ES2345596B1

ES2345596B1 - Composicion para la prevencion o el tratamiento de la diabetes mellitus.

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Publication number: ES2345596B1
Application number: ES200900829A
Authority: ES
Inventors: Francisco Martin Bermudo; Patricia Moreno Martinez; Veronica Rivero Valdenebro; Elvira Leon Gomez; Francisco Javie Navarro Antolin
Original assignee: Universidad Pablo de Olavide; Fundacion Progreso y Salud
Current assignee: Universidad Pablo de Olavide; Fundacion Progreso y Salud
Priority date: 2009-03-26
Filing date: 2009-03-26
Publication date: 2011-07-13
Anticipated expiration: 2029-03-26
Also published as: ES2345596A1; WO2010109042A1

Abstract

Composición para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere a una composición que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEOFR1) y a su uso para la elaboración de un medicamento. La presente invención ofrece una respuesta al problema de la pérdida de función y/o masa de las células beta pancreáticas en la diabetes mellitus.

Description

Composición para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina. Específicamente, se refiere a una composición que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1) y a su uso para la elaboración de un medicamento. La presente invención ofrece una respuesta al problema de la pérdida de función y/o masa de las células beta pancreáticas en la diabetes mellitus.

Estado de la técnica anterior

La diabetes mellitus es un grave problema sanitario tanto por la prevalencia de la enfermedad como por las graves complicaciones crónicas que desarrollan los pacientes. Un aspecto central en el desarrollo de la diabetes es la reducción en el número de células beta pancreáticas productoras de insulina, y la incapacidad para producir suficiente insulina para mantener la normoglucemia. En el caso de la diabetes tipo 1, la destrucción progresiva de las células beta da lugar a una reducción en términos absolutos de la masa beta. En la diabetes tipo 2, la función y masa de las células beta es insuficiente. Además, hay un aumento en la demanda de insulina generado por la resistencia a la insulina.

Una de las aproximaciones terapéuticas más prometedoras para el tratamiento de la diabetes es el trasplante de islotes pancreáticos. Una de las limitaciones más importantes que impiden la aplicación generalizada de esta terapia es la insuficiente cantidad de islotes disponibles para trasplantar. Una vía alternativa para superar el déficit de islotes es la generación de células productoras de insulina mediante la estimulación de la replicación de los islotes o la inducción de diferenciación a partir de precursores pluripotenciales. Es posible inducir la proliferación de los islotes pancréaticos in vitro, sin embargo, el incremento de la proliferación a menudo está asociada a la desdiferenciación de las células beta pancreáticas que pierden la capacidad de producir insulina. Durante las cuatro últimas décadas, varios estudios han señalado que el páncreas posee un reservorio de células troncales y/o progenitoras con capacidad para dar lugar a células con un fenotipo de célula beta secretora de insulina (Zhang et al. J Cell Mol Med. 2005; 9:331-334; Soria et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005; 289:G177-G180). Uno de los factores reguladores de la proliferación y diferenciación de las posibles células troncales o progenitoras pancreáticas es el factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) liberado por las células del endotelio vascular (Lammert et al. 2001. Science. 294:564-567; Lammert et al. 2003. Curr Biol. 13:1070-1074).

Se ha demostrado que el VEGF es un regulador esencial en la vascularización de los islotes y en la revascularización de los islotes trasplantados (Brissova et al. Diabetes. 2006; 55:2974-2985). El modelo propuesto es que las células beta pancreáticas mediante la liberación de VEGF atraen a las células endoteliales que expresan el receptor de tipo 2 del VEGF (VEGFR2) y actúan a través de la vía PI3K-Akt (Fujio et al. J Biol Chem. 1999; 274:16349-16354). A continuación, estas células forman una membrana basal en tomo a las células endocrinas, la cual contiene laminina, fibronectina y colágeno IV. Finalmente, estas señales endoteliales promueven la proliferación celular y la expresión del gen de la insulina (Nikolova et al. Developmental Cell. 2006; 10:397-405). Este modelo está corroborado por hallazgos que demuestran que la presencia de VEGF incrementa casi al doble la masa de células beta y el contenido de insulina en islotes humanos y de ratones (Lai et al. Transplantation. 2005; 79:1530-1536).

El receptor para el VEGF de tipo 1 (VEGFR1) es también esencial en la regulación de la angiogénesis (Fong et al. Nature. 1995; 376:66-70). El ratón knock-out para VEGFR1 muere intraútero debido al sobrecrecimiento de células endoteliales y a la desorganización vascular (Fong et al. Development. 1999; 126:3015-3025; Kearney et al. Blood. 2002; 99:2397-2407). Los estudios in vivo con el ligando específico para VEGFR1, conocido como factor de crecimiento placentario (PIGF), sugieren que el VEGFR1 puede estar desempeñando un papel dual en el control de la angiogénesis, siendo capaz de promoverla o inhibirla dependiendo del contexto (Luttun et al. Nat Med. 2002; 8:831-840; Shih et al. J Clin Invest. 2003; 112:50-57).

