BRPI0408749B1 - uso do antagonista de vegf vegfr1r2-fc delta c1(a) - Google Patents

Abstract

"usos de um agente capaz de bloquear, inibir, ou melhorar a atividade mediada por vegf e de uma molécula capaz de inibir a expressão ou a atividade de vegf, e, artigo de manufatura". métodos de tratar diabetes em mamíferos, particularmente humanos, pelo bloqueio ou pela inibição da atividade mediada por vegf. um inibidor preferido de atividade mediada por vegf é um antagonista de vegf tal como um capturador de vegf capaz de ligar e bloquear vegf.

Description

“USO DO ANTAGONISTA DE VEGF VEGFR1R2-FC DELTA C1(A)” FUNDAMENTOS Campo da invengo O campo da invencáo é em geral relacionado aos métodos de tratamento de diabetes pela administrapáo de agentes capazes de diminuir os níveis de glicose sérica. Em particular, o campo da invenpao é o de métodos de tratar diabetes pela administrapáo de agentes capazes de bloquear, inibir, ou melhorar a atividade mediada por VEGF.

Descripao da arte anterior Tem sido relatado que camundongos db/db, um modelo murino de diabetes de tipo 2, tratados como um anticorpo contra VEGF mostram melhoria de mudanpas renais diabéticas, mas nao exibem urna diminuipáo em peso corporal, níveis de glicose sérica, níveis de insulina ou consumo de alimento (Flyvbjerg et al. (2002) Diabetes 51:3090-3094).

BREVE SUMARIO DA INVENCÁO

Em um primeiro aspecto, a invenpao caracteriza-se por um método de tratar diabetes compreendendo administrar a um mamífero um agente capaz de bloquear, inibir, ou melhorar a atividade mediada por VEGF. Em modalidades específicas, o método de tratamento da invenpao resulta em níveis de glicose sérica diminuidos, tolerancia á glicose melhorada, sensibilidade á insulina melhorada, hiperinsulinemia reduzida, e/ou controle glicémico melhorado.

Em urna modalidade específica, o diabetes tratado é diabetes de Tipo 2 (também chamado de diabetes melito independente de insulina) (NIDDM). Em condipoes específicas, diabetes de Tipo 1 ou diabetes gestacional também pode ser tratado. O agente capaz de bloquear, inibir, ou melhorar a atividade mediada por VEGF em modalidades específicas é um antagonista de VEGF. Mais específicamente, o antagonista de VEGF incluí um capturador de VEGF selecionado do grupo consistindo de Flt-l(l-3)-Fc acetilado, Flt-1-(1-3R_>N)-Fc, Flt-l(l-3fiB)-Fc, Fltl(2-3As)-Fc, Flt-l(2-3)-Fc, Flt-1F2-VEGFR3D3-FcACl(a), Flt-1 D2-Flk-1D3-FcAC 1 (a), e VEGFRlR2-FcACl(a). Em outras modalidades específicas, o agente é um anticorpo, lipídeo, ácido nucléico, molécula pequeña, aptamero, molécula de anti-senso, carboidrato, peptidomimético, ou hapteno.

Administrado de agente pode ser por qualquer método conhecido na arte, incluindo rotas de administrado subcutánea, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intravenosa, intranasal, ou oral. O mamífero tratado é preferivelmente um individuo humano sofrendo de diabetes. Também adequado para o tratamento pelo método da invendo é um individuo sob o risco de desenvolvimento de diabetes de tipo 2 que exibe um ou mais sintomas de diabetes de tipo 2 ou de urna condido associada com o desenvolvimento de diabetes de tipo 2, tais como, por exemplo, resistencia á insulina, dislipidemia, síndrome ovariana policística, obesidade, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipercolesteremia, hiperinsulinemia, e hipertensáo.

Em um segundo aspecto, a invendo caracteriza-se por um método de inibir ou de desacelerara progressáo de diabetes de tipo 2 em um mamífero, compreendendo administrar a um mamífero um agente capaz de bloquear ou inibir a atividade mediada por VEGF.

Em um terceiro aspecto, a invendo caracteriza-se por um método de melhorar a tolerancia á glicose ou a sensibilidade á insulina em um mamífero em necessidade da mesma, compreendendo administrar a um mamífero um agente capaz de bloquear ou inibir a atividade mediada por VEGF.

Outros objetivos e vantagens se tomarao evidentes a partir de urna revisáo da describo detalhada seguinte.

BREVE DESCRICÁO DAS FIGURAS

Figs. 1A-B: (A) níveis de glicose sérica e (B) peso corporal em 4 semanas em camundongos diabéticos (db/db) e nao-diabéticos (db/?) tratados com VEGFRlR2-FcACl(a).

Fig. 2: níveis de glicose sérica durante 8 semanas de tratamento de controles e camundongos diabéticos (db/db) e nao-diabéticos (db/?) tratados com VEGFRlR2-FcACl(a).

Fig. 3: teste de tolerancia á glicose oral em 4 semanas de tratamento para controle e camundongos diabéticos (db/db) e nao-diabéticos (db/?) tratados com VEGFRlR2-FcACl(a).

