KR20050070080A - Ｔｃ 복합체와 표적화 잔기의 접합체 및 ＭＲＩ 진단에서의그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개선된 아자-디아민디옥심 리간드의 ^99mTc 방사선금속 복합체 조성물, 그를 함유하는 방사성약물 제제, 및 방사성약물의 제조를 위한 키트에 관한 것이다. 아자-디아민디옥심-표적화 분자 킬레이트화제 접합체의 테크네튬 금속 복합체화 화학은 다수의 테크네튬 종을 발생시키는 것으로 나타난다. 본 발명은 덜 바람직한 테크네튬 종의 존재를 억제한, 개선된 아자-디아민디옥심 접합체 테크네튬 금속 복합체 조성물을 제공한다.

Description

Ｔｃ 복합체와 표적화 잔기의 접합체 및 ＭＲＩ 진단에서의 그의 용도{Conjugtes of Tc Complexes and Targeting Moieties and Their Use in MRI Diagnostic}

본 발명은 개선된 ^99mTc 방사선금속 복합체 조성물, 그를 함유하는 방사성약물 제제, 및 방사성약물의 제조를 위한 키트에 관한 것이다.

US 5395608은 ^99mTc, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ⁵⁷Co, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁹⁷Ru, ¹¹¹In, ^113mIn, ⁶⁷Ga 및 ⁶⁸Ga를 비롯한 광범위한 방사성동위원소의 방사선금속 복합체의 제조를 위한 다양한 잠재적 다섯자리 아자-디아민디옥심 리간드를 개시하였다. 매달린 아릴 스페이서 기를 갖는 2관능성 아자-디아민디옥심 리간드가 개시되었으며, US 5395608의 실시예 3에는 하기 화학식 A의 화합물이 기재되었다.

상기 식에서, Ar은 4-아미노벤질이다.

US5395608은 상기 킬레이트화제의 방사선표지를 넓은 용어로 기술하고 있으나 방사선금속 ^99mTc를 이용한 표지에 대해서는 어떠한 구체적 실시예도 제공하고 있지 않다.

문헌[Pillai et al., J. Nucl. Med. Biol., 38, 527-31 (1994)]는 Ar이 벤질인 화학식 A의 아자-디아민디옥심 유사체의 ^99mTc 표지를 기술하였다. ^99mTc 표지는 실온에서 실시되었고, HPLC 결과는 단지 하나의 ^99mTc 종만을 나타냈다. 아자-디아민디옥심과 표적화 분자의 접합체는 기술되지 않았다.

WO 99/60018는 혈전 조영(imaging)을 위한, 아자-디아민디옥심 리간드와 펩티드의 킬레이트 접합체를 개시하였다. 펩티드는 효소 트랜스글루타미나제(즉, 인자 XIIIa)용 기질이다. 바람직한 상기 킬레이트화제 접합체는 하기 화학식의 아자-디아민디옥심으로 언급된다.

상기 식에서, 펩티드는 α₂-항플라스민 또는 카세인의 단편이다.

본 발명

본 발명자들은 드디어 상기 아자-디아민디옥심-표적화 분자 킬레이트 접합체의 테크네튬 금속 복합체화 화학이 다수의 테크네튬 종을 발생시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 덜 바람직한 테크네튬 종이 억제된, 개선된 아자-디아민디옥심 접합체 테크네튬 금속 복합체 조성물을 제공한다.

따라서, 아자-디아민디옥심 킬레이트화제 접합체는 ^xTc(여기서, x는 94m, 99 또는 99m이다)와의 킬레이트화 시 수 개의 테크네튬 종을 형성하는 것으로 밝혀졌다. 이들 다수의 ^xTc 금속 복합체 종은 크로마토그래피에 의해 분리 및 검출될 수 있다. 다수의 테크네튬 종 중 수 개는 동역학적(kinetic) 생성물, 즉, 시간이 지남에 따라 (임의로는 가열시) 전환되어 안정한 생성물을 형성하는 일과성(transient) 종이다. 동역학적으로 선호되는(일과성인) 복합체로부터 최후 종으로의 전환율은 pH 의존적이며, pH 9.5에서는 2 내지 3 시간을 요하는 반면 pH 10.5에서는 일반적으로 60 분이면 충분하다. 반응은 가열에 의해 가속될 수 있다. 이들 다수의 ^xTc 복합체 종의 일부는 친지질성이고, 방사성약물의 생체분포(biodistribution)에 부정적 영향을 미칠 수 있음이 또한 밝혀졌다. 본 발명은 상기 동역학적 종 및 친지질성 종의 수준을 최소화 및 조절함으로써 전체적인 조영 특성을 개선시킨 테크네튬 복합체 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 조절된 ^xTc 복합체 생성물 조성물을 보다 신속하고 재현가능한 방식으로 제조하고 품질을 조절할 수 있도록, 목적하는 안정한 생성물로의 전환을 최적화하는 방법론을 제공한다.

본 발명은 또한 개선된 테크네튬 복합체 조성물을 포함하는 방사성약물 및 그러한 방사선 의약품의 제조를 위한 비-방사성 키트 제형을 제공한다.

제1면에서, 본 발명은 방사성동위원소 ^xTc와 하기 화학식 I의 리간드의 금속 복합체를 포함하며, 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 10％ 미만이 화학식 I의 리간드의 일과성 ^xTc 복합체를 포함하는 테크네튬 복합체 조성물을 제공한다.

상기 식에서,

각 R¹ 및 R²는 독립적으로 R기이고;

x는 94m, 99 또는 99m이고;

Y는 -(A)_n-Z이고;

여기서, Z는 분자량이 5,000 미만인 생물학적 표적화 잔기이고;

-(A)_n-는 링커 기(linker group)이며, 여기서, 각 A는 독립적으로 -CO-, -CR₂-, -CR=CR-,-C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, C_4-8 시클로헤테로알킬렌기, C_4-8 시클로알킬렌기, C_5-12 아릴렌기, 또는 C_3-12 헤테로아릴렌기 또는 폴리알킬렌글리콜, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산 잔기이고; n은 0 내지 10의 정수이고;

각 R기는 독립적으로 H 또는 C_1-10 알킬, C_3-10 알킬아릴, C_2-10 알콕시알킬, C_1-10 히드록시알킬, C_1-10 플루오로알킬, 또는 2개 이상의 R기와 이들이 부착된 원자가 형성한 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리이다.

따라서, 본 발명의 적합한 방사성동위원소 ^xTc는 양전자 방사체 ^94mTc, 베타 방사체 ⁹⁹Tc, 또는 γ-방사체 ^99mTc이다. 바람직하게는 x는 99m이고, 따라서, 방사성동위원소는 바람직하게 ^99mTc이다.

용어 "리간드"는 아자-디아민디옥심 킬레이트화제와 생물학적 표적화 분자 (Z)의 접합체를 의미한다. 리간드는 생물학적 표적화 분자에 접합된 방사성동위원소 ^xTc의 아자-디아민 디옥심 금속 복합체를 형성하도록 디자인된다.

용어 "생물학적 표적화 잔기"는 선형 펩티드 또는 환형 펩티드 또는 이들의 조합일 수 있는 3 내지 100-머(mer) 펩티드 또는 펩티드 유사체; 또는 효소 기질 또는 억제제; 합성 수용체-결합성 화합물; 올리고뉴클레오티드, 또는 올리고-DNA 또는 올리고-RNA 단편을 의미한다. 생물학적 표적화 잔기는 합성된 것이거나 천연적인 것일 수 있으나, 바람직하게는 합성된 것이다. 본 발명의 적합한 생물학적 표적화 잔기이 분자량은 5,000 달톤 미만, 바람직하게는 200 내지 3,000 달톤 범위, 가장 바람직하게는 300 내지 2,000 달톤 범위이며, 400 내지 1,500이 특히 바람직하다.

용어 "환형 펩티드"는 2개의 말단 아미노산이 펩티드 또는 디술피드 결합 또는 합성 비-펩티드 결합, 예컨대 티오에테르, 포스포디에스테르, 디실록산 또는 우레탄 결합일 수 있는 공유결합에 의해 함께 결합된 5 내지 15개의 아미노산 서열을 의미한다.

용어 "아미노산"은 천연적으로 존재하거나 또는 순전히 합성된 것일 수 있고, 광학적으로 순수한 단일 거울상체이어서 키랄성일 수 있거나, 또는 거울상체의 혼합물일 수 있는 L- 또는 D-아미노산, 아미노산 유사체 또는 아미노산 모방체(mimetic)를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 아미노산은 광학적으로 순수하다. 용어 "아미노산 모방체"는 동배체(isostere)인, 즉, 천연 화합물의 입체적 및 전자적 구조를 모방하도록 디자인된, 천연적으로 존재하는 아미노산의 합성적 유사체를 의미한다. 그러한 동배체는 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있고, 뎁시펩티드(depsipeptide), 리트로-인베르소(retro-inverso) 펩티드, 티오아미드, 시클로알칸 또는 1,5-디치환된 테트라졸이 있으나 이에 한정되지는 않는다 (문헌 [M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)] 참조).

적합한 효소 기질 또는 억제제로는 글루코스 및 글루코스 유사체, 예컨대 플루오로데옥시글루코스, 지방산 또는 엘라스타제(elastase) 억제제가 포함된다. 적합한 효소 기질 또는 억제제는 생물학적 표적화 펩티드일 수 있다(이하 설명함).

적합한 합성 수용체-결합성 화합물에는 에스트라디올, 에스트로겐, 프로게스틴, 프로게스테론 및 다른 스테로이드 호르몬; 도파민 D-1 또는 D-2 수용체 또는 트로판과 같은 도파민 전달체를 위한 리간드; 세로토닌 수용체를 위한 리간드가 포함된다.

본 발명의 적합한 생물학적 표적화 펩티드는 3 내지 20-머 펩티드(즉, 아미노산 3 내지 20개를 포함하는 펩티드), 바람직하게는 4 내지 15-머, 가장 바람직하게는 5 내지 14-머의 상기 단편이다. 펩티드는 환형 또는 선형 또는 이들의 조합일 수 있다. 펩티드는 합성적 또는 천연적일 수 있으나 바람직하게는 합성적인 것이다. 그러한 펩티드로는 다음이 포함된다.

- 소마토스타틴, 옥트레오티드(octreotide) 및 유사체

- 라미닌 단편, 예컨대 YIGSR, PDSGR, IKVAV, LRE 및 KCQAGTFALRGDPQG,

- 백혈구 축적 부위를 표적화하기 위한 N-포르밀 펩티드,

- 혈소판인자 4 (PF4)의 단편,

- RGD-함유 펩티드,

- 효소 트랜스글루타미나제 (인자 XIIIa)용 기질인, α₂-항플라스민, 섬유결합소 또는 베타-카세인, 섬유소원 또는 트롬보스폰딘(thrombospondin)의 펩티드 단편. α₂-항플라스민, 섬유결합소, 베타-카세인, 섬유소원 및 트롬보스폰딘은 다음 참고문헌에서 찾아볼 수 있다. 즉, α₂-항플라스민 전구체는 문헌 [M. Tone et al., J. Biochem, 102, 1033, (1987)]; 베타-카세인은 문헌[L. Hansson et al., Gene, 139, 193, (1994)]; 섬유결합소는 문헌[A. Gutman et al., FEBS Lett., 207, 145, (1996)]; 트롬보스폰딘-1 전구체는 문헌 [V. Dixit et al., Proc, Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5449, (1986); R.F. Doolittle, Ann. Rev. Biochem., 53, 195, (1984)]에서 찾아볼 수 있다.