La complejidad de la ruta de señalización del VEGF queda también de manifiesto ante la existencia de diferencias entre los efectos observados in vitro o in vivo. Por ejemplo, el ratón knock out para VEGF-A (específicamente en célula beta pancreática) muestra in vivo una disminución de la secreción de insulina, mientras que en los islotes aislados, la secreción de insulina se encuentra aumentada (Iwashita et al. Diabetologia. 2007; 50: 380-389).

Explicación de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1) y a su uso para la elaboración de un medicamento. La presente invención ofrece una respuesta al problema de la pérdida de función y/o masa de las células beta pancráticas en la diabetes mellitus.

En primer lugar, la co-adición del VEGF junto con el anticuerpo de su receptor de tipo 1 (anti-VEGFR1) al cultivo in vitro de islotes pancreáticos murinos y humanos tiene como consecuencia un incremento en la proliferación celular; así como un aumento de la sensibilidad a los niveles de glucosa, es decir, una mayor secreción de insulina a un menor estímulo de elevación de la glucosa. La co-adición del VEGF junto con el anticuerpo anti-VEGFR1 tiene un efecto sinérgico con respecto a la adición de cada uno de los componentes por separado. Por otra parte, la administración in vivo de VEGF junto con el anticuerpo anti-VEGFR1 aumenta significativamente la proliferación y la secreción de insulina en respuesta a concentraciones estimulatorias de glucosa y la sensibilidad a la glucosa de los islotes pancreáticos murinos y humanos.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una composición (de ahora en adelante, composición de la invención) que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1).

El VEGF es un factor de crecimiento con actividad mitogénica para las células endoteliales; es miembro de la súper familia de genes VEGF-PDGF que incluye al VEGF-A, -B, -C, -D y -E, así como al factor de crecimiento de placenta (PIGF) (Shibuya. Cell Struct Funct 2001, 26: 25-35; Dvorak. J Thromb Haemost 2005, 3: 1835-1842; Veikkola et al. Cancer Res 2000, 60: 203-212). VEGF-A es el miembro principal y más estudiado de esta familia de genes. En seres humanos, está codificado por un único gen organizado en ocho exones separados por siete intrones. Hasta el momento se han reportado seis isoformas del VEGF en seres humanos, que contienen 121, 145, 165, 183,189 y 206 residuos de aminoácidos, generados como resultado del procesamiento alternativo del RNAm, y que se conocen con el nombre de isoformas VEGF-A 121, VEGF-A 145, VEGF-A 165, VEGF-A 183, VEGF-A 189 y VEGF-A 206, respectivamente (Ferrara et al. Nat Med 2003, 9: 669-676; Partanen y Paavonen. Microsc Res Tech 2001, 55: 108-121). En ratón, se conocen cuatro isoformas del VEGF-A, que contienen 120, 144, 164 y 188 aminoácidos y que se conocen con el nombre de isoformas VEGF-A 120, VEGF-A 144, VEGF-A 164 y VEGF-A 188. El VEGFA-164 se considera la isoforma de ratón equivalente a la isoforma VEGF-165 de seres humanos, dado que existe una identidad de aproximadamente el 90% entre ambos.

Los términos "factor de crecimiento de endotelio vascular", "VEGF" o "VEGF-A", tal y como se utilizan en la presente descripción, se refieren a cualquiera de las proteínas generadas como resultado del procesamiento alternativo del RNAm del gen VEGF-A o a cualquier variante de las mismas. Este término incluye, por tanto, cualquiera de las proteínas VEGF-A 121, VEGF-A 145, VEGF-A 165, VEGF-A 183, VEGF-A 189 o VEGF-A 206, generadas como resultado del procesamiento alternativo del RNAm del gen VEGF-A humano (número de acceso del Genebank: NG008732; SEQ ID NO: 1), o cualquier variante de las mismas. Este término incluye también cualquiera de las proteínas VEGF-A 120, VEGF-A 144, VEGF-A 164 o VEGF-A 188, generadas como resultado del procesamiento alternativo del RNAm del gen vegf-a de ratón (número de acceso del Genebank: NC000083; SEQ ID NO:2), o cualquier variante de las mismas.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo. El término "VEGF-A 165", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la proteína de 165 residuos de aminoácidos (número de acceso del Genebank: BAG70265; SEQ ID NO: 3), codificado por el RNAm (número de acceso del Genebank: NM 001025368; SEQ ID NO: 4) generado como resultado del procesamiento alternativo del RNAm del gen VEGF-A humano.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 164 humano o una variante del mismo. El término "VEGF-A 164", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la proteína de 164 residuos de aminoácidos (número de acceso del Genebank: AAH61468; SEQ ID NO: 5), codificado por el RNAm (número de acceso del Genebank: NM009505; SEQ ID NO: 6) generado como resultado del procesamiento alternativo del RNAm del gen vegf-a de ratón.

