MXPA05008972A - Metodos de tratamiento de diabetes por bloqueo de la actividad mediada por factor de crecimiento endotelial vascular. - Google Patents

Abstract

Metodos de tratamiento de diabetes en mamiferos, particularmente humanos, al bloquear o inhibir la actividad mediada por VEGF. Un inhibidor preferido de actividad mediada por VEGF es un antagonista de VEGF tal como una trampa de VEGF capaz de unirse a VEGF y bloquearlo.

Description

METODOS DE TRATAMIENTO DE DIABETES POR BLOQUEO DE LA ACTIVIDAD MEDIADA POR FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR CAMPO DE LA INVENCION El campo de la invención generalmente se refiere a métodos de tratamiento de diabetes al administrar agentes capaces de reducir los niveles de glucosa en el suero. En particular, el campo de la invención son métodos de tratamiento de diabetes al administrar agentes capaces de bloquear, inhibir, o mitigar la actividad mediada por VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular, por sus siglas en inglés) . ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se ha reportado que los ratones db/db, un modelo murino de diabetes de tipo 2 , tratados con un anticuerpo contra VEGF muestran mitigación de cambios renales diabéticos, pero no presentan una disminución, en peso corporal, niveles de glucosa en el suero, niveles de insulina o consumo de alimento (Flyvbjerg et al. (2002) Diabetes 51: 3090-3094) . SUMARIO DE LA INVENCION En un primer aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de diabetes que comprende administrar a un mamífero un agente capaz de bloquear, inhibir, o mitigar Ref. 166189 la actividad mediada por VEGF. En modalidades específicas, el método de tratamiento de la invención da por resultado niveles de glucosa en el suero disminuidos, tolerancia a la glucosa mejorada, sensibilidad a la insulina mejorada, hiperinsulinemia reducida, y/o control glicérico mejorado. En una modalidad específica, la diabetes tratada es diabetes de tipo 2 (también denominada diabetes mellitus no dependiente de insulina) (NIDDM, por sus siglas en inglés) . En condiciones específicas, la diabetes de tipo I o diabetes durante la gestación también puede ser tratada. El agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF en modalidades específicas es un antagonista de VEGF. De manera más específica, el antagonista de VEGF incluye una trampa de VEGF seleccionada del grupo que consiste de Flt-1 (1-3) -Fe, Flt-1 (l-3k-,N) -Fe , Flt-1 (1-3??) -FC, Flt-1 (2-3??) -Fe, Flt-1 (2-3) -Fe, Flt-1D2-VEGFR3D3-FcACl(a), Flt-lD2-Flk-lD3-FcACl (a) , y VEGFR1R2-FcACl (a) acetilados. En otras modalidades específicas, el agente es un anticuerpo, lípido, ácido nucleico, molécula pequeña, aptámero, molécula de antisentido, carbohidrato, peptidomimético o hapteno. La administración del agente puede ser cualquier método conocido en la técnica, que incluye la vías de administración subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal , intravenosa, intranasal u oral. El mamífero tratado es preferiblemente un sujeto humano que padece de diabetes. También adecuado para tratamiento por el método de la invención es un sujeto en riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2 que presenta uno o más síntomas de diabetes de tipo 2 o de una condición asociada con el desarrollo de diabetes de tipo 2, tal como, por ejemplo, resistencia a la insulina, dislipidemia, síndrome de ovario poliquístico, obesidad, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipercolesteremia, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia e hipertensión. En un segundo aspecto, la invención se refiere a un método para inhibir o hacer más lenta la progresión de la diabetes de tipo 2 en un mamífero, que comprende administrar a un mamífero un agente capaz de bloquear o inhibir la actividad mediada por VEGF. En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método para mejorar la tolerancia a la glucosa o sensibilidad a la insulina en un mamífero que necesita el mismo, que comprende administrar a un mamífero un agente capaz de bloquear o inhibir la actividad mediada por VEGF. Otros objetos y ventajas se harán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada consecuente .

