MXPA04011828A - Modelo animal para toxicologia y prediccion de dosis. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con el uso de tejidos fetales para generar un modelo de tejido en un animal no humano. El modelo de tejido comprende tejidos objetivo que permiten el progreso hasta el desarrollo in vivo. En un hospedador no humano con el fin de obtener tejidos que tengan un fenotipo maduro que pueda ser utilizado para determinar toxicidad y/o eficacia de una agente.

Description

MODELO ANIMAL PARA TOXICOLOGIA Y PREDICCION DE DOSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se encuentra en el campo de la biología celular. De manera más específica, se relaciona con el uso de tejidos fetales derivados de una especie y que se permite que progresen hasta el desarrollo in vivo en un hospedador de otra especie con el fin de obtener tejidos que tengan un fenotipo maduro que se puede utilizar para determinar actividad o toxicidad de un agente. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso de modelos animales es crítico para la determinación correcta de la eficacia y seguridad de medicamentos nuevos. Las pruebas realizadas en dos especies, habitualmente roedores (conejos, ratas, ratones, hámsteres, cobayos, etc.) y frecuentemente en primates se requieren cuando se presenta una aplicación de investigación de un medicamento nuevo (I D, por sus siglas en inglés) . Los modelos de roedores son menos costosos pero con frecuencia presentan de problemas de ser evolutivamente demasiado alejados del humano y por lo tanto no reflejan adecuadamente la fisiología humana. Esto puede ser válido para estudios tanto de eficacia como de seguridad. Aunque esto ha sido un problema persistente para medicamentos de moléculas pequeñas, conforme se desarrollan más y más anticuerpos, este problema se vuelve incluso más agudo.

Ref . :160020 Los anticuerpos reconocen secuencias separadas de aminoácidos y pueden ser específicos no solo para una proteína dada sino también para una especie específica. Por ejemplo, un anticuerpo para una molécula de adhesión celular epitelial de rata (EpCAM, por sus siglas en inglés) puede reconocer el EpCAM de rata, pero no de ratón o humano (Stephan et al, Endocrinology 140:5841-5854, 1999) y viceversa para anticuerpos contra EpCAM humanos. Esto es válido aunque la secuencia proteínica para la rata, ratón y el humano de EpCAM está conservada en >98%. Debe esperarse que la mayor parte de los anticuerpos para uso terapéutico tendrán cierto grado de especificidad de especie. La mayor parte no reaccionará con proteína de roedor y algunas pueden ser completamente específicas para la forma humana de la proteína y no dan reacción cruzada con versiones de primate no humanas de la misma proteína. Los anticuerpos desarrollados para el tratamiento de cáncer habitualmente se prueban para determinar su eficacia al inyectar subcutáneamente líneas de células derivadas de tumor humano en ratas o ratones inmunodeficientes {nu/nu o SCID) . Dado que el sistema inmunológico de los animales no ataca a las células humanas, las células humanas pueden crecer en tumores humanos. El efecto de los anticuerpos monoclonales sobre estos tumores puede ser estudiado al administrar el anticuerpo monoclonal específico para la proteína humana para el ratón y el crecimiento, encogimiento o muerte del tumor medido. Lo que es más raro, las células tumorales se pueden implantar debajo de la cápsula renal, un área bien vascularizada y se puede permitir que crezcan en este lugar. Estos se denominan como "modelos de xenoinjertos " . No obstante, estos modelos de xenoinjerto no están bien adaptados para realizar determinación de seguridad de medicamentos debido a que los anticuerpos monoclonales administrados no se unirán a la proteína de ratón o rata y por lo tanto no ponen en peligro al hospedador roedor por medio del mecanismo mediado por anticuerpo-objetivo. Generalmente, deben realizarse entonces estudios de seguridad en primates si el anticuerpo monoclonal da reacción cruzada con células de primate, o se deben esperar datos de estudios clínicos en humanos, en fase I. Sería claramente de gran utilidad tener un medio para determinar toxicidad de estos anticuerpos en tejidos humanos normales postnatales o adultos en una etapa previa en comparación a un ensayo clínico. Un enfoque conocido para determinar tal seguridad es utilizar inmunohistoquímica para determinar los diversos tipos de células o de tejido humano que se unen por los anticuerpos. No obstante, es bien sabido de los ensayos clínicos de anticuerpos que la unión del anticuerpo solo no es un elemento de predicción de la seguridad. Algunos anticuerpos monoclonales se unen a tejidos cancerosos pero no perjudican su función, es decir, destruyen las células cancerosas o reducen la proliferación de las células cancerosas. Véase, por ejemplo, Le is et al Cáncer Immunol Immunother 37:255-263 (1993); Herlyn et al J. Immunol Methods 73:157-167 (1984); Fendly et al Cáncer Research 50:1550-1558 (1990); y Balzer et al J. Mol Med 77.