생물학적 표적화 잔기가 펩티드인 경우, 펩티드 말단 중 하나 또는 둘 다는 적합한 대사 억제성 기로 임의로 보호될 수 있다. 용어 "대사 억제성 기"는 펩티드 또는 아미노 또는 카르복실 말단의 아미노산의 생체내 대사을 억제하거나 또는 저해하는 생체적합성(biocompatible) 기를 의미한다. 그러한 기는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 펩티드 아민 말단을 위해서는, 아세틸, Boc (여기서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐이다), Fmoc (여기서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다), 벤질옥시카르보닐, 트리플루오아세틸, 알릴옥시카르보닐, Dde[즉, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸] 또는 Npys(즉, 3-니트로-2-피리딘 술페닐) 중에서 적합하게 선택한다. 펩티드 아민 말단의 대사 억제는 또한 아민 말단을 아자-디아민 디옥심 킬레이트화제에 부착시킴으로써 달성될 수도 있다. 펩티드 카르복실 말단을 위한 적합한 대사 억제성 기로는 카르복사민, tert-부틸 에스테르, 벤질 에스테르, 시클로헥실 에스테르, 아미노 알콜 또는 아자-디아민 디옥심 킬레이트화제로의 부착이 포함된다. 바람직하게는, 대사 억제성 기 중 적어도 하나는 아자-디아민 디옥심 킬레이트화제이도록 선택한다.

펩티드의 카르복실 말단은 카르복시펩티다제 효소에 의한 생체내 절단에 특히 약하다. 결국, 아자-디아민디옥심 킬레이트화제를 바람직하게는 카르복실 말단에 부착시킨다. 펩티드가 환형 펩티드를 포함할 경우, 대사 억제성 기는 환형 펩티드 고리를 폐쇄하는 공유결합일 수 있다.

본 발명의 바람직한 생물학적 표적화 펩티드는 α₂-항플라스민 또는 카세인의 3 내지 20-머 펩티드 단편, 가장 바람직하게는 4 내지 15-머, 특히 5 내지 14-머의 상기 단편이다. 본 발명의 바람직한 α₂-항플라스민 또는 카세인 펩티드는 하나 이상의 대사 억제성 기, 및 다음 중 어느 하나의 N-말단으로부터 취한 아미노산 서열을 포함한다.

(i) α ₂ -항플라스민

즉, NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH

또는 이것에서 하나 이상의 아미노산을 교환, 추가 또는 제거한 변형, 예컨대

NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH,

NH₂-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH,

NH₂-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH, 또는

(ii) 카세인

즉, Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-Ile-Gly.

본 발명의 특히 바람직한 α₂-항플라스민 펩티드는 4개의 아미노산 서열 Asn-Gln-Glu-Gln (NQEQ)를 포함하는 펩티드 단편이다. 가장 특히 바람직한 상기 α₂-항플라스민 펩티드는 하기 서열을 갖는다.

Asn-Gln-Glu-Gln-Gal-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly

여기서, Xaa는 Tyr 또는 I-Tyr (즉, 요오도-티로신)이다.

상기 바람직한 α₂-항플라스민 펩티드는 바람직하게는 펩티드의 양 말단 모두에 대사 억제성 기를 가지며, 이 때, 아자-디아민디옥심이 대사 억제성 기들 중 하나이다. 이 경우, 아자-디아민디옥심 킬레이트화제는 바람직하게는 카르복시 말단에 부착되고, N-말단은 대사 억제성 기, 바람직하게는 N-아세틸기에 의해 보호되어 α₂-항플라스민 펩티드가 바람직하게는 하기 서열을 갖게 된다.

Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly

여기서, Xaa는 Tyr 또는 I-Tyr (즉, 요오도-티로신)이다.

용어 "플루오로알킬"은 불소 치환기가 하나 이상인 알킬기를 의미하며, 따라서 이 용어는 모노플루오로알킬(예컨대, -CH₂F) 내지 퍼플루오로알킬(예컨대, CF₃)의 기를 포함한다.

본 발명자들은 목적하는 테크네튬 종 이외에, 아자-디아민디옥심 리간드가 화학식 I의 리간드의 일과성 ^xTc 복합체로서 분류되는 다른 테크네튬 복합체를 형성한다는 것을 발견하였다. 본 발명의 테크네튬 복합체 조성물은 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 10％ 미만이 화학식 I의 리간드의 일과성 ^xTc 복합체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 "일과성 ^xTc 복합체"는 화학식 I의 리간드와의 동역학적으로 선호되는 테크네튬 금속 복합체화 반응 생성물이다. 이들은 특성상 일과성이므로, 주변 조건하에서, 목적하는 열역학적으로 안정한 최후의 화학적 복합체화 반응 생성물로 서서히 전환된다. 일과성 ^xTc 복합체의 화학 구조는 알려지지 않았으나, 화학식 I의 리간드의 -NY- 잔기의 교두보 질소 원자가 테크네튬과 배위된 것으로 생각된다. 그러한 배위에서는 아마도 아자-디아민디옥심 리간드가 다섯자리 리간드(즉, 디옥심트리아민 공여체 군을 가짐)로서 작용하거나, 또는 모노옥소 코어(즉, Tc=O³⁺ 코어)를 갖는 Tc(V) 복합체 중의 옥심기 하나가 비배위된 네자리 킬레이트화제로서 작용할 것이다. -NY- 질소 원자가 비배위된 열역학적 생성물의 8원의 킬레이트 고리 크기에 비해, -NY- 질소 원자가 배위될 때에는 더 작은 5원의 킬레이트 고리 크기를 가지므로, 교두보 질소 원자에 의한 상기 배위가 동역학적으로 선호될 것이다.

특히 방사성약물 적용에서는, 시간에 따라 정확한 조성이 변화하는 다수의 테크네튬 종의 존재는 확실히 바람직하지 않은데, 이는 투여되는 조성의 재현가능성을 달성하기 어렵고, 각 종이 상이한 생체분포 특성을 가질 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명은 일과성 테크네튬 복합체의 수준을 조절하여 목적하는 열역학적 생성물을 가장 높은 수준의 순도로 얻는 방법을 제공한다. 아자-디아민디옥심 리간드의 테크네튬 복합체의 목적하는 열역학적 생성물은 하기 구조, 즉, Tc(V) 디옥소 복합체이고, 아자-디아민디옥심 리간드는 -NY- 기의 질소가 비배위된 디아민디옥심 금속 공여체 군을 갖는 것으로 생각된다.

상기 식에서, R¹, R² 및 Y는 상기 정의된 바와 같다. 유사-거대환 고리 구조는 일과성 ^xTc 복합체에 비해 열역학적 안정성을 제공하는 것으로 생각된다. Y의 특성이 -NY-의 N 원자가 3차 아민이도록 하는 경우, 이 3차 아민의 상당 부분은 pH 9.0 미만의 수용액에서 3차 아민의 염기성도로 인해 양성자화된다 (pK_a 값은 전형적으로 8 내지 10의 범위이다).

본 발명자들은 목적하는 테크네튬 종 및 일과성 ^xTc 복합체 이외에, 아자-디아민디옥심 리간드가 친지질성 테크네튬 복합체로서 분류되는 다른 테크네튬 복합체를 형성할 수 있다는 것과 그러한 친지질성 복합체는 ^xTc 조성물의 생체분포에 부정적으로 영향을 미칠 수 있음을 발견하였다. 용어 "친지질성 테크네튬 복합체"는 목적하는 아자-디아민디옥심의 열역학적 테크네튬 복합체에 비해 상당히 더 큰 옥탄올 물 분배계수를 갖는, 화학식 I의 리간드와 테크네튬의 아자-디아민디옥심 금속 배위 복합체를 의미한다. 상기 "친지질성 테크네튬 복합체"는 50％ 이하의 유기 용매를 이동상으로 사용할 경우 C18 역상 HPLC에서 정지상에 강하게 결합한다. 따라서, 조성물 중 상기 "친지질성 테크네튬 복합체"의 존재는 이들을 역상-HPLC 분석시 칼럼으로부터 용출시키기 위해 유기 용매 함량이 70％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상인 수성/유기 용매 이동상의 사용을 필요하게 한다.

상기 "친지질성 테크네튬 복합체"는 특히 합성 엘라스토머성 고무로 이루어진 마개를 포함하는 제약 바이알 또는 용기에서 동결건조된 화학식 I의 리간드를 제조하거나, 또는 생물학적 표적화 분자 (Z)가 반응성 친핵성 기, 예컨대 아민-함유 화합물, 특히 1차 또는 2차 아민을 갖는 것(예컨대, 펩티드의 리신 잔기); 티올을 갖는 것(예컨대, 펩티드의 시스테인 잔기), 또는 페놀을 갖는 것(예컨대, 펩티드의 티로신 잔기)일 때에 관찰되기 쉬운 것으로 생각된다. 그러한 환경에서는 합성 고무로부터의 휘발성 비-극성 침출물(leachable)이 합성 마개로부터 감압 제거되고, 저온 동결건조 플러그 상에서 응축될 수 있다. 이어서, 표적화 분자의 친핵성 기와 침출된 화합물의 화학 반응에 의해 보다 친지질성을 갖는 Z 유도체가 형성된다. 그러한 화학 반응은 친핵성 기가 상대적으로 반응성인(즉, 양성자화된 아민과 대립하는 것으로서 유리되거나 또는 보다 많은 티올레이트 또는 페놀레이트 종이 존재함) 알칼리성 pH에서 선호된다. ^xTc 방사선표지를 실시하는 경우, 그 결과는 "친지질성 테크네튬 복합체" 불순물이 관찰된다는 것이다. 동결건조 동안 합성 고무 마개로부터의 다양한 휘발성 비-극성 침출물의 침출은 공지되어 있었으나(문헌[Jahnke et al., Int. J. Pharmaceut., 77, 47-55 (1991) and J. Parent. Sci. Technol., 44(5), 282-288 (1990)] 참조), 이들 침출물이 방사성의약 제제에 미치는 영향은 종전에 보고된 바 없다. 또한, 상기 마개 침출물이 가열 동안, 예컨대 멸균을 위한 오토클레이빙 동안에 발생할 수 있다는 것이 알려져 있으므로(예컨대, 문헌[Danielson J. Parent. Sci. Technol. 46(2), 43-47 (1992)] 참조), 비록 동결건조가 최악의 시나리오이기는 하지만, 생물학적 표적화 분자 (Z)와 상기 침출물과의 반응은 다른 환경에서도 일어날 수 있다고 생각된다.

