핀화하고, 상기 농도구배 에탄올 용액중 재수화하고, 4℃에서 10분간 미국 펜실바니아주 포트 워싱턴 소재의 EMS사의 4% 파라포름알데하이드중에서 고정하였다. 그 후 조직을 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재의 로슈(Roche)사의 단백질 가수분해효소 K(5㎎/mL; 10분, 37℃)로 증해하고 0.5X SSC 완충액(식염수-시트르산 나트륨 완충액)으로 세척하였다(10분). 농도 구배 에탄올에서의 순차적인 탈수후 전혼성화를 수행하고, 재수화에 대하여 상기한 바와 같이 역 공정을 실시하고, 혼성화 완충액(50% 포름아마이드, 2X SSC, 10% 황산덱스트란, v/v)중 42℃에서 2시간동안 배양하였다. 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마사의 tRNA(50㎍/mL) 및 적절한 표지 탐침을 함유하는 혼성화 완충액을 사용하여 55℃에서 혼성화를 하룻밤동안 실시하였다. 그후 혼성화 조직을 2X SSC 완충액, 0.1X SSC-EDTA 완충액(0.1X SSC, 1mM EDTA) 및 2X SSC 완충액으로 1시간 40분동안 연속적으로 세척하였다. 최종적으로 슬라이드를 NH4OAc를 함유하는 상기 농도구배 에탄올중에서 탈수하고(각 2분) 실온에서 1.5기간동안 진공 건조장치에서 건조하였다. 조직을 하룻밤동안 인 스크린에 노출하였다. 미국 뉴욕주 로체스터 소재의 코닥(Kodak)사의 감광 유제로 슬라이드를 코팅하고 현상하기 전에 3 내지 5주동안 4℃에 노출하였다. 현상된 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신으로 반대염색하였다.
택맨(TaqMan) 분석의 원리
어플라이드 바이오시스템즈’7700 서열 분석 시스템(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아 포스터 시티 소재)을 사용하는 형광유전자성 5’-뉴클레아제 분석(택맨 PCR)은 유전자-특정, 염료-표지된 올리고뉴클레이티드 탐침의 형광 증가를 검사하여 실시간 검출/정량을 가능하게 하였다. 목표 및 참조 유전자에 대한 탐침은 5-말단에서 6-카복시플루오레신(6FAM) 리포터 염료 그리고 3-말단에서 6-카복시-N,N,N',N'-테트라메틸로다민(TAMRA) 소광 염료로 표지된다. 탐침이 목표 유전자에 어닐링될 때, 6FAM의 형광은 TAMRA의 가까운 근접부분에 의해 차단된다. 택 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성이 목표 매개 존재의 양에 직접 비율에 형광 여기를 초래하는 목표 서열로부터 탐침을 치환하여 올리고뉴클레오티드 탐침로부터 염료를 방출시켰다. 데이터 분석은 어플라이드 바이오시스템의 서열 검출 시스템 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
택맨 프라이머 및 탐침: TGFβ1, ANP, 콜라겐 I 및 콜라겐 III
프라이머 및 탐침은 올리고 프라이머 분석 소프트웨어, 버전 5.0(내셔날 바이오사이언시즈 인코포레이트(National Biosciences Inc.(NBI)-콜로라도 주, 캐스케이드, 우즈시에크 린틸크 소재)을 사용하여 설계하였다. 프라이머는 라이프 테크놀로지(Life Technologies)(뉴욕주, 그랜드 아일랜드 소재)에서 합성되고, 탐침은 어플라이드 바이오시스템에서 합성되었다. 프라이머/탐침 세트는 분석된 래트 유전자의 공지된 서열로부터 설계하였다. 모든 목표 유전자 값은 참조 유전자, 항상 발현하는 사이클로필린으로 표준화되었다. 프라이머/탐침 세트 서열은 표 8에 제시한다.
모든 올리고뉴클레오티드는 5'에서 3'으로 기입된다. 프라이머는 표지되지 않고 모든 탐침은 5'-말단이 6-카복시플루오레신(6FAM) 리포터 염료로 및 3’-말단이 6-카복시-N,N,N',N'-테트라메틸로다민(TAMRA) 소광 염료로 표지된다.