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B: (A) Niveles de glucosa en el suero y (B) peso corporal a las 4 semanas en ratones diabéticos (db/db) y no diabéticos (dJb/?) tratados con VEGFR1R2-FcACl (a) . Figura 2 : Niveles de glucose en el suero hasta 8 semanas de tratamiento de controles y ratones diabéticos (dbldb) y no diabéticos (db/?) con VEGFRlR2-FcACI (a) . Figura 3 : Prueba de tolerancia a la glucosa oral a las 4 semanas de tratamiento para ratones control y diabéticos {db/db) y no diabéticos (db/?) tratados con VEGFR1R2-FCÁC1 (a) . Figura 4 : Prueba de tolerancia a la glucosa oral a 8 semanas de tratamiento para ratones control y diabéticos {db/db) y no diabéticos (db/?) tratados con VEGFR1R2-FcACl(a) . Figura 5A-5B Niveles de glucose e insulina en el suero en ayunas después de 8 semanas de tratamiento de ratones control y diabéticos (db/db) y no diabéticos (db/?) tratados con VEGFRlR2-FcACl (a) . DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Antes de que se describan los presentes métodos, cabe entender que esta invención no se limita a los métodos particulares, y condiciones experimentales descritos, ya que esos métodos y condiciones pueden variar. También cabe entender que la terminología usada aquí es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones anexas. Como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un método" incluye uno o más métodos, y/o pasos del tipo que aquí se describe y/o que será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción y así sucesivamente. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto en la técnica al cual está dirigida esta invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí se pueden usar en la práctica o pruebas de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos . Todas las publicaciones aquí mencionadas se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Descripción General La invención se basa en parte en el hallazgo de que la administración de un agente capaz de bloquear o inhibir la actividad mediada por VEGF es capaz de reducir la glucosa en el suero y mejorar el desecho de glucosa en mamíferos diabéticos . Estos hallazgos representan la primera vez que un agente capaz de bloquear o inhibir la actividad mediada por VEGF se ha mostrado que mitiga la diabetes. Por lo tanto, la invención provee métodos de tratamiento de diabetes en un mamífero al administrar un antagonista de VEGF. De manera más específica, el método de la invención se puede poner en práctica con un antagonista de VEGF tal como una trampa de VEGF, como se muestra más adelante, o un anticuerpo específico de VEGF. Definiciones Por el término "dosis terapéuticalmente efectiva" se- entiende una dosis que produces el efecto deseado para el cual se ha de administrar. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y lo logrará- un experto en la técnica con el uso de técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) . iPor el término "bloqueador" , "inhibidor" o "antagonista" se entiende una sustancia que retarda o previene una reacción o respuesta química o fisiológica. Los bloqueadores o inhibidores comunes incluyen pero no se limitan a moléculas de antisentido, anticuerpos, antagonistas y sus derivados. De manera más especifica, un ejemplo de un bloqueador o inhibidor de VEGF es un antagonista basado en receptor de VEGF que incluye, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, o una trampa de VEGF tal como VEGFR1R2-FcACl (a) (SEQ ID NOs: 1-2). Para una descripción completa de antagonistas basados en receptor de VEGF que incluyen VEGFRlR2-FcACl (a) , véase la publicación del PCT WO/00/75319, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Una "molécula pequeña" se define aquí como aquella que tiene un peso molecular por debajo de aproximadamente 500 Daltons, y puede incluir tanto moléculas químicas como moléculas peptídicas. Construcciones de ácido nucleico Los componentes individuales de la proteína de fusión específica de VEGF de la invención pueden ser construidos por métodos de biología molecular conocidos en la técnica con las instrucciones provistas por la presente especificación. Estos componentes se seleccionan a partir de una primera proteína de receptor celular, tal como, por ejemplo, VEGFR1; una segunda proteína de receptor celular, tal como, por ejemplo, VEGFR2; un componente de multimerización, tal como un Fe.