따라서, 상기 "친지질성 테크네튬 복합체"는 특히 이하 제3 실시양태의 키트와 같이 합성 마개를 갖는 바이알 또는 용기에서 테크네튬 복합체 조성물을 제조할 때, 특히 동결건조를 이용할 경우에 특히 문제가 된다. 본 발명은 마개 재료 및 키트 제형의 적당한 선택에 의해 "친지질성 테크네튬 복합체"를 억제 또는 제어하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 테크네튬 복합체 조성물은, 일과성 ^xTc 복합체 수준이 억제될 뿐 아니라, 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 5％ 미만이 상기 정의된 바와 같은 친지질성 ^xTc 복합체를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 테크네튬 복합체 조성물은 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 3％ 미만이 친지질성 ^xTc 복합체를 포함하는 것이다. 가장 바람직하게는, 상기 친지질성 ^xTc 복합체의 수준은 2％ 미만이며, 1％ 미만이 특히 바람직하고, 0.5％ 미만이 이상적이다.

본 발명은 화학식 I의 리간드의 친지질성 ^xTc 복합체가 바람직하지 못한 생체내 간 흡수(uptake) 및 혈액 보유를 나타냄을 보여준다. 간은 방사성약물 조영을 위한, 특히 폐 또는 심장 조영을 위한 중요한 백그라운드(background) 기관이기 때문에 간 흡수를 최소화하는 것이 중요하다. 표적화 분자 (Z)가 폐 색전(PE)과 같은 폐 내부의 표적 혈전을 표적화하도록 디자인될 경우, 조영 잠재력 또한 응혈을 둘러싼 기관 및 조직(예컨대, 폐, 심장, 혈액 및 간)에서의 방사능에 의해 영향을 받을 것이다.

본 발명의 다양한 테크네튬 아자-디아민디옥심 복합체는 적합한 크로마토그래피법, 예컨대 HPLC, 특히 역상 HPLC, 즉, RP-HPLC에 의해 분리 및 검출할 수 있다. 상기 친지질성 및 동역학적 종의 존재는 이전 연구자들에게 인식되지 않았다. 따라서, 예를 들어 항플라스민 펩티드와의 아자-디아민디옥심 접합체의 초기 HPLC 및 ITLC 분석은 90％를 넘는 공칭 순도, 즉, 만족스러운 순도를 나타내었다. 이어진 생체분포 연구는 방사화학 불순물의 측정량과 불일치하는, 높은 간 보유 수준을 나타냈다. 불순물은 간 흡수를 나타내는 것으로 알려진 RHT(환원된 가수분해 테크네튬)를 포함하였다. RHT는 ITLC에 의해 검출되는 부동 종이다. 추가의 구별을 위한 크로마토그래피 분석은 본 발명의 다수 종을 나타냈다.

RP-HPLC를 이용하면, 일과성 ^xTc 복합체는 열역학적 생성물보다 짧은 머무름 시간을 나타내는 반면, 친지질성 복합체는 열역학적 생성물보다 훨씬 더 긴 머무름 시간을 나타낸다. 따라서, 피크 크기를 수량화(quantification)하면, 주어진 ^xTc 복합체화 반응이 완료까지 진행되었는지, 및 존재하는 친지질성 ^xTc 복합체의 수준을 쉽게 모니터링할 수 있다. 목적하는 열역학적 ^xTc 복합체 생성물의 참 시료(authentic sample)는 주어진 시스템에서, 본 발명에 의해 교시되는 바와 같이 주변 온도(18 내지 25℃)에서의 연장된 복합체화 반응 시간에 의해, 또는 보다 높은 온도에서의 후속 가열에 의해 쉽게 확립시킬 수 있다. 이어서, 상기 참 시료를 사용하여 사용된 특정 크로마토그래피 시스템에서 관찰되는 피크들을 식별할 수 있다.

용어 "logP"는 그의 통상적 의미, 즉, 옥탄올-물 분배계수(P)의 로그이다. 상기 옥탄올-물 분배계수는 광범위한 유기 화합물에 대해 공개되어 있고, 다양한 기술, 예컨대 직접 측정(^99mTc 복합체에 대해서는 문헌[A.R. Ketring et al., Int. J. Nucl. Med. Biol., 11, 113-119 (1984)] 참조) 또는 크로마토그래피[A. Hoepping et al., Bioorg. Med. Chem., 6, 1663-1672 (1998)]에 의해 측정할 수 있다. 바람직한 측정 방법은 머무름 시간을 logP와 연계시킬 수 있도록, 공지된 표준물로 크로마토그래피 시스템(예컨대, HPLC)를 검정하는 것이다. 이것은 종들의 혼합물을 동시에 측정할 수 있다는 이점을 갖는다.

본 발명의 바람직한 테크네튬 복합체는 대칭적이며, 따라서 화학식 I의 리간드의 -NY- 잔기 상의 2개의 -CR² ₂R² ₂NHCR¹ ₂C(=N-OH)R¹ 치환체는 동일하도록 선택한다. 이것은 테크네튬 복합체가 키랄 중심을 함유하지 않는다는 이점을 갖는데, 이는 키랄 중심이 부분입체이성질체성 테크네튬 복합체를 유발할 수 있고 가능하게는 특정 이성질체의 정제를 요할 수 있기 때문이다.

본 발명의 테크네튬 아자-디아민 디옥심 복합체에서, 하나 이상의 R²기가 H인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 모든 R²기가 H이다. 각 R¹은 바람직하게는 C_1-3 알킬, C_2-4 알콕시알킬, C_1-3 히드록시알킬 또는 C_1-3 플루오로알킬 중에서 선택되고, 가장 바람직하게는 C_1-3 알킬 또는 C_1-3 플루오로알킬이다. 모든 R¹기가 CH₃인 것이 가장 특히 바람직하다.

본 발명의 테크네튬 복합체가, 2개 이상의 R기가 그들이 부착된 원자와 함께 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리를 형성하는 R기를 포함할 경우, 그러한 고리는 3 내지 6개의 원소, 특히 5 또는 6개의 원소를 갖는다. 가장 바람직한 상기 고리는 포화된 카르보시클릭 고리이다. 바람직한 카르보시클릭 고리는 동일 탄소 원자 또는 인접한 탄소 원자들에 부착된 2개의 R¹기가 합쳐져 3 내지 6원, 특히 5 또는 6원의 포화된 고리를 형성한 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 테크네튬 아자-디아민디옥심 복합체 조성물은 하기 화학식 II의 리간드를 갖는 것이다.

상기 식에서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-3 알킬 또는 C_1-3 플루오로알킬이고, p는 0 내지 3의 정수이고, Z는 화학식 I에서 정의된 바와 같다. 따라서, 화학식 II에서 Y는 -CH₂CH₂(A)_pZ이다. 바람직한 화학식 II의 리간드는 상기한 바와 같이 대칭적이다.

링커 기 -(A)_n-의 역할은 금속 배위에 의해 생성된 비교적 벌키한 테크네튬 복합체를 생물학적 표적화 잔기 (Z)의 활성 부위로부터 멀리 떨어뜨려, 예를 들어 수용체 결합이 손상되지 않도록 하는 것으로 파악된다. 이것은 벌키한 기가 그 자신을 활성 부위로부터 멀리 위치시키기 위한 자유를 갖도록 하는 유연성(예컨대, 단순한 알킬쇄) 및(또는) 금속 복합체를 활성 부위로부터 먼 쪽으로 향하게 하는 시클로알킬 또는 아릴 스페이서와 같은 강직성의 조합에 의해 달성될 수 있다. 링커 기의 특성은 또한 생성되는 접합체의 테크네튬 복합체의 생체분포를 개선하는데 이용될 수도 있다. 즉, 예를 들어 링커 기에 에테르 기를 도입하면 플라스마 단백질 결합을 최소화하는 것에 도움이 되고, 또는 폴리알킬렌 글리콜, 특히 PEG(폴리에틸렌글리콜)와 같은 중합체 링커 기의 사용은 생체내에서 혈액 중 제제의 수명 연장에 도움이 될 것이다.

바람직한 링커 기 -(A)_n-는 2 내지 10개의 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 5개의 원자, 특히 바람직하게는 2 또는 3개의 원자를 함유하는 골격 쇄(즉, -(A)_n- 잔기를 구성하는 연결된 원자들)를 갖는다. 원자가 2개인 최소의 링커 기 골격쇄는 아자-디아민디옥심 킬레이트화제가 생물학적 표적화 잔기로부터 잘 분리되어 임의의 상호작용이 최소화되도록 한다는 이점을 부여한다. 추가의 이점은 Z 기의 잠재적인 킬레이트 고리 크기가 너무 크므로 (2개의 원자 링커 기 쇄의 경우 8원 이상), 이들 기가 아자-디아민디옥심의 ^xTc로의 배위와 효과적으로 경쟁할 가능성이 낮다는 점이다. 이러한 방식으로, 생물학적 표적화 잔기의 생물학적 표적화 특성 및 아자-디아민디옥심 킬레이트화제의 금속 복합체화 능력이 둘 다 상기 유형의 접합체에서 유지된다. 생물학적 표적화 잔기 Z는, 혈액 중에서 쉽게 대사을 일으키지 않게 연결되는 방식으로 아자-디아민디옥심 킬레이트화제에 결합되는 것이 매우 바람직하다. 이는 그러한 대사은 표지된 생물학적 표적화 잔기가 목적하는 생체내 표적 부위에 도달하기 전에 ^xTc 금속 복합체가 절단되도록 할 것이기 때문이다. 따라서, 생물학적 표적화 잔기는 바람직하게는 용이하게 대사되지 않는 -(A)_n- 링커 기를 통해 본 발명의 ^xTc 금속 복합체에 공유결합된다. 적합한 상기 연결은 탄소-탄소 결합, 아미드 결합, 우레아 또는 티오우레아 연결, 또는 다른 결합이다.

비-펩티드 링커 기, 예컨대 알킬렌기 또는 아릴렌기는 접합된 생물학적 표적화 잔기와의 현저한 수소 결합 상호작용이 없으므로 링커 기가 생물학적 표적화 잔기를 둘러싸지 않는다는 이점을 갖는다. 바람직한 알킬렌 스페이서 기는 -(CH₂)_q-이고, 여기서, q는 2 내지 5의 정수이다. 바람직하게는 q는 2 또는 3이다. 바람직한 아릴렌 스페이서는 하기 화학식을 갖는다.

상기 식에서, a 및 b는 각각 독립적으로 0, 1 또는 2이다.