RNA 분리: TGFβ 1 , ANP, 콜라겐 I 및 콜라겐 III
RNA는 동결된(-70℃) 좌심실(LV) 조직(대략 10 내지 20㎎)을 제조자의 지시에 따라서 1.5㎖ RNA-STAT 60(리도 메디칼 레보레토리 인코포레이트(Leedo MedicalLaboratories, Inc.), 텍사스주 휴스톤 소재)을 사용하여 추출하였다. 간략하게, 조직을 5mm 탐침(울트라-투랙스(Ultra-Turrax) T8 분쇄기, IKA 워크 인코포레이티드, 노스캐롤라이나주 윌밍톤)을 갖춘 조직 분쇄기를 사용하여 균질화하였다. 균질화 이후에 동일 부피의 분자 등급의 클로로폼(시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co.), 미주리주 세인트 루이스 소재)을 실온에서 10분동안 주기적으로 혼합하면서 항온처리하였다. 샘플을 10분간 12,000g에서 원심분리하고 RNA를 분자 등급의 아이소프로판올(시그마 케미칼 코포레이션)의 동일 부피를 첨가하여 상층으로부터 침전시켰고 -80℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. RNA를 12,000g에서 원심분리하여 펠렛화하였고 75% 에탄올로 세척하고 뉴클레아제가 없는 물(프로메가(Promega), 위스콘신주, 메디슨)에 용해하였다. RNA를 희석하고 분광학적으로 농도 및 순도를 분석하였다(A260/A280=1.9 내지 2.0, 평균 수율: 2.5㎍ RNA)
역전사: TGFβ 1 , ANP, 콜라겐 I 및 콜라겐 III
이중-나선 cDNA는 15% 뉴클레아제가 없는 물(프로메가, 위스콘신주 매디슨 소재) 및 1X RT 완충액(라이프 테크놀로지, 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재) 및 10mM DTT(라이프 테크놀로지), 각각 0.5mM의 dATP, dTTP, dGTP, dCTP(피이 바이오시스템즈(PE Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 2.5μM 올리고 d(T)15(올리고 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(Oligo Therapeutics, Inc.), 오레곤주 윌손빌 소재), 40 유닛 RNAsin(프로메가) 및 200 유닛 슈퍼스크립트 II 트랜스크립테이즈(라이프 테크놀로지)를 함유하는 20㎕의 최종 부피에 400ng RNA(4㎕)를 첨가하여 합성하였다. 반응은 정확한 반응 온도를 확인하기 위해서 뚜껑을 갖는 얇은-벽 반응 튜브(어플라이드 바이오시스템)내에서 수행하였다. 반응은 다음 프로토콜에 따라서 진앰프(GeneAmp) 9600 써모 사이클러(어플라이드 바이오시스템)를 사용하여 수행하였다: 37℃에서 1시간, 95℃에서 5분, 4℃에서 10분.
택맨 분석: TGFβ 1 , ANP, 콜라겐 I 및 콜라겐 III
각각 PCR 반응은 다음을 함유한다: 2.5㎕(50ng)의 각각의 cDNA를, 38.5% 뉴클레아제가 없는 물(프로메가), 1X PCR 완충액 II, 2mM MgCl2, 0.05U/㎕ 앰플리택 골드(AmpliTaq Gold)(PCR 중심 반응액 키트 N808-0228, 어플라이드 바이오시스템), 300nM의 각각 전방향 및 역방향 프라이머, 200nM의 탐침(어플라이드 바이오시스템) 및 각각 200μM의 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP(어플라이드 바이오시스템)을 함유하는 22.5㎕의 PCR 믹스(mix)에 첨가하였다. 단일 반응을 마크로앰프 광학 튜브내에 준비하고 7700 서열 검출기에 로드하였다. 다음 프로토콜은 모든 반응에 적용된다: 95℃에서 10분(중합효소 활성화); 95℃에서 10초(변성) 및 57℃에서 1분(어닐링)의 40사이클.
택맨 프라이머 및 탐침: COX-2, 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1
모든 프라이머 및 탐침은 7700 서열 검출 시스템에 공급된 프라이머 발현 소프트웨어를 사용하여 설계하고, 어플라이드 바이오시스템에 의해 합성하였다. 총 RNA(200ng 내지 320pg) 5배-희석을 사용한 표준 커브는 실험 샘플의 분석 이전에 택맨 반응에 각각 프라이머/탐침의 효율을 결정하기 위해 수행하였다. 프라이머/탐침 세트는 분석된 래트 유전자의 공지된 서열로부터 설계하였다. 모든 목표 유전자 값은 참조 유전자인 구성적으로 발현된 사이클로필린으로 정규화하였다. 프라이머/탐침 세트 서열은 표 8에 제시한다.
RNA 단리: COX-2, 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1
RNA는 토탈리 RNA 아이솔레이션(Totally RNA Isolation) 키트(암비온, 인코포레이션(Ambion Inc.), 텍사스주 오스틴 소재)을 사용하여 동결된 래트 심장 조직으로부터 추출하였다. 조직은 스텐레스강 모터 및 막자를 사용하여 크러슁하고 -80℃로 냉각하고 3 내지 10㎖의 냉각된 변성 완충액을 함유하는 다운스 균질화기(콘테스(Kontes), 뉴저지주 비네랜드 소재)에 옮겼다. 조직은 균질화하고 멸균 15㎖ 폴리프로필렌 원심분리 튜브로 옮겼다. 동일 부피의 페놀:클로로폼:아이소아밀 알콜(25:24:1)을 첨가하고 샘플을 1분간 격렬하게 흔들고 빙욕에서 15분 이상 항온 처리하였다. 샘플을 30분동안 10,000g에서 원심분리하였다. 수성 상을 제거하고 아세테이트 나트륨 용액(3.0M NaOAc pH 4.5)의 1/10부피를 첨가하고, 샘플을 10초간 흔들거나 뒤집고 산-페놀(아이소아밀 알콜과 예비 혼합됨):클로로폼(5:1, 암비온 인코포레이티드)을 개시 샘플 부피와 동일한 양으로 첨가하였다. 샘플을 격렬하게 1분간 흔들고 15분간 얼음상에서 항온 처리하고 10,000g에서 30분간 원심분리하였다. 수성 상을 제거하고 투명 폴리프로필렌 튜브에 넣었다. 동일 부피의 아이소프로판올(시그마, 미주리주 세인트 루이스 소재)을 첨가하고 샘플을 혼합하고 -20℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 샘플을 10,000g에서 30분간 원심분리하고 상청액을 제거하고 RNA 펠렛을 DNAse/RNAse가 없는 물에 재부유시켰다. 샘플을 2시간 이상 -80℃에서 동결하고 습윤 얼음상에서 해동하고 정량을 위해 희석하였다.
