MXPA05004418A - Conjugados de complejos de tc y porciones enfocadoras y su uso en diagnostico de mri. - Google Patents

Conjugados de complejos de tc y porciones enfocadoras y su uso en diagnostico de mri.

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Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones de complejo de radiometal de 99mTc mejoradas de ligandos de aza-diaminadioxima, junto con preparaciones radiofarmaceuticas que los contienen y conjuntos para la preparacion de los radiofarmaceuticos. La quimica de formacion de complejo de metal de tecnecio de conjugados de quelantes de moleculas enfocadoras de aza-diaminadioxima es mostrada para dar lugar a una multiplicidad de especies de tecnecio. La presente invencion proporciona una composicion de complejo de metal de tecnecio conjugado de aza-diaminadioxima mejorada, en la cual la presencia de la especie de tecnecio menos deseable es suprimida.

Description

CONJ UGADOS DE COMPLEJOS DE TC Y PORCION ES EN FOCADORAS Y S U USO EN DIAGNOSTICO DE M RI Campo de la invención La presente invención se refiere a composiciones de complejos de radiometales de 99mTc mejoradas, preparaciones radiofarmacéuticas que las contienen, junto con conjuntos para la preparación de los radiófarmacéuticos.
Antecedentes de la invención US 5395608 describe un rango de ligandos de aza-diaminadioxima potencialmente pentadentados para la preparación de complejos de radiometales de u n amplio rango de radioisótopos, incluyendo 99mTc, 1 05Rh, 1 09Pd , 57Co, 186Re, 1 88Re, 97Ru , 1 1 1 ln, 1 13ml n , 67Ga y 68Ga. Los ligandos de aza-diaminadioxima bifuncionales con grupos separadores de arilo pendientes son descritos y el Ejemplo 3 de US 5395608 describe el compuesto de Fórmula A: Fórmula A donde Ar = 4 aminobencilo.
US 5395608 describe el radiomarcado de tales quelantes en términos generales, pero no proporciona ningún Ejem plo específico sobre marcado con el radiometal 99mTc. I llai et al [J . Nucl. ed. Biol . , 38, 527-31 ( 1994)] describen el marcado con 99mTc de un análogo de aza-diam inadioxima de Fórmula A, donde Ar es bencilo. El marcado con 99mT es realizado a temperatura ambiente y las trazas de HPLC muestran solo una sola especie de 99mTc. Los conjugados de la aza-diam inadioxima con moléculas enfocadoras no son descritas. WO 99/60018 describe conjugados de quelatos de ligandos de aza- diaminadioxima con péptidos para imagenología de trombos. Los péptidos son substratos para la enzima transglutaminasa (es decir, Factor XI 11 a) . Se dice que uno de tales conjugados de quelante es una aza- diaminadioxima de fórmula: donde el péptido es un fragmento de a2-antiplasmina o caseína .
La presente invención Se ha encontrado ahora que la química de formación de complejos de metal de tecnecio de tales conjugados de quelante de molécula enfocadora de aza-diaminadioxima puede dar lugar a una multiplicidad de especies de tecnecio. La presente invención proporciona una composición de complejo de metal de tecnecio conjugado con aza-diaminadioxima, en la cual son suprimidas las especies de tecnecio menos deseables. Así, se han encontrado conjugados de quelantes de aza-diaminadioxima para formar varias especies de tecnecio en la quelación con xTc (donde x = 94m , 99 o 99m) . Estas múltiples especies de complejo de metal "Te pueden ser separadas y detectadas mediante cromatografía. Algunas de las múltiples especies de tecnecio pueden ser separadas y detectadas mediante cromatografía. Algunas de las múltiples especies de tecnecio son productos cinéticos, es decir, especies transientes que son convertidas sobre un periodo (opcionalmente con calentamiento) para dar un producto estable. La velocidad de conversión de los complejos cinéticamente favorecidos (transientes) a la especie final es dependiente del pH : se requieren 2-3 horas a pH 9.5, mientras que usualmente son suficientes 60 minutos a pH 1 0.5. La reacción puede ser acelerada mediante calentamiento. También se ha encontrado que algunas de estas múltiples especies de complejo xTc son lipofílicas y pueden afectar adversamente la biodistribución del radiofarmacéutico. La presente invención proporciona una composición de com plejo de tecnecio en la cual el nivel de estas especies cinéticas y lipofílicas es minimizado y controlado, de ah í que mejora las características de imagenología globales. La presente invención también proporciona la metodolog ía para optim izar la conversión al producto estable deseado, de manera que una composición de producto de complejo de xTc controlada puede ser preparada y controlada en calidad en una manera más rápida y reproducible. La presente invención también proporciona radiofarmacéuticos comprendiendo la composición de complejo de tecnecio mejorada, junto con formulaciones de conjunto no radioactivo para la preparación de tales radiofarmacéuticos.
Descripción detal lada de la invención En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición de complejo de tecnecio, la cual comprende un com plejo de metal del radioisótopo xTc con un ligando de Fórmula (I): donde: cada R1 y R2 es independientemente un grupo R; x es 94m , 99 o 99m; Y es -(A)n-Z donde: Z es una porción enfocadora biológica de peso molecular menor que 5, 000; -(A)n- es un grupo enlazador donde cada A es independientemente -CO-, -CR2-, -CR=CR-, -C=C-, -CR2C02-, -C02CR2-, - NR-, -N RCO-, -CONR-, -NR(C=0)N R-, N R(C=S)N R-, -S02NR-, -NRS02-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -C R2N RCR2-, un grupo cicloheteroalquileno de C .8 , un grupo cicloalquileno de C4.8, un grupo arileno de C5.12, o un grupo heteroarileno de C3.12 o una porción de polialquilenglicol , ácido poliláctico o ácido poliglicólico; n es un entero de valor 0 a 10; cada grupo R es independientemente H o alquilo de C^ o , alquilarilo de C3.i o , alcoxialquilo de C2. 0, hidroxialquilo de C^m , fluoroalquilo de C,. 10, o 2 o más grupos R, j unto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo carbocíclico, heterocíclico, saturado o insaturado; en donde menos de 10% del "Te presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de xTc transientes del ligando de Fórmula I . los radioisótopos de Tc adecuados de la presente invención son, por lo tanto, el em isor de positrón S mTc, el emisor beta "Te o el ?-emisor 99mTc. De preferencia, x es 99m , es decir, el radioisótopo es de preferencia 99mTc. Por el término "ligando" se quiere decir el conjugado del quelante de aza-diamina dioxima con la molécula objetivo biológica (Z) . El ligando es diseñado para formar complejos de metal de aza-diamina dioxima del radioisótopo xTc conjugado con la molécula objetivo biológica . Por el término "porción enfocadora biológ ica" se quiere decir, pétidos de 3-1 00 meros o análogos de péptidos, los cuales pueden ser péptidos lineales o péptidos cíclicos o combinaciones de los mismos; o substratos de enzimas o inhibidores; compuestos de unión de receptores sintéticos; oligonucleótidos; o fragmentos de oligo-DNA u oligo-RNA. La porción enfocadora biológica puede ser de origen sintético o natural , pero de preferencia es sintética. Las porciones objetivo biológicas adecuadas de la presente invención tienen un peso molecular menor que 5, 000 Daltones, de preferencia en el rango 200 a 3000 Daltones, muy preferiblemente en el rango de 300 a 2000 Daltones, con 400 a 1 500 siendo especialmente preferidos. Por el término "péptido cíclico" se quiere decir una secuencia de 5 a 1 5 aminoácidos en la cual los dos aminoácidos terminales están unidos juntos mediante un enlace covalente, el cual puede ser un enlace de péptido o disulfuro o un enlace no de péptido sintético, tal como un enlace de tioéter, fosfodiéster, disiloxano o uretano. Por el término "aminoácido" se quiere decir un L- o D-aminoácido, análogo de am inoácido o imitador de aminoácido el cual puede ocurrir de manera natural o de origen puramente sintético, y puede ser ópticamente puro, es decir, un enantiómero simple y de ah í quiral, o una mezcla de enantiómeros. De preferencia, los aminoácidos de la presente invención son ópticamente puros. Por el término "im itador de am inoácido" se quiere decir análogos sintéticos de aminoácidos que ocurren de manera natural los cuales son isósteres, es decir ha sido diseñados para imitar la estructura estérica y electrónica del compuesto natural. Tales isósteres son bien conocidos para aquéllos expertos en la técnica e incluyen pero no están lim itados a depsipéptidos, retro-inverso péptidos, tioamidas, cicloalcanos o tetrazoles 1 , 5-disubstituidos [ver M . Goodman , Biopolymers, 24, 137, (1985)].