Fig. 4: teste de tolerancia á glicose oral em 8 semanas de tratamento para controle e camundongos diabéticos (db/db) e nao-diabéticos (db/?) tratados com VEGFRlR2-FcACl(a).

Figs. 5A-B: níveis de insulina e de glicose sérica de jejum após 8 semanas de tratamento de controle e camundongos diabéticos (db/db) e nao-diabéticos (db/?) tratados com VEGFRlR2-FcACl(a).

DESCRICÁO DETALHADA

Antes de os presentes métodos serem descritos, é para ser entendido que esta invengo nao é limitada aos métodos particulares, e ás conduces experimentáis descritos, visto que tais métodos e condigóes podem variar. Também é para ser entendido que a terminología aqui usada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e nao é intencionada para ser limitante, porque o escopo da presente invengáo será limitado apenas pelas reivindicagóes anexas.

Como utilizadas neste relatório descritivo e ñas reivindicagóes anexas, as formas singulares de "um", "urna", "o", e "a" incluem suas referencias no plural a nao ser que o contexto dite claramente o contrário.

Assim, por exemplo, urna referencia a "um método" incluí um ou mais métodos, e/'ou urna ou mais etapas do tipo aqui descrito e/ou que se tomará evidente para aquelas pessoas expelientes na arte durante a leitura desta descrigáo e assim por diante. A nao ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui empregados possuem o mesmo significado como comumente entendido por urna pessoa expeliente na arte á qual esta invengáo pertence. Embora muitos métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aqueles aqui descritos possam ser usados na prática e no teste da presente invengáo, os métodos e materiais preferidos sao descritos abaixo. Todas as publicagóes aqui mencionadas sao aqui incorporadas como referencia em sua totalidade.

Descricáo geral A invengáo é baseada em parte na descoberta de que a administragáo de um agente capaz de bloquear ou inibir a atividade mediada por VEGF é capaz de diminuir a glicose sérica e melhorar a disposigáo de glicose em mamíferos diabéticos. Estas descobertas representan! pela primeria vez que tem sido mostrado que um agente capaz de bloquear ou inibir a atividade mediada por VEGF melhora o diabetes. Assim, a invengáo proporciona métodos de tratar diabetes em um mamífero pela administragáo de um antagonista de VEGF. Mais específicamente, o método da invengáo pode ser praticado com um antagonista de VEGF tal como um capturador de VEGF, como mostrado abaixo ou um anticorpo específico para VEGF. Definigoes O termo "dose terapéuticamente eficaz" significa urna dose que produz o efeito desejado para o qual ela é administrada. A dose exata dependerá do propósito do tratamento, e será averiguável por urna pessoa expeliente na arte usando técnicas conhecidas (veja, por exemplo Lloyd (1999) The Art, Science and Technology ofPharmaceutical Compounding). O termo "bloqueador", "inibidor", ou "antagonista” significa urna substancia que retarda ou previne urna resposta ou reagao fisiológica ou química. Bloqueadores ou inibidores comuns incluem mas nao sao limitados a moléculas de anti-senso, anticorpos, antagonistas e seus derivados. Mais específicamente, um exemplo de um inibidor ou bloqueador de VEGF é um antagonista baseado em receptor de VEGF incluindo, por exemplo, um anticorpo anti-VEGF, ou um capturador de VEGF tal como VEGFR1R2-FcACl(a) (SEQ. ID. NOS: 1-2). Para urna descrigao completa de antagonistas baseados em receptor de VEGF incluindo VEGFR1R2-FcAC 1 (a), veja publicaqao PCT WO/OO/75319, cujo conteúdo é aqui incorporado em sua totalidade como referencia.

Urna "molécula pequeña" é aqui definida para ter um peso molecular abaixo de cerca de 500 Daltons, e pode incluir moléculas químicas bem como peptídicas.

Construtos de ácido nucléico Componentes individuáis de proteínas de fusáo específicas para VEGF da invenqáo podem ser construidos por métodos de biología molecular conhecidos na arte com as instruyes proporcionadas pelo presente relatório descritivo. Estes componentes sao selecionados de urna primeira proteína receptora celular, tal como, por exemplo, VEGFR1; urna segunda proteína receptora celular, tal como, por exemplo, VEGFR2; um componente de multimeriza^áo, tal como um Fe.

Modalidades específicas das proteínas de fusáo específicas para VEGF úteis nos métodos da invenqáo compreendem um componente de multimerizacáo que permite que as proteínas de fusáo se associem, por exemplo, como multímeros, preferivelmente dímeros. Preferivelmente, o componente de multimerizacáo compreende um dominio derivado de imunoglobulina. Componentes de multimerizacáo adequados sáo seqüéncias codificadoras de urna regiáo de dobradiipa de cadeia pesada de imunoglobulina (Takahashi et al. 1982 Cell 29:671-679); seqüéncias de gene de imunoglobulina, e suas por9oes.