Modalidades específicas de las proteínas de fusión específicas de VEGF útiles en los métodos de la invención comprenden un componente de multimerización que permite que las proteínas de fusión se as.ocien, v.gr., como multímeros, preferiblemente dímeros . Preferiblemente, el componente de multimerización comprende un dominio derivado de inmunoglobulina . Los componentes de multimerización adecuados son secuencias que codifican una región de gozne de cadena pesada de inmunoglobulina (Takahashi et al. 1982 Cell 29: 671-679) ;¦ secuencias de genes de inmunoglobulina, y porciones de las mismas . Las construcciones de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión útiles en los métodos de la invención se insertan en un vector de expresión por métodos conocidos en la técnica, en donde la molécula de ácido nucleico está operativamente ligada a una secuencia de control de expresión. Los sistemas de hospedero-vector para la producción de proteínas que comprenden un vector de expresión introducidos en una célula hospedero adecuados para la expresión de la proteína se conocen en la técnica. La célula hospedero adecuada puede ser una célula bacteriana tal como E. coli, una célula de levadura, tal como Pichia pastoris, una célula de insecto, tal como Spodoptera frugiperda, o una célula de mamífero, tal como una célula COS, CHO, 293, BHK o NSO. Ácidos nucleicos de antisentido En un aspecto de la invención, la actividad mediada por VEGF es bloqueada o inhibida mediante el uso de ácidos nucleicos de antisentido de VEGF. La presente invención provee el uso terapéutico o profiláctico de ácido nucleicos que comprende por lo menos seis nucleótidos que son de antisentido para un gen o ADNc que codifica VEGF o una porción del mismo. Como se usa aquí, un ácido nucleico de "antisentido" de VEGF se refiere a un ácido nucleico capaz de hibridar en virtud de cierta complementariedad de secuencia a una porción de un ARN (preferiblemente ARNm) que codifica VEGF. El ácido nucleico de antisentido puede ser complementario a una región codificadora y/o no codificadora de un ARNm que codifica VEGF. Esos ácidos nucleicos de antisentido tienen utilidad como compuestos que previenen la expresión de VEGF, y se pueden usar en el tratamiento de diabetes . Los ácidos nucleicos de antisentido de la invención son oligonucleótidos de doble cadena o una sola cadena, ARN o ADN o una modificación o derivado de los mismos, y pueden ser administrados directamente a una célula o ser producidos intracelularmente por transcripción de secuencias introducidas exógenas . Los ácidos nucleicos de antisentido de VEGF son de por lo menos seis nucleótidos y son preferiblemente oligonucleótidos que varían de 6 a aproximadamente 50 oligonucleótidos . En aspectos específicos, el oligonucleótido es por lo menos de 10 nucleótidos, por lo menos 15 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, o por lo menos 200 nucleótidos . Los oligonucleótidos pueden ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados de los mismos o versiones modificadas de los mismos y pueden ser de una sola cadena o de doble cadena. Además, las moléculas de antisentido pueden ser polímeros que son simuladores de ácido nucleico, tales como PNA, morfolino oligos, y LNA. Otros tipos de moléculas de antisentido incluyen AR cortos de doble cadena, conocidos como ARNsi, y ARN cortos de pasador, y ARNds largos (>50 pb pero generalmente >500 pb) . Ribozimas inhibidoras En un aspecto de la invención, la diabetes se puede tratar en un sujeto que padece de esa enfermedad al reducir el nivel de actividad de VEGF mediante el uso de moléculas de ribozima diseñadas para cortar catalíticamente transcripciones de ARNm de genes que codifican VEGF, con lo que se impide la traducción de ARNm del gen objetivo y, por lo tanto, la expresión del producto del gen. Las ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar el corte específico de ARN. El mecanismo de la acción de la ribozima implica hibridación específica de secuencia de la molécula de ribozima al ARN objetivo complementario, seguido por un evento de corte endonucleolítico . La composición de moléculas de ribozima debe incluir una o más secuencias complementarias al ARNm de gen objetivo, y debe incluir la secuencia catalítica bien conocida responsable del corte del ARNm. Para esta secuencia, véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,093,246. Aunque las ribozimas que cortan el ARNm en las secuencias de reconocimiento específicas del sitio se pueden usar para destruir ARNm que codifican VEGF, el uso de las ribozimas de cabeza de martillo es preferido. Las ribozimas de cabeza de martillo cortan los ARNm en sitios determinados por regiones de flanqueo que forman pares de bases complementarios con el ARNm objetivo. El único requerimiento es que el ARNm tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5 ' -UG-31. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo son bien conocidas en la técnica. Las ribozimas de la presente invención también incluyen ARN endorribonucleasas (de aquí en adelante "ribozimas de tipo Cech") tal como la que ocurre naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como el ARN de IVS, o L-19 IVS) . Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que híbrida a una secuencia de ' ARN objetivo en donde tiene lugar el corte del ARN objetivo. La invención abarca aquellas ribozimas de tipo Cech que cortan secuencias de sitio activo de ocho pares de bases que están presentes en el gen que codifica VEGF.