-699-712 (1999). Además, es extremadamente difícil obtener tejidos de diversos tipos de tejido a partir de adultos sanos normales y por lo tanto es difícil determinar los efectos de un anticuerpo que se une a un tejido normal o determinar cualquier toxicidad de un anticuerpo sobre tejidos normales. La mayor parte de los estudios que utilizan tejido humano usan tejidos extraídos en autopsias. Estos tejidos son variables en cuanto a calidad y estado de enfermedad y con frecuencia han experimentado cambios mayores. De manera alternativa, se puede obtener tejido que es extraído durante cirugía debido á que se encuentra adyacente a tejido enfermo, tal como cáncer y se puede congelar o conservar de inmediato. Este tejido extraído quirúrgicamente es más relevante para el te ido vivo que el tejido obtenido en autopsias, pero debido a su proximidad a tejido enfermo o a tratamientos que el paciente ha experimentado, este tejido también puede ser significativamente diferente del tejido normal. Un modelo animal que pueda permitir comparaciones directas del efecto de un agente tal como un anticuerpo monoclonal u otra proteína o molécula pequeña de medicamento, en tejidos humanos tanto enfermos (por ejemplo tumorales) como normales y que al mismo tiempo pueda ser extremadamente valioso en determinar toxicidad y eficacia del agente. Los modelos animales que pueden permitir determinaciones de variación de dosis del agente terapéutico en una especie diferente al modelo animal también pueden ser extremadamente útiles para propósitos en el diseño de la toxicología y otros estudios que se utilizan para fundamentar la presentación de un IND. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un modelo animal no humano de tejidos normales que tienen un fenotipo maduro y tejidos enfermos. Este modelo es útil, por ejemplo, para determinar los efectos (por ejemplo toxicidad) de diversos agentes sobre tejidos normales y enfermos. En consecuencia, en un aspecto, la invención es un método para generar un modelo no humano de animal vertebrado que tiene objetivo de tejido normal de fenotipo maduro y tejidos, enfermos objetivo tanto de un primer animal vertebrado mediante: (a) implantación de tejido normal objetivo inmaduro o recombinantes de tejido normal elaborados a partir de células inmaduras o progenitoras del primer animal en un segundo animal receptor vertebrado no humano en un lugar suficiente para soportar el crecimiento y la maduración del tejido; (b) permitir que el tejido normal objetivo del primer animal se desarrolle en un tejido con un fenotipo maduro; (c) implantar el tejido enfermo objetivo o las células enfermas del primer animal en un animal' receptor vertebrado no humano en un lugar suficiente para soportar el crecimiento del tejido enfermo; y (d) permitir que el tejido enfermo objetivo o las células enfermas del primer animal crezcan . En algunas modalidades preferidas, tanto el tejido normal objetivo como el tejido enfermo objetivo del primer animal se implantan en lugares diferentes en un animal vertebrado no humano, único. En otras modalidades, los te idos objetivo normales y enfermos se implantan en diferentes animales de la misma especie o de especies diferentes, dependiendo de los datos comparativos deseados. Preferiblemente en este caso, las implantaciones se realizan en paralelo, o tan cerca o tan inmediatamente como se pueda y de manera más preferible en el mismo día. En algunas modalidades, tanto el tejido normal objetivo implantado como el tejido enfermo implantado son de origen humano. Los animales vertebrados adecuados para tener tejido implantado en un segundo animal son muchos, e incluyen a modo de ejemplo y sin limitación, mamíferos y otros vertebrados con preferencia particular a especies como ratones, ratas, aves, conejos, gatos, perros, cerdos, borregos, chivos, venados, caballos, ganado, humanos y primates no humanos tales como papiones, chimpancés y monos. El animal seleccionado para albergar o recibir el tejido objetivo para implantación preferiblemente es un animal vertebrado no humano inmunodeficiente . Los animales adecuados para cumplir con esta función son muchos e incluyen a modo de ejemplo y sin limitación vertebrados mamíferos y no mamíferos. Las modalidades preferidas particularmente se seleccionan de manera deseable del grupo que consiste de ratones, ratas, conejos, ranas, aves, gatos, perros, cerdos, borregos, chivos y primates no humanos. En algunas modalidades, el primate no humano es el papión, chimpancé o mono . Los animales vertebrados no humanos preferidos particularmente para recibir y albergar una implantación de acuerdo con esta invención son roedores inmunodeficientes (ratón y rata) . En otro aspecto, la invención es un modelo de tejido para tejido normal objetivo o para tejido enfermo a partir de una primera especie de animal