Los inhibidores o substratos de enzimas adecuados incluyen glucosa y análogos de glucosa, tales como fluorodeoxiglucosa, ácidos grasos o inhibidores de elastasa. Los in hibidores o substratos de enzimas adecuados pueden ser péptidos objetivos biológicos (como se describe más adelante). Compuestos de unión de receptores sintéticos adecuados incluyen estradiol, estrógeno, progestina, progesterona y otras hormonas esteroides; ligandos para el receptor D-1 o D-2 de dopamina, o transportador de dopamina tal como tropanos; y ligandos para el receptor de serotonina . Los péptidos objetivo biológicos de la presente invención son péptidos de 3-20 meros (es decir, péptidos com prendiendo 3 a 20 aminoácidos), de preferencia 4 a 1 5 meros, muy preferiblemente 5 a 14 meros de tales fragmentos. Los péptidos pueden ser cíclicos o lineales o combinaciones de los mismos. Los péptidos pueden ser de origen sintético o natural, pero de preferencia son sintéticos. Tales péptidos incluyen : - somatostatina, ocreotide y análogos - fragmentos de laminina, por ejemplo YIGSR, PDSGR, I KVAV, LRE y KCQAGTFALRGDPQG, - péptidos de N-formilo para enfocar sitios de acumulación de leucocitos, - fragmentos de factor de plaqueta 4 (PF4) , - péptidos conteniendo RGD, - fragmentos de péptidos de 2-antiplasmina, fibronectina o beta- caseína, fibrinógeno o trombospondina, los cuales son substratos para la enzima transglutaminasa (Factor XI 11 a) . Las secuencias de aminoácidos de a2-antiplasmina , fibronectina, beta-caseína, fibrinógeno y trombospondina pueden encontrarse en las siguientes referencias: precursor de a2-ant¡plasmina [M.Tone et al . , J . Biochem. , 1 02, 1 033, (1987)]; beta-caseína [L. Hansson et al. , Gene, 139, 193, (1 994)] ; fibronectina [A. Gutman et al, FEBS Lett. , 207, 145, (1 996)]; precursor de trombospondina-1 [V.Dixit et al, Proc. Nati. Acad . Sci. , USA, 83, 5449, ( 1986)]; R. F. Doolittle, Ann. Rev. Biochem. , 53, 1 95, ( 1 984). Cuando la porción enfocadora biológico es un péptido, uno o ambos extremos de péptido pueden ser protegidos opcionalmente con un grupo inhibidor de metabolismo adecuado. Por el térmi no "grupo inhibidor de metabolismo" se quiere decir un grupo biocompatible, el cual inhibe o suprime el metabolismo in vivo del péptido o aminoácido en el extremo amino o carboxilo. Tales grupos son bien conocidos para aquéllos expertos en la técnica y son elegidos adecuadamente a partir de, para el extremo amino de péptido: acetilo, boc (donde Boc es ter-butiloxicarbonilo) , Fmoc (donde Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo), benciloxicarbonilo, trifluoroacetilo, aliloxicarbonilo, Dde [es decir, 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)etilo] o Npys (es decir, 3-nitro-2-piridin sulfeni lo). La inhibición de metabolismo del extremo amino de péptido puede lograrse también mediante unión del extremo amino al quelante de aza-diamina dioxima. Los grupos inhibidores de metabolismo adecuados para el extremo carboxilo de péptido incluyen : carboxamida, éster de ter-butilo, éster de benilo, éster de ciclohexilo, amino alcohol o unión al quelante de aza-diamina dioxima. De preferencia, al menos un grupo inhibidor de metabolismo es elegido para ser el quelante de aza-diamina dioxima. El extremo carboxilo de péptidos es particularmente susceptible a corte ¡n vivo por enzimas de carboxipeptidasa. En consecuencia, el quelante de aza-diamina dioxima es unido, de preferencia, en el extremo carboxi lo. Cuando el péptido comprende un péptido cíclico, el grupo inhibidor de metabolismo puede ser el enlace covaiente que encierra el anillo de péptido cíclico. Los péptidos objetivo biológ icos preferidos de la presente invención son fragmentos de péptido de 3 a 20 meros de a2-antiplasmina o caseína, muy preferiblemente 4 a 1 5 meros, especialmente fragmentos tales de 5 a 14 meros. Los péptidos de <x2-ant¡plasmina o caseína preferidos de la presente invención comprenden al menos un grupo inhibidor de metabolismo y una secuencia de aminoácidos tomada del extremo N de ya sea: (i) a?-antiplasmina es decir, N H2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH o variantes de esta, en la cual uno o más aminoácidos han sido intercambiados, adicionados o removidos, tales como: NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH, NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH, NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-.GIy-OH ; o (ii) caseína es decir, Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-GIn-Ser-Lys-Val-l le-Gly.
Los péptidos de a2-antiplasmina especialmente preferidos de la presente invención son fragmentos de péptido comprendiendo la secuencia de 4 aminoácidos Asn-GIn-Glu-GIn (NQEQ) . Tales péptidos de a2-antiplasmina muy especialmente preferidos tienen la secuencia : Asn-GIn-Glu-GIn-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly, donde Xaa es Tyr o l-Tyr (es decir, yodo-tirosina). Tales péptidos de a2-antiplasmina preferidos tienen, de preferencia, grupos inhibidores de metabolismo en am bos extremos de péptido, donde la aza-diaminadioxima es uno de los grupos inhibidores de metabolismo. En ese caso, el quelante de aza-diaminadioxima está unido preferiblemente en el extremo carboxi y el extremo N está protegido por un grupo inhibidor de metabolismo, de preferencia N-acetilo de manera que el péptido de a2-antiplasmina de preferencia es: Ac-Asn-GIn-Glu-GIn-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly, donde Xaa es Tyr o l-Tyr (es decir, yodo-tirosina). Por el término "fluoroalquilo" se quiere decir un grupo alquilo con al menos un substituyente de flúor, es decir, el térm ino abarca grupos desde monofluoroalquilo (por ejemplo, -CH2F) a perfluoroalquilo (por ejemplo, CF3) . Los presentes inventores han encontrado que, además de la especie de tecnecio deseada, los ligandos de aza-diaminadioxima forman otros complejos de tecnecio los cuales son categorizados como complejos de "Te transientes del ligando de Fórmula I . Las composiciones de complejo de tecnecio de la presente invención son aquéllas caracterizadas porque menos de 1 0% del Tc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de xTc transientes del ligando de Fórmula I . Estos "complejos de xTc transientes" son los productos de reacción de formación de complejos de metal de tecnecio cinéticamente favorecidos con el ligando de Fórmula I . Son de naturaleza transiente, convirtiéndose lentamente al producto de reacción de formación de complejo químico final termodinámicamente estable bajo condiciones ambiente. Las estructuras químicas de los complejos de xTc transientes no son conocidas, pero se cree que involucran la coordinación del átomo de nitrógeno de cabeza de puente de la porción -NY- del ligando de Fórmula (I) al tecnecio. Tal coordinación probablemente involucraría el ligando de aza-diaminadioxima que funciona ya sea como un ligando pentadentado (es decir, teniendo un conjunto donador de dioximetriamina), o como un quelante tetradentado con un grupo oxima no coordinado en un complejo Tc(V) con un núcleo monooxo (es decir, un núcleo de Tc=03+). Tal coordinación por el átomo de nitrógeno de cabeza de puente sería favorecido cinéticamente por el tamaño de anillo de quelato de 5 anillos más pequeño cuando el átomo de nitrógeno -NY- coordina, comparado con el tamaño de anillo de quelato de 8 anillos del producto termodinámico, en donde el átomo de nitrógeno -NY-no está coordinado. Para aplicaciones radiofarmacéuticas en particular, la presencia de múltiples especies de tecnecio cuya composición exacta cambia con el tiempo es claramente indeseable, debido a que es difícil de lograr la reproducibilidad de lo que es administrado y cada especie puede tener diferentes características de biodistribución. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para controlar los niveles de los complejos dé tecnecio transientes, de manera que el producto termodinámico deseado es obtenido en el más alto grado de pureza. Se cree que el producto termodinámico deseado de los complejos de tecnecio del ligando de aza-diamonidioxima tiene la estructura: donde R1 , R2 y Y son como se define antes; es decir, un complejo dioxo de Tc(V), con el ligando de aza- diaminadioxima teniendo un conjunto donador de metal de diaminadioxima, donde el nitrógeno del grupo -NY- no está coordinado. Se cree que la estructura de anillo pseudo-macrocíclica confiere estabilidad termodinámica comparada con ios complejos de Tc transientes. Cuando la naturaleza de Y es tal que el átomo de N d -NY- es una amina terciaria, entonces una proporción significativa de esta amina terciaria es protonada en solución acuosa a pH menor que 9.0 debido a la basicidad de aminas terciarias (las cuales tienen valores de pKa normalmente en el rango de 8 a 1 0). Los presentes inventores han encontrado que, además de la especie de tecnecio deseada y los complejos de "Te transientes, los ligandos de aza-diaminadioxima pueden formar otros complejos de tecnecio los cuales son categorizados como complejos de tecnecio lipofílicos, y que tales complejos lipofílicos pueden afectar de manera adversa la biodistribución de la composición de xTc. Por el término "com plejo de tecnecio lipofílico" se quiere decir un complejo de coordinación de metal de aza-diaminadioxima de tecnecio con el ligando de Fórmula I , el cual tiene un coeficiente de partición de octanol agua significativamente mayor que el complejo de tecnecio termodinámico deseado de la aza-diaminadioxima. Tales "complejos de tecnecio lipofílicos" se unen fuertemente a la fase estacionaria en HPLC de fase inversa de C 18 cuando se usa hasta 50% de solvente orgánico en la fase móvil. Por lo tanto, la presencia de tal "complejo de tecnecio lipofíl ico" en la composición, necesita el uso de una fase móvil de solvente acuoso/orgánico con un contenido orgánico de al menos 70%, de preferencia al menos 90% para provocar que levigue de la columna en un análisis de H PLC de fase inversa. Se cree que tales "complejos de tecnecio lipofílicos" son particularmente probables de ser observados cuando se preparan ligandos liofilizados de Fórmula I en frascos o recipientes farmacéuticos, los cuales comprenden un cierre hecho de hule elastomérico sintético y la molécula objetivo biológica (Z) comprende un g rupo nucleofílico reactivo, tal como un compuesto conteniendo amina, especialmente uno que tiene una amina primaria o secundaria (por ejemplo, un residuo de lisina de un péptido); un tiol (por ejemplo, un residuo de cisteína de un péptido), o un fenol (por ejemplo, un residuo de tirosina de un péptido). En tales circunstancias, lixiviables no polares volátiles del hule sintético pueden ser removidos del cierre sintético a vacío y condensar en el tapón de liofilización frío. La reacción quím ica del compuesto lixiviado con el g rupo nucleofílico de la molécula objetivo conduce a la formación de más derivados lipofílicos de Z. Tales reacciones químicas son favorecidas a pH alcalino, donde el grupo nucleofílico es relativamente reactivo (es decir, libre como se opone a aminas protonadas, o un mayor grado de especies de tiolato o fenolato estando presentes) . Cuando el radiomarcado de xTc es realizado, el resultado es que se observan impurezas de "complejo de tecnecio lipofílico". La lixiviación de un rango de lixiviables no polares volátiles de los cierres de hule sintético durante la liofilización es conocida [ver Jahnke et al , I nt. J. Pharmaceut. , 77, 47-55 (1 991 ) y J . Parent. Sci.Technol. , 44(5), 282-288 (1 990)], pero el efecto de estos lixiviables sobre los agentes radiofarmacéuticos no ha sido reportado previamente. Tam bién es sabido que tales lixiviables de cierre pueden surgir durante el calentamiento, por ejemplo, al someter a autoclave para esterilización [ver, por ejemplo, Danielson J. Parent. Sci .Technol. 