Generación de anticuerpos para proteínas VEGF En otro aspecto de la invención, la invención se puede poner en práctica con un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de anticuerpo capaz de unir y bloquear la actividad de VEGF. Los anticuerpos anti-VEGF se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 6,121,230, incorporada aquí específicamente por referencia. El término "anticuerpo" como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que comprende una región de marco de un gen de inmunoglobulina o fragmentos del mismo que se une y reconoce específicamente un antígeno. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen las regiones constantes kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon, y mu, así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican ya sea como kappa o lantfSda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Dentro de cada clase de IgG, hay diferentes isotipos (v.gr., IgGx, IgG2, etc.). Típicamente, la región de unión a antígeno de un anticuerpo será la más crítica en la determinación de especificidad y afinidad de unión. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas, o como un número de fragmentos bien caracterizados producidos por digestión con varias peptidasas. Por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por abajo de los enlaces de disulfuro en la región de gozne para producir F(ab)'2, un dímero de Fab que por sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace de disulfuro. El F(ab)'2 puede ser reducido bajo condiciones ligeras para romper el enlace de disulfuro en la región de gozne, lo que convierte al dímero F(ab)'2 en un monómero Fab'. El monómero Fab' es esencialmente Fab con parte de la región de gozne . Aunque varios fragmentos de anticuerpo se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la técnica apreciará que esos fragmentos pueden ser sintetizados nuevamente ya sea químicamente o con el uso de metodología de ADN recombinante . Por lo tanto, el término anticuerpo, como se usa aquí, también incluye fragmentos de anticuerpo ya sea producidos por la modificación de anticuerpos enteros, o " aquellos sintetizados nuevamente-*con el uso de metodologías de ADN recombinante (v.gr., Fv de una sola cadena) (scFv) o aquellas identificadas con el uso de genotecas de despliegue de fase (véase, por ejemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348 : 552-554) . Los métodos para preparar anticuerpos son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler & Milstein (1975) Nature 256: 495-497; Harlow & Lañe (1988) Antibodies: a Laboratory Manual , Cold Spring * Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY) . Los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de interés se pueden clonar a partir de una célula, v.gr., los genes que codifican un anticuerpo monoclonal se pueden clonar a partir de un hibridoma y usar para producir un anticuerpo monoclonal recombinante . Las genotecas de genes que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos monocloiiales también se pueden hacer a partir de un hibridoma o células plasmáticas . Las combinaciones aleatorias de los productos de gen de cadena pesada y ligera generan un gran acervo de anticuerpos con diferente especificidad antigénica. Las técnicas para la producción de anticuerpos de una sola cadena o anticuerpos recombinantes (US 4,946,778; US 4,816,567) se pueden adaptar para producir anticuerpos usados en las proteínas de fusión y métodos de la presente invención. También, se pueden usar ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanos o humanizados. Alternativamente, la tecnología de despliegue de fagos se puede usar para identificar anticuerpos y fragmentos Fab heteroméricos que se unen específicamente a antígenos seleccionados . Detección selectiva y selección de anticuerpos La detección selectiva y la selección de anticuerpos preferidos se pueden construir mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La detección selectiva inicial para la presencia de anticuerpos monoclonales específicos para un antígeno objetivo se puede conducir, por ejemplo, a través del uso de métodos basados en ELISA. Una detección selectiva secundaria se conduce preferiblemente para identificar y seleccionar un anticuerpo monoclonal para usarse en la construcción de las proteínas de fusión multiespecíficas de la invención. La detección selectiva secundaria se puede conducir con cualquier método conocido en la técnica. Un método preferido, denominado "perfil asistido por modificación de biosensor" ("BiaMAP, por sus siglas en inglés") se describe en USSN co-pendiente 60/423,017 presentada el 1 de Noviembre de 2002, incorporada aguí específicamente por referencia en su totalidad. BiaMAP permite la identificación rápida de clones de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales con características deseadas. De manera más específica, los anticuerpos monoclonales se almacenan en grupos relacionados con epítopes distintos basados en la evaluación de interacciones anticuerpo : antígeno . Población en tratamiento Se espera que el número de personas que padecen diabetes mellitus alcance 300 millones para el año 2009 (Type 2 Diabetes Prediction and Prevention (1999) ed. G. A. Hitman, John Wiley & Sons) , de los cuales aproximadamente 80-90% son diabetes de tipo 2. La retinopatía diabética es una causa principal de la ceguera; otras complicaciones de la diabetes incluyen enfermedad renal, problemas de los pies y condiciones neuropáticas . En diabetes mellitus de tipo 1 o dependiente de insulina (IDDM, por sus siglas en inglés) las células B del páncreas que producen insulina son destruidas por lo que es probablemente una enfermedad autoinmune . El reemplazo de insulina es la terapia preferida. Se ha determinado que la patogénesis de diabetes mellitus de tipo 2 o no dependiente de insulina (NIDDM) resulta tanto de un defecto de las células B como resistencia a la insulina. Por lo tanto, los pacientes con NIDDM de tipo 2 tienen los dos defectos fisiológicos de hipersecrec ón de insulina (durante la fase temprana de diabetes de tipo 2) y resistencia a la insulina en tejidos objetivo. Por lo tanto, en la primera fase de NIDDM, el nivel de glucosa en el plasma es normal a pesar de la resistencia a la insulina demostrable con niveles de insulina elevados. En la segunda fase, la resistencia a la insulina empeora por lo que se desarrolla hiperglicemia postprandial a pesar de insulina elevada. En la tercera o última fase de diabetes de tipo 2, la resistencia a la insulina no cambia pero la declinación de la secreción de insulina provoca hiperglicemia por ayuno y diabetes manifiesta. Los trastornos asociados con resistencia a la insulina incluyen NIDDM, angiopatia diabética, aterosclerosis , nefropatía diabética, neuropatía diabética, y complicaciones oculares diabéticas tales como retinopatia, formación de cataratas y glaucoma, así como resistencia a la insulina inducida por glucocorticoides , dislipidemia, síndrome de ovario poliquístico, obesidad, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia e hipertensión. Por consiguiente, la población que ha de ser tratada por el método de la invención son sujetos que padecen de NIDDM, sujetos que padecen de resistencia a la insulina, y sujetos en riesgo de empeoramiento de NIDDM o resistencia a la insulina. Además, un sujeto con uno o más síntomas asociados con NIDDM es un candidato para tratamiento con el método de la invención. El diagnóstico de un paciente en riesgo de desarrollar NIDDM o de padecer NIDDM preferiblemente lo hace un médico clínico calificado. Los métodos para diagnosticar NIDDM se describen, por ejemplo, en US 5,719,022, incorporada aquí específicamente por referencia. Métodos de administración La invención provee métodos de tratamiento que comprenden administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un agente de la invención. En un aspecto preferido, el agente es substancialmente purificado (v.gr., substancialmente libre de substancias que limitan su efecto o producen efectos colaterales no deseados) . El sujeto es preferiblemente un animal, v.gr., tal como vacas, cerdos, caballos, gallinas, gatos, perros, etc., y es preferiblemente un mamífero, y muy preferiblemente un humano. Se conocen varios sistemas de suministro y se pueden usar para administrar un agente de la invención, v.gr., encapsulamiento de liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptor (véase, v.gr., Wu y Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro vector, etc. Los métodos de introducción pueden ser entérales o parenterales e incluyen pero no se limitan a vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal y oral. Los compuestos se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección de bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (v.gr., mucosa oral, mucosa rectal o intestinal, etc.) y se pueden administrar junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. La administración puede ser aguda o crónica (v.gr., diaria, semanal, mensual, etc.) o e combinación o alteración con otros agentes . En otra modalidad, el agente activo se puede suministrar en una vescícula, en particular un liposoma (véase Langer (1990) Science 249: 1527-1533). En otra modalidad, el agente activo se puede suministrar en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede usar una bomba (véase Langer (1990) supra) . En otra modalidad, se pueden usar materiales poliméricos (véase Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105) . En otra modalidad en donde el agente activo de la invención es un ácido nucleico que codifica una proteína, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su proteína codificada, al construirla como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarla de modo que se haga intracelular , v . gr . , mediante el uso de un vector retroviral (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,980,286) , o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (v.gr., una pistola de genes; Biolistic, Dupont) , o revestimiento con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transíección, o al administrarla en enlace con un péptido en forma de caja que se sabe que entra al núcleo (véase v.gr., Joliot et al. , 1991, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, se puede introducir un ácido nucleico intracelularmente e incorporar dentro del ADN de la célula hospedero para expresión, por recombinación homologa.