vertebrado que tiene un fenotipo maduro presente dentro de un segundo animal receptor u hospedador no humano inmunodeficiente , en donde el tejido de la primera especie objetivo normal o enfermo se selecciona del grupo que consiste de tejidos de los siguientes sistemas biológicos: sistema nervioso central: Cerebro - (materia gris y blanca que contiene neuronas, neuroglia, etc.) y cerebelo, ojo, tallo cerebral (protuberancia, médula, cerebro medio), médula espinal; endocrino: (suprarrenal (corteza y médula), ovario, páncreas (islotes de Langerhans y páncreas exocrino) , paratiroides , hipófisis (adenohipófisis y neurohipófisis) , testículos, tiroides (epitelio folicular, células parafoliculares , coloide, etc.); mama: mama (lóbulos, ductos, células mioepiteliales , etc.); hematopoyético : bazo, amígdalas, timo, médula ósea (linfocitos; monocitos/macrófagos , granulocitos , precursores eritroides, megacariocitos , mastocitos, osteoclastos y osteoblastos) , células de sangre periférica (neutrófilos, linfocitos, monocitos, vasófilos, eosinófilos, eritrocitos y plaquetas) ; respiratorio: pulmón (bronquios, bronquiolos, alvéolos, etc.); cardiovascular: corazón, vasos sanguíneos (arterias, venas, etc.); gastrointestinal: esófago, estómago (fondo) , intestino delgado (íleon, yeyuno o duodeno) , colon, hígado (tríadas portales, células hepáticas, etc.), glándulas salivales; genitourinario: riñon, sistema urinario, vejiga, uréter, uretra, trompas de falopio, vagina, placenta, próstata, útero, cuello uterino; músculo esquelético: músculo esquelético; piel: piel (epidermis, apéndices, dermis); nervios periféricos: nervios periféricos; células mesoteliales : células de revestimiento de la pared del tórax, pared abdominal, pericardio o de la superficie de muestras gastrointestinales, de corazón o pulmón, etc. En ciertos aspectos preferidos particularmente, la invención es un ratón o rata inmunodeficiente que tiene modelos de tejido humano para tejido humano normal objetivo que tiene fenotipo maduro y tejido humano enfermo en donde el tejido humano normal se selecciona del grupo que consiste de pulmón, próstata, riñon, páncreas, vejiga, piel, hígado, corazón, colon, duodeno, estómago, tiroides, glándula salivaría y timo. En otro aspecto, la invención es un método para determinar el efecto de un tratamiento dirigido contra un tejido enfermo objetivo al aplicar dicho tratamiento a un animal receptor vertebrado no humano inmunodeficiente de una especie que tiene por lo menos uno de cada uno de un tejido normal objetivo que tiene fenotipo maduro y un tejido enfermo objetivo, en donde estos tejidos objetivo son de una especie de animal vertebrado diferente del animal receptor y determinar el efecto del tratamiento en los tejidos objetivo normal y enfermo. En ciertos aspectos, los modelos animales de esta invención son particularmente útiles para evaluar tratamientos candidato que se van a aplicar contra tejido enfermo tal como cáncer, en donde los tratamientos candidatos van a ser utilizados para radioterapia, quimioterapia o terapia radiofarmacéutica o radioinmunoterapia . Los modelos animales de esta invención también son útiles para formación de radioimágenes de neoplasmas o tumores y para el estudio de metástasis . En otros aspectos, la invención es un método para determinar una dosis de un agente que es tóxico para un tejido objetivo al administrar un agente a un animal receptor inmunodeficiente que tiene por lo menos un tejido normal objetivo que tiene un fenotipo maduro y un tejido canceroso objetivo de un animal donador, y determinar cualquier efecto tóxico, perjudicial o adverso del agente sobre los tejidos objetivo normales o cancerosos. En otro . aspecto, la invención es un método para identificar un agente que es tóxico para las células objetivo infectadas, enfermas o cancerosas en mayor medida que las células normales por administración de un agente a un animal receptor inmunodeficiente que tiene tanto tejido objetivo normal que tiene fenotipo maduro como tejido objetivo enfermo o canceroso de un animal donador e identificar el agente que reduce el crecimiento o que destruye a los tejidos objetivo infectados, enfermos o cancerosos en mayor medida en comparación con los tej idos normales . En otro aspecto, la invención es un método para determinar una cantidad eficaz de un agente que es tóxico para células enfermas o cancerosas en un grado mayor en comparación con células normales al administrar un agente a un animal receptor inmunodeficiente que tiene tanto tejido objetivo normal que tiene fenotipo maduro como tejido humano canceroso de un animal donador y determinar una cantidad de agente que es eficaz en los tejidos objetivos tanto normales como enfermos o cancerosos . En otras modalidades adicionales, se proporcionan ensayos de cribado basados en animales completos. En estas modalidades, la invención abarca el uso de animales hospedadores no humanos que ya han recibido