모든 RNA를 추가로 DNAse 증해에 의해 순수분리하여 게놈성 DNA 및 LiCl 침전을 제거하고 탄수화물을 제거하였다. 각각의 RNA(100㎍)을 40mM 트리스 pH 7.8, 6mM MgCl2, 10mM CaCl2를 함유한 완충액중에서 1 유닛 DNAse(로슈 다이아그노스틱(Roche Diagnostics), 인디아나주 인디아나폴리스 소재) 및 10 유닛 RNAse 억제제(어플라이드 바이오시스템, 캘리포니아 포스터 시티)와 함께 37℃에서 45분간 항온 처리하였다. DNAse 및 완충액은 RNA 클린업(큐아젠(Qiagen), 캘리포니아주 발렌시아 소재)을 위한 알엔이지(RNesay) 미니 프로토콜을 사용하여 제거하였다. 이어서, RNA를 샘플 부피에 절반 부피인 7.5M LiCl/50mM EDTA(암비온 인코포레이티드, 텍사스주 오스틴 소재)로 침전시키고 -20℃에서 밤새 항온 처리하고 4℃에서 13,000 내지 16,000g에서 30분동안 원심분리하였다. 모든 RNA는 -80℃에서 2시간 이상 동결하고 해동하고 분광학적으로 농도 및 순도를 분석하였다.
택맨 분석: COX-2, 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1
택맨 반응은 다음과 같이 수행하였다. 10㎕(200ng)의 총 RNA(DNA분해 및 LiCl 침전됨)를 다음을 함유하는 15㎕의 RT-PCR 반응 믹스에 첨가하였다: 12.5㎕의 우라실 N-글리코실라제가 없는 2X 1단계 PCR 마스터 믹스(암플리택 골드 ENA 중합효소, dUTP를 갖는 dNTPs, 수동 기준물질 및 최적화된 완충 요소를 함유함), 0.625㎕의 40X 멀티스크라이브 및 RNAse 억제제 믹스, 0.625㎕의 20μM 전방향 프라이머, 0.625㎕의 20μM 역방향 프라이머, 0.5㎕의 5μM 택맨 탐침 및 0.125㎕의DNAse/RNAse가 없는 물. 반응은 마이크로앰프 광학 캡 또는 접착 덮개(어플라이드 바이오시스템)를 갖춘 마이크로앰프 광학 96개 웰 반응판에 준비되고 7700 서열 검출기내로 적재된다. 다음 프로토콜은 모든 반응에 적용된다: 48℃에서 30분(역방향 전사), 95℃에서 10분(역방향 전사효소의 불활성화 및 중합효소의 활성화); 95℃에서 15초(변성) 및 60℃에서 1분간(어닐링)의 40사이클.
하이드록시프롤린 분석
심근 하이드록시프롤린 농도는 상기에서 기술된 바와 같이(4) 산화된 하이드록시프롤린과 p-다이메틸아미노벤즈알데하이드 사이의 반응을 정량하는 비색 분석에 의해 측정하였다. 간략하게, 조직(180 내지 250㎎)을 리엑티-썸(Reacti-Therm) 가열 블록(피어스(Pierce), 일리노이주 록포드 소재)을 사용하여 60℃에서 18시간동안 건조시키고 칭량했다. 건조된 조직 및 양성 콜라겐 대조군(소 콜라겐 유형 I, 시그마, 미주리주 세이트 루이스 소재)를 리엑티-썸 가열 블록내에서 150℃에 3시간동안 2㎖의 6N HCl로 가수분해하였다. 산을 질소 기체하에서 증발시키고 샘플은 1㎖의 시트레이트-아세테이트 완충액(0.7M NaOAc, 0.2M 시트레이트, 45mM 시트르산, pH 6.0)중에서 4㎖의 아이소프로판올의 존재하에 재수화하고 0.45㎛ 밀렉스(Millex) LCR 여과기(겔맨 사이언스(Gelman Sciences), 미시간주 앤 아버 소재)를 통해 여과하였다.
하이드록시프롤린 함량은 60㎕의 가수분해된 샘플 또는 콜라겐 표준물질을 350㎕ 시트레이트-아세테이트-아이소프로판올 완충액(40% 아이소프로판올을 갖는 시트레이트-아세테이트 완충액, 부피/부피) 및 100㎕의 300mM 클로라민 R(제이. 티. 베이커(J.T. Baker), 뉴저지주 필립스버그 소재)과 함께 25℃에서 5분간 항온 처리함으로써 측정하였다. 에를리히 시약(Erlich's Reagent)(1.25㎖, 80% 아이소프로판올을 갖는 70% 과염소산중의 3.5M p-다이메틸아미노벤즈알데하이드, 부피/부피)을 시각화 및 하이드록시프롤린의 정량을 위해서 첨가하였다. 샘플을 60℃에서 30분간 항온 처리하고, 실온으로 냉각하고 흡광도를 558nm에서 측정하였다. 하이드록시프롤린 함량은 새로이 준비된 트랜스-4-하이드록시-L-프롤린(시그마, 미주리주 세인트 루이스 소재)의 표준 커브로부터 정량하였다. 모든 샘플 및 표준물질은 이중으로 수행하였다.