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a una proteína sustancialmente homologa y funcionalmente equivalente al VEGF. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que no alteren sustancialmente su función.

Tal como aquí se utiliza, una proteína es "sustancialmente homologa" al VEGF cuando su secuencia de aminoácidos presenta un buen alineamiento con la secuencia de aminoácidos del VEGF, es decir, cuando su secuencia de aminoácidos tiene un grado de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos del VEGF, de, al menos, un 50%, típicamente de, al menos, un 80%, ventajosamente de, al menos, un 85%, preferentemente de, al menos un 90%, más preferentemente de, al menos, un 95%, y, aún más preferentemente de, al menos, un 99%. Las secuencias homologas a la secuencia de VEGF pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias, por ejemplo, el programa BLAST.

El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación o fosforilación.

Asimismo, la expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que la proteína en cuestión, por sí sola o en combinación con un agente inhibidor del VEGFR1, mantiene su función relacionada con la capacidad de inducir la proliferación, aumentar la sensibilidad a glucosa o aumentar la liberación de insulina inducida por glucosa, de islotes pancreáticos murinos y humanos. Dicha capacidad se puede determinar mediante métodos convencionales tales como los ensayos descritos en los Ejemplos que acompañan a esta descripción.

Resulta evidente para un experto en la materia que moléculas capaces de mimetizar la actividad biológica de VEGF podrían también ser empleadas.

Todas las isoformas del VEGF son capaces de unirse a alguno de estos tres receptores: VEGFR-1 (también conocido como Flt-1), VEGFR-2 (KDR o Flk-1) (Partanen y Paavonen. Microsc Res Tech 2001, 55: 108-121) y/o VEGFR-3 (Flt-4) (Ferrara et al. Nat Med 2003, 9: 669-676; Veikkola et al. Cancer Res 2000, 60: 203-212). VEGFR-1/Flt1 es una glicoproteína transmembrana de la superficie celular capaz de unir PIGF, VEGF-A y VEGF-B, resultando en la activación de diferentes vías de señalización. Además del VEGFR1 localizado en membrana, también se ha descrito una alternativa de splicing del Flt1, denominada sFlt1, que carece del dominio carboxilo terminal y, por lo tanto, aparece soluble, de manera que al conservar sus propiedades de unión a VEGF-A y PIGF es capaz de bloquear los efectos del mismo (Ferrara et al. Nat Med 2003; Dvorak. J Thromb Haemost 2005, 3:1835-1842; Carmeliet y Collen. Curr Top Microbial Immunol 1999, 237:133-158).

El término "receptor del VEGF tipo 1 (VEGFR1/Flt1)", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una glicoproteína transmembrana de la superficie celular capaz de unir PIGF, VEGF-A y VEGF-B. Este término incluye, por tanto, la proteína humana con secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7 (número de acceso del Genebank: NP002010), codificada por el mRNA VEGFR1 humano (número de acceso del Genebank: NM002019; SEQ ID NO: 8). Este término incluye también la proteína de ratón con secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9 (número de acceso del Genebank: NP 034358), codificada por el gen vegfr1 de ratón (número de acceso del Genebank: NM010228; SEQ ID NO: 10).

Tal como se utiliza en la presente invención el término "agente inhibidor" se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con el receptor de VEGF o con fragmentos funcionales del mismo, disminuye o elimina la intensidad o la duración de la actividad biológica de dicho receptor. En esta definición se incluyen además aquellos compuestos que impiden o disminuyen la expresión del gen VEGFR1, es decir, que impiden o diminuyen la transcripción del gen, la maduración del RNAm, la traducción del RNAm o la modificación post-traduccional. Un agente inhibidor puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico o polinucleótido, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico o cualquier otro tipo de molécula que disminuya o elimina el efecto y/o la función
del VEGFR1.

También podrían emplearse anticuerpos para inhibir al VEGFR1. Los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, podrían ser capaces de inhibir la actividad del VEGFR1. El término "anticuerpo" tal como se emplea en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la proteína VEGFR1. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas, incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina. Los anticuerpos pueden ser policlonales (incluyen típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epitopos distintos) o monoclonales (dirigidos contra un único determinante en el antígeno). El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, por manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del VEGFR1 y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. El anticuerpo puede ser también recombinante, quimérico, humanizado, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo o polipéptido recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con el ácido nucleico codificante del polipéptido, o produce el polipéptido como resultado de la recombinación homologa. Por tanto, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo del VEGFR1, un fragmento del mismo, o cualquiera de sus combinaciones. Así, por ejemplo, anticuerpos del VEGFR1 son conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarse, los anticuerpo anti-VEGFR1 de la casa comercial R&D Systems con números de referencia AF471 o AF321 empleados en los ejemplos de la patente.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento.