implantes de tejido objetivo de acuerdo con la invención, o partes del mismo, para probar las propiedades citotóxicas, citostáticas , antimicrobianas, antiinflamatorias u otras propiedades terapéuticas de tratamientos administrados a los mamíferos, o para probar la actividad de tales tratamientos en el control o inhibición de desarrollo de cáncer, infecciones o enfermedades. Así, de acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para cribado e identificación o para prueba de un tratamiento, medicamento u otra sustancia o tratamiento para determinar la actividad contra el desarrollo o en el tratamiento de cáncer, infección o enfermedad, que comprende administrar a un animal hospedador no humano que ya ha recibido implantes de tejido objetivo de acuerdo con las enseñanzas de esta invención, en donde el tratamiento, medicamento u otra sustancia relacionada y la detección o la anotación de que cualquier incidencia reducida en el desarrollo de cáncer, infección o enfermedad y una reducción en la morbilidad, en comparación con animales correspondientes que no reciben el tratamiento, droga o sustancia o la detección o nada de una eficacia en el mantenimiento, restauración o mejoramiento de la función corporal . DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra el resultado cuando los tejidos de órganos fetales normales que se han colocado en la cápsula renal (paneles 1, 2, 3, 6, 7 y 8) o la almohadilla grasa (paneles 4 y 5) de ratones atímicos (nu/nu) panel 1, 6, 7 y 8) o ratones SCID (panel 2, 3, 4, 5) comprome idos inmunológicamente y se permite que se desarrollen en un fenotipo más maduro. La figura 2 muestra los resultados de utilizar tejidos madurados para modelo de seguridad/eficacia. En la figura se muestran los ríñones de los animales. El lado izquierdo de la figura 2 muestra los tumores LnCAP mientras que el lado derecho muestra los tejidos normales. Los paneles superiores son de animales tratados mientras que los paneles inferiores son de animales control. La figura 3 muestra la inmunohistoquímica de tejidos madurados de próstata humana y colon humano a partir de los experimentos que se describen en la figura 2. Los tejidos también se tiñen con anticuerpo mPA6 marcado directamente (anticuerpo contra EpCAM humano) . El anticuerpo contra EpCAM humano, mPA6, no se une a EpCAM de ratón. Las figuras 4A y 4B muestran los resultados de un estudio de seguridad/eficacia con anticuerpo mPA7. Este anticuerpo se une al antígeno PA7 humano (CD46) , el cual está presente en próstata normal y epitelio de páncreas en cáncer pancreático. Este anticuerpo no reconoce a la contraparte de antígeno de ratón. La figura 5 muestra dos recombinantes de tejido humano diferentes. Se puede inducir una línea de células progenitoras epiteliales de vejiga (hBLA) para formar epitelio de vejiga maduro (anterior) al combinar con mesénquima de vejiga fetal. No obstante, las mismas células formarán epitelio de próstata maduro cuando se combinen con el mesénquima de la vesícula seminal (abajo) . Las flechas indican células con tinción positiva. Las figuras 6-1 a 6-4 muestra tejidos bien desarrollados de colon humano, páncreas, corazón y próstata de órganos fetales normales humanos que han crecido durante seis meses en ratones SCID. La figura 7 muestra tejidos en mosaico de humano y de rata de testículos e hígado en donde la porción epitelial se deriva de líneas de células progenitoras fetales y la porción estromal se deriva del mesénquima de rata fetal . Los tejidos se recombinan y se permite que se desarrolle durante 4 a 10 meses para obtener un prototipo maduro. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Describimos un modelo animal no humano en el cual se permite que los tejidos normales fetales objetivo o recombinantes de tejido de especies animales humanas u otras especies, típicamente elaborados utilizando líneas de células normales, y mesénquima de rata o ratón extirpado, experimenten maduración de desarrollo in vivo. El modelo resultante se puede utilizar para determinar los efectos de un agente en tejido objetivo tanto normal como enfermo (por ejemplo canceroso) . Este modelo es particularmente útil como un modelo humano debido a que los tej idos humanos maduros normales representativos de una diversidad de órganos no están disponibles fácilmente para experimentación. El uso de tejidos fetales humanos o de recombinantes de tejido elaborados de células progenitoras humanas proporciona acceso a una amplia variedad de tejidos humanos madurados que de otra manera no están disponibles fácilmente. Por ejemplo, las células progenitoras pancreáticas humanas pueden dar lugar a células humanas del ducto, acinares y de islote. Utilizando este modelo de animal no humano (es decir, modelo de xenoinjerto) , se pueden determinar fácilmente los efectos de un régimen o agente de tratamiento terapéutico en la totalidad de los tres tipos de células pancreáticas humanas maduras .