Transfección celular y terapia génica La presente invención abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión específica de VEGF de la invención para transfección de células in vitro e in vivo. Estos ácidos nucleicos se pueden insertar en cualquiera de un número de vectores bien conocidos para transfección de células y organismos objetivo. Los ácidos nucleicos son transfectados a células ex vivo e in vivo, a través de la interacción del vector y la célula objetivo. La reintroducción de células transfectadas se puede lograr por cualquier método conocido en la técnica, que incluye re-implante de células encapsuladas . Las composiciones se administran (v.gr., mediante inyección en un músculo) a un sujeto en una cantidad suficiente para inducir una respuesta terapéutica. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como "una dosis o cantidad terapéuticamente efectiva" . En otro aspecto, la invención provee un método de tratamiento de diabetes en un humano que comprende transfectar una célula con un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión específica de VEGF de la invención, en donde el ácido nucleico comprende un promotor inducible operablemente enlazado al ácido nucleico que codifica la proteína de fusión específica de VEGF. Para procedimientos de terapia génica en el tratamiento o prevención de enfermedad humana, véase por ejemplo, Van Brunt (1998) Biotechnology 5: 1149-1154.

Terapias de Combinación En numerosas modalidades, las proteínas de fusión específicas de VEGF de la presente invención se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos o terapias adicionales . La terapia de combinación incluye la administración de una sola formulación de dosis farmacéutica que contiene una proteína de fusión específica de VEGF y uno o más agentes hipoglicémicos adicionales o agentes de pérdida de peso; así como la administración de una proteína de fusión específica de VEGF y uno o más agentes hipoglicémicos adicionales o agentes de pérdida de peso en su propia formulación de dosis farmacéutica separada. Por ejemplo, una proteína de fusión específica de VEGF de la invención y un agente hipoglicémico se pueden administrar al paciente juntos en una sola composición de dosis oral tal como una tableta o cápsula, o cada agente se puede administrar en formulaciones de dosis orales separadas. En donde se usan formulaciones de dosis separadas, la proteína de fusión específica de VEGF de la invención y uno o más agentes hipoglicémicos adicionales se pueden administrar esencialmente al mismo tiempo, es decir, concurrentemente, o en tiempos escalonados por separado, es decir, secuencialmente . Un ejemplo de los agentes de pérdida de peso es Axokine® (Regeneron) . Ejemplos de los agentes hipoglicémicos incluyen: insulina; biguanidinas , tales como metformin Glucophage®; (B S) , y buformiri; sulfonilureas , tales como acetohexamida, Diabinese®; (Pfizer) , Amaryl® (Aventis) , Glynase Pres Tabs® (Pharmacia) , Glucotrol XL® (Roering Pfizer) , tolazamida, tolbutamida, DiaBeta® (Hoechst) , Glucotrol® (Pfizer) y gliclazida; tiazolidinodionas , tales como Rezulin® (Park Davis) , Actos® (Tekada) y Avandia® (GSK) ; inhibidores de a-glicosidasa, tales como Precose® (Bayer) y Glyset® (Bayer) ; - eglitinida tal como Prandin® (Novo Nordisk) ; agentes elevadores de glucosa tales como Glucagon® (Lilly) , y agonistas de ß3 adrenorreceptor tales como CL-316 , 243. Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas útiles en la práctica del método de la invención incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente activo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable . El término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la U.S. Pharmacopeia u otra farmacopeia generalmente reconocida para usarse en animales, y muy particularmente, en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Esos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores de pH . Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos . La formulación oral puede incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington1 s Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin.