Os constmtos de ácido nucléico codificadores de proteínas de fusáo úteis nos métodos da invenido sao inseridos em um vetor de expressáo por métodos conhecidos na arte, nos quais a molécula de ácido nucléico é operativamente ligada em urna seqüencia de controle de expressáo. Sistemas de hospedeiro-vetor para a produqao de proteínas compreendendo um vetor de expressáo introduzido em urna célula hospedeira adequada para a expressáo da proteína sáo conhecidos na arte. A célula hospedeira apropriada pode ser urna célula bacteriana tal como E. coli, urna célula de levedura, tal como Pichia pastoris, urna célula de inseto, tal como Spodoptera frugiperda, ou urna célula mamífera, tal como urna célula COS, CHO, 293, BHK ou NSO. Ácidos nucléicos de anti-senso Em um aspecto da invenqáo, atividade mediada por VEGF é bloqueada ou inibida pelo uso de ácidos nucléicos de anti-senso de VEGF. A presente invengáo proporciona o uso terapéutico ou profilático de ácidos nucléicos compreendendo pelo menos seis nucleotídeos que estáo em anti-senso para um gene ou cDNA codificador de VEGF ou de urna sua porqáo. Como aqui empregado, um ácido nucléico de "anti-senso" de VEGF refere-se a um ácido nucléico capaz de hibridizar em virtude de alguma complementaridade de seqüencia em urna porpáo de um RNA (preferivelmente mRNA) codificador de VEGF. O ácido nucléico de anti-senso pode ser complementar a urna regiáo codificadora ou náo-codificadora de um mRNA codificador de VEGF. Tais ácidos nucléicos de anti-senso possuem utilidade como compostos que previnem a expressáo de VEGF, e podem ser utilizados no tratamento de diabetes. Os ácidos nucléicos de anti-senso da inven9áo sáo oligonucleotídeos de fita individual ou de fita dupla, RNA ou DNA ou urna modifica9áo ou um derivado dos mesmos, e podem ser diretamente administrados a urna célula ou intracelularmente produzidos por transcribo de seqüencias introduzidas, exógenas.

Os ácidos nucléicos de anti-senso de VEGF sao de pelo menos seis nucleotídeos e sao preferivelmente oligonucleotídeos variando de 6 a cerca de 50 oligonucleotídeos. Em aspectos específicos, o oligonucleotídeo é de pelo menos 10 nucleotídeos, pelo menos 15 nucleotídeos, pelo menos 100 nucleotídeos, ou pelo menos 200 nucleotídeos. Os oligonucleotídeos podem ser DNA ou RNA ou misturas quiméricas ou derivados ou versoes modificadas dos mesmos e podem ser de fita individual ou de fita dupla. Em adibo, as moléculas de anti-senso podem ser polímeros que sao miméticos de ácido nucléico, tais como PNA, morfolino-oligos, e LNA. Outros tipos de moléculas de anti-senso incluem RNAs de fita dupla curtos, conhecidos como siRNAs, e RNAs grampo-de-cabelo curtos, e dsRNA longo (> 50 pb mas normalmente > 500 pb).

Rihozimas inibitórias Em um aspecto da invenqáo, diabetes pode ser tratado em um individuo sofrendo de tal doenqa pela dimmuipáo do nivel de atividade de VEGF pelo uso de moléculas de ribozima projetadas para catalíticamente clivarem os transcritos de mRNA de gene codificadores de VEGF, prevenindo a tradubo de mRNA de gene alvo e, portanto, a expressao do produto de gene.

Ribozimas sao moléculas de RNA enzimáticas capazes de catalisar a clivagem específica de RNA. O mecanismo de abo de ribozima envolve hibridizabo seqüéncia-específica da molécula de ribozima em RNA alvo complementar, seguida por um evento de clivagem endonucleolítica. A composibo das moléculas de ribozima tém que incluir urna ou mais seqüencias complementares ao mRNA de gene alvo, e tém que incluir a seqüéncia catalítica bem conhecida responsável pela clivagem de mRNA. Para esta seqüéncia, veja, por exemplo, Patente US 5.093.246. Embora ribozimas que clivam mRNA em seqüéncias de reconhecimento sitio- específicas possam ser utilizadas para destruir mRNAs codificadores de VEGF, o uso de ribozimas cabe9a-de-martelo é preferido. Ribozimas cabe9a-de-martelo clivam mRNAs em localizares ditadas pelas regioes de flanco que formam pares de base complementares com o mRNA alvo. O único requerimiento é que o mRNA alvo possua a seguinte seqüéncia de duas bases: 5'-UG-3'. A construyo e a produqáo de ribozimas cabe9a-de-martelo sao bem conhecidas na arte. As ribozimas da presente invenqáo também estáo incluidas em RNA endorribonucleases (daqui por diante "ribozimas de tipo Cech") tal como aquela que ocorre naturalmente em Tetrahymena íhermophila (conhecido como IVS, ou L-19 IVS RNA). As ribozimas de tipo Cech possuem um sitio ativo de oito bases que hibrizida em urna seqüéncia de RNA alvo onde ocorre a pós-clivagem de RNA alvo. A invenqao incluí aquelas ribozimas de tipo Cech que tém como alvo seqüéncia de sitio ativo de oito pares de base que estáo presentes no gene codificador de VEGF.