Similarmente , describimos modelos animales no humanos en los cuales el tejido fetal o los recombinantes del tejido que se permite que experimenten maduración de desarrollo in vivo se derivan de otros animales vertebrados no humanos . I . Técnicas Generales A menos que se indique de otra manera, la práctica de la presente invención utilizará técnicas convencionales de biología molecular (que incluyen técnicas recombinantes) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología los cuales están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989) Cold Spríng Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis ( .J. Gait, ed. , 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed. , 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. , 1987); Jntroduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press: Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D . G. Newll, eds . , 1993-8) J. Wiley y Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocole in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds . , 1987); PCR: The Polymera.se Chain Reacton, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocole in Imm nology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Protocols in Molecular Biology (Wiley y Sons, 1999) ; Immunbiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997) ; Antibodies : a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies : a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a JaJorato-ry manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zenetti y J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993). II. Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos en la técnica, anotaciones y otra terminología específica utilizada en la presente se diseña para que tenga los significados entendidos habitualmente por los expertos en la técnica a la cual pertenece la invención. En algunos casos, los términos con significados comprendidos comúnmente se definen en la presente por claridad o para una referencia fácil, y la inclusión de tales definiciones en la presente no necesariamente debe considerarse que represente una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica. Las técnicas y procedimientos que se describen a los que se hace referencia en la presente generalmente están bien entendidos y se utilizan habitualmente usando metodología convencional por aquellos expertos en la técnica tales como, por ejemplo, las metodologías de clonación molecular ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pres, Cold Spring Harbor, N.Y. Según sea apropiado, los procedimientos que involucran el uso de equipos y reactivos disponibles comercialmente generalmente se llevan a cabo de acuerdo con los protocolos o parámetros definidos por el fabricante, a menos que se indique de otra manera. Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unión específica a un objetivo, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc. , a través de por lo menos un sitio de reconocimiento de antígeno, que se localiza en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término abarca no solo a los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos de cualquier isotipo (IgA, IgG, IgE, IgD, o IgM) , sino también a fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab 1 , F(ab')2/ Fv) , dado que los imitantes de cadena ligera (ScFv) , de los mismos, las proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, los anticuerpos quiméricos (por ejemplo anticuerpos humanizados) y cualquier otra conf guración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. Un "anticuerpo monoclonal " se refiere a una población de anticuerpo homogénea en donde el anticuerpo monoclonal está constituido de aminoácidos (que se presentan de manera natural y que no se presentan de manera natural) que están involucrados en la unión selectivo de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, están dirigidos contra un único sitio antigénico. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa de cualquier isotipo (IgA, IgG, IgE, IgD, o IgM) , sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab ' , F(ab')2/ Fv) , mutantes de cadena única (ScFv) , de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una fusión de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécla de inmunoglobulina que comprende un sitio, de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un antígeno. Tales fragmentos y variantes son bien conocidos en la técnica y se utilizan regularmente in vitro e in vivo. Esta invención no se pretende que se limite respecto a la fuente de anticuerpo o la manera en la cual se elabora (por ejemplo, por hibridoma, selección de fago, expresión