46(2), 43-47 (1992)], de manera que se cree q ue la reacción de la molécula objetivo biológica (Z) con tales lixiviables puede ocurrir en otras circunstancias también , aunque la liofilización es el peor escenario. Tales "complejos de tecnecio lipofílicos" son , por lo tanto, particlarmente problemáticos cuando se prepara la com posición de complejo de tecnecio en un frasco o recipiente teniendo un cierre sintético, especialmente cuando se usa liofilización - tales como los conjuntos de la tercera modalidad a continuación . La presente invención proporciona métodos para suprimir o controlar los "complejos de tecnecio lipofílicos" mediante elección adecuada de materiales de cierre y formulaciones de conjunto. Las composiciones de compiejo de tecnecio preferidas de la presente invención son aquéllas en donde, además de un nivel suprimido de complejos de Tc transientes, menos de 5% del xTc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de xTc lipofílicos como es definido antes. De preferencia, las composiciones de complejo de tecnecio de la presente invención son aquél las en donde menos de 3% del xTc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de xTc l ipofílicos. Muy preferiblemente, el nivel de estos complejos de xTc lipofílicos es menor que 2%, con menos de 1 % siendo especialmente preferido y menos de 0.5% siendo el ideal. La presente invención muestra que los complejos de xTc lipofílicos del ligando de Fórmula I exhiben captación en h ígado y retención en sangre in vivo indeseables. Minimizar la captación en hígado es importante, debido a que el hígado es un órgano de soporte importante para formación de imágenes radiofarmacéutica - especialmente para imagenología de pulmón o corazón. Cuando la molécula enfocadora (Z) es diseñada para enfocar trombos dentro del pulmón, tal como émbolos pulmonares PE), el potencial para formar imágenes también será afectado por radioactividad en los órganos y tejidos que rodean el coágulo sangu íneo (es decir, pulmón, corazón , sangre e hígado) . Los diversos complejos de tecnecio aza-diaminadioxima de la presente invención pueden ser separados y detectados mediante métodos cromatográficos adecuados, tales como HPLC, especialmente HPLC de fase inversa, es decir, RP-H PLC. La presencia de estas especies lipofíl icas y cinéticas no fue reconocida por investigadores previos. Así, por ejemplo, análisis de ITLC y H PLC iniciales de un conj ugado de aza-diam inadioxima con un péptido de antiplasmina, sugirió una pureza nominal de alrededor de 90%, es decir, una pureza satisfactoria. Estudios de biodistribución subsecuentes exhibieron altos niveles de retención en el h ígado, los cuales fueron inconsistentes con las cantidades medidas de impurezas radioquímicas. Las impurezas incluyeron RHT (tecnecio hidrolizado reducido) , el cual es conocido por exhi bir captación en hígado. El RHT es una especie inmóvil, la cual es detectada por ITLC. Adicionalmente, el análisis cromatográfico más discriminatorio mostró las múltiples especies de la presente invención . Usando RP-H PLC, los complejos de xTc transientes exhiben tiempos de retención menores que aquél del producto termodinámico, mientras que los complejos lipofílicos exhiben tiempos de retención significativamente más largos que aq uél del producto termodinám ico. Usando la cuantificación de tamaño de pico, la persona experta en la técnica puede monitorear así fácilmente, si una reacción de formación de complejos de "Te dada ha procedido a terminación y los niveles de complejos de "Te lipofílicos presentes. Una muestra auténtica del producto de complejo de xTc termodinám ico deseado puede ser establecido fácilmente para un sistema dado mediante ya sea un tiempo de reacción de formación de complejo prolongado a temperatura ambiente 81 8-25°C) , o siguiendo calentamiento a temperaturas más elevadas como se muestra mediante la presente invención. Tales muestras auténticas pueden ser usadas entonces para identificar los picos observados para el sistema de cromatografía particular usado. El término "logP" tiene su significado estándar - es decir, el logaritmo (base 10) del coeficiente de partición (P) de octanol-agua. Tales coeficientes de partición de octanol-agua son publicados para un amplio rango de compuestos orgánicos y pueden medirse mediante una variedad de técnicas, tales como medición directa [para complejos de 99mTc ver A.R. etring et al, Int. J. ucí. Med.Biol., 11, 113-119 (1984)], o cromatografía [A.Hoepping et al, Bioorg.Med.Chem., 6, 1663-1674 (1998)]. Un método de medición preferido es calibrar un sistema de cromatografía (por ejemplo HPLC) con estándares conocidos, de manera que el tiempo de retención puede ser correlacionado con logP. Esto tiene la ventaja de que pueden medirse concurrentemente mezclas de especies. Los complejos de tecnecio preferidos de la presente invención son simétricos, es decir, los dos substituyentes -CR22R22NHCR12C(=N-OH)R1 en la porción -NY- del ligando de Fórmula (I) son elegidos para ser los mismos. Esto tiene la ventaja de que, el complejo de tecnecio no contiene un centro quiral, debido a que tales centros pueden resultar en complejos de tecnecio diastereoméricos y posiblemente requieren la purificación de isómeros particulares. En los complejos de tecnecio aza-diamina dioxima de la presente invención, se prefiere que al menos un grupo R2 sea H, más preferiblemente todos los grupos R2 son H. Cada R1 es elegido de preferencia de: alquilo de d.3, alcoxialquilo de C2-4, hidroxialquilo de d-3 o fluoroalquilo de C1-3 y muy preferiblemente alquilo de C -3 o fluoroalquilo de C1-3. Es muy especialmente preferido que todos los grupos R1 sean CH3. Cuando los complejos de tecnecio de la presente invención comprenden grupos R, en donde dos o más grupos R, junto con los átomos a los cuales están unidos , forman un anillo carbocíclico, heterocíclico, saturado o insaturado, tales anillos preferidos tienen 3 a 6 miembros, especialmente 5 o 6 miembros. Los más preferidos de tales anillos son los anillos carbocíclicos saturados. Los anillos carbocíclicos preferidos son aq uéllos en los cuales 2 grupos R1 unidos a ya sea los m ismos átomos de carbono o átomos de carbono adyacentes se combinan para formar anillos saturados de 3 a 6 miembros, especialmente 5 o 6 miembros. Las composiciones de complejo de tecnecio aza-diaminadioxima especialmente preferidos de la presente invención son aquéllas con los ligandos de Fórmula (II): donde cada R1 es eleg ido independientemente de alquilo de C1 -3 o fluoroalquilo de C1 -3, p es un entero de valor 0 a 3, y Z es como se define para la Fórmula I . As í, en la Fórmula I I , Y es -CH2CH2(A)pZ. Los ligandos preferidos de Fórmula (I I) son simétricos como se describe antes. Se prevé que el papel del grupo enlazador -(A)n- es distanciar el complejo de tecnecio relativamente voluminoso, lo cual resulta en coordinación de metal, del sitio activo de la porción enfocadora biológica (Z) , de manera que por ejemplo, la unión de receptor no sea deteriorada. Esto puede lograrse mediante una combinación de flexibilidad (por ejemplo, cadenas alquilo simples) , de manera que el grupo voluminoso tenga la libertad de posicionarse a sí mismo lejos del sitio activo y/o rigidez, tal como un separador de cicloalquilo o arilo, el cual orienta el complejo de metal lejos del sitio activo. La naturaleza del grupo enlazador también puede ser usada para modificar la biodistribución del complejo de tecnecio resultante del conjugado. De esta manera, por ejemplo, la introducción de grupos éter en el enlazador ayudará a minim izar la unión de proteína de plasma, o el uso de grupos enlazadores poliméricos, tales como polialquilenglicol, especialmente PEG (polietilenglicol) puede ayudar a prolongar el tiempo de vida del agente en la sangre in vivo. Los grupos enlazadores preferidos -(A)n- tienen una cadena de esqueleto (es decir, los átomos enlazados los cuales forman la porción -(A)n-) , la cual contiene 2 a 10 átomos, muy preferiblemente 2 a 5 átomos, prefiriéndose especialmente 2 o 3 átomos. Una cadena de esq ueleto de grupo enlazador mínima de 2 átomos confiere la ventaja de que el quelante de aza-diaminadioxima esté bien separado de la porción enfocadora biológica de manera que cualquier interacción sea minimizada. Una ventaja adicional es que el tamaño de anillo de quelato potencial del grupo Z es tan largo (al menos 8 para una cadena de grupo enlazador de 2 átomos), que sea poco probable que estos g rupos com pitan de manera efectiva con la coordinación de la aza-diaminadioxima al xfc. En esta manera, tanto las características de enfocado biológico de la porción enfocadora biológica como la capacidad de formación de complejos de metal del quelante de aza-diaminadioxima son mantenidas en conjugados de este ti po. Es fuertemente preferido que la porción enfocadora biológica Z esté unida al q uelante de aza-diaminadioxima en tal manera que el enlace no experimente un fácil metabolismo en la sangre. Esto se debe a que tal metabolismo resultaría en que el complejo de metal de "Te es cortado antes de que la porción enfocadora biológ ica marcada alcance el sitio objetivo in vivo deseado. Por lo tanto, la porción enfocadora biológica está unida de preferencia covalentemente a los complejos de metal de xTc de la presente invención vía grupos enlazadores -(A)n-, los cuales no son metabolizados fácilmente. Tales enlaces adecuados son enlaces carbono-carbono, enlaces de amida, enlaces de urea o tiourea o enlaces de éter. Los grupos enlazadores no de péptido, tales como grupos alquileno o grupos arileno, tienen la ventaja de que no existen interacciones de unión de hidrógeno significativas con la porción enfocadora biológica conjugada, de manera que el enlazador no se envuelve alrededor de la porción enfocadora biológica. Los grupos separadores de alquileno preferidos son -(CH2)q-, donde q es un entero de valor 2 a 5. De preferencia q es 2 o 3. Los separadores de arileno preferidos son de fórmula: donde: a y b son cada uno independientemente 0, 1 o 2.
U n grupo Y preferido es así -CH2CH2-(A)p-Z, donde p es un entero de valor 0 a 3. Cuando Z es un péptido, Y es de preferencia -CH2CH2-(A)p-Z, donde -(A)p- es -CO- o -N R-. Cuando -(A)p- es -N H-, este agrupamiento tiene la ventaja adicional de que es contenido desde el intermediario simétrico N (CH2C H2NH2)3, el cual está comercialmente disponible. Los precursores de triamina q ue tienen diferentes longitudes de cadena requieren el uso de estrategias sintéticas para distinguir qu ímicamente las diversas aminas (por ejemplo, vía grupos protectores) . Los quelantes de aza-diaminadioxima preferidos de Fórmula II son conjugados de preferencia a los péptidos de a2-antiplasmina (y modalidades preferidas de los mismos) descritos antes. Las composiciones de complejo de tecnecio mejoradas de la presente invención pueden ser preparadas al hacer reaccionar el radioisótopo de Tc (es decir, 99mTc "Te o 9 mTc) en el estado de oxidación apropiado con el ligando de Fórmula (I) o (I I) en solución en un solvente adecuado, con ya sea: (i) un tiempo de reacción prolongado a tem peratura ambiente; o (ii) calentamiento a temperatura más elevada; o (iii) combinaciones de los mismos; para im pulsar la reacción al producto de complejo de "Te termodinámico deseado y así minimizar el nivel de los "complejos de xTc transientes". El material de inicio de tecnecio usual es pertecnetato, es decir, Tc04", el cual es tecnecio en el estado de oxidación de Tc(VI I). El pertecnetato por sí mismo no forma fácilmente complejos de metal, de ah í que la preparación de complejos de tecnecio usualmente requiere la adición de un agente reductor adecuado, tal como ión estañoso para facilitar la formación de complejo al reducir el estado de oxidación del tecnecio a los estados de oxidación menores, usualmente Tc(l) a Tc(V). El solvente puede ser orgánico o acuoso, o mezclas de los mismos. Cuando el solvente comprende un solvente orgánico, el solvente orgánico es de preferencia un solvente biocompatible, tal como etanol o DMSO. De preferencia, el solvente es acuoso y muy preferiblemente es solución salina isotónica. Para obtener las composiciones de complejo de tecnecio de la presente invención, la mezcla de reacción debe ser calentada a una temperatura mínima de 50°C durante un periodo de al menos 10 minutos. Condiciones de calentamiento adecuadas son un rango de temperatura de 50 a 80°C durante 10 a 20 minutos, de preferencia 60 a 70°C durante 10 a 1 5 minutos, muy preferiblemente 60 a 65°C durante 1 0 a 12 minutos, con 60°C durante 10 minutos siendo lo ideal. El pH del medio de reacción está convenientemente en el rango de pH 8.5 a 9.5, de preferencia pH 8.8 a 9.0, muy preferiblemente pH 8.8. El proceso de calentamiento puede emplear cualquier metodología adecuada, tal como baños calientes de fluido, tales como agua o aceite de alta ebullición (por ejemplo, silicón), bloques de calentamiento, placas calientes o radiación de microondas, siempre y cuando pueda alcanzarse el control de temperatura deseado. Después de que se completa el calentamiento, se permite que la mezcla de reacción ya sea se enfríe a temperatura ambiente o pueda enfriarse de manera activa (por ejemplo, en una corriente de un fluido de enfriamiento tal como un gas o agua) o vía un bloque de calentamiento con enfriamiento inductivo integral.