En una modalidad preferida, la composición se formula de conformidad con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administrac ón intravenosa, subcutánea, o intramuscular a seres humanos. En donde es necesario, la composición también puede incluir un agente de solubilización y un anestésico local tal como lidocaina para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En donde la composición se ha de administrar por infusión, se puede suministrar con una botella de infusión que contiene agua estéril de grado farmacéutico o solución salina. En donde la composición se administra por inyección, un ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina se puede proveer para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración. Los agentes activos de la invención se pueden formular como formas neutras o sales. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellas derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con grupos carboxilo libres tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietil mina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

La cantidad del agente activo de la invención que será efectiva en el tratamiento de diabetes se puede determinar mediante técnicas clínicas estándares con base en la presente descripción. Además, las pruebas in vitro se pueden utilizar opcionalmente para ayudar a identificar regímenes de dosis óptimos. La dosis precisa que se ha de usar en la formulación también dependerá de la vía de administración, y la severidad de la condición, y se debe decidir de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada sujeto. Sin embargo, regímenes de dosis adecuados para administración intravenosa son generalmente de aproximadamente 50-5000 microgramos de compuesto activo por kilogramo de peso corporal. Los regímenes de dosis adecuados para administración intranasal son generalmente de aproximadamente 0.01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Las dosis efectivas se pueden extrapolar a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de pruebas in vitro o con modelos animales . Para administración sistémica, una dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de pruebas in vitro. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluya la CI50 como se determina en cultivo de células . Esa información se puede usar para determinar en forma más precisa dosis útiles en humanos . Las dosis iniciales también se pueden determinar a partir de datos in vivo, v.gr., modelos animales, mediante métodos que se conocen en la técnica. Un experto en la técnica podría optimizar fácilmente la administración a humanos con base en datos de animales. La cantidad e intervalo de dosis se pueden ajustar individualmente para proveer niveles en el plasma de los compuestos que son suficientes para mantener el efecto terapéutico. Un experto en la técnica podrá optimizar dosis locales terapéuticamente efectivas sin experimentación extraordinaria . La cantidad de compuesto administrada, desde luego, dependerá del sujeto que es tratado, del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la forma de administración, y el criterio del médico que lo prescribe. La terapia se puede repetir intermitentemente mientras los síntomas sean detectables o incluso cuando no sean detectables . La terapia se puede proveer sola o en combinación con otros fármacos . Equipos La invención también provee un artículo de fabricación que comprende material de empaque y un agente farmacéutico contenido dentro del material de empaque, en donde el agente farmacéutico comprende por lo menos una proteína de fusión específica de VEGF de la invención, y en donde el material de empaque comprende una etiqueta o inserto de empaque que indica que la proteína de fusión específica de VEGF se puede usar para el tratamiento de diabetes. Otras características de la invención se harán evidentes en el curso de las siguientes descripciones de modalidades ilustrativas que se dan para ilustración de la invención y no se pretende que limiten la misma. EJEMPLOS El siguiente ejemplo se expone para proveer a los expertos en la técnica de un desglose y descripción completos de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar precisión con respecto a los números usados (v.gr., cantidades, temperatura, etc.) pero deben considerarse algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, y la presión está a presión atmosférica o casi a presión atmosférica. EJEMPLO 1 Efecto de tratamiento con VEGFR1R2 -FcACl (a) en ratones diabéticos (db/dfo) Ratones diabéticos {db/db) de 8-10 semanas de edad fueron aclimatados durante 1 semana y el tratamiento empezó después de este punto. Grupos de ratones (db/d ) (n=6) se asignaron aleatoriamente por peso y se trataron por inyección s . c . una vez a la semana durante 4 semanas con una de las siguientes composiciones: vehículo (portador); proteína FcACl (Fe); o 25, 12.5 o 2.5 mg/kg de VEGFRlR2-FcACl (a) . Además, dos grupos de ratones no diabéticos (d /?) se trataron por inyección s.c. como sigue: 25 mg/kg de VEGFRlR2-FcACl (a) y vehículo (vehículo diabético) . Los niveles de glucosa en la sangre se evaluaron al mismo tiempo cada semana inmediatamente antes de la siguiente inyección durante las 4 semanas de tratamiento. Todos los grupos fueron evaluados en este tiempo por una prueba de tolerancia a la glucosa oral. El