recornbinante, animales transgénicos, etc.). Los fragmentos o análogos se pueden preparar utilizando métodos de ADN recornbinante o por métodos sintéticos tales como síntesis en fase sólida. Una "molécula pequeña" se refiere a cualquier composición de materia que no está elaborada de aminoácido y que tiene un peso molecular menor de aproximadamente 5000 daltons, preferiblemente menor de aproximadamente 2500 daltons. Una "cantidad eficaz" o una "cantidad suficiente" de un anticuerpo u otro tratamiento, sustancia o agente de diagnóstico o terapéutico es una sustancia suficiente para llevar a cabo los resultados benéficos o deseados, que incluye la obtención de la información de diagnóstico o de pronóstico, los resultados clínicos tales como el encogimiento en el tamaño del tumor (en el contexto de cáncer, por ejemplo, de cáncer de mama o próstata) , el retardo del crecimiento de células enfermas o cancerosas, disminución de los síntomas que resulta de la enfermedad, incremento en la calidad de vida de aquellos quienes que padecen la enfermedad, disminución de la dosis u otras medicaciones requeridas para tratar la enfermedad, retraso del progreso de la enfermedad o prolongación de la supervivencia de los individuos. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para propósitos de esta invención, una cantidad eficaz de medicamento, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para reducir la proliferación (o para destruir) células cancerosas o enfermas o infectadas y reducir el retraso de desarrollo o el crecimiento de la metástasis de células cancerosas, directa o indirectamente. Un "agente" es cualquier elemento al cual se puede exponer un individuo y pueden incluir, sin limitación, anticuerpos, moléculas pequeñas, proteínas, compuestos farmacéuticos (por ejemplo medicamentos), sustancias químicas caseras, industriales, ambientales y de otro tipo. Los agentes que se pueden probar en los modelos animales de esta invención incluyen pero no se limitan a agentes inmunoquimoterapéuticos, citocinas, agentes quimioterapéuticos y sustancias radiofarmacéuticas y también pueden comprender agentes radioactivos internos o externos así como péptidos radiomarcados . La terapia de genes llevada a cabo por métodos bien conocidos en la técnica también se puede evaluar utilizando estos modelos. Se conocen muchos agentes quimioterapéuticos. Los agentes adecuados para uso en la práctica de esta invención se pueden seleccionar, pero no se limitan a los siguientes: alopurinol de sodio, mesilato de dolasetron, pamidronato disódico, etidronato, fluconazol, epoetina a, clorhidrato de levamisol, amifostina, clorhidrato de granisetron, leucovorin de calcio, sargamostim, dronabinol, mesna, filgrastim, clorhidrato de pilocarpina, acetato de octreotide, dexrazoxano, clorhidrato de ondansetron, ondansetron, busulfan, carboplatino, cisplatino, tiotepa, clorhidrato de melfalano, melfalano, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, clorhidrato de mecloretamina, carmustina, lomustina, polifeprosano 20 con implante de carmustina, estreptozocina, clorhidrato de doxorrubicina , sulfato de bleomicina, clorhidrato de daunirribicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina, clorhidrato de idarrubicina, plimicina, mitomicina, pentostatina, mitoxantrona, valrrubicina, citarabina, fosfato de fludarabina, floxuridina, cladribina, metotrexato, mercaptopurina, tioguanina, capecitabina, metiltestosterona, nilutamida, testolactona, bicalutamida, flutamida, anastrozol, citrato de toremifeno, tamoxifeno, fosfato de sodio de estramustina, etinilestradiol , estradiol, estrógenos esterificados , estrógenos conjugados, acetato de leuprolide, acetato de goserelina, acetato de medroxiprogesterona , acetato de megestrol, clorhidrato de levamisol, aldesleucina, clorhidrato de irinotecano, dacarbazina, asparaginasa, fosfato de etopósido, clorhidrato de gemcitabina, trastuzumab, altretamina, clorhidrato de topotecano, hidroxiurea, interferón a-2b, mitotano, clorhidrato de procarbazina, tartrato de vinorrelbina , L- asparginosa de E. coli, L-asparginasa de Erwinia, sulfato de vincristina, denileucina diftitox, aldesleucina , rituximab, interferón a-2a, paclitaxel, docetaxel, BCG viva ( intravesical ) , sulfato de vinblastina, etopósido, tretinoina, tenipósido, porfímero de sodio, fluorouracilo , fosfato de betametasona de sodio y acetato de betametasona, letrozol, factor de etopósido citrororum, ácido folínico, leucouorin de calcio, 5-fluorouricilo, adriamicina, citoxano y diaminodicloroplatino . En otro aspecto, la invención proporciona un método para evaluar la eficacia de un método de formación de radioimágenes de tumores o