통계 분석
데이터는 편차 1방향 분석법(ANOVA)를 사용하여 분석하였다. 그룹내의 규정도 추정 및 그룹 사이의 편차의 동일성이 일관되게 일치할 수 없기 때문에 분석은 가공하지 않은 데이터의 계수 변환된 값(비매개변수 분석)상에서 수행하였다. 알파=0.05의 유의 수준을 평균 사이의 계통적 비교에 사용하였다. 최소 유의 차(LSD) 방법을 그룹 사이의 계통적 비교에 사용하였다. 데이터는 SAS 통계 소프트웨어에서 PROC TTEST를 사용하여 분석하였다(SAS PC, 버전 6.12, SAS 인스티튜트, 노스 캐롤라이나주 캐리 소재). 모든 데이터는 평균치의 평균 ± 표준 오차(SEM)로서 보고한다.
동물 배제
3마리의 동물이 실험중에 사망하였다: 래트 #17(알도스테론 + 염 그룹, 정맥내 주입 24일 후에 사망), 래트 #64(알도스테론 + 염 그룹, 수술 후에 사망) 및 래트 #5(비히클 그룹, 수술 후에 사망). 추가 동물은 만약 다중 변수가 이들이 배정되는 처리 그룹을 나타내지 않는 것으로 밝혀질 경우(예컨대, 처리 그룹의 평균으로부터 표준 편차가 3 초과) 배제된다. 이러한 3마리의 동물을 연구에서 배제하였다: 래트 #57(7일 프로토콜, 알도스테론 + 염 그룹), 래트 #97(14일 프로토콜, 알도스테론 + 염 그룹) 및 래트 #24(30일 프로토콜, 100㎎/㎏/일 에플레레논 그룹). 상기 3마리 동물은 처리 그룹에 대한 평균으로부터 표준 편차가 3보다 큰 염증 표지 유전자(COX-2, 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1)의 발현을 증명하였다. 또한, 래트 #24는 원격계측 장치의 기능이상으로 결과로부터 배제되었다. 이들 동물에서 유도되는 값은 표 9.10 내지 표 9.19에 제시되며, 데이터 표에서 다른 동물에 대한 데이터로부터 분리되어 있다.
결과
혈압
혈압은 실험(표 10) 전체에서 비히클 + 염 대조군에서 정상으로 유지되었다. 알도스테론 + 염은 시간에 따른 혈압의 점진적인 증가를 유도했다. 에플레레논 + 알도스테론 + 염을 수여받은 동물에서 심장수축 혈압은 8 내지 30일에 상당히 감소하였다. 그러나 혈압은 비히클 + 염 대조군에 비해 상승된 상태를 유지한다.
체중, 심근 비대 및 ANP
7, 14 및 30일에 알도스테론 + 염 처리를 받은 동물은 비히클 + 염이 처리된 정상혈압 대조군에 비해 체중이 상당히 감소하였다(표 11 내지 13). 알도스테론 + 염 처리에 의해 유도된 체중의 감소는 30일에 에플레레논의 투여에 의해 상당히 감소하였다(표 11). 상당한 좌 및 우심실 비대가 알도스테론 + 염 처리에 대한 반응으로 발생하였다. 좌심실 비대는 알도스테론 + 염 처리의 7일 후에 명백한 반면(표 11), 우심실 비대는 알도스테론 + 염 처리 30일 후에 명백하였다(표 13). 에플레레논은 알도스테론 + 염 처리에 의해 유도된 절대적 심실 중량 또는 심실 중량에 대한 경골 길이의 비율에 영향이 없었다(표 11 내지 13). 또한 심방 나트륨이뇨 펩타이드(ANP) mRNA 수준의 상당한 상승이 알도스테론 + 염을 처리한 동물에서 관찰되었다(표 11 내지 13). ANP mRNA 상향조절은 처리의 30일 후에 에플레레논에 의해 상당히 감소하였으나 14일 후에는 감소되지 않았다(표 13).
심근 섬유증
상기 실험군(표 14 내지 16)중 모든 시점의 조직내 콜라겐 부피 분율 및 하이드록시프롤린 수준은 통계학적으로 상이하지 않았다. 알도스테론 + 염, 및 알도스테론 + 에플레레논 + 염 처리를 실시한지 30일 후, 비히클 + 염 대조군과 비교하여 콜라겐 I형 메시지의 가장 적은 증가가 감지되었다(표 16). 콜라겐 III형 mRNA 수준은 모든 시점에서 크게 증가하지 않았다(표 14 내지 16).
심근 조직병리학
처리를 실시한지 7일, 14일 및 30일 후, 반-정량적 점수평가법을 사용하여 심근 조직 손상을 평가하였다. 비히클 + 염 대조군의 심장은 모든 시점에서 조직학적으로 정상이었다. 처리를 실시한지 7일 후 알도스테론 + 염이 투여된 래트의 심장에서는 어떠한 혈관성 병변 또는 심근 병변이 확인되지 않았다(표 14). 반면, 처리를 실시한 지 14일 후에는 초점성 동맥 및 심근 변경이 관찰되었다(표 15 및 16). 알도스테론 + 염 처리를 실시한지 14일 후 및 30일 후의 동맥 및 심근의 정성적 변화는 유사하였으나, 그의 빈도 및 심각성은 시간에 따라 증가하였다. 도 44에 도시된 바와 같이, 에플레레논을 투여함으로써 모든 시점에서 심근 손상이 크게 감소되었다(표 14 내지 16).