Un aspecto preferido de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento de terapia celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" la utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen la acción pretendida, en principio, en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas.

La composición de la presente invención puede ser empleada, por ejemplo, pero sin limitarse, para el cultivo ex vivo de islotes pancreáticos o de sus células beta pancreáticas con el fin de inducir su proliferación, aumentar su sensibilidad a glucosa y/o aumentar su capacidad para liberar insulina, en respuesta a la glucosa, para el tratamiento de la diabetes mellitus. Por tanto, un aspecto preferido de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento de terapia celular somática para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

Otro aspecto preferido de la invención se refiere al uso de la composición de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus. La diabetes mellitus se define como un desorden metabólico, de etiología múltiple, que se caracteriza por una hiperglicemia crónica con alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos, grasas y proteínas. Estas alteraciones son una consecuencia de un defecto en la secreción de insulina, de una acción alterada de la insulina o de ambas cosas. Según la Asociación Americana de Diabetes (ADA), la diabetes mellitus puede clasificarse en 4 grupos: diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2; otros tipos de diabetes mellitus y diabetes gestacional. La diabetes tipo 1 se define como una enfermedad en la que se produce una destrucción de las células beta, generalmente de origen autoinmune. Esta destrucción conduce a una ausencia muy alta o total de insulina. La diabetes méllitus tipo 2 se debe a una resistencia a la acción de la insulina y a un déficit relativo de la secreción de esta hormona; en fases iniciales, se genera una situación de hiperinsulinismo y, generalmente, hiperglucemia, mientras que en fases tardías de la enfermedad, aparece el fracaso de la célula beta pancreática con hipoinsulinismo e hiperglucemia. Una de las enfermedades incluidas por el ADA en el grupo "otros tipos de diabetes" es la diabetes del adulto de aparición en el joven denominada también en su abreviatura inglesa tipo MODY (Maturity-onset diabetes of the young), caracterizada por una alteración de la secreción de insulina, siendo la acción de la insulina normal o estando mínimamente disminuida.

Existen numerosas enfermedades en las que se han implicado el VEGF o sus receptores, que podrían asimismo beneficiarse del uso de esta composición como medicamento. VEGF ha sido empleado para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares isquémicas, para estimular la revascularización de las regiones isquémicas, para incrementar el flujo sanguíneo coronario o para prevenir la restenosis después de una angioplastia. El VEGF y sus receptores también han sido implicados por ejemplo, pero sin limitarse, en accidentes cerebrovasculares, en la isquemia de la médula espinal o en la neuropatía diabética o isquémica. El VEGF es un agente terapéutico para el tratamiento de desórdenes neuronales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la isquemia crónica cerebral, la esclerosis lateral amiotrófica o la enfermedad similar a la esclerosis lateral amiotrófica. VEGF también se ha demostrado que tiene un papel en la angiogénesis de la formación del hueso; por lo que condiciones que pueden beneficiarse de un tratamiento con VEGF son, por ejemplo, pero sin limitarse, reparación de huesos en fracturas, destrucción de los discos intervertebrales, fusón espinal, meniscos dañados, reconstrucción craneofacial, daño en el cartílago, necrosis avascular del hueso, osteoartritis, osteoesclerosis, oesteoporosis, fijación de implantes o enfermedades del hueso heredadas o adquiridas. VEGF también ha sido implicado en los procesos de úlceras gástricas, cierre de heridas, úlceras pies diabéticos o neuropatía diabética. En principio, la composición de la invención podría ser útil para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de cualquier estado patológico o natural que puedan beneficiarse de la formación o regeneración de nuevos vasos.

El VEGF o una variante del mismo y el agente inhibidor del VEGFR1 podrían administrarse a un paciente por separado, de manera simultánea o secuencialmente, dependiendo de la pauta de administración más adecuada a cada caso. Dicha preparación combinada del VEGF o una variante del mismo y del agente inhibidor del VEGFR1 por separado, de manera simultánea o secuencial sería útil en la elaboración de un medicamento.

Por tanto, en otro aspecto de la invención se describe una preparación combinada (de ahora en adelante, preparación combinada de la invención) que comprende, al menos, el VEGF o una variante del mismo y un agente inhibidor del VEGFR1 para su uso por separado, simultáneo ó secuencial para la elaboración de un medicamento. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo. En otra realización preferida de la invención, el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo anti-VEGFR1.

Debe enfatizarse que el término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo, en una composición, para poder encontrarse disponibles para su aplicación separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.

Una realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso por separado, simultáneo ó secuencial de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento de terapia celular somática.

Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso por separado, simultáneo o secuencial de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere al uso por separado, simultáneo ó secuencial de la preparación combinada de la invención para la elaboración de un medicamento de terapia celular somática para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la composición de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la preparación combinada de la invención. En una realización preferida de este aspecto de la invención la composición farmacéutica comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la composición de la invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la preparación combinada de la invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo.