따라서, 바람직한 Y기는 -CH₂CH₂-(A)_p-Z이고, 여기서, p는 0 내지 3이 정수이다. Z가 펩티드일 경우, Y는 바람직하게는 -CH₂CH₂-(A)_p-Z이고, 여기서, -(A)_p-는 -CO- 또는 -NR-이다. -(A)_p-이 -NH-일 경우, 이 기는 상업적으로 입수가능한 대칭 중간체 N(CH₂CH₂NH₂)₃으로부터 유도된다는 부가적인 이점을 갖는다. 상이한 쇄 길이를 갖는 트리아민 전구체는 다양한 아민을 화학적으로 식별하기 위한 합성적 전략(예컨대, 보호기)의 사용을 요한다.

바람직한 화학식 II의 아자-디아민디옥심 킬레이트화제는 바람직하게는 상기한 α₂-항플라스민 펩티드 (및 그의 바람직한 실시양태)에 접합된다.

본 발명의 개선된 테크네튬 복합체 조성물은 반응을 목적하는 열역학적 ^xTc 복합체 생성물로 진행시켜 "일과성 ^xTc 복합체"의 수준을 최소화하기 위한

(i) 주변 온도에서의 연장된 반응 시간; 또는

(ii) 보다 높은 온도에서의 가열; 또는

(iii) 이들의 조합 중 어느 하나를 이용하여, 적합한 용매 중에서 적당한 산화 상태의 ^xTc 방사성동위원소(즉, ^99mTc, ⁹⁹Tc 또는 ^94mTc)를 화학식 I 또는 II의 리간드와 반응시켜 제조할 수 있다. 통상적인 테크네튬 출발 물질은 퍼테크네테이트, 즉, Tc(VII) 산화 상태의 테크네튬인 TcO₄ ^-이다. 퍼테크네테이트 그 자체는 쉽게 금속 복합체를 형성하지 않으므로, 테크네튬 복합체의 제조는 일반적으로 테크네튬의 산화 상태를 보다 낮은 산화 상태, 통상 Tc(I) 내지 Tc(V)로 감소시켜 복합체화를 용이하게 하기 위한 적합한 환원제, 예컨대 제1주석 이온의 첨가를 요한다. 용매는 유기 또는 수성 용매, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 용매가 유기 용매를 포함할 경우, 유기 용매는 바람직하게는 생체적합성 용매, 예컨대 에탄올 또는 DMSO이다. 바람직하게는, 용매는 수성이고, 가장 바람직하게는 등장 염수이다. 본 발명의 테크네튬 복합체 조성물을 얻기 위해서, 반응 혼합물은 최소 50℃의 온도에서 10분 이상의 시간 동안 가열하여야 한다. 적합한 가열 조건은 50 내지 80℃에서 10 내지 20분 동안, 바람직하게는 60 내지 70℃에서 10 내지 15분 동안, 가장 바람직하게는 60 내지 65℃에서 10 내지 12분 동안, 이상적으로는 60℃에서 10분 동안이다. 반응 매질의 pH는 적합하게는 pH 8.5 내지 9.5, 바람직하게는 pH 8.8 내지 9.0, 가장 바람직하게는 pH 8.8이다. 가열 공정은, 목적하는 온도 조절이 달성되기만 한다면, 고온 유체 조, 예컨대 물 또는 고비등 오일(예컨대, 실리콘), 히팅 블록, 핫 플레이트 또는 마이크로파 조사와 같은 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 가열이 완료된 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각되도록 두거나 또는 적극적으로 냉각시키거나(예를 들어 기체 또는 물과 같은 냉각 유체의 스트림 중에서) 또는 통합 유도 냉각되는 히팅 블록을 통해 냉각시킬 수 있다.

본 발명자들은 또한 생체적합성 양이온과 약유기산의 염 하나 이상이 반응 혼합물에 존재함으로써 바람직하지 않은 친지질성 ^xTc 복합체가 억제될 수 있다는 사실을 또한 확립하였다. 용어 "약유기산"은 pK_a가 3 내지 7의 범위인 유기산을 의미한다. 용어 "생체적합성 양이온"은 이온화된, 음으로 하전된 기와 염을 형성하는 양으로 하전된 상대이온을 의미하며, 여기서, 상기 양으로 하전된 상대이온은 또한 비-독성이어서 표유류 신체, 특히 인간 신체에 투여하기 적합하다. 적합한 생체적합성 양이온의 예로는 알칼리 금속 나트륨 또는 칼륨; 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘; 및 암모늄 이온이 포함된다. 바람직한 생체적합성 양이온은 나트륨 및 칼륨, 가장 바람직하게는 나트륨이다.

적합한 상기 약유기산은 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 글루코헵톤산, 벤조산, 페놀 또는 포스폰산이다. 따라서, 적합한 염은 아세테이트, 시트레이트, 타르트레이트, 글루코네이트, 글루헵토네이트, 벤조에이트, 페놀레이트 또는 포스포네이트, 바람직하게는 아세테이트이다. 아세테이트 염은 바람직하게는 나트륨 또는 칼륨 아세테이트이고, 가장 바람직하게는 나트륨 아세테이트이다. 이들 염의 사용 시 부가적인 이점은 산 음이온이 테크네튬에 약하게 복합체화되고(예컨대, 타르트레이트, 글루코네이트 또는 시트레이트), 리간드 교환 또는 트랜스킬레이트화(transchelation) 공정에서 아자-디아민디옥심 리간드에 의해 치환된다는 것이다. 상기 조건은 테크네튬 이온의 가수분해와 같은 바람직하지 않은 부반응을 억제하는 것을 보조하는데 유용하다. 약유기산의 염의 적합한 사용 농도는 1 내지 100 μmol/㎖의 범위, 바람직하게는 5 내지 50 μmol/㎖의 범위이다.

출원인은 반응 혼합물에 방사선보호제(radioprotectant)를 첨가하는 것은 일단 형성된 ^xTc 복합체 생성물을 안정화시킬 뿐 아니라 뜻밖에도 일과성 ^xTc 복합체로부터 목적하는 열역학적 테크네튬 생성물로의 전환을 가속시킨다는 것을 또한 발견하였다. 이것은 보다 짧은 가열 시간 및(또는) 보다 낮은 가열 온도를 적용할 수 있다는 이점을 갖는다. 이것은 생물학적 표적화 잔기가 어느 정도 이상 감열성일 경우에 특히 유리하다. 용어 "방사선보호제"는 물의 방사분해(radiolysis)로부터 발생하는 산소-함유 자유 라디칼과 같은 고반응성 자유 라디칼을 포획함으로써 산화환원 과정과 같은 분해 반응을 저해하는 화합물을 의미한다.

본 발명의 방사선보호제는 적합하게는 멸균 산소 또는 공기 원; 아스코르브산; 파라-아미노벤조산 (즉, 4-아미노벤조산 또는 PABA); 겐티스산 (즉, 2,5-디히드록시벤조산) 및 이들 산과 상기 정의된 생체적합성 양이온의 염 중에서 선택한다. 바람직한 방사선보호제는 아스코르브산 및 파라-아미노벤조산 또는 이것과 생체적합성 양이온의 염이다. 특히 바람직한 방사선보호제는 파라-아미노벤조산 및 이것과 생체적합성 양이온의 염, 이상적으로는 나트륨 파라-아미노벤조에이트이다. 본 발명의 방사선보호제는 제약 등급 규격에 상업적으로 이용가능하다.

본 발명자들은 바람직하지 않은 친지질성 ^xTc 복합체의 수준이 사용되는 제약 등급 바이알 마개의 선택에 의해 영향을 받음을 또한 확립하였다. 상기 마개는 전형적으로 브로모부틸, 클로로부틸 또는 부틸 고무 또는 이들의 혼합물을 포함하고, 합성 고무로부터의 휘발성 침출 물질(예컨대, 힌더드 페놀계 산화방지제 또는 페놀계 수지 부생성물)이 아자-디아민디옥심 킬레이트 접합체와 반응하여 다양한 수준의 친지질성 ^xTc 복합체를 생성할 수 있다고 생각된다. 대부분의 유형의 마개가 이러한 문제를 나타내나, 그 정도가 다양하므로, 마개의 선택 또한 친지질성 ^xTc 복합체의 수준을 억제하는데 도움이 되는 인자라고 생각된다.

본 발명의 테크네튬 복합체 조성물의 제조는 바람직하게는 본 발명의 제3 실시양태(하기)에서 기재한 비-방사성 키트를 사용하여 실시한다.

본 발명의 테크네튬 복합체 조성물의 제조에 사용되는 아자-디아민디옥심 킬레이트화제 접합체는 하기 화학식 III의 2관능성 킬레이트와 생물학적 표적화 잔기 (Z)의 반응에 의해 제조할 수 있다.

상기 식에서,

각 R¹ 및 R²는 독립적으로 R기이고;

E는 -(A)_n-J이고;

여기서, J는 Z로의 접합에 적합한 관능기이고;

-(A)_n-는 링커 기이고, 여기서, 각 A는 독립적으로 -CO-, -CR₂-, -CR=CR-,-C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, C_4-8 시클로헤테로알킬렌기, C_4-8 시클로알킬렌기, C_5-12 아릴렌기, 또는 C_3-12 헤테로아릴렌기 또는 폴리알킬렌글리콜, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산 잔기이고;

n은 0 내지 10의 정수이고;

각 R기는 독립적으로 H 또는 C_1-10 알킬, C_3-10 알킬아릴, C_2-10 알콕시알킬, C_1-10 히드록시알킬, C_1-10 플루오로알킬, 또는 2개 이상의 R기와 이들이 부착된 원자가 형성한 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리이다.

용어 "접합에 적합한 관능기"는 Z의 상응하는 관능기(전형적으로 아민, 카르복실 또는 티올기)와 반응하여 아자-디아민 디옥심 킬레이트화제를 Z에 화학적으로 연결하는 관능기를 의미한다. 바람직한 상기 접합에 적합한 관능기는 -NR⁵R⁶, -CO₂M, -NCS, -NCO, -SM¹, -OM¹, 말레이미드 또는 아크릴아미드이고, 여기서

R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 R기 또는 P^G이고;

M은 H, 생체적합성 양이온, P^G 또는 활성 에스테르이고;

M¹은 H 또는 P^G이고; P^G는 보호기이다.

용어 "생체적합성 양이온"은 상기 정의한 바와 같다.