Los presentes inventores también han establecido que los complejos de "Te lipofílicos indeseables puedan ser suprimidos por la presencia en la mezcla de reacción de al menos una sal de un ácido orgánico débil con un catión biocompatible. Por el término "ácido orgánico débil" se quiere decir un ácido orgánico con un pKa en el rango de 3 a 7. Por el término "catión biocompatible" se quiere decir un contraión cargado positivamente, el cual forma una sal con un grupo cargado negativamente, ionizado, donde dicho contraión cargado positivamente también es no tóxico y de ah í que sea adecuado para administración al cuerpo mam ífero, especialmente el cuerpo humano. Ejemplos de cationes biocompatibles adecuados incluyen: los metales alcalinos sodio o potasio; los metales alcalino-térreos calcio y magnesio; y el ión amonio. Los cationes biocompatibles preferidos son sodio y potasio, muy preferiblemente sodio. Tales ácidos orgánicos débiles adecuados son ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido glucoheptónico, ácido benzoico, fenoles o ácidos fosfónico. De ahí, las sales adecuadas son acetatos, citratos, tartratos, gluconatos, glucoheptonatos, benzoatos, fenolatos o fosfonatos, de preferencia acetatos. La sal de acetato es de preferencia acetato de sodio o potasio, muy preferiblemente acetato de sodio. Una ventaja adicional de usar estas sales es que el anión de ácido forma un complejó débilmente con el tecnecio (tal como tartrato, gluconato o citrato) , y es desplazado por el ligando de aza-diaminadioxima en un intercarmbio de ligando o proceso de transquelación . Tales condiciones son útiles para ayudar a suprimir las reacciones laterales indeseables, tales como hidrólisis del ión de tecnecio. Una concentración adecuada para usarse para ia sal del ácido orgánico débil está en el rango de 1 a 1 00 µp???/ml , de preferencia en el rango de 5 a 50 µ????/p?? . Los solicitantes han encontrado además que la adición de un radioprotector a la mezcla de reacción no solo estabiliza el producto de complejo de xTc una vez formado, sino que acelera inesperadamente la conversión de los complejos de "Te transientes al producto de complejo de tecnecio termodinámico deseado. Esto tiene la ventaja de que pueden aplicarse tiempos de calentamiento más cortos y/o temperaturas de calentamiento menores. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando la porción enfocadora biológica es sensible al calor hasta al menos algún grado. Por el término "rad ioprotector" se quiere decir un compuesto que inhibe las reacciones de degradación, tales como procesos redox, al atrapar radicales libre altamente reactivos, tales como radicales libres conteniendo oxígeno que surgen de la radiólisis de agua. Los radioprotectores de la presente invención son elegidos convenientemente de: una fuente de oxígeno o aire estéril; ácido ascórbico; ácido para-aminobenzoico (es decir, ácido 4-am inobenzoico o PABA); ácido gentísico (es decir, ácido 2 , 5-dihidroxibenzoico) y sales de tales ácidos con un catión biocompatible, como se define antes. Los radioprotectores preferidos son ácido ascórbico y ácido para-aminobenzoico, o sales de los mismos con un catión biocompatible. Los radiprotectores especialmente preferidos son ácido para-am inobenzoico y sales de los m ismos con un catión biocompatible, de manera ideal para-aminobenzoato de sodio. Los radioprotectores de la presente invención están comercialmente disponibles a una especificación de grado farmacéutico. Los presentes inventores también han establecido que los niveles de complejos de Tc lipofílicos indeseables son influenciados por la elección de cierre de frasco de grado farmacéutico empleado. Tales cierres normalmente comprenden hules de bromobutilo, clorobutilo o butilo, o mezclas de los mismos, y se cree que los materiales lixiviados volátiles (por ejemplo, antioxidante fenólico obstruido o sub-productos de resina fenólica) del hule sintético pueden reaccionar con el conjugado de quelato de aza-diaminadioxima para dar niveles variantes de complejos de xTc lipofílicos. Se cree que la mayoría de los tipos de cierre exhiben este problema, pero a grados variantes - de ahí que la elección de cierre también sea un factor para ayudar a suprimir los niveles de complejos de "Te lipofílicos. La preparación de la composición de complejo de tecnecio de la presente invención es realizada, de preferencia, usando un conjunto no radioactivo, como se describe en la tercera modalidad de la invención (a continuación). Los conjugados de quelante de aza-diaminadioxima usados en la preparación de las composiciones de complejo de tecnecio de la presente invención, pueden ser preparados mediante reacción de un quelato bifuncional de Fórmula III con la porción enfocadora biológica (Z): Fórmula III donde: cada R1 y R2 es Independientemente un grupo R; E es -(A)n-J donde: J es un grupo funcional adecuado para conjugación a Z; -(A)n- es un grupo enlazador donde cada A es independientemente - CO-, -CR2-, -CR=CR-, -C=C-, -CR2CO2-, -C02CR2-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=0)NR-, -NR(C=S)NR-, -S02NR-, -NRS02-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno de C4.8, un grupo ciclbalquileno de C4-8, un grupo arileno de C5.12. o un grupo heteroarileno de C3.i2 o una porción de polialquilenglicol, ácido poliláctico o ácido poliglicólico; n es un entero de valor 0 a 10; cada grupo R es independientemente H o alquilo de C1.10, alquilarilo de C3. 0. alcoxialquilo de C2. 0, hidroxialquilo de C1.10, fluoroalquilo de C1.10 o 2 o más grupos R, junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo carbocíclico, heterocíclico, saturado o insaturado. Por el término "grupo funcional adecuado para conjugación" se quiere decir un grupo funcional, el cual reaccionará con un grupo funcional correspondiente de Z (normalmente un grupo amina, carboxilo o tiol) para enlazar químicamente el quelante de aza-diamina dioxima a Z. Tales grupos funcionales preferidos adecuados para conjugación son : -NR5R6, -C02M, -NCS, -NCO, -SM\ -OM1 , maleimida o acrilam ida , donde: R5 y Re son independientemente un grupo R o PG; M es H , un catión biocompatible, PG o un éster activo; M1 es H o PG¡ y PG es un grupo protector. El término "catión biocompatible" es como se define antes. Por el término "g rupo protector" se quiere decir un grupo, el cual inhibe o suprime reacciones qu ímicas indeseables, pero el cual es diseñado para ser suficientemente reactivo de manera que pueda ser cortado del grupo funcional en cuestión bajo condiciones suaves que no modifiquen quím icamente el resto de la molécula. Después de la desprotección, el grupo en cuestión puede ser usado para conjugar el quelato bifuncional de Fórmula I II a la porción enfocadora biológica (Z). Los grupos protectores son bien conocidos para aquéllos expertos en la técnica y son elegidos convenientemente de, cuando J es -NR5Re: Boc (donde Boc es ter-butiloxicarbonilo), Fmoc (donde Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo), trifluoroacetilo, aliloxicarbonilo, Dde [es decir, 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexiliden)etilo] o N pys (es decir, 3-nitro-2-piridin sulfenilo); y cuando J es -C02PG: éster de metilo, éster de ter-butilo, éster de bencilo. Cuando J es -OPG, grupos protectores adecuados son: acetilo, benzoilo, trifilo o tetrabutildimetilsililo. Cuando J es -SOG, grupos protectores adecuados son: tritilo y 4-metoxibencilo. El uso de grupos protectores adicionales es descrito en "Protective Groups in Organic Synthesis" (Grupos protectores en síntesis orgánica) , Theorodora W.