염증성 매개체의 유전자 발현
다중 전구-염증성 분자의 발현 수준을, 정량적 택맨 PCR 분석을 사용하여 평가하였다(표 17 내지 19). 모든 시점에서 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 및 단핵세포화학주성단백질-1(MCP-1)의 발현 수준은 유사하였으며 알도스테론 + 염 처리에 의해 크게 증가하였다. 알도스테론 + 염 처리를 실시한지 14일 후(약 6배) 및 30일 후(약 13배), 오스테오폰틴 발현 또한 크게 상향조정되었다(표 18 및 19). 전환 성장인자 베타 1(TGF-β1) mRNA 수준은 검사한 모든 시점에서 상향조정되지 않았다. 세포내 유착 분자-1(ICAM-1) mRNA 발현은 알도스테론 + 염 처리를 실시한지 14일 후 및 30일 후 상향조정되었으나, 증가 정도는 미미하였다(표 9 및 10). 알도스테론 + 염 처리를 실시한지 30일 후, 혈관세포 유착 분자-1(VCAM-1)에서의 유전자 발현은 2배 증가하였으나, 이러한 증가는 통계학적으로 중요한 정도에 미치지 못하였다(표 19). 모든 표지 유전자의 발현은 에플레레논에 의해 알도스테론 + 염으로 처리된 동물에서의 유전자 발현과 비교하여 크게 감소하였다.
면역조직화학
면역조직화학적 분석을 사용하여 알도스테론 + 염-유도된 전구-염증성 반응의 분자 분석을 추가로 수행하였다. 내피에 대한 세포 유착 및 혈관주위 공간 침투의 대부분은 단핵세포/대식세포 항체(ED-1)에 대해 양성이고 T-세포 항체(CD-3)에 대해 음성이었다. 오스테오폰틴 발현은 주로 영향을 받은 중간세포 및 일부 영향을 받지 않은 관상동맥에 집중되지만, 세포주위 공간 및 심근괴사 영역의 일부 대식세포에도 존재하였다. 심근 세포에서는 주목할만한 오스테오폰틴 발현에 대한 증거가 발견되지 않았다. 내피세포 및 세포주위 공간에서는 ICAM-1 염색이 확인되었으나, VCAM-1은 주로 내피세포에서 발현되었다. 에플레레논을 투여하면 평가된 모든 표지 단백질에 대해 심근 조직에서의 알도스테론 + 염 처리로 인한 손상을 현저하게 둔화시켰다.
오스테오폰틴 mRNA의 동일반응계 하이브리드 형성
심근 조직에서 오스테오폰틴 발현을 국소화하기 위해 동일반응계 하이브리드 형성을 수행하였다. 오스테오폰틴 mRNA는 대부분 관상 동맥의 내측 세포에서 발견되지만, 오스테오폰틴 메시지는 또한 말초혈관 세포와 허혈 및 괴저 영역을 침윤한 세포에서도 확인되었다. 오스테오폰틴 mRNA는 심근세포나 영향을 받지 않는 간질 영역에서는 명확하지 않았다.
결론
염의 존재하에 알도스테론으로 래트를 처리하면 혈관 염증과 심장 조직 손상이 유도된다. 알도스테론 + 염 처리에 의해 유도된 이 손상이 일어나기 전에 친염증성 분자의 상향조절이 특징인 염증 반응이 선행된다. 에플레레논은 이 초기의 혈관 염증성 반응 및 후속적인 심근 손상을 현저하게 약화시켰다.