용어 "보호기"는 바람직하지 않은 화학 반응을 저해 또는 억제하나, 분자의 나머지를 화학적으로 변형시키지 않는 온화한 조건하에서 해당 관능기로부터 절단될 수 있기에 충분한 반응성을 갖도록 디자인된 기를 의미한다. 탈보호 후, 해당 기는 화학식 III의 2관능성 킬레이트를 생물학적 표적화 잔기 (Z)에 접합시키는데 사용될 수 있다. 보호기는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, J가 -NR⁵R⁶일 경우에는 Boc (여기서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐이다), Fmoc (여기서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다), 트리플루오아세틸, 알릴옥시카르보닐, Dde [즉, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸] 또는 Npys(즉, 3-니트로-2-피리딘 술페닐) 중에서 적합하게 선택되고, J가 -CO₂P^G일 경우에는 메틸 에스테르, tert-부틸 에스테르, 벤질 에스테르 중에서 적합하게 선택된다. J가 -OP^G일 경우 적합한 보호기는 아세틸, 벤조일, 트리틸 또는 테트라부틸디메틸실릴이다. J가 -SP^G일 경우 적합한 보호기는 트리틸 및 4-메톡시벤질이다. 추가의 보호기의 사용은 문헌 ['Protective Groups in Organic Synthesis', Theorodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, (John Wiley ＆ Sons, 1991)]에 기재되어 있다.

용어 "활성 에스테르"는 더 나은 이탈기가 되도록 디자인되어 아민과 같은 생물학적 표적화 잔기상에 존재하는 친핵체와의 보다 쉬운 반응을 허용하는 카르복실산의 에스테르 유도체를 의미한다. 적합한 활성 에스테르의 예는 N-히드록시숙신이미드(NHS), 펜타플루오로페놀, 펜타플루오로티오페놀, 파라-니트로페놀, 히드록시벤조트리아졸 및 PyBOP (즉, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)이다.

화학식 III의 2관능성 킬레이트는 문헌 [S. Liu et al., Chem. Rev., 99, 2235-2268 (1999)]에 기재된 바와 같이 생물학적 표적화 잔기 (Z)에 접합시킬 수 있다. 즉, 예를 들어, 아민-관능화된 화학식 III의 아자-디아민 디옥심 킬레이트화제 (즉, J=-NR⁵R⁶)를 아미드 결합을 통해 생물학적 표적화 잔기 (Z)의 카르복실기(들)에 접합시킬 수 있다. 이 커플링은 직접(예컨대, 고체상 펩티드 합성기를 사용하여) 또는 당업계에 공지된 적당한 중간체, 예컨대 생물학적 표적화 잔기의 카르복실기의 활성화된 에스테르를 통해 실시할 수 있다. 별법으로, 2관능성 킬레이트화제의 매달린 아민기를 먼저 이소티오시아네이트(-NCS) 또는 이소시아네이트(-NCO)기로 전환시켜, 각각 티오우레아 및 우레아 연결의 형성을 통한 아민-함유 생물학적 표적화 잔기로의 접합을 허용할 수 있다. 별법으로, 2관능성 아자-디아민 디옥심 킬레이트화제의 매달린 아민기를 디산의 한 산 관능기와 반응시켜 말단 카르복실기를 링커 기를 통해 도입할 수 있다. 카르복실 관능기를 갖는 2관능성 킬레이트화제(즉, J=-CO₂M)를 유사한 방식으로 사용하여 아미드 결합을 통해 아민-함유 생물학적 표적화 잔기에 직접 커플링시킬 수 있다. 2관능성 킬레이트는 또한 생물학적 표적화 잔기 상의 티올기와 반응하여 적합한 티오에테르 연결을 형성하도록 다자인된 기를 가질 수도 있다. 그러한 기의 예는 말레이미드(이것은 말레산 무수물과 상응하는 아민을 반응시킨 후 아세트산 무수물과 함께 가열하여 제조할 수 있다), 및 아크릴아미드(이것은 아크릴릴 클로라이드와 아민을 반응시켜 제조할 수 있다)이다.

본 발명의 2관능성 아자-디아민디옥심 킬레이트화제는 적합하게는 하기 화학식 IV의 화합물을

(i) 적당한 클로로니트로소 유도체 Cl-C(R¹)₂-C(=NO)R¹; 또는

(ii) 화학식이 Cl-C(R¹)₂-C(=NOH)R¹인 α-클로로 옥심 중 어느 하나로 알킬화시키거나, 또는

(iii) 화학식이 Br-C(R¹)₂-C(=O)R¹의 α-브로모케톤으로 알킬시킨 후 디아민디케톤 생성물을 히드록시아민을 이용하여 디아민디옥심으로 전환시켜 제조할 수 있다.

상기 식에서, A, J, R² 및 n은 상기 화학식 III에서 정의된 바와 같다.

경로 (i)은 문헌 [S. Jurisson et al., Inorg. Chem., 26, 3576-82 (1987)]에 기재되어 있다. 클로로니트로소 화합물은 적당한 알켄을 니트로실 클로라이드(NOCl)로 처리하여 얻을 수 있다. 클로로니트로소 화합물에 대한 더욱 상세한 합성은 문헌 [Ramalingam, K. et al., Synth. Commun. (1995) 25(5) 732-52; Glaser et al., J. Org. Chem. (1996), 61(3), 1047-48; Clapp, Leallyn B. et al., J. Org. Chem. (1971), 36(8) 1169-70; Saito, Giulichi et al., Shizen Kagaku (1995), 47, 41-9; Schulz, Manfred, Z. Chem. (1981), 21(11), 404-5]에 주어져 있다. 경로 (iii)은 문헌 [Nowotnik et al., Tetrahedron, 50(29), p.8617-8632 (1994)]에 기재되어 있다. α-클로로-옥심은 상업적으로 입수가능한 상응하는 α-클로로-케톤 또는 알데히드의 옥심화에 의해 얻을 수 있다. α-브로로케톤은 상업적으로 입수가능하다.

제2면에서, 본 발명은 상기 아자-디아민디옥심 테크네튬 복합체 조성물을 인간 투여에 적합한 멸균 형태로 포함하는 방사성약물을 제공한다. 이러한 방사성약물은 적합하게는 멸균 완전성을 유지하면서 피하 니들로 1회 또는 다수회 찔러 구멍을 내기에 적합한 밀봉(예컨대, 크림프트-온 셉텀(crimped-on septum) 밀봉 마개)이 제공된 용기에 의해 공급된다. 이러한 용기는 하나 또는 다수 환자 투여량을 함유할 수 있다. 바람직한 다수 투여량 용기는 다수 환자 투여량을 함유하므로, 환자 1인 투여량을 임상적 상황에 적합화된 제제의 이용가능한(viable) 수명 동안 다양한 시간 간격으로 임상 등급 주사기 내로 빼낼 수 있는 단일 벌크 바이알(예컨대, 10 내지 100 ㎤)을 포함한다.

본 발명의 방사성약물은 또한 미리 충전된 주사기로 공급될 수 있다. 그러한 미리 충전된 주사기는 주사기로부터 직접 환자에게 투여될 수 있는 형태의 단일 인간 투여량을 함유하도록 디자인된다. 상기 미리 충전된 주사기는 적합하게는 무균 제작에 의해 제조되므로 제품이 멸균 형태이다. 따라서, 미리 충전되는 주사기는 바람직하게는 임상적 용도에 적합하고 따라서, 방사성약물의 멸균 완전성을 유지하는 일회용 또는 다른 주사기이다. 방사성약물을 함유하는 미리 충전된 주사기는 유리하게는 방사능 투여량으로부터 취급자를 보호하기 위한 주사기 차폐물(shield)와 함께 제공될 수 있다. 적합한 상기 방사성약물 주사기 차폐물은 당업계에 공지되어 있고, 바람직하게는 납 또는 텅스텐을 포함한다. 상기 미리 충전된 주사기는 바람직하게는 미리 주사기 차폐물을 장착하고 추가의 방사선 차폐를 제공하는 용기 내에 포장한 채로 소비자에게 운송하므로, 제조자로부터 소비자에게로 운송하는 동안 포장의 외면에서 외부 방사선량이 최소화된다.

^99mTc 진단용 조영 방사성약물을 위해 적합한 ^99mTc 방사능 함량은 생체내에서 조영하고자 하는 부위, 흡수 및 표적 대 백그라운드 비율에 따라 180 내지 1500 MBq (3.5 내지 42 mCi)의 범위이다. ^99mTc 방사성약물을 이용한 심장 조영의 경우, 스트레스 연구(stress study)에는 약 1110 MBq (30 mCi)를, 휴식 연구(rest study)에는 약 350 MBq (10 mCi)를 사용할 수 있다. ^99mTc 방사성약물을 이용한 혈전 조영의 경우, 약 750 MBq (21 mCi)가 적합할 것이다.

제3면에서, 본 발명은 본 발명의 ^xTc 방사성약물 조성물의 제조를 위한 비-방사성 키트를 제공한다. 이 키트는 예컨대 혈류 내로의 직접 주사를 통한 인간 투여에 적합한 멸균 방사선의약 제품을 생성하도록 디자인된다. ^99mTc의 경우, 키트는 바람직하게는 동결건조되고, ^99mTc 방사성동위원소 발생기로부터의 멸균 ^99mTc-퍼테크네테이트(TcO₄ ^-)로 재구성되어 추가의 조작없이 인간 투여에 적합한 용액을 생성하도록 디자인된다. 적합한 키트는 비-복합체화된 화학식 I 또는 II의 아자-디아민디옥심 리간드, 제약학적으로 허용가능한 환원제, 예컨대 나트륨 디티오나이트, 중아황산나트륨, 아스코르브산, 포름아미딘 술핀산, 제1주석 이온, Fe(II) 또는 Cu(I), 상기 정의한 바와 같은 생체적합성 양이온과 약유기산의 염 하나 이상을 함께 함유하는 용기(예컨대, 셉텀-밀봉된 바이알)를 포함한다. 약유기산의 염은 바람직하지 않은 친지질성 ^xTc 복합체의 형성을 억제하는 기능을 한다(상기한 바와 같음).

비-방사성 키트는 임의로는 제2 약유기산 또는 그것과 생체적합성 양이온의 염을 또한 포함할 수 있으며, 이것은 트랜스킬레이트화제로 기능한다. 트랜스킬레이트화제는 신속하게 반응하여 테크네튬과 약한 복합체를 형성한 후 아자-디아민디옥심으로 치환되는 화합물이다. 이것은 테크네튬 복합체화와 경쟁하는 퍼테크네테이트의 신속한 환원으로 인해 환원된 가수분해 테크네튬 (RHT)이 형성될 위험성을 최소화한다. 적합한 상기 트랜스킬레이트화제는 상기한 약유기산 및 그의 염, 바람직하게는 타르트레이트, 글루코네이트, 글루코헵토네이트, 벤조에이트, 또는 포스포네이트, 바람직하게는 포스포네이트, 가장 특히 디포스포네이트이다. 바람직한 상기 트랜스킬레이트화제는 MDP, 즉, 메틸렌디포스폰산 또는 그것과 생체적합성 양이온의 염이다.

유리된 형태의 리간드의 사용에 대한 대안으로서, 키트는 임의로는 테크네튬 첨가시 트랜스금속화(즉, 리간드 교환)을 일으켜 목적 생성물을 생성하는 아자-디아민디옥심 리간드의 금속 복합체를 함유할 수 있다. 적합한 상기 트랜스금속화용 복합체는 구리 또는 아연 복합체이다.