Geraijáo de anticorpos para proteínas VEGF

Em outro aspecto da inve^áo, a inve^ao pode ser praticada com um anticorpo anti-VEGF ou fragmento de anticorpo capaz de ligar e bloquear a atividade de VEGF. Anticorpos anti-VEGF sao descritos, por exemplo, na Patente US 6.121.230, aquí específicamente incorporada como referencia. O termo "anticorpo" como aqui usado refere-se a um polipeptídeo compreendendo urna regiáo de molde de um gene de imunoglobulina ou seus fragmentos que específicamente se liga e reconhece um antígeno. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem as regioes constantes kappa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon, e mu, bem como a miríade de genes de regiáo variável de imunoglobulina. Cadeias leves sao classificadas como kappa ou lambda. Cadeias pesadas sáo classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE, respectivamente. Dentro de cada classe de IgG, há diferentes isótipos (por exemplo IgGj, IgG2, etc.). Típicamente, a regiáo de liga9áo em antígeno de um anticorpo será a mais crítica na determinaqáo da especificidade e da afinidade de ligado.

Anticorpos existem como imunoglobulinas intactas, ou como numerosos fragmentos bem caracterizados produzidos pela digestao com várias peptidases. Por exemplo, pepsina digere um anticorpo abaixo de ligaqoes de dissulfeto na regiáo de dobradÍ9a para produzir F(ab)'2, um dímero de Fab que propriamente é urna cadeia leve ligada em Vh-Ch1 por urna ponte de dissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido sob condÍ9oes brandas para quebrar a ligaqáo de dissulfeto na regiáo de dobradiqa, convertendo deste modo o dímero F(ab)'2 em um monómero Fab1. O monomero Fab' é essencialmente Fab com parte da regiáo de dobradiqa. Embora vários fragmentos de anticorpo sejam definidos em termos da digestáo de um anticorpo intacto, urna pessoa expeliente na arte reconhecerá que tais fragmentos podem ser sintetizados de novo quer química quer pelo uso de metodología de DNA recombinante. Assim, o termo anticorpo, como aqui usado, também incluí fragmentos de anticorpo quer produzidos pela modificagáo de anticorpos inteiros, quer aqueles sintetizados de novo utilizando metodologías de DNA recombinante (por exemplo, Fv de cadeia única (sFv) ou aqueles identificados usando bibliotecas de exibÍ9áo de fago (veja, por exemplo, McCafferty et al. (1990), Nature 348: 552-554). Métodos para preparar anticorpos sáo conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497; Harlow & Lañe (1988) Antibodies: a Laboratorv Manual Coid Spring Harbor Lab, Coid Spring Harbor, NY). Os genes codificadores das cadeias leve e pesada de um anticorpo de interesse podem ser clonados de urna célula, por exemplo, os genes codificadores de um anticorpo monoclonal podem ser clonados de um hibridoma e usados para produzir um anticorpo monoclonal recombinante. Bibliotecas de gene codificadoras de cadeias leve e pesada de anticorpos monoclonais também podem ser preparadas a partir de hibridoma ou células de plasma. Combinares aleatorias de produtos de gene de cadeias leve e pesada geram urna colero grande de anticorpos com especificidade antigénica diferente. Técnicas para a prodn?áo de anticorpos de cadeia única ou de anticorpos recombinantes (US 4.946.778; US 4.816.567) podem ser adaptadas para produzir anticorpos usados em proteínas de fusáo e métodos para a presente invengáo. Também, camundongos transgénicos, ou outros organismos tais como outros mamíferos, podem ser utilizados para expressar anticorpos humanos ou humanizados. Alternativamente, tecnología de exibÍ9ao de fago podem ser empregadas para identificar anticorpos e fragmentos Fab heteroméricos que específicamente se ligam em antígenos selecionados.

Triagem e sele^áo de anticorpos Triagem e sele^ao de anticorpos preferidos podem ser conduzidas por urna variedade de métodos conhecidos na arte. Triagem inicial para a presera de anticorpos monoclonais específicos para um antígeno alvo pode ser conduzida por meio do uso de métodos baseados em ELISA, por exemplo. Urna triagem secundaria é preferivelmente realizada para identificar e selecionar um anticorpo monoclonal desejado para uso na construyo de proteínas de fusáo multiespecíficas da invenfáo. Triagem secundária pode ser conduzida com qualquer método adequado conhecido na arte. Um método preferido, chamado de "Biosensor Modification-Assisted Profiling" ("BiaMAP") é descrito em USSN copendente 60/423.017 depositado aos 01 de novembro de 2002, aqui específicamente incorporado como referencia em sua totalidade. BiaMAP permite a rápida identificafáo de clones de hibridoma produzindo anticorpos monoclonais com características desejadas. Mais específicamente, anticorpos monoclonais sao classificados em grupos relacionados com epitopo distinto baseados na avaliagáo de intera9oes de anticorpo: antígeno.