Greene y Peter G . M. Wuts (John Wiley & Sons, 1 991 ). Por el térm ino "éster activo" se quiere decir un derivado de éster del ácido carboxílico, el cual es diseñado para ser un mejor grupo que sale y de ahí permitir una reacción más fácil con los nucleófilos presentes en la porción enfocadora biológica, tales como aminas. Ejem plos de los ésteres activos adecuados son: N-hidroxisuccinimida (NHS) , pentafluorofenol, pentafluorotiofenol, para-nitrofenol, hidroxibenzotriazol y PyBOP (es decir, hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-oxitripirrolidinofosfonio). Los quelatos bifuncionales de Fórmula II I pueden ser conjugados a la porción enforacora biológica (Z) como se describe por S. Liu et al [Chem . Rev. , 99, 2235-2268 (1999)] . De esta manera, por ejemplo, los quelantes de aza-diami na d ioxima amina-funcionalizados de Fórm ula I I I (es decir, J = -NR5R6) pueden ser conjugados al o los grupos carboxilo de la porción enfocadora biológica (Z) , vía enlaces amida. Este acoplamiento puede ser realizado directamente (por ejemplo, usando síntesis de péptido de fase sólida) , o vía intermediarios apropiados como es sabido en la técnica, tales como ésteres activados del grupo carboxilo de la porción enfocadora biológica. De manera alternativa, el grupo amina pendiente del quelante bifuncional puede ser convertido primero a un isotiocianato (-NCS) o grupo isocianato (-NCO), lo cual permite la conjugación a las porciones enfocadoras biológicas conteniendo amina, vía la formación de tiourea y enlaces de urea respectivamente. De manera alternativa, el grupo amina pendiente del quelante de aza-diamina dioxima bifuncional puede hacerse reaccionar con una función de ácido de un d iácido para introducir un grupo carboxilo terminal vía un grupo enlazador. Un quelante bifuncional que soporta una función carboxilo (es decir, J = -C02M) puede ser usado en una manera similar para acoplarse directamente a porciones enfocadoras biológicas conteniendo amina vía un enlace amida. El quelato bifuncional también puede soportar un grupo diseñado para reaccionar con grupos tiol en la porción enfocadora biológica para formar enlaces tioéter estables. Ejemplos de tales grupos son maleimidas (las cuales pueden ser preparadas mediante reacción de anhídrido maleico con la am ina correspondiente, seguido por calentamiento con anhídrido acético) y acrilam idas (las cuales pueden ser preparadas mediante reacción de cloruro de acrililo con la amina). Los quelantes de aza-diaminadioxima bifuncionales de la presente invención pueden ser preparados de manera adecuada mediante alquilación de un compuesto de Fórmula IV: Fórmula IV donde A, J, R2 y n son como se define para la Fórmula I I I anterior, con ya sea : (i) el derivado cloronitroso apropiado CI-C(R1 )2-C(=NO)R1 ; (ii) una alfa-cloro oxima de la fórmula CI-C(R1 )2-C(=NOH) R1 ; (iii) una alfa-bromocetona de fórmula Br-C(R1 )2-C(=0)R1 , seguida por conversión del producto de diaminadicetona a la diaminadioxima con hidroxilamina. La ruta (i) es descrita por S. Jurisson et al [I norg. Chem . , 26, 3576-82 (1987)] . Los compuestos cloronitroso pueden ser obtenidos mediante tratamiento del alqueno apropiado con cloruro de nitrosilo (NOCI), Detalles sinéticos adicionales de compuestos cloronitroso están dados por: Ramalingam, K. et al. Synth. Commun. ( 1 995) 25(5) 743-52; Glaser et al J. Org . Chem . (1996) , 61 (3), 1 047-48; Clapp, Leallyn B. ; et al J . Org Chem. (1971 ) , 36(8) 1 169-70; Saito, Giulichi et al Shizen Kagaku (1 995) , 47, 41 -9 y Schulz, Manfred Z. Chem (1 981 ) , 21 (1 1 ), 404-5. La ruta (iii) es descrita por Nowotnik et al [Tetrahedron, 50(29), p.8617-8632 (1994)]. Las alfa-cloro-oximas pueden ser obtenidas mediante oximación de la alfa-cloro-cetona o aldehido correspondiente, los cuales están comercialmente disponibles. Las alfa-bromocetonas están comercialmente disponibles. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona radiofarmacéuticos que comprenden las composiciones de complejo de aza-diam inadioxima tecnecio anteriores en una forma estéril adecuada para adm inistración humana. Tales radiofarmacéuticos son suministrados convenientemente en un recipiente, el cual es provisto con un sello, el cual es adecuado para perforación simple o múltiple con una aguja hipodérmica (por ejemplo, un cierre de sello de séptum encrespado) , mientras que se mantiene la integridad estéril. Tales recipientes pueden contener dosis de pacientes simples o mú ltiples. Los recipientes de dosis m úlples preferidos comprenden un solo frasco de volumen (por ejemplo de volumen de 10 a 1 00 cm3) , el cual contiene dosis de pacientes múltiples, por lo cual las dosis de pacientes solos pueden ser arrastradas así hacia jeringas de grado clínico a varios intervalos durante el tiempo de vida viable de la preparación para adecuarse a la situación clínica. Los radiofarmacéuticos de la presente invención también pueden ser suministrados en jeringas pre-llenadas. Tales jeringas pre-llenadas son diseñadas para contener una dosis humana simple, la cual está en una forma en donde la dosis puede ser adm inistrada al paciente directamente desde la jeringa. Tales jeringas pre-llenadas son preparadas adecuadamente mediante fabricación aséptica, de manera que el producto está en forma estéril. Por lo tanto, la jeringa que es pre-llenada, es de preferencia, una jeringa desechable u otra que es adecuada para uso clínico y de ahí que mantiene la integridad estéril del radiofarmacéutico. La jeringa pre-l lenada que contiene el radiofarmacéutico puede ser provisto ventajosamente con un escudo de jeringa para proteger al operador de la dosis radioactiva. Tales escudos de jeringa radiofarmacéutica adecuados son conocidos en la técnica y de preferencia comprende ya sea plomo o tungsteno. Tales jeringas pre-llenadas son embarcadas , de preferencia, al cliente ya equipadas con un escudo de jeringa y empacadas dentro de un recipiente que proporciona protección de radiación adicional, de manera que la dosis de radiación externa al exterior del empaque es minimizada durante el transporte desde el fabricante hasta el cliente. Un contenido de radioactividad de 99mTc adecuado para un radiofarmacéutico de imagenolog ía diagnóstica de 99mTc está en el rango de 180 a 1500 Mbq (3.5 a 42 mCi), dependiendo del sitio a ser imaginado in vivo, la captación y la proporción de objetivo a soporte. Para imagenología de corazón con un radiofarmacéutico de Te, ca. 1 1 10 MBq (30 mCi) puede usarse para un estudio de tensión, y ca. 350 MBq (10 mCi) para un estudio en reposo. Para imagenolog ía de trombo con un radiofarmacéutico de 99mTc ca. 750 MBq (21 mCi) sería adecuado. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona conjuntos no radioactivos para la preparación de las composiciones radiofarmacéuticas de xTc de la presente invención. Tales conjuntos son diseñados para dar productos radiofarmacéuticos estériles adecuados para administración humana, por ejemplo, vía inyección directa en el torrente sanguíneo. Para 99mTc, el conjunto es liofilizado de preferencia y es diseñado para ser reconstituido con 99mTc-pertecnetato (TcCV) estéril a partir de un generador de radioisótopo de 99mTc para dar una solución adecuada para administración humana sin manipulación adicional. Conjuntos adecuados comprenden un recipiente (por ejemplo, un frasco sellado con séptum) conteniendo el ligando de aza-diaminadioxima sin formar complejo de Fórmula (I) o (II), junto con un agente reductor farmacéuticamente aceptable, tal como ditionito de sodio, bisulfito de sodio, ácido ascórbico, ácido formamidina sulfínico, ión estañoso, Fe(l l) o Cu(l); junto con al menos una sal de un ácido orgánico débil con un catión biocompatible como se define antes. La sal del ácido orgánico débil funciona para suprimir la formación de complejos de Te lipofílicos indeseables (como se describe antes). Los conjuntos no radioactivos pueden comprender además de manera opcional, un segundo ácido orgánico débil o sal del mismo con un catión biocompatible, el cual funciona como un transquelante. El transquelante es un compuesto que reacciona rápidamente para formar un complejo débil con tecnecio, entonces es desplazado por la aza-diaminadioxima. Esto minimiza el riesgo de formación de tecnecio hidrolizado reducido (RHT) debido a la rápida reducción de pertecnetato que compite con la formación de complejo de tecnecio. Tales transquelantes adecuados son los ácidos orgánicos débiles y las sales de los mismos descritos antes, de preferencia tartratos, gluconatos, glucoheptonatos, benzoatos o fosfonatos, de preferencia fosfonatos, muy especialmente difosfonatos. Tal transquelante preferido es MDP, es decir, ácido metilendifosfónico, o una sal del mismo con un catión biocompatible.
Como una alternativa para el uso del ligando en forma libre, el conjunto puede contener opcionalmente un complejo de metal del ligando de aza-diaminadioxima el cual, sobre adición del tecnecio, experimenta transmetalización (es decir, intercambio de ligando) dando el producto deseado. Tales complejos adecuados para transmetalización son complejos de cobre o cinc. El agente reductor farmacéuticamente aceptable usado en el conjunto es de preferencia una sal estañosa, tal como cloruro estañoso, fluoruro estañoso o tartrato estañoso, y puede estar ya sea en forma anhidra o hidratada. La sal estañosa de preferencia es cloruro estañoso o fluoruro estañoso. Los conjuntos no radioactivos pueden comprender además de manera opcional, componentes adicionales tales como un radioprotector, conservador antimicrobiano, agente ajustador de pH o relleno. El término "radioprotector" es como se define antes. Por el término "conservador antimicrobiano" quiere decir un agente que inhibe el crecimiento de microorganismos potencialmente dañinos, tales como bacterias, levaduras o mohos. El conservador antimicrobiano también puede exhibir algunas propiedades bactericidas, dependiendo de la dosis. El papel principal del o los conservadores antimicrobianos de la presente invención es inhibir el crecimiento de cualquiera de tales microorganismos en la postreconstitución de composición radiofarmacéutica de xTc, es decir, en el producto diagnóstico radioactivo por sí mismo. Sin embargo, el conservador antimicrobiano también puede ser usado opcionalmente para inhibir el crecimiento de microorganismos potencialmente dañinos en uno o más componentes del conjunto no radioactivo de la presente invención antes de la reconstitución. El o los conservadores antimicrobianos adecuados incluyen: los parabenos, es decir, metil, etil, propil o butil parabeno o mezclas de los mismos; alcohol bencílico; fenol; cresol; cetrimida y tiomersal. El o los conservadores antimicrobianos preferidos son los parabenos. El término "agente ajustador de pH" significa un compuesto o mezcla de compuestos usados para segurar que el pH del conjunto reconstituido está dentro de los límites aceptables (aproximadamente pH 4.0 a 10.5) para administración a humanos o mamíferos. Tales agentes ajustadores de pH adecuados incluyen amortiguadores farmacéuticamente aceptables, tales como tricina, fosfato o TRIS [es deicr, tris(hidroximetil)aminometano] y bases farmacéuticamente aceptables, tales como carbonato de sodio, bicarbonato de sodio o mezclas de los mismos. Para las aza-diaminadioximas de la presente invención, se prefiere que el agente ajustador de pH comprenda bicarbonato de sodio. Cuando la porción enfocadora biológica es un fragmento de péptido de a2-antiplasmina, una formulación de conjunto preferida comprende: el ligando de Fórmula (I ) , reductor estañoso, una sal de acetato de un catión biocompatible, un transquelante de ácido difosfónico más un agente aj ustador de pH. Uno de tales conjuntos preferidos comprende: el ligando de Fórmula (I I) , cloruro estañoso; acetato de sodio; MDP o una sal biocompatible del mismo; un radioprotector, especialmente PABA o una sal biocom patible del mismo, muy especialmente la sal de sodio de PABA; y bicarbonato de sodio como el agente ajustador de pH . Uo de tales conjuntos más preferido comprende además el ligando de Fórmula I I , donde cada R1 es CH3, (A)p es NH y Z es Ac-Asn-GIn-Glu-GIn-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-, donde Xaa es Tyr o l-Tyr, y Ac es N-acetilo. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un método de imagenolog ía diagnóstica de trombos usando los radiofarmacéuticos de la presente invención , donde la molécula enfocadora biológica es un fragmento de péptido de 3 a 20 meros de ct2-antiplasmina que comprende la secuencia Asn-GIn-Glu-GIn. Muy preferiblemente, el fragmento de péptido de a2-antiplasmina comprende la secuencia Asn-GIn-Glu-GIn-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly, donde Xaa es como se define antes. Los émbolos pulmonares (PE) están compuestos de cantidades significativas de fibrina, la cual es reticulada y estabilizada mediante la acciónde Factor XI 11 a . Tanto la fibrina como el Factor XI 11 a son generados a partir de precursores no activos específicamente en sitios de trombosis. Los fragmentos de péptidos de a2-antiplasmina de la presente invención son substratos potentes para Factor Xll la, y así están unidos covalentemente a fibrina dentro de los émbolos pulmonares vía la acción de esta enzima. Los complejos de 99mTc de los conjugados de fragmento de péptido de a2-antiplasmina y aza-diaminadioxima de la presente invención son captados así selectivamente en el sitio del émbolo in vivo, dando captación positiva o imagenología de "mancha caliente" para tales sitios en relación al tejido normal. Una lógica similar se aplica a otros tipos de trombos in vivo (por ejemplo, trombosis de vena profunda o dvt), debido a que el Factor Xllla funciona en una manera similar. De ahí, los conjugados de substrato de Factor Xll la de la presente invención son útiles para la imagenología de trombos in vivo, especialmente émbolos pulmonares y trombosis de vena profunda. La invención es ilustrada mediante los Ejemplos no limitantes detallados a continuación. El Ejemplo 1 describe la síntesis de Compuesto 1 , el cual es un quelante de aza-diaminadioxima de la invención. El Ejemplo 2 describe la síntesis de la forma protegida de una molécula enfocadora de péptido preferida, la cual es un fragmento de péptido de a2-antiplasmina para enfocar trombos. El ejemplo 3 describe la síntesis de Compuesto 3, el cual es un conjugado del quelante de aza-diaminadioxima del Ejemplo 1 con el péptido enfocado del Ejemplo 2. El Ejemplo 3 también describe la síntesis de los Compuestos 4 a 7. El Ejemplo 4 es un Ejemplo comparativo que muestra el radiomarcado de 99mTc de Compuesto 3 como se muestra en la técnica anterior. El Ejemplo 5 describe los sistemas de H PLC usados en la presente invención . El Sistema J es uno que da un RCP aparentemente aceptable, pero los complejos de xTc lipofílicos son retenidos en la columna (es decir, tienen demasiada afinidad por la fase estacionaria cuando se usa hasta 40% de acetonitrilo en la fase móvil). El Sistema H tiene un gradiente de levigación el cual incluye más solvente orgánico en la fase móvil (hasta 90% de acetonitrilo) y de ah í que leviga exitosamente los complejos de tecnecio lipofílicos de la columna , de manera que son analizados. El 4% de sobre-estimado de la pureza usando el Sistema J es debido a complejos de 99mTc lipofílicos no detectados (ver Figura 3). El Ejemplo 10 y Figura 1 muestran que tales niveles de complejos de 98mTc lipofílicos tienen un efecto significativo en la captación en h ígado in vivo. El Ejemplo 6 describe la preparación de conjuntos liofil izados de la presente invención . La formulación 82/6 es preferida, debido a que existe menos tendencia de la torta secada por congelación a colapsarse durante la liofilización. La formulación 82/6 también es más fuerte a levigar generador de 99mTc envejecido (es decir, hasta 6 horas después de levigación del generador), dando RCP inicial satisfactorio y buena estabilidad post reconstitución de la preparación . El Ejemplo 7 describe la reconstitución de los conjuntos liofilizados para dar composiciones de complejo de 99mTc de la presente invención. El Ejemplo 8 muestra que los péptidos conteniendo lisina (K), es decir, que tienen grupos amina (Compuestos 3 y 4) muestran niveles significativos de complejos de tecnecio lipofílicos. Cuando éstos son reemplazados con aminoácidos no conteniendo amina como para el Compuesto 5, el nivel de complejos lipof ílicos es muy reducido. Esto también es mostrado por el derivado de benzamida (Compuesto 6) . El Ejemplo 9 muestra el efecto del uso de un radioprotector en las composiciones de complejo de 99mTc. El Ejemplo 1 1 muestra el efecto del contenido de complejo de xTc lipofílico en la biodistribución de una composición de complejo de 99mTc. La variación de impurezas lipof ilicas provocó un aumento significativo (p<0.05) en la retención en sangre de la radioactividad a 1 hora p.i. (1 .88 a 3.26%) con una tendencia concomitante hacia una disminución en salida urinaria (63.07 a 51 .04%) aunque no es estad ísticamente significativa. La radioactividad presente en el hígado también aumentó significativamente (p<0.05) desde 2.24% hasta 1 0.24% . De esta manera, aumentar los niveles de impurezas lipofílicas conduce a la retención significativamente incrementada de 99mTc-Compuesto 3 en la sangre y captación significativamente mayor en el h ígado. Esto provocó, a su vez, una tendencia hacia la excreción urinaria dism inuida. El Ejem plo 12 muestra el efecto de una sal de ácido orgánico débil sobre el contenido de complejo de tecnecio lipofílico y biodistribución resultante. Se muestra que la adición de trihidrato de acetato de sodio a la formulación de 99mTc-Compuesto 3 aumenta la limpieza de sangre y disminuye la captación en hígado, como se esperaría debido al contenido suprimido de complejos de 99mTc lipofílicos presentes. El potencial de imagenolog ía diagnóstica de la composición es mejorado así sig nificativamente. La captación del agente en el corazón y pulmón es despreciable y de ahí que el agente sea potencialmente útil para imagenlog ía de PE de pulmón debido a la captación de soporte baja satisfacotria. El Ejem plo 1 3 muestra que una composición de complejo de xTc mejorada de la presente invención todavía exhibe captación de coágulo útil, es decir, se retiene la actividad enfocadora biológica. Como se demuestra a partir del Ejemplo 1 1 y Figura 1 , la principal característica biológica resultante de la presencia de complejos de 99mTc l ipofílicos es un aumento en el %id en el h ígado. La Figura 1 muestra el efecto de contenido de complejo de 99mTc lipofílico en la composición en la captación de hígado. La Figura 2 muestra una traza de H PLC representativa de una composición de complejo de aza-diam inadioxima 99mTc, q ue muestra las diversas especies descritas en la presente invención - la Figura 2A es un despliegue de picos escala completa normal y la Figura 2B es una escala expandida. La Figura 3 compara las trazas de H PLC para la m isma preparación de complejo de 99mTc de aza-diaminadioxima usando dos sistemas diferentes - Sistema J y Sistema H . Los complejos de xTc lipofílicos son detectados usando el Sistema H (a un nivel de ca. 5% del material radiomarcado presente) , pero no son detectados usando el Sistema J .
Tabla 1 Compuesto X 1. ? 2. -GKLLT(I-Y)PSVQEQN-Ac 3. -CO(CH2)2C02-VHHQKLVFF-NH2 4. -GALLTYPSVAQAN-Ac 5. -COPh 6. -CO(CH2)2C02H 7. Donde: Ac es acetilo.
Ejemplo 1: Síntesis de 3.3.11.11-tetrametil-7-(2-aminoetil¾-4,7.10-triazatridecano-2.12-dionadioxima (Compuesto 1 o Pn216) A una solución de tris(2-aminoetil)amina (1 mi, 6.68 mmol) en acetonitrilo (10 mi) se adicionó bicarbonato de sodio (1.12 g, 13.36 mmol, 2eq). Una solución de 3-cloro-3-metil-2-n¡trosobutano [R.K.Murmann, J.Am.Chem.Soc, 79, 521-526 (1957); 1.359g, 10.02 mmol, 1.5 eq] en acetonitrilo seco (5 mi) se adicionó lentamente. La mezcla de reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 3 días y entonces se filtró. El residuo se lavó bien con acetonitrilo y el filtrado se evaporó. El producto crudo fue purificado entonces mediante EP-HPLC (columna: Hamilton PRP-1 ; gradiente: 0 a 1 00%B en 20 m in; donde el Levigante A es 2% de N H3 acuoso y el Levigante B es acetonitrilo, a una velocidad de flujo de 3ml/min) para dar el Compuesto 1 (1 64 mg, 7%). d? (CD3OD, 300 MHz): 2.77 (2H , t, J 6Hz, CH2NH2), 2.50-2.58 (10H, m , H2NCH2CH2N(CH2CH2NH)2), 1 .85 (6H , s, 2 x CH3C=N), 1 .23 ( 1 2H, s, 2 x (CH3)2CNH).
Ejemplo 2: Síntesis del péptido Ac-NQEQVS PY(3hTLLKG (Compuesto El péptido protegido Ac-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(3l)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH , fue ensamblado en una resina de 2-clorotritilo al anclar Fmoc-Gly- a la resina y entonces ciclos de desprotección/acoplamiento sucesivos con los aminoácidos protegidos apropiados y los reactivos de acoplamiento DCC y HOBt. La síntesis de péptido de fase sólida es descrita en P. Lloyd-Williams, F.AIbericio y E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (Aproximaciones q u ímicas a la síntesis de péptidos y proteínas) , CRC Press, 1 997. La asparagina terminal fue acetilada, cortada de la resina usando 0.5% TFA y Compuesto 2 usado sin purificación adicional como la sal de trifluoroacetato.
Ejemplo 3: Síntesis de Compuestos 3 a 7. El péptido Ac-NQEQVSPY(3I )TLLKG protegido (Compuesto 2) fue cortado de la resina de fase sólida como se describe en el Ejemplo 2 y entonces es acoplado con el Compuesto 1 en solución usando PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-oxitris-pirrolidino-fosfonio) y HOBt (1 -hidroxibenzotriazol) como los agnetes de acoplamiento. El Compuesto 3 fue obtenido mediante desprotección en el reactivo K [el reactivo K es 82.5% TFA, 5% fenol, 5% agua procesada, 5% tioanisol, 2.5% etanoditiol EDT)]. El conjugado crudo fue purificado primero mediante RP-HPLC usando TFA seguido por una segunda purificación e intercambio de sales con ácido acético, liolización, filtración con un filtro de 0.22µ y una liofilización final para dar el Compuesto 3. Peso molecular por MS 1970 ± 1 Daltones. Los péptidos usados en los Compuestos 4 y 5 fueron preparados en una manera similar. El Compuesto 7 fue preparado mediante derivación del Compuesto 1 (Pn216) con anhídrido glutárico en D F. El compuesto 6 fue preparado mediante reacción del Compuesto 1 (Pn216) con anhídrido benzoico en acetonitrilo, en la presencia de trietilamina.