키트에 사용되는 제약학적으로 허용가능한 환원제는 바람직하게는 제1주석염, 예컨대 염화제1주석, 불화제1주석 또는 타르타르산염제1주석이고, 무수 또는 수화 형태일 수 있다. 제1주석염은 바람직하게는 염화제1주석 또는 불화제1주석이다.

비-방사성 키트는 임의로는 방사선보호제, 항균 보존제, pH 조절제, 또는 충전제와 같은 부가 성분을 또한 포함할 수 있다. 용어 "방사선보호제"는 상기 정의한 바와 같다. 용어 "항균 보존제"는 박테리아, 효모 또는 곰팡이와 같은 잠재적으로 유해한 미생물의 성장을 억제하는 제제를 의미한다. 항균 보존제는 또한 투여량에 따라 약간의 살균 특성을 나타낼 수도 있다. 본 발명의 항균 보존제(들)의 주 역할은 재구성 후의 ^xTc 방사성약물 조성물, 즉, 방사성 진단 제품 그 자체 중에서의 상기 미생물의 성장을 저해하는 것이다. 그러나, 항균 보존제는 또한 임의로는 잠재적으로 유해한 미생물이 재구성 전의 본 발명의 비-방사성 키트의 하나 이상의 성분 중에서 성장하는 것을 억제하는데 사용할 수도 있다. 적합한 항균 보존제(들)로는 파라벤, 즉, 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 파라벤 또는 이들의 혼합물, 벤질 알콜; 페놀; 크레솔; 세트리미드 및 티오메르살이 있다. 바람직한 항균 보존제(들)는 파라벤이다.

용어 "pH 조절제"는 재구성된 키트의 pH가 인간 또는 포유류 투여에 허용가능한 한계 이내(대략 pH 4.0 내지 10.5)이도록 보장하기 위해 사용되는 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 적합한 상기 pH 조절제로는 제약학적으로 허용가능한 버퍼, 예컨대 트리신, 포스페이트 또는 TRIS [즉, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄], 및 제약학적으로 허용가능한 염기, 예컨대 탄산나트륨, 중탄산나트륨 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 본 발명의 아자-디아민디옥심의 경우, pH 조절제가 중탄산나트륨을 포함하는 것이 바람직하다.

생물학적 표적화 잔기가 α₂-항플라스민의 펩티드 단편일 경우, 바람직한 키트 제형은 화학식 I의 리간드, 제1주석 환원제, 생체적합성 양이온의 아세테이트 염, 디인산 트랜스킬레이트화제와 pH 조절제를 포함한다. 바람직한 상기 키트는 화학식 II의 리간드, 염화제1주석, 나트륨 아세테이트; MDP 또는 그의 생체적합성 염; 방사선보호제, 특히 PABA 또는 그의 생체적합성 염, 가장 특별하게는 PABA의 나트륨염; 및 pH 조절제로서의 중탄산나트륨을 포함한다. 가장 바람직한 상기 키트는, 각 R¹이 CH₃이고 (A)_p가 NH이고 Z가 Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly- (여기서, Xaa는 Tyr 또는 I-Tyr이고 Ac는 N-아세틸이다)인 화학식 II의 리간드를 또한 포함한다.

제4면에서, 본 발명은 생물학적 표적화 분자가 α₂-항플라스민의 3 내지 20-머 펩티드 단편인 본 발명의 방사성약물을 사용하는 진단용 혈전 조영 방법을 제공한다. 바람직하게는, α₂-항플라스민의 펩티드 단편은 서열 Asn-Gln-Glu-Glu를 포함한다. 가장 바람직하게는, α₂-항플라스민의 펩티드 단편은 서열 Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly (여기서, Xaa는 상기 정의한 바와 같다)을 포함한다. 폐 색전(PE)은 인자 XIIIa의 작용에 의해 가교되고 안정화된 상당량의 섬유소로 구성된다. 섬유소 및 인자 XIIIa는 둘 다 비-활성 전구체로부터 혈전증 부위에 특이적으로 발생된다. 본 발명의 α₂-항플라스민의 펩티드 단편은 잠재적인 인자 XIIIa용 기질이므로 이 효소의 작용을 통해 폐 색전 내부의 섬유소에 공유결합된다. 따라서, 본 발명의 아자-디아민디옥심 α₂-항플라스민 펩티드 단편 접합체의 ^99mTc-복합체는 생체내 색전 부위에 선택적으로 흡수되므로, 이 부위에서 정상 조직에 비해 포지티브 흡수 또는 "핫-스팟(hot-spot)" 조영을 생성한다. 유사한 논리가 다른 유형의 생체내 혈전 (예컨대, 심부정맥혈전증 또는 dvt)에도 적용될 수 있는데, 이는 인자 XIIIa가 유사한 방식으로 기능하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 인자 XIIIa 기질 접합체는 생체내 혈전, 특히 폐 색전 및 심부정맥혈전증의 조영에 유용하다.

본 발명을 이하 상세하게 설명된 비-제한적 실시예로 설명한다.

실시예 1은 본 발명의 아자-디아민디옥심 킬레이트화제인 화합물 1의 합성을 기재한다.

실시예 2는 혈전을 표적화하기 위한 α₂-항플라스민의 펩티드 단편인 바람직한 펩티드 표적화 분자의 보호된 형태의 합성을 기재한다.

실시예 3은 실시예 1의 아자-디아민디옥심 킬레이트화제와 실시예 2의 표적화 펩티드의 접합체인 화합물 3의 합성을 기재한다. 실시예 3은 또한 화합물 4 내지 7의 합성을 기재한다.

실시예 4는 당업계에 교시된 것과 같은 화합물 3의 ^99mTc 방사선표지를 보여주는 비교예이다.

실시예 5는 본 발명에서 사용된 HPLC 시스템을 기재한다. 시스템 J는 명백히 허용가능한 RCP는 제공하지만, 친지질성 ^xTc 복합체는 칼럼상에 보류시키는 시스템이다 (즉, 후자는 이동상에 40％ 이하의 아세토니트릴을 사용할 경우 정지상에 대한 치환도가 너무 크다). 시스템 H는 이동상 중에 보다 많은 유기 용매를 포함하는 용출 구배를 가지며(90％ 이하의 아세토니트릴), 따라서, 칼럼으로부터 친지질성 테크네튬 복합체를 성공적으로 용출시켜 그것을 분석할 수 있게 한다. 시스템 J를 사용한 순도의 4％ 과대평가는 미검출된 친지질성 ^99mTc 복합체로 인한 것이다(도 3 참조). 실시예 10 및 도 1은 상기 수준의 친지질성 ^99mTc 복합체가 생체내 간 흡수에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여준다.

실시예 6은 본 발명의 동결건조된 키트의 제조를 설명한다. 제형 82/6이 바람직한데, 이는 동결건조 동안 동결건조된 케이크(cake)가 붕괴되는 경향이 덜하기 때문이다. 제형 82/6은 또한 숙성된 ^99mTc 발생기 용출물에 대해 보다 강건하여 (즉, 발생기 용출 후 6 시간 이하), 만족스러운 초기 RCP 및 양호한 재구성후 제제 안정성을 제공한다.

실시예 7은 본 발명의 ^99mTc 복합체 조성물을 제공하기 위한 동결건조된 키트의 재구성을 기재한다.

실시예 8은 리신(K)을 함유하는, 즉, 아민기를 갖는 펩티드 (화합물 3 및 4)가 상당한 친지질성 테크네튬 복합체 수준을 나타냄을 보여준다. 이들을 화합물 5에서처럼 아민을 함유하지 않는 아미노산으로 대체할 경우, 친지질성 복합체 수준이 훨씬 감소되었다. 이러한 현상은 벤즈아미드 유도체(화합물 6)에서도 나타난다.

실시예 9는 방사선보호제의 사용이 본 발명의 ^99mTc 복합체 조성물에 미치는 영향을 보여준다.

실시예 10은 바이알 마개가 ^99mTc 복합체 조성물에 미치는 영향을 입증한다.

실시예 11은 친지질성 ^xTc 복합체 함량이 ^99mTc 복합체 조성물의 생체분포에 미치는 효과를 보여준다. 친지질성 불순물의 변화는, 1 시간 p.i에서 방사능의 혈액 보유의 현저한 증가 (1.88％에서 3.26％로)(p<0.05)와 함께, 통계적으로 현저하지는 않으나 소변 배출이 감소(63.07％에서 51.04％로)되는 경향을 나타냈다. 간에 존재하는 방사능도 또한 2.24％에서 10.24％로 현저하게 증가했다(p<0.05). 따라서, 친지질성 불순물 수준의 증가는 혈액 중 ^99mTc-화합물 3의 보유를 현저하게 증가시켰고, 간에서의 흡수를 현저하게 높였다. 이것은 다시 소변 배설이 감소되는 경향을 유발했다

실시예 12는 약유기산염이 친지질성 테크네튬 복합체 함량 및 결과 생체분포에 미치는 영향을 보여준다. 나트륨 아세테이트 삼수화물을 ^99mTc-화합물 3의 제형에 첨가하는 것은, 억제된 친지질성 ^99mTc 복합체 존재 함량으로 인해 예상되는 바와 같이, 혈액 청소(blood clearance)를 증가시키고 간 흡수를 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서, 조성물의 진단 조영 잠재력이 상당히 개선된다. 심장 및 폐로의 제제의 흡수는 무시할만하므로 제제는 만족스럽게 낮은 백그라운드 흡수로 인해 폐 PE 조영에 잠재적으로 유용하다.

실시예 13은 본 발명의 개선된 ^xTc 복합체 조성물이 여전히 유용한 응혈 흡수를 나타내므로, 생물학적 표적화 활성을 유지한다는 것을 보여준다. 실시예 11 및 도 1에서 입증된 바와 같이, 친지질성 ^99mTc 복합체의 존재로 인한 주된 생물학적 특성은 간의 ％id의 증가이다.

도 1은 친지질성 ^99mTc 복합체 함량이 간 흡수에 미치는 영향을 보여준다.

도 2는 본 발명에 기재된 다양한 종을 나타내는, 아자-디아민디옥심 ^99mTc 복합체 조성물의 대표적인 HPLC 결과를 보여준다. 도 2A는 정상적인 전체 스케일의 피크 표시이고, 도 2B는 확대된 스케일이다.

도 3은 2개의 상이한 시스템, 즉, 시스템 J 및 시스템 H를 사용한 동일한 아자-디아민디옥심 ^99mTc 복합체 제제의 HPLC 결과를 비교한다. 친지질성 ^xTc 복합체는 시스템 H를 사용한 경우에 검출되었으나 (존재하는 방사선표지된 물질의 약 5％ 수준으로), 시스템 J를 사용한 경우 검출되지 않았다.

표에서, Ac는 아세틸이다.