Popula9áo de tratamento É esperado que o número de pessoas sofrendo de diabetes melito alcance 300 milhoes pelo ano de 2009 ÍType 2 Diabetes Prediction and Prevention (1999) ed. G. A. Hitman, John Wiley & Sons), dos quais cerca de 80-90% sao diabete de tipo 2. Retinopatia diabética é urna causa líder de cegueira; outras complicares de diabetes incluem doen9a renal; problemas de pé e condÍ9Óes neuropáticas. Em diabetes melito dependente de insulina (IDDM) ou de tipo 1 células B produtoras de insulina do páncreas sao destruidas pelo que é provavelmente urna doen9a autoimune. Reposi9áo de insulina é a terapia preferida. A patogenese de diabetes melito independente de insulina (NIDDM) ou de tipo 2 tem apesar de tido sido determinada como o resultado tanto de um defeito de célula B quanto de resistencia á insulina. Assim, os pacientes com NIDDM de tipo 2 possuem os dois defeitos fisiológicos de hipersecre9áo de insulina (durante a fase inicial de diabetes de tipo 2) e de resistencia á insulina em tecidos alvo. Portanto, na primeira fase de NIDDM, o nivel de glicose plásmica é normal a despeito da resistencia á insulina demonstrável com níveis de insulina elevados. Na segunda fase resistencia á insulina piora de modo que hiperglicemia posprandial se desenvolve a despeito da insulina elevada. Na terceira e última fase de diabetes de tipo 2, a resistencia a insulina nao muda mas o declínio da secre9áo de insulina causa hiperglicemia de jejum e diabetes observável.

Distúrbios associados com resistencia á insulina incluem NIDDM, angiopatia diabética, aterosclerose, nefropatia diabética, neuropatía diabética, e complica9óes oculares diabéticas tais como retinopatia, formagáo de catarata e glaucoma bem como resistencia á insulina induzida por glicocorticóide, dislipidemia, síndrome ovariana policística, obesidade, hiperglicemia, hiperlipidemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperinsulinemia, e hipertensáo.

Conseqüentemente, a popula9áo a ser tratada pelo método da invenpao sao individuos sofrendo de NIDDM, individuos sofrendo de resistencia á insulina, e individuos sob o risco de piora de NIDDM ou de resistencia á insulina. Ainda mais, um individuo com um ou mais dos síntomas associados com NIDDM é um candidato para tratamento pelo método da invenpao. O diagnóstico de um paciente sob risco de desenvolvimento de NIDDM ou de sofrimento de NIDDM é preferivelmente feito por um médico clínico qualificado. Métodos para o diagnóstico de NIDDM sao descritos, por exemplo, emUS 5.719.022, aqui específicamente incorporado como referencia. Métodos de administrapáo A invenpao proporciona métodos de tratamento compreendendo administrar a um individuo urna quantidade eficaz de um agente da invenpao. Em um aspecto preferido, o agente está substancialmente purificado (por exemplo, substancialmente livre de substancias que limitam seu efeito ou produzem efeitos colaterais indesejados). O individuo é preferivelmente um animal, por exemplo, tal como vacas, porcos, cávalos, galinhas, gatos, caes etc., e preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente humano. Vários sistemas de liberapáo sao conhecidos e podem ser usados para administrar um agente da invenpao, por exemplo, encapsulapao de lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (veja, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), constmpáo de um ácido nucléico como parte de um vetor retroviral ou outro vetor etc. Métodos de introdupao podem ser enteráis ou parenterais e incluem mas nao sao limitados ás rotas intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, e oral. Os compostos podem ser administrados por qualquer rota conveniente, por exemplo por infusáo ou injepáo de bolo, por absorpáo através de revestimentos epiteliais ou mucocutáneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa retal e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administrados juntos com outros agentes biológicamente ativos. Administrado pode ser sistémica ou local. Administrado pode ser aguda ou crónica (por exemplo diária, semanal, mensalmente etc.) ou em combinado com outros agentes.

Em outra modalidade, o ingrediente ativo pode ser liberado em urna vesícula, em particular um lipossoma (veja Langer (1990) Science 249:1527-1533). Em aínda outra modalidade, o ingrediente ativo pode ser liberado em um sistema de liberado controlada. Em urna modalidade, urna bomba pode ser usada (veja Langer (1990) supra). Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser empregados (veja Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105). Em outra modalidade na qual o ingrediente ativo da invendo é um ácido nucléico codificador de urna proteína, o ácido nucléico pode ser administrado in vivo para promover a expressao de sua proteína codificada, pela construpáo dele como parte de um vetor de expressao de ácido nucléico apropriado e administrado dele de modo que se tome intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (veja, por exemplo Patente US 4.980.286), ou por injedo direta, ou pelo uso de um bombardeio de micropartículas (por exemplo, um canháo de gene; Biolistic, Dupont), ou revestimento com lipídeos ou receptores de superficie celular ou agentes de transfecgao, ou por administrado dele em ligado a um peptídeo homeobox-semelhante que, como conhecido, entra no núcleo (veja, por exemplo, Joliot et al, 1991, Proc. Nati. Acad. Sel USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, um ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro de DNA de célula hospedeira para expressao, por recombinado homologa.

Transfecdo celular e terapia genética A presente invendo incluí o uso de ácidos nucléicos codificadores de proteínas de fusáo VEGF-específicas da invendo para a transfec9ao de células in vitro e in vivo. Estes ácidos nucléicos podem ser inseridos em qualquer um de numerosos vetores bem conhecidos para transfecgáo de células alvo e organismos. Os ácidos nucléicos sao transfectados para dentro de células ex vivo e in vivo, por meio de interaqao do vetor e da célula alvo. Reintrodu^ao de células transfectadas pode ser conduzida por qualquer método conhecido na arte, incluindo reimplantagáo de células encapsuladas. As composigoes sao administradas (por exemplo, por injegáo em um músculo) em um individuo em urna quantidade suficiente para gerar urna resposta terapéutica. Urna quantidade adequada para realizar isto é definida como "urna quantidade ou dose terapéuticamente eficaz".