tratamiento de los animales se continuó durante 4 semanas adicionales (8 semanas en total) según el régimen anteriormente descrito, y los niveles de glucosa en la sangre se evaluaron después de 8 semanas de tratamiento. Resultados a las 4 semanas de tratamiento. Todos los animales diabéticos [db/db) - habían desarrollado hiperglicemia en el tiempo de inicio del experimento como se muestra por la glucosa ' en la sangre elevada (grupos Preface DIA en la figura 1A en el tiempo 0) . Los animales tratados con 25, 12.5 y 2.5 mg/kg de VEGFRlR2-FcACl (a) mostraron una reducción significativa y progresiva en glucosa en el suero durante el período de tratamiento de 8 semanas . Los animales tratados con 25, 12.5 y 2.5 mg/kg de VEGFRlR2-FcACl (a) no mostraron una reducción significativa en peso corporal en comparación con ratones control con vehículo o con FcACl durante el primer período de 4 semanas (medidas repetidas ANOVA, N.S. véase la figura IB) . Resultados durante 8 semanas de tratamiento . Todos los animales diabéticos (db/db) presentaron hiperglicemia como se muestra por la glucosa en la sangre elevada (grupos Preface DIA en la figura 2 en la semana 8) . Los animales tratados con 25, 12. 5 y 2.5 mg/kg de VEGFR1R2 -FcACl (a) mostraron una reducción significativa en glucosa en la sangre sin ayuno durante el período de tratamiento de 8 semanas (medidas repetidas ANOVA, d.f. 4,25, FGrupo = 6.36 p = 0.001, Friempo = 38.5 p< 0.0001; Finteracción =1.8 p = 0.04; véase la figura 1A) . EJEMPLO 2 Efecto de VEGFR1R2 -FcACl (a) sobre tolerancia de glucosa oral en ratones diabéticos Ratones diabéticos (db/db) y no diabéticos (db/7) de 8-10 semanas de edad se trataron como se describió antes. La capacidad para desechar un bolo de glucosa suministrado en el estómago por alimentación forzada se evaluó después de 4 inyeccipnes (semana 5) y después de 8 inyecciones (en la semana 9) . Para esta evaluación, los ratones fueron desprovistos de alimento durante aproximadamente 18 horas y después de ser alimentados forzadamente, se midió la glucosa en la sangre a 0, 30, 60 y 120 minutos. Resultados para 4 semanas de tratamiento. Ratones diabéticos [db/db) tratados con vehículo y con proteína FcACl tuvieron una capacidad para desechar glucosa perturbada en comparación con ratones de control no diabéticos esbeltos (db/?) (figura 3) . Después de 4 inyecciones (en la 5a semana) los animales tratados con 25, 12.5 y 2.5 mg/kg VEGFRlR2-FcÁCl (a) mostraron una mejora significativa en la capacidad para desechar la glucosa administrada. Estos valores demuestran que la inhibición de VEGF mejora la tolerancia a la glucosa en mamíferos diabéticos. Por el contrario, los ratones diabéticos [db/db) tratados con vehículo y con proteína FcACl no mostraron mejora en la capacidad para desechar glucosa o tolerancia a la glucosa (figura 3) . Resultados para 8 semanas de tratamiento . Ratones diabéticos [db/db) tratados con vehículo y con proteína FcACl tuvieron una capacidad para desechar glucosa en comparación con ratones de control no diabéticos esbeltos [db/?) (figura 4) . Después de 8 inyecciones (en la 9a semana) los animales tratados con 25, 12.5 y 2.5 mg/kg VEGFRlR2-FcACl (a) mostraron una mejora significativa en la capacidad para desechar la glucosa administrada. Estos valores demuestran que la inhibición de VEGF mejora la tolerancia a la glucosa en mamíferos diabéticos. Por el contrario, los ratones diabéticos (db/db) tratados con vehículo y con proteína FcACI no mostraron mejora en la capacidad para desechar glucosa o tolerancia a la glucosa (figura 4) . EJEMPLO 3 Efecto de tratamiento con VEGFRlR2-FcACl (a) sobre glucosa e insulina en ayunas en el suero en ratones diabéticos (dfo/db) Ratones diabéticos (áb/db) fueron aclimatados durante 1 semana y el tratamiento empezó como se describió antes. Después de 8 inyecciones (en la 9a semana) se evaluó la glucosa e insulina en la sangre en ayunas (figura 5B) . Los ratones diabéticos (db/db) tratados con vehículo y con proteína FcACl tuvieron niveles de glucosa en la sangre en ayunas elevados en comparación con ratones de control no diabéticos esbeltos (db/?) (figura 5A) . Los animales tratados con VEGFRlR2-FcÁCl (a) mostraron una reducción significativa en la glucosa en la sangre en ayunas en comparación con los controles diabéticos (vehículo o FcACl ; figura 5'A) y un nivel de insulina significativamente reducido. Esto demuestra que la inhibición de VEGF mejora no sólo la hiperglicemia en un mamífero diabético, sino que también mejora la sensibilidad a la insulina.

La presente invención se puede modalizar en otras formas específicas sin apartarse del espíritu o atributos esenciales de la misma. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (24)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. El uso de un agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF en la preparación de un medicamento para el tratamiento diabetes en un mamífero.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el tratamiento de diabetes da por resultado una o más de las concentraciones de glucosa en el suero reducidas, tolerancia a la glucosa mejorada, sensibilidad a la insulina incrementada, hiperinsulinemia reducida, y/o control glicérico mejorado.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde la diabetes es diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) .