실시예 1: 3,3,11,11-테트라메틸-7-(2-아미노에틸)-4,7,10-트리아자트리데칸-2,12-디온디옥심 (화합물 1 또는 Pn216)

아세토니트릴 (10㎖) 중 트리스(2-아미노에틸)아민 (1㎖, 6.68mmol)의 용액에 중탄산나트륨 (1.12g, 13.36mmol, 2eq.)을 첨가하였다. 건조 아세토니트릴 (5㎖) 중 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄[R.K.Murmann, J. Am. Chem. Soc, 79, 521-526 (1957); 1.359g, 10.02mmol, 1.5eq]의 용액을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반한 후 여과하였다. 잔류물을 아세토니트릴로 잘 세척하고 여액을 증발시켰다. 이어서, 조질 생성물을 RP-HPLC (칼럼: 해밀톤(Hamilton) PRP; 구배: 20분 동안 1 내지 100％B; 용출액 A는 2％ NH₃ 수용액이고 용출액 B는 아세토니트릴이고, 유속은 3㎖/분이었다)로 정제하여 화합물 1 (164mg, 7％)를 얻었다.

δ_H (CD₃OD, 300MHz): 2.77 (2H, t, J 6Hz, CH₂NH₂), 2.50-2.58 (10H, m, H₂NCH₂CH₂N(CH₂CH₂NH)₂), 1,85 (6H, s, 2 x CH₃C=N), 1,23 (12H, s, 2 x (CH₃)₂CNH).

실시예 2: 펩티드 Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG (화합물 2).

2-클로로트리틸 수지에 Fmoc-Gly-를 앵커링(anchoring)한 후 적당한 보호된 아미노산 및 커플링 시약 DCC 및 HOBt를 이용한 연속적인 탈보호/커플링 순환에 의해, 보호된 펩티드 Ac-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Thr(3I)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH를 상기 수지상에 어셈블링하였다. 고체상 펩티드 합성은 문헌 [P. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997]에 기재되어 있다. 말단 아스파라긴을 아세틸화하고, 0.5％ TFA를 사용하여 수지로부터 절단하고, 화합물 2를 추가의 정제없이 트리플루오로아세테이트 염으로서 사용하였다.

실시예 3: 화합물 3 내지 7의 합성

실시예 2에 기재된 바와 같이 보호된 Ac-NQEQVSPY(3I)TLLKG 펩티드(화합물 2)를 고체 상 수지로부터 절단한 후, PyBOP (벤조트리아졸-1-일-옥시트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트) 및 HOBt (1-히드록시벤조트리아졸)을 커플링제로 사용하여 용액 중 화합물을 1과 커플링하였다. 시약 K [시약 K는 TFA 82.5％, 페놀 5％, 가공수 5％, 티오아니솔 5％, 에탄디티올(EDT) 2.5％이다] 중에서 탈보호시켜 화합물 3을 얻었다. 조질 접합체를 먼저 TFA를 사용하여 RP-HPLC로 정제한 후 아세트산을 이용한 두번째 정제 및 염 교환, 동결건조, 0.22μ 필터를 이용한 여과 및 최종 동결건조에 의해 화합물 3을 얻었다.

MS로 측정한 분자량 1970±1 달톤

화합물 4 및 5에 사용된 펩티드를 유사한 방식으로 제조하였다. 화합물 7은 화합물 1 (Pn216)을 DMF 중에서 글루타르산 무수물로 유도체화하여 제조하였다. 화합물 6은 아세토니트릴 중에서 트리에틸아민의 존재하에 화합물 1 (Pn216)을 벤조산 무수물과 반응시켜 제조하였다.

실시예 4: 화합물 3의 Tc-99m 방사선표지[비교예]

H₂O에 용해시킨 화합물 3의 0.1㎖ 분량(1㎎/㎖)을 탈산소화 염수(0.9％ w/v, 1㎖) 및 NaOH (0.1M) 수용액 0.035㎖와 함께 질소-충전된 10㎖ 유리 바이알로 옮겼다. 이 용액에 테크네튬 발생기 용출물 (1㎖, 약 0.4GBq)을 첨가한 후 염화제1주석 수용액(0.1㎖, 약 10㎍)을 첨가하였다. 표지용 pH는 9.0 내지 10.0이었다. 바이알을 주변 실험실 온도(15 내지 25℃)에서 30분 동안 인큐베이션하여 표지시켰다. 시험하기 전에, 생성된 제제를 목적하는 방사능 농도로 희석하거나, 또는 HPLC 정제를 수행하여 (시스템 B) 비표지된 출발 물질 및 방사능 불순물을 제거하였다. 정제 후, 유기 용매를 감압 제거하고 샘플을 0.1M 포스페이트 버퍼 pH 7.4 약 5㎖에 용해시켜 6 내지 9MBq/㎖의 작업 농도를 얻었다. 사용하기 전에 아래 기재한 박막 크로마토그래피(TLC) 시스템을 사용하여 방사화학 순도를 분석하였다.

i) 0.9％ w/v 염수로 용출되는 ITLC SG 2cm x 20cm

ii) 50:50 v/v 아세토니트릴:H₂O로 용출되는 와트만 번호(Whatman No.) 1 2cm x 20cm

표지된 기질은 TLC 시스템 (i)에서는 원점에 또는 그에 가까이 머물렀고, 시스템 (ii)에서는 용매 선단에 가깝게 이동하였다.

실시예 5: HPLC 시스템

유속: 모든 시스템에서 1㎖/분, TFA=트리플루오로아세트산

시스템 A

칼럼: 워터스(Waters) C18 250x4.5mm. 입도 4 마이크론

구배: 용출 프로파일 20분 동안 10 내지 60％ B

용출액 A: 0.1％ TFA 수용액

용출액 B: 아세토니트릴 중 0.1％ TFA

시스템 B

칼럼: 워터스 노바팍 (Waters Novapak) C18 150x3.9mm. 입도 4 마이크론

구배: 용출 프로파일 22분 동안 0 내지 100％ B

용출액 A: 0.1％ TFA 수용액

용출액 B: 아세토니트릴 중 0.1％ TFA

시스템 H

칼럼: 페노메넥스(Phenomenex) C18 (2) 루나(Luna) 25x0.46cm, 5㎛;

구배: 용출 프로파일 0 내지 20분에서 16 내지 40％ B, 20 내지 22분에서 40 내지 90％ B, 22 내지 30분에서는 90％ B, 30 내지 31분에서 90 내지 16％ B. 이후 칼럼을 16％ B에서 14분 동안 재평형화시켰다.

용출액 A: 0.05％ TFA 수용액

용출액 B: 아세토니트릴 중 0.04％ TFA

시스템 J

칼럼 페노메넥스 C18 (2) 루나 25x0.46cm, 5㎛;

구배: 용출 프로파일 0 내지 20분에서 16 내지 40％ B, 20 내지 22분에서 40 내지 16％ B. 이후 칼럼을 16％ B에서 8분 동안 재평형화시켰다.

용출액 A: 0.05％ TFA 수용액

용출액 B: 아세토니트릴 중 0.05％ TFA

재구성된 동결건조된 키트(로트 58, 실시예 6)의 HPLC 시스템 J에 의한 분석(실시예 5)은 시스템 J(종래 기술) 사용 시 94％의 RCP를 보였으나 시스템 H(본 발명) 사용 시에는 90％의 RCP를 보였다-도 3 참조.

실시예 6: 동결건조된 키트의 제조

주사용수(WFI) 총 부피의 약 90％를 제조 용기에 넣고 질소 퍼징에 의해 탈산소화시켰다. 메틸렌 디포스폰산, 염화제1주석 이수화물, 화합물 3(아세테이트 염 형태), 나트륨 아세테이트 삼수화물 및 p-아미노벤조산, 나트륨염을 각각이 용해되도록 차례대로 가하면서 질소 퍼징을 계속했다. 용액의 질소 퍼징을 용액 윗 공간으로의 질소 흐름으로 대체했다. 이어서, 탄산수소나트륨 및 무수 탄산나트륨, 또는 탄산수소나트륨 단독을 가하고 용해되도록 두었다. 이어서, 벌크 용액을 탈산소 WFI를 이용하여 최종 부피 100％ (약 5리터)로 조정했다. 이어서, 벌크 용액을 멸균 0.2 ㎛ 필터를 통해 충전 용기 내로 여과하였다. 충전 작업 동안 충전 용기의 윗공간을 멸균 여과된 (0.2 ㎛) 질소 또는 아르곤으로 퍼징하였다. 1.0㎖ 분량을 바이알 내로 무균 주입하였다. 바이알을 마개 A, B 또는 C로 반-막음(half-stopper)하고 미리 냉각된 동결 건조 선반 위로 옮겼다. 이어서, 바이알을 동결건조하고, 다시 멸균 여과된 (0.2㎛) 질소 기체로 역충전하고, 마개로 막고, 밀봉했다.

표에서, 마개 A = PH701/45 AS 레드-브라운(Red-Brown); 마개 B = 4023/50 1083 그레이(Grey); C = 4432/50 1178 그레이(Grey).

* 로트 33은 NaCl 2mg을 충전제로 함유했다

** 로트 33은 Na-타르트레이트 이수화물 25 ㎍을 트랜스킬레이트화제로 함유했다

*** 로트 86, 87, 88, 94, 98 및 제형 82/4는 무수 SnCl₂ 30㎍과 등가인 SnCl₂·2H₂O 36㎍을 사용했다

실시예 7: 동결건조 키트로부터의 ^99m Tc 복합체 제조

실시예 6의 동결건조된 키트를 ^99mTc-퍼테크네테이트 (2 내지 8㎖의 테크네튬 발생기 용출물; 0.5 내지 2.5 GBq)로 재구성하였다. 60℃ 수조에서 10 분 동안 용액을 가열한 후 실온에 방치하였다. 방사화학 순도를 실시예 5에 기재된 HPLC 방법으로 시스템 H에서 측정하였고(도 2 참조), RHT를 아래 기재한 ITLC 방법으로 측정했다.

ITLC SG 2cm x 20cm를 50:50 (v/v) 메탄올:암모늄 아세테이트 용액 (1M)으로 용출하였다. 방사선표지된 종에 기초한 리간드는 용매 선단으로 이동하였다. RHT는 원점에 머물렀다.

용액을 HPLC 시스템 H로 분석했고 그 결과를 아래 표 3에 기재했으며 표에서 ％RCP는 열역학적 ^99mTc 복합체의 방사화학 순도이다.

실시예 8: 표적화 분자가 ^99m Tc 친지질성 복합체 함량에 미치는 영향

동결건조된 키트 제형을 실시예 6에 따라, 다양한 표적화 분자 (Z)에 대해 로트 63의 제형 (실시예 6)을 사용하여 제조하였다. 실시예 7에 따른 재구성 및 분석 후의 배치(batch)로부터의 바이알 3개에 대한 시험 결과를 표 4에 나타냈다.