neoplasmas, o de un método para tratamiento con un anticuerpo radiomarcado, que comprende la etapa de administrar un anticuerpo específico de tumor, radiomarcado al modelo de animal de la invención. El anticuerpo radiomarcado puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal que comprende una radiomarca, que preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de tecnecio- 99m, indio-111, yodo-131, renio -186, renio-188, samario-153, lutecio-177, cobre-64, escandio-47 e ítreo-90. Los anticuerpos monoclonales marcados con estos radionúclidos terapéuticos tales como yodo-131, renio-188, holmio-166, samario-153 y escandio-47, los cuales no comprometen la inmunorreactividad de anticuerpos y no se descomponen in vivo, son los que se prefieren de manera especial. La persona experta en la técnica apreciará que se conocen otros isótopos radioactivos y que pueden ser adecuados para aplicaciones específicas. La formación de radioimágenes se puede llevar utilizando la Tomografía computarizada de emisión de fotones únicos (SPECT) , la Tomografía de emisión de posición (PET) , la Tomografía por computadora (CT) o la Formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) . La formación de imagen correlativa, que permite una mayor definición anatómica de la ubicación de las metástasis localizadas por formación de radioinmunoimagen también se contempla. Un "individuo" es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, y de manera más preferible un humano. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a animales de granja, animales de caza, mascotas, primates, ratones y ratas. Como se utiliza en la presente, el término " inmunodeficientes " significa una incapacidad innata, adquirida o inducida, para desarrollar una respuesta inmunológica normal. Como se describe con mayor detalle en lo siguiente, los métodos para reducir el nivel de respuesta inmunológica del individuo por debajo de lo normal son bien conocidos en la técnica y su uso en el contexto de esta invención está dentro de la habilidad habitual de los expertos .

Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" es una solución para obtener resultados clínicos benéficos o deseados. Para propósitos de esta invención, los resultados clínicos benéficos o deseados incluyen, pero no se limitan a alivio de los síntomas, disminución del grado de enfermedad, estado estabilizado de la enfermedad (es decir, que no empeore) , retraso o frenado del avance de la enfermedad, disminución o paliación del estado de enfermedad y remisión (parcial o total), detectable o indetectable . El término "tratamiento" también significa prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" incluye profilaxis. El tratamiento incluye cese del crecimiento de un tumor u otro tejido enfermo, regresión o desaparición de un tumor sólido detectable o de un tejido infectado o enfermo de manera detectable, o prevención o disminución en metástasis de un tumor o el tejido dispersado o infectado, o enfermo. El término "paliar" una enfermedad significa que el grado o las manifestaciones clínicas indeseables de un estado de enfermedad se frenan o el curso en el tiempo del progreso del estado de enfermedad se frena o se prolonga, en comparación con una sustancia que se sabe que tiene poco o nulo efecto sobre estos parámetros de enfermedad.

Como se utiliza en la presente, los modelos de la invención son valiosos para la evaluación de una gama de enfermedades y desórdenes que incluyen, a modo de ejemplo y no como limitación: anemias, cánceres malignos, desórdenes autoinmunes, diversas disfunciones y deficiencias inmunológicas , infección por microorganismos patógenos, diabetes, enfermedad de ovario poliquístico, hipertrofia prostética benigna, osteoporosis, enfermedades neurodegenerativas tales como ALS, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, distrofia muscular, diversos desórdenes metastásicos y no metastásicos tales como diversos cánceres cutáneos que incluyen melanoma; cáncer de mama,- cáncer de próstata; cáncer renal; cáncer hepático; cáncer pulmonar, cáncer de cerebro y otros cánceres de cabeza y cuello que incluyen glioblastomas ; linfornas y leucemias, enfermedades cardiovasculares, daño renal y enfermedades, etc. En algunos aspectos de esta invención, los modelos animales facilitan la determinación de una dosis segura y eficaz de un régimen terapéutico que resulta en un mejoramiento de la calidad de vida del individuo, medido por una- reducción en náusea, vómito, pérdida de apetito, incapacidad para dormir, declinación de las sensaciones en general, reducción en la actividad diaria, fatiga y depresión, sin incrementar otros efectos secundarios indeseables.