Ejemplo 4: Radiomarcado de Tc-99m del Compuesto 3 fEiemplo comparativo!. Una alícuota de 0.1 mi de Compuesto 3 disuelta en H20 (1 mg/ml) fue transferida a un frasco de vidrio de 1 0ml llenado con nitrógeno junto con solución salina desoxigenada (0.9% p/v, 1 mi) y 0.035 mi de NaOH acuoso (0.1 M). A esta solución se adicionó levigado de generador de tecnecio (1 ml, aprox. 0.4GBq) y entonces solución acuosa de cloruro estañoso (0.1 mi, ca.10µg). El pH de marcado fue 9.0-1 0.0. . Los frascos fueron incubados a temperatura ambiente de laboratorio ( 1 5-25°C) durante 30 minutos para efectuar el marcado. La preparación resultante fue ya sea diluida a la concentración radiactiva deseada o la purificación de H PLC fue realizada (Sistema B) para remover el material de inicio sin marcar y las impurezas radioactivas antes de la prueba. Después de la purificación, el solvente orgánico fue removido a vacío y la muestra se volvió a disolver en aproximadamente 5 mi de amortiguador de fosfato 0. 1 M pH 7.4 para dar una concentración de trabajo de 6-9MBq/ml . La pureza radioquím ica fue valorada antes de usarse medíante el sistema de cromatografía de capa fina (TLC) descrito a continuación: i) ITLC SG 2cm x 20cm levigado con 0.9% p/v de solución salina ii) Whatman No. 1 2cm x 20cm levigado con 50: 50 v/v aceton ítrilo: H20 Los substratos marcados permanecen a, o cerca de, el origen en el sistema de TLC (i) y se mueven cerca al frente de solvente en el sistema (ii).
Ejemplo 5: Sistemas de HPLC. Velocidad de flujo: 1 ml/min en todos los sistemas y TFA=ácido trifluoroacético. Sistema A Columna Waters C1 8 250x4.5mm Tamaño de partícula 4 mieras Gradiente: Perfil de levigación 1 0-60%B en 25 min . Levigante A:0. 1 % TFA acuoso Levigante B:0.1 % TFA en acetonitrilo. Sistema B Columna Waters Novapak C 18 1 50x3.9mm Tamaño de partícula 4 mieras Gradiente: Perfil de levigación 0-1 00%B en 22 min. Levigante A: 0.1 % TFA acuoso Levigante B:0.1 % TFA en acetonitrilo Sistema A Columna Phenomenex C 1 8 25x0.46mm, 5µ?? ; Gradiente: Perfil de levigación 16-40%B de 0 a 20 min, 40-90%B de 20- 22min, 90%B 22-30min, entonces 90-1 6%B de 30-31 m in . La columna es re-equ ilibrada entonces en 1 6B durante 14 min .
Levigante A:0.05% TFA en agua. Levigante B:0.04% TFA en acetonitrilo. Sistema J Colum na Phenomenex C1 8 (2) Luna 25 x 4.6 cm, 5 µ?? ; Gradiente: Perfil de levigación 16-40%B de 0 a 20 minutos, 40-1 6%B de 20-22 minutos. La columna es re-equilibrada en 1 6B durante 8 minutos. Levigante A:0.05% TFA acuoso Levigante B:0.05% TFA en acetonitrilo.
El análisis mediante Sistema J de H PLC (Ejemplo 5) de un conjunto secado por congelación reconstituido (lote 58, Ejemplo 6), mostró un RCP de 94% usando el Sistema J (técnica anterior) , pero un RCP de 90% usando el Sistema H (presente invención) - ver Figura 3.
Ejemplo 6: Preparación de conjuntos liofilizados Aproximadamente 90% del volumen total de agua para inyección (WFI) fue colocado en el recipiente de preparación y se desoxigenó mediante purga con nitrógeno. Se adicionaron ácido metilen difosfónico, dihidrato de cloruro estañoso, Compuesto 3 (como la sal de acetato), trihidrato de acetato de sodio y ácido p-aminobenzoico, sal de sodio, permitiendo a su vez que cada uno se disolviera mientras que continuaba la purga con nitrógeno. La purga con nitrógeno de la solución fue reemplazada con un flujo de nitrógeno sobre el espacio superior de la solución. Entonces se adicionaron carbonato ácido de sodio y carbonato de sodio anhidro, o carbonato ácido de sodio solo, y se perm itió que se disolvieran. La solución de carga fue ajustada entonces a 1 00% del volumen final (~5 litros) con WFI desoxigenado. La solución de carga fue filtrada entonces a través de un filtro estéril de 0.2 µ?t? en el recipiente de llenado. El espacio superior del recipiente de llenado fue purgado con nitrógeno fiirado (0.2 µ?t?) estéril o argón durante la duración de la operación de llenado. Se dispensaron asépticamente al ícuotas de 1 .0 mi en frascos. Los frascos fueron medio tapados con cierres A, B o C y se transfirieron a repisas de secador por congelación pre-enfriadas. Los frascos fueron liofilizados entonces, retro-llenados con gas nitrógeno filtrado (0.2 µ?t?) estéril , tapados y sellados.
Tabla 2: Formulaciones de conjunto donde Cierre A = PH701 /45 AS café rojizo; cierre B = 4023/50 1083 gris; C = 4432/50 1 178 g ris. * lote 33 contenía 2 mg de NaCI como relleno, ** lote 33 contenía 25 µg de dihidrato de Na-tartrato como un transquelante, *** lotes 86, 87, 88, 94, 98 y formulación 82/4 usaron 36 g de SnCI2.2H20 equivalente a 30 µg de SnCI2 anhidro Ejemplo 7: preparación de complejos de 33mTc a partir de conjuntos i liofilizados Los conjuntos secados por congelación del Ejemplo 6 fueron reconstituidos con 99mTc-pertecnetato (2 - 8 m i de levigado de generador de tecnecio; 0.5 - 2.5 GBq) . La solución fue calentada en un baño de agua a 60°C durante 1 0 minutos y entonces se permitió que permaneciera a temperatura ambiente. La pureza radioquímica fue determinada mediante el método de HPLC descrito en el Ejemplo 5 Sistema H (ver la Figura 2) y el RHT fue determinado mediante el método de ITLC descrito a continuación: ITLC SG 2 cm x 20 cm levigó con una solución 50:50 (v/v) de metanohacetato de amonio ( 1 M) . La especie radiomarcada basada en ligando se mueve al frente de solvente. RHT es retenido en el origen. Las soluciones fueron analizadas mediante el Sistema H de HPLC y los resultados están dados en la Tabla 3 a continuación, donde el %RCP es la pureza radioquím ica del complejo de 99nTc termodinám ico.
Tabla 3: Análisis de HPLC de complejos de † Se cree q ue RC P variable se debe a las variaciones en el calentamiento.
Ejemplo 8: Efecto de molécula enfocadora sobre el contenido de complejo lipofílico de 99mTc Las preparaciones de conjunto secado por congelación se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 6, para varias moléculas enfocadoras (Z), usando la Formulación de Lote 63 (Ejemplo 6). Los resultados son mostrados en la Tabla 4 para prueba de tres frascos del lote después de la reconstitución y análisis como para el Ejemplo 7: Tabla 4: Efecto de Z sobre el contenido de complejo lipofilco de Ejemplo 9: Efecto de radioprotector sobre las preparaciones de complejo de 99mTc El efecto del radioprotector para-aminobenzoato de sodio (Na-PABA) sobre la pureza de las preparaciones de com plejo de 99mTc fue estudiado -tanto en solución y como preparaciones de conjunto secadas por congelación . Todas las preparaciones se hicieron en frascos 1 0R con cierres 1 083 4023/50 grises, a la concentración radioactiva final (RAC) de 0.5 GBq/m l. Las preparaciones fueron analizadas a varios tiempos postreconstitución (PR) usando el Sistema H de HPLC y los resultados están dados en la Tabla 5 como porcentajes de la composición rad ioactiva.
Tabla 5: Análisis de marcado para preparaciones conteniendo PABA Lote Na TiemEspecies de complejos de 99mTc (%) pABA po RHT BamTc04- Otros comKin Pre- Td PostLp (ng/ PR plejos hidrofí- pico picos frasco) (min) licos 0 30 0.7 0 0.6 11.1 1.8 86.1 0 0.1 87 0 240 0.7 3.5 0.6 4.4 2.1 88.9 0.6 0 0 480 0.4 7.1 0.7 2.6 2.3 86.5 0.7 0 87 + 25 30 0.5 0.1 0.5 1.9 2.1 93.1 1.8 0 pABA 25 330 0.6 1.6 0.6 1.3 2.2 93.8 0.3 0 25 30 0.6 0 0.5 4.3 2.1 92.4 0.3 0.2 93 25 300 0.5 1.3 0.5 2.9 2.2 92.2 0.6 0 25 480 Np 4.6 0.7 3 3.1 87.2 0.7 0.1 87 50 30 0.8 0 0.4 1.7 2.2 92.3 3.1 0 + 50 240 1 0 0.5 0.7 1.8 94.7 2.3 0 pABA 50 480 0.6 0.7 0.5 1.3 2 93.2 2.4 0 50 30 0.7 0 0.8 1.6 2.1 95.2 0.2 0.1 94 50 300 0.6 0.9 0.4 1.1 1.9 95.1 0.4 0 50 480 Np 1.9 0.9 2.5 1.9 91 0.8 0.2 87 100 30 Np 0.1 0.8 0.5 1.9 93.2 3.4 0 + 100 300 0.7 0 0.4 0.3 2 95.2 2 0 pABA 100 480 0.7 0.7 0.6 0.3 2 94 2.1 0 200 30 0.6 0.2 0.3 0.4 2.1 96 0.2 0.6 86 200 240 0.9 0 0.5 0.2 2.1 93.3 2.9 0.7 200 480 0.8 0.6 0.5 0.3 1 .8 96.5 0.3 Np = análisis no realizado, Td = producto termodinám ico (pico principal), Kin = complejos ci néticos, Lp = complejos lipofílicos.
Ejemplo 10: Efecto de cierres en RCP v complejos lipofílicos de 89mTc El efecto de cierre de frasco sobre radiomarcado fue estudiado para varias formulaciones de conjunto liofilizado. Los conjuntos liofilizados producidos usando dos cierres de hule diferentes (West Pharmaceutical Services) fueron reconstituidos de acuerdo con el método expuesto en el Ejemplo 7. Las diferencias en RCP e im purezas radiomarcadas fueron notadas (ver Tabla 6, la cual muestra el promedio de 10 determinaciones de RCP): Tabla 6: Efecto de cierre en RC P y complejos lipofílicos de •Calentado a 90°C durante 1 0 minutos en un bloque calentador.