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse para su administración a un animal, y más preferiblemente a un mamífero, incluyendo al hombre, en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Así, pueden estar, sin limitarse, en soluciones acuosas o no acuosas, en emulsiones o en suspensiones. Ejemplos de soluciones no acuosas son, por ejemplo, pero sin limitarse, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, o ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Ejemplos de soluciones acuosas, son por ejemplo, pero sin limitarse, agua, soluciones alcohólicas en agua, o medios salinos. Las soluciones acuosas pueden estar tamponadas o no, y pueden tener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes adicionales incluyen sales para modular la fuerza iónica, conservantes incluyendo, pero sin limitarse a, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, o similares, o nutrientes, incluyendo glucosa, dextrosa, vitaminas y minerales. Alternativamente, las composiciones pueden prepararse para su administración en forma sólida. Las composiciones pueden combinarse con varios vehículos o excipientes inertes, incluyendo pero sin limitarse a: aglutinantes, tales como celulosa microcristalina, goma tragacanto, o gelatina; excipientes, tales como almidón o lactosa; agentes dispersantes, tales como ácido algínico o almidón de maíz; lubricantes, tales como estearato de magnesio, deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina; o agentes aromatizantes, tales como menta o salicilato de metilo.

Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, a parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardíaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante la administración de un supositorio, percutanea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.

La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la composición farmacéutica de la invención que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la técnica.

La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar la composición de la invención que comprende disponer conjuntamente el VEGF o una variante del mismo y un agente inhibidor del VEGFR1. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo anti-VEGFR1.

Otro aspecto de la presente invención, se refiere a un método de cultivo celular in vitro caracterizado porque una o más células aisladas se disponen, de manera simultánea o secuencial, en un medio de cultivo que comprende, el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1).

Por ejemplo, pero sin limitarse, la célula o las células aisladas puede o pueden disponerse:

a): en un medio de cultivo que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1); o

b): primero, en un medio de cultivo que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y, después, en un medio de cultivo que comprende un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1); o

c): primero, en un medio de cultivo que comprende un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1) y, después, en un medio de cultivo que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo.

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En una realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo anti-VEGFR1.

En una realización preferida del método de cultivo celular in vitro de la presente invención la célula o las células aisladas es o son células beta pancreáticas. El método de cultivo de la presente invención induce un incremento en la proliferación celular y/o un aumento de la sensibilidad a los niveles de glucosa de las células beta pancreáticas. Las células cultivadas mediante el método cultivo de la presente invención pueden emplearse en la preparación de un medicamento de terapia celular somática.

La tensión de oxígeno tiene un papel crítico en la regulación de la expresión génica del VEGF. El factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) se ha identificado como el regulador principal de la respuesta transcripcional debida a hipoxia, aunque otros factores de transcripción, como AP-1, SP-1 y NF\kappaB, tienen sitios de unión en la región del promotor de VEGF. Además, hay citoquinas que pueden activar la expresión de VEGF, como por ejemplo, pero sin limitarse, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el factor transformante de crecimiento beta (TGF-beta), el factor de crecimiento insulínico (IGF-1), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (IGF-1) la interleuquina 1 alfa (IL-1alfa), la interleuquina 1 beta (IL-1 beta), la interleuquina 6 (IL-6) o la prostaglandina E2 (PGE2). Por tanto, la inducción de hipoxia o cualquiera de estos factores capaces de inducir la expresión del VEGF endógeno, en combinación con un agente inhibidor del VEGFR1, tendría como consecuencia un incremento en la proliferación celular o un aumento de la sensibilidad a los niveles de glucosa de los islotes pancreáticos o de sus células beta.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Descripción de las figuras

Figura 1. Muestra la proliferación celular (incorporación de BrdU) de islotes pancreáticos murinos y humanos tratados "in vitro" mediante microscopía confocal. Las células fueron marcadas con DAPI para detectar los núcleos y con anticuerpos frente a BrdU marcados con TRUC. A: islote pancreático murino fresco y cultivado 1 h en condición estandar. B: islote pancreático murino cultivado 48 h con 100 ng/ml VEGFA+10 \mug/ml Anti-VEGFR1. C: islote pancreático murino cultivado 48 h con 100 ng/ml VEGFA. D: islote pancreático humano cultivado 48 h en condición estandar. E: islote pancreático humano cultivado 48 h con 100 ng/ml VEGFA+10 \mug/ml Anti-VEGFR1. Se muestran los resultados de un experimento representativo de los 7 realizados. Barra: 20 \mum.