실시예 9: 방사선보호제가 ^99m Tc 복합체 제제에 미치는 영향

방사선보호제 나트륨 파라-아미노벤조에이트(Na-PABA)가 ^99mTc 복합체 제제에 미치는 영향을 용액 및 동결건조된 키트 제제 둘 다에 대해 조사하였다. 모든 제제는 1083 4023/50 그레이(Grey) 마개가 있는 10R 바이알에서 최종 방사능 농도(RAC) 0.5 GBq/㎖로 제조하였다. 제제를 HPLC 시스템 H를 사용하여 재구성후(PR) 다양한 시점에서 분석하고, 그 결과를 방사능 조성물의 백분율로서 표 5에 나타냈다.

실시예 10: 마개가 RCP 및 ^99m Tc 친지질성 복합체에 미치는 영향

바이알 마개가 방사선표지에 미치는 영향을 다양한 동결건조 키트 제형에 대해 조사하였다. 2개의 상이한 고무 마개 (웨스트 파마슈티컬 서비시즈(West Pharmaceutical Services))를 사용하여 제조한 동결건조된 키트를 실시예 7에 제시된 방법에 따라 재구성했다. RCP 및 방사선표지된 불순물의 차이가 나타났다 (표 6 참조, 10회의 RCP 측정의 평균을 나타냄).

마개가 RCP 및 ^99mTc 친지질성 복합체에 미치는 영향

로트	제형	마개	％RCP(10회 평균)	％99mTc 친지질성 복합체
87*	82/1	4023/50 그레이	86.8	0.1
94	82/2	4023/50 그레이	93.9	0.1
88*	82/1	PH701/45AS 레드-브라운	92.3	1.3
98	82/2	PH701/45AS 레드-브라운	93.8	1.4

^*히트 블록에서 90℃에서 10분 동안 가열함

실시예 11: 친지질성 테크네튬 복합체 함량이 생체분포에 미치는 영향

정상적인 수컷 위스타(Wistar) 래트 (체중 150 내지 250g)에 대해 실험을 실시했고, 해부는 ^99mTc-화합물 3 제제를 정맥내로 주사한 지 1 시간 후에 실시하였다. 상기 제제는 로트 #58 (자세한 것은 실시예 6 참조)로서 기재된 동결건조된 키트 제형로부터 제조하였고, 가열하지 않거나 또는 90℃에서 상이한 시간 동안 가열하고 투여전에 주변 온도로 냉각시켰다. 시스템 H를 이용한 HPLC 분석(실시예 5)은 표 6(아래)에 나타낸 상이한 수준의 친지질성 불순물을 확인시켜 주었다. 생체분포 데이터는 각 제제에 대해 계산하였고, 기관/조직 데이터는 각 개별 동물에 대해 3개 군의 평균 및 표준편차를 보고하였다. 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 97 SR-2 스프레드시트 패키지를 사용하여, 단일요인/일원분산분석(ANOVA) 시험 또는 비쌍체 양방검정 스튜던트 t-테스트 (unpaired, 2-tailed Student's t-test) (2개의 샘플, 이분산성)을 이 데이터에 적용하였다. 결과는 p 값이 0.05 미만이었을 때 유의적으로 상이한 것으로 간주되었다. 결과는 표 7에 나타냈다.

실시예 12: 약산염이 친지질성 테크네튬 복합체 함량 및 생체분포에 미치는 영향

나트륨 아세테이트 삼수화물을 제형에 첨가함으로써 유발되는 생체분포의 변화를 동결건조된 키트 로트 번호 58 및 65를 비교하여 평가하였다. 이어서, 키트 재구성 및 생체분포 조사를 실시예 10에서와 같이 실시하였다. 이 데이터를 비쌍체 양방검정 스튜던트 t-테스트를 이용하여 분석하였다. 방사능의 혈액 보유가 유의하게 감소되었고(2.95％에서 2.12％로)(p<0.05), 또한 간 관련 방사능도 6.10％에서 2.82％로 유의하게 감소되었다(p<0.05).

실시예 13: 정맥혈전색전증의 래트 모델에서의 응혈 흡수 비교

친지질성 ^xTc 복합체의 변동이 공지된 제제(로트 58 및 65 - 실시예 7 참조)를 조사하였다. 즉, 래트(수컷 위스타, 250 내지 350g)를 15％ 우레탄으로 마취시켰다. 개복 후, 대정맥을 단리하고 주변 지방 조직을 제거했다. 백금 와이어(1.5cm x 0.5mm)를 내부 대정맥에 삽입하고 5분 후 엘라그산(1.2 x10^-4 M) 0.4㎖를 넙다리정맥을 통해 정맥내 주사하여 응혈 형성을 개시하였다. 60분 후, 로트 58 또는 65 (실시예 7에 따라 제조됨) 0.1㎖ (동물 당 50MBq)를 동일한 정맥을 통해 주사하고, 다시 60분 후 동물을 죽이고 응혈을 제거하고 칭량 및 계수하였다. 다른 조직, 예컨대, 혈액, 폐, 심장도 또한 해부하고 계수하였다. 추적자의 응혈 내로의 흡수는 상대 농도(응혈의 cpm/g를 동물의 투여량/g으로 나눔) 및 백그라운드 조직에 대한 응혈로서 측정했다. 이 모델에서 형성된 응혈의 평균 중량은 약 27 mg, n=32이었다(5 내지 50mg 범위).

응혈 중 방사능의 상대 농도는 로트 58에서는 8.01 (n=4, SD=3.33), 로트 65에서는 7.49 (n-4, SD=1.84)이었다.

Claims (29)

1. 방사성동위원소 ^xTc와 하기 화학식 I의 리간드의 금속 복합체를 포함하며, 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 10％ 미만이 화학식 I의 리간드의 일과성(transient) ^xTc 복합체를 포함하는 테크네튬 복합체 조성물.

   <화학식 I>

   상기 식에서,

   각 R¹ 및 R²는 독립적으로 R기이고;

   x는 94m, 99 또는 99m이고;

   Y는 -(A)_n-Z이고;

   여기서, Z는 분자량이 5,000 미만인 생물학적 표적화 잔기이고;

   -(A)_n-는 링커(linker) 기이며, 여기서, 각 A는 독립적으로 -CO-, -CR₂-, -CR=CR-,-C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NR-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, C_4-8 시클로헤테로알킬렌기, C_4-8 시클로알킬렌기, C_5-12 아릴렌기, 또는 C_3-12 헤테로아릴렌기 또는 폴리알킬렌글리콜, 폴리락트산 또는 폴리글리콜산 잔기이고; n은 0 내지 10의 정수이고;

   각 R기는 독립적으로 H 또는 C_1-10 알킬, C_3-10 알킬아릴, C_2-10 알콕시알킬, C_1-10 히드록시알킬, C_1-10 플루오로알킬, 또는 2개 이상의 R기와 이들이 부착된 원자가 형성한 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리이다.
2. 제1항에 있어서, 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 5％ 미만이 화학식 I의 리간드의 일과성 ^xTc 복합체를 포함하는 테크네튬 복합체 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 5％ 미만이 화학식 I의 리간드의 친지질성 ^xTc 복합체를 포함하는 것을 또한 특징으로 하는 테크네튬 복합체 조성물.
4. 제3항에 있어서, 테크네튬 복합체 조성물 중에 존재하는 ^xTc의 3％ 미만이 화학식 I의 리간드의 친지질성 ^xTc 복합체를 포함하는 테크네튬 복합체 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, x가 99m인 테크네튬 복합체 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 3 내지 20개의 아미노산의 펩티드인 테크네튬 복합체 조성물.
7. 제6항에 있어서, 3 내지 20개의 아미노산의 펩티드가 α₂-항플라스민의 단편인 테크네튬 복합체 조성물.
8. 제7항에 있어서, α₂-항플라스민의 단편이 테트라펩티드 Asn-Gln-Glu-Gln을 포함하는 테크네튬 복합체 조성물.
9. 제8항에 있어서, α₂-항플라스민의 단편이 하기 펩티드를 포함하는 테크네튬 복합체 조성물.

   Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly

   여기서, Xaa는 Tyr 또는 I-Tyr이다.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, Y가 -CH₂CH₂-NR-(A)_mZ이고, 여기서, m은 0 내지 5의 정수인 테크네튬 복합체 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 각 R¹이 독립적으로 C_1-3 알킬, C_2-4 알콕시알킬, C_1-3 히드록시알킬 또는 C_1-3 플루오로알킬인 테크네튬 복합체 조성물.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 하기 화학식 II의 리간드인 테크네튬 복합체 조성물.

    <화학식 II>

    상기 식에서, 각 R¹은 독립적으로 C_1-3 알킬 또는 C_1-3 플루오로알킬이고, p는 0 내지 3의 정수이다.
13. 제12항에 있어서, (A)_p가 -CO- 또는 -NR-인 테크네튬 복합체 조성물.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 각 R¹이 CH₃이고, (A)_p가 NH이고, Z가 Ac-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Xaa-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-이고, 여기서, Xaa가 Tyr 또는 I-Tyr이고, Ac가 N-아세틸인 테크네튬 복합체 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제(radioprotectant)를 또한 포함하는 테크네튬 복합체 조성물.
16. 제15항에 있어서, 방사선보호제가 파라-아미노벤조산 또는 그의 생체적합성 염인 테크네튬 복합체 조성물.
17. 제1항 내지 제16항의 테크네튬 복합체 조성물을 포유류 투여에 적합한 형태로 포함하는 방사성약물.
18. 제17항에 있어서, ^xTc가 ^99mTc인 방사성약물.
19. (i) 제1항의 화학식 I의 리간드;

    (ii) 생체적합성 환원제;

    (iii) 약유기산 또는 그것과 생체적합성 양이온의 염을 포함하는, 제17항 또는 제18항의 테크네튬 방사성약물의 제조를 위한 키트.
20. 제19항에 있어서, 리간드가 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 것인 키트.
21. 제19항에 있어서, 리간드가 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 정의된 화학식 II의 리간드인 키트.
22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, pH 조절제를 또한 포함하는 키트.
23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 생체적합성 환원제가 제1주석을 포함하는 키트.
24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 약유기산이 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 글루콘산, 글루코헵톤산, 벤조산, 페놀 또는 포스폰산인 키트.
25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 방사선보호제를 또한 포함하는 키트.
26. 제25항에 있어서, 방사선보호제가 파라-아미노벤조산 또는 그의 생체적합성 염을 포함하는 키트.
27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조된 키트.
28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,

    (i) 제14항의 화학식 II의 리간드;

    (ii) 제1주석을 포함하는 생체적합성 환원제;

    (iii) 메틸렌디포스폰산을 포함하는 약유기산 또는 그것과 생체적합성 양이온의 염;

    (iv) 파라-아미노벤조산 또는 그의 생체적합성 염을 포함하는 방사선보호제;

    (v) 중탄산나트륨을 포함하는 pH 조절제를 포함하는 키트.
29. 테크네튬 복합체 조성물이 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 것인 제17항의 방사성약물을 사용하는 혈전 진단 조영(imaging) 방법.