신장 고혈압 래트 모델
알도스테론 억제제 및 사이클로옥시게나제-2 선택적 억제제의 조합 치료는 신장-동맥 결찰 고혈압 래트, 고레닌 고혈압 모델에서의 혈압 강하 활성에 대해 평가되었다. 이 모델에서, 왼쪽 신장 동맥의 결찰 6일 후, 혈장 레닌 활성 및 혈압은 둘다 상당히 올라갔다(문헌[J.L. Cangiano et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 206, 310-313 (1979)]). 수컷-스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에게 혈압의 연속 모니터링을 위해 무선원격측정 혈압 전송기를 설치하였다. 래트는 케타민-HCl(100㎎/㎏) 및 아세프로마진 말레에이트(2.2㎎/㎏)의 혼합물을 사용하여 마취시켰다. 중간 절개를 통해 복부 대동맥을 노출시켰다. 미세혈관 클램프를 신장 동맥 및 엉덩뼈 갈림에 대해 대동맥 말단에 놓았다. 대동맥을 22-게이지 바늘을 사용하여 구멍을 내고, 카테터의 끝을 삽입한다. 허리근에서 묶음실에 의해 제 위치에 고정된 캐테터를 무선원격측정 혈압 전송기(오리건주 썬리버 소재의 미니-미터 캄파니 인포코레이티드)에 연결시킨다. 전송기를 복강에 놓고, 절개 폐쇄시 복근에 봉합한다. 래트를 무선원격측정 수신기 위에 단독으로 수용하고, 표준 래트용 쵸콜릿 및 물을 무제한으로 허용한다. 수술 후 회복을 위해 적어도 5일을 허용한다. 평균 동맥 혈압 및 심장 박동수를 미니-컴퓨터와 같은 적절한 데이터 기록기상에서 측정한다. 1일 24시간 당 2.5 내지 10분 간격으로 200 내지 500Hz에서 10초간 데이터를 샘플링한다. 24시간동안 대조군 데이터를 수집한 후, 래트를 메토헥시탈(30㎎/㎏, 복강내)로 마취시키고, 필요한 경우 보충한다. 약 2㎝ 길이로 중간 복부 절개를 실시하여 왼쪽 신장을 노출시킨다. 신장 동맥을 대동맥 근처의 정맥으로부터 분리하고, 이때 정맥을 건드리지 않게 주의한다. 동맥을 멸균 4-0 견을 사용하여 완전히 결찰한다. 절개를 근육층 및 피부의 조심스런 봉합에 의해 폐쇄한다. 6일 후, MAP는 전형적으로 50 내지 70㎜Hg까지 올라가고, 알도스테론 길항제 또는 하나 이상의 사이클로옥시게나제-2 선택적 억제제와의조합을 약 8주동안 각각의 날에 위관에 의해 투여한다. 20 내지 200㎎/㎏/1일의 알도스테론 억제제 및 1, 3, 10, 30 및 100㎎/㎏/1일의 사이클로옥시게나제-2- 선택적 억제제를 사용하여 단일 약물 투약을 실시한다. 1, 3, 10, 30 또는 100㎎/㎏/1일의 사이클로옥시게나제-2-선택적 억제제의 1일 투여량과 20 내지 200㎎/㎏/1일의의 알도스테론 억제제의 1일 투여량의 조합을 투여함으로써 약물 혼합물을 수득한다. 혈압 강하를 무선원격측정 시스템에 의해 모니터링하고, 화합물과의 반응을 비히클로 치료한 동물에서 수득된 반응과 비교한다. 혈장 및 뇨 나트륨 및 칼륨 수준을 알도스테론 차단의 유효성의 측정치로서 모니터링한다. 샘플을 분리하는 대사실을 이용하여 뇨 샘플을 하룻밤동안 수거한다. 정맥 카테터삽이에 의해 혈장 샘플을 수득한다. 나트륨 및 칼륨을 불꽃 광도계에 의해 수득한다. 관류 결합을 수행한 절제한 심장의 조직학적 및 화학적 측정에 의해 심장 섬유증을 측정한다. 좌심실 및 우심실을 중량을 측정하고, 묻고, 절개한다. 계속해서, 피프로시리어스 적색을 사용하여 절개물을 염색하고, 적색으로 염색된 콜라겐 영역을 컴퓨터 영상 분석에 의해 정량한다. 심장의 끝을 산으로 증해하고, 유리 하이드록시프롤린을 색측정법으로 측정한다. MAP는 조합 치료를 사용하여 치료한 시험 동물에서 정상 혈압으로 상당히 저하될 것이고, 심근 섬유증의 증상을 정지시키거나 피할 수 있을 것으로 예측된다.
죽상경화증의 예방을 포함하는 심혈관 질환의 예방 평가에 적절한 몇몇 다른 동물 모델이 이용가능하다. 스테벤스(Stehbens)의 문헌[Prog. Card. Dis., XXIX, 1007-28(1986)] 및 장(Zhang) 등의 문헌[Science, 258, 468-71(1992)]을 참고할 수 있다.
죽상경화증에 대한 APOe 마우스 모델은 로젤리어(Roselear) 등의 문헌[Arterioscle. Thromb. Vasc. Biol., 16, 1013-18 (1996)]에 기재되어 있다. 알도스테론 차단제는 죽상경화 병변을 예방하는데 활성이어야 한다.
본원에 기재된 생물학적 평가는 심혈관 질병을 치료 또는 예방하기 위한 알도스테론 수용체 길항제 및 NSAID를 포함한 조합 치료의 효능을 증명하는데 유용하다.
비록 본 발명이 특정 실시태양에 대해 기재되어 있지만, 본 발명이 이들 실시태양의 세부사항으로 제한되는 것으로 여겨서는 안된다.
본원에 언급된 모든 특허 문헌은 참고로 인용되어 있다.

Claims (69)

  1. 첫번째 양의 알도스테론 수용체 길항제 및 두번째 양의 비스테로이드 소염제(NSAID)를 포함하는 심혈관 질병의 치료 또는 예방을 위한 조합로서, 상기 첫번째 양과 두번째 양이 합해서 치료 효과량의 상기 알도스테론 수용체 길항제 및 상기 NSAID를 포함하는 조합.