Ejemplo 11 : Efecto de contenido de complejo de tecnecio llpofílico sobre la biodistribución Se realizaron experimentos en ratas Wistar macho normales (peso corporal 1 50-250g) y las disecciones se realizaron a 1 hora después de la inyección intravenosa de preparaciones de 98mTc-Compuesto 3. Las últimas fueron preparadas a partir de una formulación de conjunto liofilizado, descrito como Lote #58 (ver Ejemplo 6 para detalles), y fueron ya sea no calentadas o calentadas durante diferentes tiempos a 90°C y se enfriaron a ambiente antes de la administración. El análisis de HPLC usando el Sistema H (Ejemplo 5) confirmó los diferentes niveles de impurezas lipofílicas mostradas en la Tabla 6 (a continuación). Los datos de biodistribución fueron calculados para cada preparación de órgano/tejido. Los datos fueron reportados para cada animal individual y el promedio y desviación estándar del grupo de tres. Se aplicó una prueba de análisis varianza de de factor simple/una vía de (ANOVA) o una prueba t de Student de dos colas, no emparejadas (2 muestras, varianza desigual) a estos datos usando un paquete de hojas extendidas Microsfot Excel 97 SR-2. Los resultados fueron considerados significativamente difentes si el valor p fue menor que 0.05. Los resultados están dados en la Tabla 7: Tabla 7: % promedio de dosis inyectada (con desviaciones estándar) para preparaciones calentadas durante varios lapsos de tiempo (0-45 min @90°C) .
Ejemplo 12: Efecto de sal de ácido débil sobre el contenido de complejo de tecnecio lipofílico v biodistribución Los cambios en la biodistribución provocados por la adición de trihidrato de acetato de sodio a la formulación fueron evaluados mediante la comparación de los lotes de conjunto liofilizado números 58 y 65. Los estudios de reconstitución y biodistribución de conjunto fueron realizados entonces como para el Ejemplo 10. Estos datos fueron analizados mediante el uso de una prueba t de Student de 2 colas, no emparejadas. Existió u n decremento significativo (pZOI05) en la retención en sangre de radioactividad (2.95 a 2.12%) y además un decremento significativo en la radioactividad asociada con h ígado (p<0.05) desde 6.1 0% hasta 2.82%.
Tabla 8: % promedio de dosis inyectada (con desviaciones estándar) para formulaciones con o sin trihidrato de acetato de sod io Lote # 58 65 (Preparación) (15093) (1 5160) Formulación Sin acetato Con acetato Contenido lipofílico 3.1 % 1 .0% Organo Promedio S. D. Promedio S. D. Peso animal 179.28 4.86 1 63.72 12.31 Hueso 0.98 0.03 0.70 0.02 Músculo 2.87 0.03 2.90 0.17 Sangre 2.95 0.08 2.12 0.02 Ríñones 18.52 0.71 21 .37 1 .00 Vejiga & orina 61 .66 0.85 61 .23 2.43 Pulmón 0.23 0.01 0.1 6 0.04 H ígado 6.1 0 0.38 2.82 0.09 Bazo 0. 1 6 0.01 0.07 0.00 Estómago 0. 1 5 0.04 0.39 0.40 SI , Ll & heces 2.48 0.43 3.27 1 .50 Corazón 0.06 0.00 0.06 0.01 Tiroide 0.03 0.00 0.03 0.01 Cadáver 3.81 0.26 4.90 0.26 Sitio de inyección 0.73 0.02 0.82 0.12 Ejemplo 13: Comparación de la captación de coágulo en un modelo de rata de tromboembolismo venoso Se estudiaron preparaciones con variaciones conocidas en complejos de Tc lipofílicos (lotes 58 y 65 - ver Ejemplo 7) . De esta manera , las ratas (Wistar macho, 250-350g) fueron anestesiadas con 1 5% de uretano. Después de la laparotom ía, la vena cava fue aislada y liberada de tejido graso circundante. Una alambre de platino ( 1 .5 cm x 0.5 mm) fue insertado en la vena cava inferior y 5 m inutos después se inyectó de manera intravenosa 0.4 mi de ácido elág ico (1 .2 x 1 0~4 M) a través de la vena femoral para iniciar la formación de coágulo. 60 minutos después, 0.1 m l (50MBq por animal) de ya sea el lote 58 o 65 (preparados como para el Ejemplo 7), fue inyectado vía la misma vena y después de unos 60 minutos adicionales, los animales fueron sacrificados y el coágulo removido, pesado y contado. Otros tejidos, por ejemplo, sangre, pulmón, corazón , también fueron disecados y contados. La captación de rastreador en el coágulo fue determinada como la concentración relativa (cpm/g de coágulo por dosis/g de animal) y coágulo a tejido de soporte. El peso promedio de los coágulos formados en este modelo fue alrededor de 27 mg , n=32 (5-50mg de rango). La concentración relativa de radioactividad en el coágulo fue 8.01 (n=4, SD=3.33) para el lote 58 y 7.49 (n=4, SD= 1 .84) para el lote 65.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Una composición de complejo de tecnecio, la cual comprende complejo de metal del radioisótopo *Tc con un ligando de Fórmula (I): (I) donde: cada R y R2 es independientemente un grupo R; x es 94m, 99 o 99m ; Y es -(A)n-Z donde: Z es una porción enfocadora biológica de peso molecular menor que 5,000; -(A)n- es un grupo enlazador donde cada A es independientemente -CO-, -CR2-, -CR=CR-, -C=C-, -CR2C02-, -C02CR2-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -N R(C=0)NR-, NR(C=S)NR-, -S02NR-, -NRS02-, -CR2OC R2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, un grupo cicloheteroalquileno de C4.8, un grupo cicloalquileno de C4-8, un grupo arileno de C5- 2l o un grupo heteroarileno de C3- 12 o una porción de polialquilenglicol, ácido poliláctico o ácido poliglicólico; n es un entero de valor 0 a 10; cada grupo R es independientemente H o alquilo de ?1-10, alquilarilo de C3-10, alcoxialquilo de C2.10, hidroxialquilo de Ci.i0, fluoroalquilo de C1. 10, o 2 o más grupos R, junto con los átomos a los cuales están unidos forman un anillo carbocíclico, heterocíclico, saturado o insaturado; en donde: (i) menos de 10% del xTc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de "Te transientes del ligando de Fórmula I; y (ii) menos de 5% del Tc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de Tc lipof ilicos del ligando de Fórmula I. 2. La composición de complejo de tecnecio de la reivindicación 1, en donde menos de 5% del xTc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de Tc transientes del ligando de Fórmula I. 3. La composición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 o 2, en donde menos de 3% del Tc presente en la composición de complejo de tecnecio comprende complejos de xTc lipof ilicos del ligando de Fórmula I. 4. La composición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 a 3, donde x es 99m. 5. La composición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 a 4, donde Z es un péptido de 3 a 20 aminoácidos. 6. La composición de complejo de tecnecio de la reivindicación 5, en donde el péptido de 3 a 20 aminoácidos es un fragmento de <x2-antiplasmina. 7. La composición de complejo de tecnecio de la reivindicación 6, en donde el fragmento de a2-antiplasmina com prende el tetrapéptido Asn-GIn-Glu-GIn. 8. La composición de complejo de tecnecio de la reivindicación 7, en donde el fragmento de a2-antiplasmina comprende el péptido: Asn-GIn-Glu-GIn-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly, donde Xaa es Tyr o l-Tyr. 9. La composición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 a 8, en donde Y es -CH2CH2-NR-(A)n,-Z1 donde m es un entero de valor 0 a 5. 1 0. La composición de complejo de tecnecio de las reivind icaciones 1 a 9, donde cada R1 es independientemente alquilo de Ci-3, alcoxialquilo de C2.4 , hidroxialquilo de C1 -3 o fluoroalquilo de C1 -3. 1 1 . La com posición de complejo de tecnecio de las reivind icaciones 1 a 1 0, donde el ligando es de Fórmula (I I ) : donde: cada R1 es independientemente alquilo de C 1.3 o fluoroalquilo de Ci -3; y p es un entero de valor 0 a 3. 1 2. La composición de complejo de tecnecio de la reivindicación 1 1 , donde (A)p es -CO- o -N R-. 13. La composición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 1 y 12 , donde cada R1 es CH3 y (A)p es N H y Z es Ac-Asn-GIn-Glu-GIn-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly, donde Xaa es Tyr o l-Tyr y Ac es N-acetilo. 14. La composición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 a 13, la cual comprende además un radioprotector. 15. La composición de complejo de tecnecio de la reivindicación 14, donde el radioprotector es ácido para-aminobenzoico o una sal biocompatible del m ismo. 16. Un radiofarmacéutico, el cual comprende la com posición de complejo de tecnecio de las reivindicaciones 1 a 1 5 en una forma adecuada para administración a mamífero. 17. El radiofarmacéutico de la reivindicación 1 6, donde xTc es 99mTc. 18. Un conjunto para la preparación del radiofarmacéutico de tecnecio de las reivindicaciones 16 o 17, el cual comprende: (i) el ligando de Fórmula (I) de la reivindicación 1 ; (ii) un agente reductor biocompatible, (iii) un ácido orgánico débil o u na sal del mismo con un catión biocompatible. 19. El conjunto de la reivindicación 18, en donde el ligando es como se define en las reivindicaciones 5 a 1 0. 20. El conjunto de la reivindicación 1 9, donde el ligando es de Fórmula I I como es definido en las reivindicaciones 1 1 a 1 3. 21 . El conjunto de las reivi ndicaciones 1 8 a 20, el cual comprende además un agente ajustador de pH . 22. El conjunto de las reivindicaciones 1 8 a 21 , en donde el agente reductor biocompatible comprende estaño. 23. El conjunto de las reivindicaciones 1 8 a 22, en donde el ácido orgánico débil es ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido glucónico, ácido glucoheptónico, ácido benzoico, un fenol o un ácido fosfónico. 24. El conjunto de las reivindicaciones 1 8 a 23, el cual comprende además un radioprotector. 25. El conjunto de la reivindicación 24, en donde el radioprotector comprende ácido para-aminobenzoico o una sal biocompatible del mismo. 26. El conjunto de las reivindicaciones 1 8 a 25, el cual es liofilizado. 27. El conjunto de las reivindicaciones 1 8 a 26, el cual comprende: (i) el ligando de fórmula I I de la reivindicación 1 3; (ii) un agente reductor biocompatible, el cual comprende estaño; (iii) un ácido orgán ico débil o sal del mismo con un catión biocompatible, el cual comprende ácido metilend ifosfónico; (iv) un radioprotector, el cual comprende ácido para-aminobenzico o una sal biocompatible del mismo; (v) un agente ajustador de pH, el cual comprende bicarbonato de sodio. 28. Un método para imagenolog ía diagnóstica de trom bos usando el radiofarmacéutico de la reivindicación 1 6, en donde la composición de complejo de tecnecio es como se define en las reivi ndicaciones 6 a 8.
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