Em outro aspecto, a invengáo proporciona um método de tratar diabetes em um humano compreendendo transfectar urna célula com um ácido nucléico codificador de urna proteína de fiisáo VEGF-específica da invengáo, no qual o ácido nucléico compreende um promotor indutível operacionalmente ligado no ácido nucléico codificador de proteína de fiisáo VEGF-específica. Para procedimentos de terapia genética no tratamento ou na prevengo de doenga humana, veja por exemplo, Van Brunt (1998) Biotechnology 6:1149-1154.

Terapias de combinagáo Em numerosas modalidades, as proteínas de fiisáo VEGF-específicas da presente inven9áo podem ser administradas em combina9áo com um ou mais compostos ou terapias. Terapia de combinagáo incluí a administragáo de urna formula9áo de dose farmacéutica unitária que contém urna proteína de fiisáo VEGF-específica e um ou mais agentes hipoglicémicos ou agentes de perda de peso; bem como administragáo de urna proteína de fiisáo VEGF-específica e um ou mais agentes hipoglicémicos ou agentes de perda de peso em sua própria formulagáo de dosagem farmacéutica separada. Por exemplo, urna proteína de fiisáo VEGF-específica da inven9áo e um agente hipoglicémico podem ser administrados ao paciente juntos em urna composÍ9áo de dosagem oral unitaria tal como um tablete ou urna cápsula, ou cada agente pode ser administrado em formulagóes de dosagem separadas. Se formulapóes de dosagem separadas forem usadas, a proteína de fusáo VEGF-específica da invengáo e um ou mais agentes hipoglicémicos adicionáis podem ser administrados essencialmente ao mesmo tempo, i.e. concorrentemente, ou em tempos separadamente escalonados, i.e., seqüencialmente.

Um exemplo de tais agentes de perda de peso é Axokine® (Regeneron). Exemplos de tais agentes hipoglicémicos incluem: insulina; biguanidas, tal como metformina Glucophage® (BMS), e buformina; sulfonil-uréias, tais como acetoexamida, Diabinese® (Pfizer), Amaryl® (Aventis), Glynase Pres Tabs® (Pharmacia), Glucotrol XL® (Roering Pfizer), tolazamida, tolbutamida, DiaBeta® (Hoechst), Glucotrol® (Pfizer) e gliclazida; tiazolidonadionas, tais como Rezulin® (Park Davis), Actos® (Tekada), e Avandia® (GSK); inibidores de α-glicosidase, tais como Precose® (Bayer) e Glyset® (Bayer); Meglitinida tal como Plandin® (Novo Nordisk); Agentes Elevadores de Glicose tal como Glucagon® (Lilly); e agonistas de adrenorreceptor β3 tal como CL-316.243.

Composi^oes farmacéuticas Composipóes farmacéuticas úteis na prática do método da invengo incluem urna quantidade terapéuticamente eficaz de um agente ativo, e um agente de transporte farmacéuticamente aceitável. O termo "farmacéuticamente aceitável" significa aprovado por um agencia regulatória de govemo federal ou de um govemo estadual ou listado na US Pharmacopeia ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animáis, e mais particularmente, em humanos. O termo "agente de transporte" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o agente terapéutico é administrado. Tais agentes de transporte farmacéuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de feijao-soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhante. Excipientes farmacéuticos apropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha de trigo, giz, gel de sílica, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sodio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno-glicol, água, etanol e semelhantes. A composigáo, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificadores, ou agentes tamponadores de pH. Estas composigoes podem tomar a forma de solugóes, suspensóes, emulsáo, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulagóes de liberagáo prolongada e semelhante. A composigáo pode ser formulada como um supositorio, com agentes aglutinantes e agentes de transporte tradicionais tais como triglicerídeos. Formulagáo oral pode incluir agentes de transporte padráo tais como graus farmacéuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de agentes de transporte farmacéuticamente adequados sao descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W. Martin.

Em urna modalidade preferida, a composigáo é formulada de acordo com procedimentos rotineiros como urna composigáo farmacéutica adaptada para administragáo intravenosa, subcutánea, ou intramuscular a seres humanos. Se necessário, a composigáo também poderá incluir um agente de solubilizagáo e um anestésico local tal como lidocaína para diminuir a dor no sitio de injegáo. Se a composigáo for para ser administrada por infusáo, ela poderá ser dispensada com urna garrafa de infusáo contendo meio salino ou água de grau farmacéutico estéril. Se a composigáo for administrada por injegáo, urna ampola de água estéril para injegáo ou meio salino pode ser proporcionado de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administragáo.