  2. 첫번째 양의 알도스테론 수용체 길항제, 두번째 양의 NSAID 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 물질을 포함하는 심혈관 질병의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물로서, 상기 첫번째 양과 두번째 양이 합해서 치료 효과량의 상기 알도스테론 수용체 길항제 및 상기 NSAID를 포함하는 약학 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 에폭시-스테로이드성 알도스테론 수용체 길항제인 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 에폭시-스테로이드성 알도스테론 수용체 길항제가 20-스피록세인 화합물의 스테로이드 핵의 "C" 고리에 융합된 에폭시 잔기를 갖는 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 20-스피록세인 화합물이 9α,11α-치환된 에폭시 잔기의 존재를 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가
    에플레레논;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-다이메틸 에스터,(7α,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소,γ-락톤,(6β,7β,11α,17β)-;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-7-(1-메틸에틸) 에스터, 모노칼륨 염,(7α,11α,17β)-;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-7-메틸 에스터, 모노칼륨 염,(7α,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-1,4,6-트라이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,(6β,7β,11α)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,메틸 에스터,(6β,7β,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,모노칼륨 염,(6β,7β,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,(6β,7β,11α,17β)-;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,에틸 에스터,(7α,11α,17β)-; 및
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,1-메틸에틸 에스터,(7α,11α,17β)-로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 에플레레논인 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살,에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜 및 아이부프로펜으로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 NSAID가 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진 및 옥시펜부타존으로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 NSAID가 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 NSAID 및 상기 알도스테론 수용체 길항제가 상기 조합에서 약 1:1 내지 약 1:20의 상기 NSAID 대 상기 알도스테론 수용체 길항제의 중량비 범위로 존재하는 약학 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 중량비 범위가 약 1:5 내지 약 1:15인 약학 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 중량비가 약 1:10인 약학 조성물.
  15. 제 2 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 스피로노락톤인 약학 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 NSAID 및 상기 알도스테론 수용체 길항제가 상기 조합에서 약 1:1 내지 약 1:20의 상기 NSAID 대 상기 알도스테론 수용체 길항제의 중량비 범위로 존재하는 약학 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 중량비 범위가 약 1:5 내지 약 1:15인 약학 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 중량비가 약 1:10인 약학 조성물.
  20. 제 2 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 약학 조성물.
  21. 첫번째 양의 알도스테론 수용체 길항제 및 두번째 양의 NSAID를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 심혈관 질병의 치료 또는 예방이 필요한 대상의 심혈관 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 첫번째 양과 두번째 양이 합해서 치료 효과량의 상기 알도스테론 수용체 길항제 및 상기 NSAID를 포함하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    심혈관 질병이 고혈압, 심장부전, 관상동맥질환, 동맥류, 동맥경화증, 죽상경화증, 심근경색증, 색전증, 뇌졸중, 혈전증, 앙기나, 혈관 플라크 염증, 혈관 플라크 파열, 가와사키병(Kawasaki disease), 석회화 및 염증으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  23. 제 21 항에 있어서,
    심혈관 질병이 관상동맥질환, 동맥류, 동맥경화증, 죽상경화증, 심근경색증, 색전증, 뇌졸중, 혈전증, 앙기나, 혈관 플라크 염증, 혈관 플라크 파열, 가와사키병, 석회화 및 염증으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  24. 제 21 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 스피로락톤형 화합물인 방법.
  25. 제 21 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 스피로노락톤인 방법.
  26. 제 26 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 디클로페낙, 페노프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 톨메틴 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  28. 제 21 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 에폭시-스테로이드성 알도스테론 수용체 길항제인 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 에폭시-스테로이드성 화합물이 20-스피록세인 화합물의 스테로이드 핵의 "C" 고리에 융합된 에폭시 잔기를 갖는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 20-스피록세인 화합물이 9α,11β-치환된 에폭시 잔기의 존재를 특징으로 하는 방법.
  31. 제 28 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가
    에플레레논;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-다이메틸 에스터,(7α,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소,γ-락톤,(6β,7β,11α,17β)-;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-7-(1-메틸에틸) 에스터, 모노칼륨 염,(7α,11α,17β)-;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-7-메틸 에스터, 모노칼륨 염,(7α,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-1,4,6-트라이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,(6β,7β,11α)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,메틸 에스터,(6β,7β,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,모노칼륨 염,(6β,7β,11α,17β)-;
    3'H-사이클로프로파[6,7]프레그나-4,6-다이엔-21-카복실산,9,11-에폭시-6,7-다이하이드로-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,(6β,7β,11α,17β)-;
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,에틸 에스터,(7α,11α,17β)-; 및
    프레근-4-엔-7,21-다이카복실산,9,11-에폭시-17-하이드록시-3-옥소-,γ-락톤,1-메틸에틸 에스터,(7α,11α,17β)-로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  32. 제 21 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제가 에플레레논인 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  34. 제 21 항에 있어서,
    상기 NSAID가 아세트아미노펜, 벤옥사프로펜, 캐프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루비프로펜, 아이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 옥사프로진, 옥시펜부타존, 페닐부타존, 피록시캠, 설린닥, 서프로펜, 테니댑, 톨메틴, 조메피락 및 아스피린으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  35. 제 21 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제 및 상기 NSAID가 연속 방식으로 투여되는 방법.
  36. 제 21 항에 있어서,
    상기 알도스테론 수용체 길항제 및 상기 NSAID가 실질상 동시 방식으로 투여되는 방법.
  37. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 약 0.1 내지 약 400㎎의 1일 투여량 범위로 투여되는 방법.
  38. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 약 1 내지 약 200㎎의 1일 투여량 범위로 투여되는 방법.
  39. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 약 1 내지 약 100㎎의 1일 투여량 범위로 투여되는 방법.