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF es una molécula capaz de inhibir la actividad o expresión de VEGF.

5. El uso de conformidad con la reivindicación 4 , en donde la molécula capaz de inhibir la expresión de VEGF es un antagonista de VEGF seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, una trampa de VEGF, una molécula pequeña, un lipido o un carbohidrato. 6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde la trampa de VEGF se selecciona del grupo que consiste de Flt-1 (1-3 ) -Fe , Flt-1 (1-3R_>N) -FC, Flt-1 (1-3?ß) -FC, Fl t - 1 ( 2 - 3?ß ) - Fe ,

Flt-1 (2-3) -Fe, Flt-lD2-VEGFR3D3-FcACl (a) , Flt-1D2- Flk-1D3 -FcACl (a) , y VEGFR1R2 - FcACl ( a) acetilados.

7. El uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde el agente capaz de inhibir la expresión es una molécula de antisentido.

8. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el medicamento es para administración por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica , intraperitoneal, intravenosa, intranasal u oral .

9. El uso de un agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF en la preparación de un medicamento para inhibir el desarrollo o progresión de diabetes de tipo 2 en un sujeto humano que padece el mismo o en riesgo de desarrollar diabetes de tipo 2.

10. El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde el tratamiento da por resultado una o más de las concentraciones de glucosa en el suero reducidas, tolerancia a la glucosa mejorada, sensibilidad a la insulina incrementada, iperinsulinemia reducida, y/o control glicémico me orado .

11. El uso de conformidad con la reivindicación 9 , en donde el agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF es una molécula capaz de inhibir la actividad o expresión de VEGF.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde la molécula capaz de inhibir la expresión de VEGF es un antagonista de VEGF seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, una trampa de VEGF, una molécula pequeña, un lípido o un carbohidrato.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, en donde la trampa de VEGF se selecciona del grupo que consiste de Flt-1 (1-3) -Fe, Flt-1 (1-3R_>N) -Fe, Flt-1 (1-3??) -FC, Flt-1 ( 2 -3¿B) -Fe , Flt-1 (2- 3) -Fe, Flt-lD2-VEGFR3D3-FcACl (a) , Flt-1D2-Flk-1D3 -FcACl (a) , y VEGFRlR2-FcACl (a) acetilados .

14. El uso de conformidad con la reivindicación 9, en donde el medicamento es para administración por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica , intraperitoneal , intravenosa, intranasal u oral .

15. El uso de un agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF en la preparación de un medicamento para mejorar la tolerancia a la glucosa o sensibilidad a la insulina en un sujeto humano que necesita el mismo.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF es una molécula capaz de inhibir la actividad o expresión de VEGF.

17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, en donde la molécula capaz de inhibir la expresión de VEGF es un antagonista de VEGF seleccionado del grupo que consiste de un anticuerpo, una trampa de VEGF, una molécula pequeña, un lipido o un carbohidrato .

18. El uso de conformidad con la reivindicación 17 , en donde la trampa de VEGF se selecciona del grupo que consiste de Flt-1 (1-3) -Fe, Flt-1 (1-3R_>N) -Fe, Flt-1 (1-3??) -Fe, Flt-1 (2-3??) -FC, Flt-1 (2-3) -Fe, Flt-1D2 -VEGFR3D3 -FcACl (a) , Flt-lD2-Flk-lD3-FcACl(a) , y VEGFR1R2 - FcACl (a) acetilados .

19. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde el medicamento es para administración por vía subcutánea, intramuscular, intradérmica , intraperitoneal , intravenosa, intranasal u oral .

20. El uso de una molécula capaz de inhibir la actividad o expresión de VEGF en la preparación de un medicamento para tratar diabetes en un paciente que necesita el tratamiento.

21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la molécula capaz de inhibir la actividad o expresión de VEGF es una trampa de VEGF seleccionada del grupo que consiste de Flt-1 (1-3) -Fe, Flt-1 (1-3R->N) -Fe, Flt-1 CL-3AB) "Fe, Flt-1 (2- 3AB)-FC, Flt-1 (2-3) -Fe, Flt-1D2 -VEGFR3D3 -FcÁCl (a) , Flt-1D2- Flk-lD3-FcACl (a) , y VEGFR1R2-FcACl (a) acetilados.

22. - El uso de un agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF y un agente hipoglicémico en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes .

23. El uso de un agente capaz de bloquear, inhibir o mitigar la actividad mediada por VEGF y un agente de pérdida de peso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de diabetes .

24. Un artículo de fabricación caracterizado porque comprende : (a) material de empaque; y (b)un agente farmacéutico contenido dentro del material de empaque ; en donde el agente farmacéutico comprende por lo menos una proteína de fusión específica de VEGF de la invención y en donde el material de empaque comprende una etiqueta o inserto de empaque que indica que la proteína de fusión específica de VEGF se puede usar para el tratamiento de diabetes .