Figura 2. Muestra la incorporación de BrdU medida mediante inmunohistoquímica en islotes pancreáticos murinos. D3: células troncales embrionarias de ratón cultivadas 24 h en condiciones de indiferenciación; Control: islotes pancreáticos frescos y cultivados 1 h en condiciones estandar; VEGF+Anti-VEGFR1 48 h: cultivo durante 48 h en presencia de 100 ng/ml VEGFA+10 \mug/ml Anti-VEGFR1; VEGF+Anti-VEGFR1 72 h: cultivo durante 72 h en presencia de 100 ng/ml VEGFA+10 \mug/ml Anti-VEGFR1; VEGF 48 h: cultivo durante 48 h en presencia de 100 ng/ml de VEGFA; Anti-VEGFR1 48 h: cultivo durante 48 h en presencia de 10 \mug/ml Anti-VEGFR1. n=7 animales por condición. Datos son la media \pm SEM. *p<0,001, D3 vs resto de condiciones. **p<0,005 Control vs VEGF+Anti-VEGFR1 48 h.

Figura 3. Muestra la incorporación de BrdU mediante inmunohistoquímica en islotes pancreáticos humanos. Control: islotes pancreáticos cultivados 48 h en condiciones estandar; VEGF+Anti-VEGFR1 48 h: cultivo durante 48 h en presencia de 100 ng/ml VEGFA+10 \mug/ml Anti-VEGFR1. n=35 islotes por condición. Datos son la media \pm SEM. *p<0,005 Control vs VEGF+Anti-VEGFR1 48 h.

Figura 4. Muestra el efecto de cultivar los islotes murinos con las 4 condiciones ya mencionadas sobre el contenido de insulina. p=NS (no significativo). n=5 animales por condición.

Figura 5. Muestra el efecto de cultivar los islotes murinos con las 4 condiciones ya mencionadas sobre la secreción de insulina inducida por glucosa. Los datos son la media \pm SEM. n=7 animales por condición. *p<0,001 Anti-VEGFR1 y VEGF+Anti-VEGFR1 vs control y VEGF.

Figura 6. Muestra el efecto de cultivar los islotes humanos en condiciones estandar y en presencia de VEGF+Anti-VEGFR1, durante 48 h, sobre la secreción de insulina inducida por glucosa. Los datos son la media \pm SEM. n=6 experimentos por condición. *p<0,05 Control vs VEGF+Anti-VEGFR1.

Figura 7. Muestra el efecto "in vivo" del VEGF sumado al bloqueo del VEGFR1 sobre la proliferación celular de los islotes pancreáticos murinos. Los datos son la media \pm SEM. n=6 animales por condición. *p<0,05 Control versus VEGF+Anti-VEGFR1 48 h.

Figura 8. Muestra el efecto "in vivo" del VEGF mas el bloqueo del VEGFR1 sobre el contenido de insulina. Los datos son la media \pm SEM. n=6 animales por condición. p=NS (no significativo).

Figura 9. Muestra el efecto "in vivo" de VEGF sumado al bloqueo del VEGFR1 sobre la secreción de insulina inducida por glucosa. Los datos son la media \pm SEM. n=6 animales por condición. *p< 0,001 VEGF+Anti-VEGFR1 vs control.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

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Ejemplo 1 Efecto del VEGF más el anticuerpo bloqueante anti-VEGFR1 sobre la proliferación celular de islotes pancreáticos murinos y humanos in vitro (o ex vivo)

Se aislaron islotes de los ratones mediante digestión con colagenasa. Esos islotes se dividieron en 4 grupos y se incubaron 48 h (a 5% CO2, normoxia y 37ºC) en las siguientes condiciones:

-: Cultivo 48 h en medio estándar.

-: Cultivo de 48 h con 100 ng/ml de VEGF.

-: Cultivo de 48 h con 10 \mug/ml de Anti-VEGFR1.

-: Cultivo de 48 h con VEGF+Anti-VEGFR1 a las dosis anteriores.

-: Cultivo de 72 h con VEGF+Anti-VEGFR1 a las dosis anteriores.

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Los islotes humanos procedieron de donantes cadavéricos. Los islotes se aislaron siguiendo el protocolo de Edmonton. Los islotes se dividieron en 2 grupos y se incubaron 48 h (a 5% CO2, normoxia y 37ºC) en las siguientes condiciones:

-: Cultivo 48 h en medio estándar.

-: Cultivo de 48 h con VEGF (100 ng/ml)+Anti-VEGFR1 (10 \mug/ml).

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Para el cultivo in vitro de los islotes murinos se ha empleado el VEGF-A 164 de ratón recombinante (R&D Systems; número de referencia 493-MV/CF) y el anticuerpo anti-VEGFR1 de ratón (R&D Systems; número de referencia AF471). Para el cultivo in vitro de los islotes humanos se ha empleado VEGF-A 165 humano recombinante (R&D Systems; número de referencia 293-VE/CF) y el anticuerpo anti-VEGFR1 humano (R&D Systems; número de referencia AF321).

Tras estos protocolos de cultivo se midió la replicación celular mediante la incorporación de BrdU. La incorporación del BrdU se evaluó mediante inmunocitoquímica, usando un anticuerpo primario anti-BrdU a dilución 1/500. Como anticuerpo secundario se usó anti-TRITC a dilución 1/250. Las imágenes se visualizaron mediante un microscopio confocal Leica TCS-SP5 (Figura 1).