  40. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 약 10 내지 약 100㎎의 1일 투여량 범위로 투여되는 방법.
  41. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 약 25 내지 약 100㎎의 1일 투여량 범위로 투여되는 방법.
  42. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 5㎎, 10㎎, 12.5㎎, 25㎎, 50㎎, 75㎎ 및 100㎎으로 이루어진 군중에서 선택된 1일 투여량으로 투여되는 방법.
  43. 제 32 항에 있어서,
    상기 에플레레논이 25㎎, 50㎎ 및 100㎎으로 이루어진 군중에서 선택된 1일 투여량으로 투여되는 방법.
  44. 첫번째 양의 알도스테론 수용체 길항제 및 두번째 양의 NSAID를 대상에게 투여하는 것을 포함하는 염증-관련 질병의 치료 또는 예방이 필요한 대상의 염증-관련 질병을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 첫번째 양과 두번째 양이 합해서 대상의 염증을 조절하는데 직접 또는 간접적으로 수반된 하나 이상의 발현 생성물의 발현을 변경시키는데 충분한 방법.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 염증-관련 질병이 상기 대상의 조직에서 나타나는 방법.
  46. 제 44 항에 있어서,
    상기 염증-관련 질병이 상기 대상의 기관에서 나타나는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서,
    상기 기관이 심장인 방법.
  48. 제 46 항에 있어서,
    상기 기관이 뇌인 방법.
  49. 제 46 항에 있어서,
    상기 기관이 신장인 방법.
  50. 제 44 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 발현 생성물의 증가된 발현이 대상의 염증을 조절하는데 직접 또는 간접적으로 수반되는 방법.
  51. 제 44 항에 있어서,
    하나 이상의 상기 발현 생성물의 감소된 발현이 대상의 염증을 조절하는데 직접 또는 간접적으로 수반되는 방법.
  52. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물 중 둘 이상이 동시에 함께 발현되는 방법.
  53. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물 중 둘 이상이 연속해서 함께 발현되는 방법.
  54. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 사이클로옥시게나제-2, 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1, VCAM-1, ANF, aVβ3, Inf-γ, IL-1, TNF-α, NADH/NADPH 옥시다제, 슈퍼옥사이드 유리 라디칼, TXA2, b-FGF, CD44, 엔도텔린, 안지오텐신 II 수용체, 활성 t-PA, 불활성 t-PA, PAI-1, CRP, IL-6, IL-10, IL-12, 트로포닌 T, HSP65, 아밀로이드, 포스포리파제 A2, 피브리노겐, CD40/CD40L, 인터그린 a1β1와 결합한 콜라겐 및 인터그린 a2β1와 결합한 콜라겐으로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  55. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 사이클로옥시게나제-2, 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1, VCAM-1, ANF, aVβ3, Inf-γ, IL-1, TNF-α, NADH/NADPH 옥시다제, 슈퍼옥사이드 유리 라디칼, TXA2, b-FGF, CD44, 엔도텔린, 안지오텐신 II 수용체, 활성 t-PA, 불활성 t-PA 및 PAI-1로 이루어진 군중에서 선택되는 방법.
  56. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 사이클로옥시게나제-2인 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    상기 사이클로옥시게나제-2가 오스테오폰틴, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 발현 생성물과 함께 발현되는 방법.
  58. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 오스테오폰틴인 방법.
  59. 제 58 항에 있어서,
    상기 오스테오폰틴이 사이클로옥시게나제-2, MCP-1, ICAM-1 및 VCAM-1로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 발현 생성물과 함께 발현되는 방법.
  60. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 MCP-1인 방법.
  61. 제 60 항에 있어서,
    상기 MCP-1이 사이클로옥시게나제-2, 오스테오폰틴, ICAM-1 및 VCAM-1로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 발현 생성물과 함께 발현되는 방법.
  62. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 ICAM-1인 방법.
  63. 제 62 항에 있어서,
    상기 ICAM-1이 사이클로옥시게나제-2, 오스테오폰틴, MCP-1 및 VCAM-1로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 발현 생성물과 함께 발현되는 방법.
  64. 제 44 항에 있어서,
    상기 발현 생성물이 VCAM-1인 방법.
  65. 제 64 항에 있어서,
    상기 VCAM-1이 사이클로옥시게나제-2, 오스테오폰틴, ICAM-1 및 MCP-1로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상의 발현 생성물과 함께 발현되는 방법.
  66. 알도스테론 수용체 길항제 및 NSAID를 포함하는 심혈관 질병을 치료 또는 예방하기 위한 키트.
  67. 제 66 항에 있어서,
    상기 키트의 함량이 대상에 의해 어떻게 사용될 수 있는지를 언급한 서면으로 기재된 지시사항을 추가로 포함하는 키트.
  68. 제 67 항에 있어서,
    상기 서면으로 기재된 지시사항이, 대상이 원하지 않는 부작용을 유도하지 않으면서 치료 효과를 얻을 수 있도록 상기 키티의 함량이 어떻게 사용될 수 있는지를 추가로 언급하고 있는 키트.
  69. 제 67 항에 있어서,
    서면으로 기재된 지시사항이 상기 키트용 약물 관리 기관에 의해 승인된 제품 라벨의 전부 또는 일부를 포함하는 키트.
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