Os agentes ativos da invengáo podem ser formulados como formas neutras ou salinas. Os sais farmacéuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com grupos amino livres tais como aqueles derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico etc., e aqueles formados com grupos carboxila livres tais como aqueles derivados de hidróxidos de sodio, de potássio, de amonio, de cálcio, férrico, isopropil-amina, trietil-amina, 2-etil-amino-etanol, histidina, procaína etc. A quantidade de agente ativo da invenpáo que será eficaz no tratamento de diabetes pode ser determinada por técnicas clínicas padráo baseadas na presente desvao. Em adigáo, ensaios in vitro podem ser opcionalmente empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A dose precisa a ser empregada na formulado também dependerá da rota de administrado, e da severidade da condifao, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico praticante e de cada urna das circunstancias individuáis. Contudo, faixas de dosagem adequadas para administrado intravenosa sao em geral de cerca de 50-5.000 microgramas de composto ativo por quilograma de peso corporal. Faixas de dosagem apropriadas para administrado intranasal sao em geral de cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. Doses eficazes podem ser extrapoladas de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de teste de modelo animal ou in vitro.

Para administrado sistémica, urna dose terapéuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente de ensaios in vitro. Por exemplo, urna dose pode ser formulada em modelos animáis para alcangar urna faixa de concentrado circulante que incluí a IC50 conforme determinada em cultura celular. Tal informado pode ser usada para determinar mais acuradamente doses úteis em humanos. Dosagens iniciáis também podem ser estimadas de dados in vivo, por exemplo, modelos animáis, usando técnicas que sao bem conhecidas na arte. Urna pessoa possuindo conhecimento ordinário na arte poderá prontamente otimizar a administrado a humanos baseando-se em dados animáis.

Quantidade e intervalo de dosagem podem ser ajustados individualmente para proporcionar níveis plásmicos de compostos que sao suficientes para manter o efeito terapéutico. Urna pessoa possuindo experiencia na arte será capaz de otimizar as dosagens locáis terapéuticamente eficazes sem experimentagáo indevida.

Claro que a quantidade de composto administrada dependerá do individuo sendo tratado, do peso do individuo, da severidade da afligáo, da maneira de administragáo, e do julgamento do médico prescrevente. A terapia pode ser repetida intermitentemente enquanto os sintomas forem detectáveis ou até mesmo quando nao forem mais detectáveis. A terapia pode ser proporcionada sozinha ou em combinagáo com outras drogas.

Kits A invengáo também proporciona um artigo de manufatura compreendendo material de embalagem e um agente farmacéutico contido dentro do material de embalagem, no qual o agente farmacéutico compreende pelo menos urna proteína de fúsáo VEGF-específica da invengáo e no qual o material de embalagem compreende um rótulo ou inserto de embalagem que indica que a proteína de fusao VEGF-específica pode ser usada para tratar diabetes.

Outras características da invengáo se tomaráo evidentes no curso das seguintes descrigóes de modalidades exemplares que sáo dadas para ilustragáo da invengáo e náo sáo intencionadas para limitarem a mesma. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos sáo descritos de modo a proporcionar áquelas pessoas ordinariamente expelientes na arte urna descrigáo completa e descrigáo de como preparar e usar os métodos e as composigóes da invengáo, e náo sáo intencionados para limitarem o escopo do que os inventores consideram sua invengáo. Esforgos tém sido feitos para garantir acurácia com respeito aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperatura etc.) mas alguns erros experimentáis e desvíos devem ser considerados. A náo ser que seja indicado de outro modo, as partes sao partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados, e pressáo está na ou próxima da atmosférica.

Exemplo 1: Efeito do tratamento com YE GFR1R2-FcAC 1 (a) em camundongos diabéticos (db/db) Camundongos diabéticos (db/db) de 8-10 semanas de idade foram aclimatados por 1 semana e o tratamento comegou após este ponto. Grupos de camundongos db/db (n=6) foram aleatoriamente designados por peso e tratados por injegáo s.c. urna vez por semana durante 4 semanas com urna das seguintes composigóes: agente de transporte (Veículo); proteína FcACl (Fe); ou 25 mg/kg, 12,5 mg/kg, ou 2,5 mg/kg de VEGFR1R2-FcACl(a). Adicionalmente, dois grupos de camundongos nao diabéticos (iib/?) foram tratados por injegáo s.c como segue: 25 mg/kg de VEGFR1R2-FcACl(a) e agente de transporte (Veículo Diabético). Níveis de glicose sanguínea foram avallados ao mesmo tempo em cada semana imediatamente antes da próxima injegáo para as 4 semanas de tratamento. Todos os grupos foram avallados neste tempo por um teste de tolerancia á glicose oral. Tratamento de animáis foi continuado por mais 4 semanas (8 semanas no total) após o regime descrito acima, e níveis de glicose sanguínea foram avallados após 8 semanas de tratamento.

Resultados em 4 semanas de tratamento: Todos os animáis diabéticos (db/db) haviam desenvolvido hiperglicemia no tempo inicial do experimento como mostrado pela glicose sanguínea elevada (Preface DIA -grupos ne Fig. 1A no tempo 0). Animáis tratados com 25 mg/kg, 12,5 mg/kg, e 2,5 mg/kg de VEGFR1 R2-FcAC 1 (a) mostraram urna redujo progressiva e significativa em glicose sérica durante o período de tratamento de 8 semanas. Animáis tratados com 25 mg/kg, 12,5 mg/kg, e 2,5 mg/kg de VEGFR1R2-FcACl(a) nao mostraram urna redugao significativa no peso corporal comparados com os camundongos de controle tratados com Veículo ou com FcACl durante o primeiro período de 4 semanas (medidas repetidas ANOVA, N.S. veja Fig. IB).