Se utilizaron como controles: células troncales embrionarias de ratón (la línea D3 cultivadas 48 h en condiciones de indiferenciación e islotes pancreáticos cultivados 1 h en condiciones estándar (RPMI 1640, 5 mM glucosa, 10% FBS y penicilina-estreptomicina). En el caso de los islotes pancreáticos humanos el control eran islotes cultivados durante 48 h en medio estándar (medio Miami).

Los datos señalan que, en presencia de 100 ng/ml VEGF +10 \mug/ml de Anti-VEGFR1 durante 48 h, la replicación celular de las células beta pancreáticas de los islotes murinos aumenta en 4,3 veces respecto del control (Figura 2). En el caso de los islotes humanos el aumento de la replicación es de 2,8 veces (Figura 3).

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Ejemplo 2 Efecto del VEGF más el anticuerpo bloqueante anti-VEGFR1 sobre sobre la secreción de insulina en respuesta a glucosa y sobre el contenido de insulina de los islotes pancreáticos murinos y humanos in vitro

-: Cultivo control.

-: Cultivo con 100 ng/ml de VEGF.

-: Cultivo con 10 \mug/ml de Anti-VEGFR1.

-: Cultivo con VEGF + Anti-VEGFR1 a las dosis anteriores.

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-: Cultivo 48 h en medio estándar.

-: Cultivo de 48 h con VEGF (100 ng/ml)+Anti-VEGFR1 (10 \mug/ml).

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El número de cultivos para cada condición fue de 4 para los islotes murinos y de 6 para los islotes humanos. Posteriormente los islotes se incubaban durante 1h en presencia de tampón KRB suplementado con 3 mM glucosa y 0.1% BSA y se realizaban incubaciones estáticas en presencia de las siguientes concentraciones de glucosa (2,75; 5,5; 11,1; 16,7 y 22,2 mM). A cada islote al final de la secreción se le extrajo la insulina mediante el método de etanol-ácido. Las muestras con la insulina se congelaron a -20ºC y los niveles de insulina se midieron mediante ELISA.

En la Figura 4 se observa que el cultivo de islotes con las distintas condiciones (control, VEGF, Anti-VEGFR1 y VEGF+AntiVEGFR1) no afecta significativamente al contenido de insulina de los islotes pancreáticos.

En la Figura 5 se observa que las condiciones VEGF, Anti-VEGFR1 y la suma de ambos inducen un incremento en la secreción de insulina inducida por glucosa, a partir de 5 mM glucosa. A la concentración de glucosa 16,7 mM se observa el efecto sinérgico de la coincubación con VEGF+Anti-VEGFR1 en comparación con estas mismas condiciones por separado (que también tienen por separado un efecto significativo de aumentar la liberación basal de insulina). Además la incubación con Anti-VEGFR1 o de VEGF+anti-VEGFR1 producen un aumento de la sensibilidad de los islotes a la glucosa, así como una mayor respuesta secretora en presencia de concentraciones estimulatorias de glucosa.

En la Figura 6 se observa que la coincubación con VEGF+Anti-VEGFR1 produce un aumento de la sensibilidad a la glucosa de los islotes, así como un incremento en la secreción de insulina.

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Ejemplo 3 Efecto del VEGF más el anticuerpo bloqueante anti-VEGFR1 sobre la proliferación celular de islotes pancreáticos murinos in vivo

Se establecieron 2 grupos de animales a los que se les inyectaron los compuestos que se detallan a continuación:

-: Control: PBS+BSA 0.1%.

-: VEGF (33 pg/kg de peso)+anticuerpo anti-VEGFR1 (25 ng/Kg de peso).

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Para la realización de este ejemplo se ha empleado el VEGF-A 164 de ratón recombinante (R&D Systems; número de referencia 493-MV/CF) y el anticuerpo anti-VEGFR1 de ratón (R&D Systems; número de referencia AF471).

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A cada ratón se le administró 4 inyecciones durante un período de 16 días (una inyección cada 4 días). El número de animales inyectados fue 10. Los compuestos detallados se administraban en la vena caudal en un volumen de 50 \mul. 12 h antes del sacrificio se les inyectaba, por la vena caudal, 75 mg/Kg de peso de BrdU en un volumen de 50 \mul. A los 16 días se sacrificaban los ratones por dislocación cervical y se extraían los islotes mediante digestión con colagenasa. La incorporación del BrdU se evaluó mediante inmunocitoquímica, usando un anticuerpo primario anti-BrdU a dilución 1/500. Como anticuerpo secundario se usó anti-TRITC a dilución 1/250. Las imágenes se visualizaron mediante un microscopio confocal Leica TCS-SP5.

Como se demuestra en la Figura 7 la administración de VEGF+Anti-VEGFR1 en los animales aumenta significativamente la proliferación celular de los islotes pancreáticos (p< 0,05).