Resultados para 8 semanas de tratamento: Todos os animáis diabéticos (db/db) aínda exibiram hiperglicemia como mostrado pela glicose sanguínea elevada (Preface DIA - grupos na Fig. 2 no tempo de semana 8). Animáis tratados com 25 mg/kg, 12,5 mg/kg, e 2,5 mg/kg de VEGFR1R2-FcACl(a) mostraram urna redugáo significativa em glicose sérica sanguínea de nao jejum durante o período de tratamento de 8 semanas (medidas repetidas ANOVA, d.f. 4, 25, FGrupo = 6,36 p =0,001, FTempo =38,5 ρΟ,ΟΟΟΙ; F interapao= 1,8 p =0,04; vejaFig. 1A).

Exemplo 2: Efeito do tratamento com VEGFRlR2-FcACl(a) sobre tolerancia á glicose oral em camundongos diabéticos Camundongos diabéticos (db/db) e nao-diabéticos (db/?) de 8-10 semanas de idade foram tratados como descrito acima. A capacidade de dispor de um bolo de glicose liberado para dentro do estomago por gavagem foi avallada após 4 injeqóes (semana 5) e após 8 injegóes (na semana 9). Para esta avaliagao, camundongos foram privados de alimento por aproximadamente 18 horas e após serem submetidos á gavagem, glicose sanguínea foi medida a 0 min, 30 min, 60 min e 120 min.

Resultados para 4 semanas de tratamento: Camundongos diabéticos (db/db) tratados com proteína FcACl e Veículo tiveram urna capacidade impedida para dispor de glicose comparados com os camundongos de controle nao-diabéticos (db/?) magros (Fig. 3). Após 4 injegóes (na 5a semana) os animáis tratados com 25 mg/kg, 12,5 mg/kg e 2,5 mg/kg de VEGFRlR2-FcACl(a) mostraram urna melhoria significativa na capacidade de dispor de glicose administrada. Estes resultados demonstrara que a inibigáo de VEGF melhora a tolerancia á glicose em mamíferos diabéticos. Em contraste, os camundongos diabéticos (db/db) tratados com proteína FcACl e Veículo nao mostraram melhoria na capacidade de dispor de glicose ou de tolerancia á glicose (Fig. 3).

Resultados para 8 semanas de tratamento: Camundongos diabéticos (db/db) tratados com proteína FcACl e Veículo aínda tiveram urna capacidade impedida para dispor de glicose comparados com os camundongos de controle nao-diabéticos (db/?) magros (Fig. 4). Após um total de 8 rnjegóes (na 9a semana) os animáis tratados com 25 mg/kg, 12,5 mg/kg e 2,5 mg/kg de VEGFRlR2-FcACl(a) mostraram urna mellioria significativa na capacidade de dispor de glicose administrada. Estes resultados demonstram que a inibiqao de VEGF melhora a tolerancia á glicose em mamíferos diabéticos. Em contraste, os camundongos diabéticos (db/db) tratados com proteína FcACl e Veículo nao mostraram melhoria na capacidade de dispor de glicose ou de tolerancia á glicose (Fig. 4).

Exemplo 3: Efeito do tratamento com VEGFRlR2-FcACl(a) sobre glicose sérica de jejum e insulina em camundongos diabéticos (db/db) Camundongos diabéticos (db/db) foram aclimatados por 1 semana e o tratamento iniciou como descrito acima. Após 8 injeqóes (na 9a semana) glicose sanguínea de jejum e insulina (Fig. 5B) foram avalladas.

Camundongos diabéticos (db/db) tratados com proteína FcACl e veículo tiveram aumentados os níveis de glicose sanguínea de jejum comparados com os camundongos nao-diabéticos (db/?) magros de controle (Fig. 5A). Os animáis tratados com VFGFR1 R2-FcAC 1 (a) mostraram urna redugao significativa em glicose sérica de jejum comparados com os controles diabéticos (Veículo e FcACl; Fig. 5A) e um nivel de insulina significativamente reduzido. Isto demonstra que a inibiqao de VEGF melhora nao apenas a hiperglicemia em um mamífero diabético mas também melhora a sensibilidade á insulina. A presente invengo pode ser realizada em outras formas específicas sem que haja o desvio do espirito ou dos atributos essenciais da mesma.

REIVLND1CACQES

Claims (3)

1. Uso do antagonista de VEGF VEGFRlR2-FcACl(a) (SEQ ID NO:2), caracterizado pelo falo de ser na preparado de um medicamento para o traíamento de diabetes melito independente de insulina (NIDDM) em um mamífero.

2. Uso de acordo com a reivindica9ao 1, caracterizado pelo falo de que o medicamento aínda compreende um agente hipoglicémico ou um agente de perda de peso.

3. Uso de acordo com qualquer urna das reivindicagoes 1 a 2, caracterizado pelo tato de que o medicamento é para a administrado via rota subcutánea.