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Ejemplo 4 Efecto del VEGF más el anticuerpo bloqueante anti-VEGFR1 sobre sobre la secreción de insulina en respuesta a glucosa y sobre el contenido de insulina de los islotes pancreáticos murinos in vivo

-: Control: PBS+BSA 0.1%.

-: VEGF (33 pg/kg de peso)+anti-VEGFR1 (25 ng/Kg de peso).

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A cada ratón se le administró 4 inyecciones durante un período de 16 días (una inyección cada 4 días). El número de animales inyectados fue 8. Los compuestos detallados se administraban en la vena caudal en un volumen de 50 \mul. A los 16 días se sacrificaban los ratones por dislocación cervical y se extraían los islotes mediante digestión con colagenasa. Posteriormente los islotes se incubaban durante 1h en presencia de tampón KRB suplementado con 3 mM glucosa y 0.1% BSA y se realizaban incubaciones estáticas en presencia de las siguientes concentraciones de glucosa (2,75; 5,5; 11,1; 16.7 y 22,2 mM). A cada islote al final de la secreción se le extrajo la insulina mediante el método de etanol-ácido. Las muestras con la insulina se congelaron a -20ºC y los niveles de insulina se midieron mediante ELISA.

En la Figura 8 se observa que la administración a los ratones de VEGF+anti-VEGFR1 no aumenta el contenido de insulina de los islotes pancreáticos.

En la Figura 9 se observa que la administración a los animales de VEGF+Anti-VEGFR1 hace que los islotes pancreáticos tengan una mayor sensibilidad a la glucosa y una mayor secreción de insulina en respuesta a concentraciones estimulatorias de glucosa.

Como conclusiones, el efecto de la combinación VEGF+Anti-VEGFR1 sobre los islotes murinos y humanos produce: i) una mayor proliferación celular; ii) una mayor sensibilidad a la glucosa (liberan insulina ante una menor elevación de glucosa) y iii) un aumento en su capacidad de secretar insulina.

<110> Fundación Progreso y Salud

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Universidad Pablo de Olavide

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<120> Composición para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus

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<130> 1985.2

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<160> 10

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<170> PatentIn version 3.5

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<210> 1

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<211> 23272

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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1

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2

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3

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4

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5

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6

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7

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8

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9

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12

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13

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15

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16

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17

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18

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<210> 2

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<211> 14758

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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19

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20

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21

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22

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23

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24

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25

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26

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27

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28

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29

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30

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<210> 3

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<211> 191

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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31

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32

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<210> 4

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<211> 3542

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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33

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34

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35

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<210> 5

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<211> 190

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 5

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36

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<210> 6

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<211> 3475

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<400> 6

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37

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38

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39

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40

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<210> 7

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<211> 1338

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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41

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42

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43

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44

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45

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46

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<210> 8

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<211> 5187

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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47

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48

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49

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50

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51

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<210> 9

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<211> 1333

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 9

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52

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53

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54

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55

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56

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57

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58

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<210> 10

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<211> 6280

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<400> 10

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59

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60

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61

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63

Claims

1. Composición que comprende el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1).

2. Composición según la reivindicación 1 donde el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo.

3. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo del VEGFR1.

5. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la elaboración de un medicamento.

6. Uso de la composición según la reivindicación 5 para la elaboración de un medicamento de terapia celular somática.

7. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6 para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

8. Preparación combinada que comprende, al menos, el VEGF o una variante del mismo y un agente inhibidor del VEGFR1 para su uso por separado, simultáneo ó secuencial para la elaboración de un medicamento.

9. Preparación combinada según la reivindicación 8 donde el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo.

10. Preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 donde el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo.

11. Preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 donde el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo anti-VEGFR1.

12. Uso de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la elaboración de un medicamento de terapia celular somática.

13. Uso de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la diabetes mellitus.

14. Composición farmacéutica que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. Composición farmacéutica que comprende una preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 que comprende además otro principio activo.

18. Procedimiento para preparar la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende disponer conjuntamente el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1).

19. Procedimiento según la reivindicación 18 donde el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 19 donde el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 donde el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo del VEGFR1.

22. Método de cultivo celular in vitro caracterizado porque una o más células aisladas se disponen, de manera simultánea o secuencial, en un medio de cultivo que comprende, el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) o una variante del mismo y un agente inhibidor de su receptor de tipo 1 (VEGFR1).

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23. Método de cultivo celular in vitro según la reivindicación 22 donde el VEGF es el VEGF-A 165 humano o una variante del mismo.

24. Método de cultivo celular in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23 donde el VEGF es el VEGF-A 164 de ratón o una variante del mismo.

25. Método de cultivo celular in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 donde el agente inhibidor del VEGFR1 es un anticuerpo del VEGFR1.

26. Método de cultivo celular in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25 donde la célula o las células aisladas es o son células beta pancreáticas.