En algunos otros aspectos, los modelos animales de esta invención se utilizan para fundamentar las determinaciones tanto de diagnóstico como de pronóstico de médicos e investigadores. Esto se lleva a cabo por aplicación de los métodos de esta invención para el uso de muestras de tejido de paciente para implante o mediante el uso de sustancias derivadas de muestras de pacientes para tratar tejido ya implantado. El tejido implantado y los métodos de tratamiento de tejido son los mismos a los descritos en la presente y los métodos de determinación de resultados están dentro de la habilidad habitual de los expertos. III. Generación de un modelo animal de fenotipo de tejido madurado Un modelo animal de fenotipo de tejido madurado se puede generar por diversos métodos diferentes. El animal receptor preferiblemente es un animal inmunodeficíente . Los animales que no son inmunodeficientes montarán una respuesta inmunológica adversa a los tejidos de otra especie que se implanta en el animal y por lo tanto el uso de animales inmunodeficientes se alienta en gran medida. En una modalidad, el animal es un ratón o una rata. La inmunodeficiencia puede generarse a través de crianza genética (por ejemplo ratones nu/nu, SCID, RAG, ratones beige o ratas desnudas, ratones o ratas atímicas, etc.), manipulación genética (por ejemplo tecnología de "bloqueo de expresión" genético) o por irradiación o por inmunosupresión química de los animales (por ejemplo al tratarlos con inmunosupresores tales como ciclosporina o al tratarlos con radiación u otro método que destruye a los linfocitos T y B inmunes) . Los sujetos animales preferidos de esta invención son animales vertebrados. El animal objeto de la presente invención particularmente preferido es un mamífero. Mediante el término "mamífero" se quiere significar un individuo que pertenece a la clase de los Mammalia. La invención es particularmente útil en la aplicación a tejido humano, aunque se pretende que también se pueda utilizar en el ámbito veterinario . Los tejidos de objetivo humanos y de otras especies que se implantan en el animal receptor son de naturaleza inmadura y pueden derivarse de diversas fuentes . En otro aspecto, el tejido humano son tejidos no cancerosos, no enfermos, es decir, tejidos normales derivados de tejidos fetales humanos que incluyen, pero que no se limitan a tejidos de los siguientes sistemas biológicos: sistema nervioso central: Cerebro - (materia gris y blanca que contiene neuronas, neuroglia, etc.) y cerebro-cerebelo, ojo, tallo cerebral (protuberancia, médula, cerebro medio) , médula espinal; endocrino: suprarrenal (corteza y médula), ovario, páncreas (islotes de Langerhans y páncreas exocrino) , paratiroides , hipófisis (adenohipófisis y neurohipófisis) , testículos, tiroides (epitelio folicular, células parafoliculares , coloide, etc.); mama: mama (lóbulos, ductos, células mioepiteliales , etc.); hematopoyético : bazo, amígdalas, timo, médula ósea (linfocitos; monocitos/macrófagos , granulocitos , precursores eritroides, megacariocitos , mastocitos, osteoclastos y osteoblastos) , células de sangre periférica (neutrófilos , linfocitos, monocitos, vasófilos, eosinófilos, eritrocitos y plaquetas); respiratorio: pulmón (bronquios, bronquiolos, alvéolos, etc.); cardiovascular: corazón, vasos sanguíneos (arterias, venas, etc.); gastrointestinal: esófago, estómago (fondo), intestino delgado (íleon, yeyuno o duodeno) , colon, hígado (tríadas portales, células hepáticas, etc.), glándulas salivales; genitourinario: riñon, sistema urinario, vejiga, uréter, uretra, trompas de falopio, vagina, placenta, próstata, útero, cuello uterino; músculo esquelético: músculo esquelético; piel: piel (epidermis, apéndices, dermis); nervios periféricos: nervios periféricos; células mesoteliales : células de revestimiento de la pared del tórax, pared abdominal, pericardio o de la superficie de muestras gastrointestinales, de corazón o pulmón, etc. Los tipos de tejido preferidos particularmente para implantación actualmente son hígado, pulmón, próstata, riñon, páncreas, corazón, colon, duodeno y timo. El tejido fetal se puede cortar en piezas pequeñas lo suficientemente pequeñas para colocarse en el sitio de implantación, pero deben ser suficientemente grandes para contener elementos tanto estromales como epiteliales del tejido de origen. En una modalidad, el tejido se corta en un tamaño de 10 mm x 10 mm x 10 mm. En otra modalidad, el tejido se corta en un tamaño de 5 mm x 5 mm x 5 mm. En otra modalidad, el tejido se corta en un tamaño de 1 mm x 1 mm x 1 mm. Se puden requerir varios recombinantes para representar todos los tipos de células diferentes de un tejido grande que contiene muchos tipos de células diferentes, tal como el pulmón. Se pueden colocar bajo la cápsula suprarrenal del mismo riñon dos o varias piezas. En otra modalidad, la fuente de tejido es una línea de células progenitores humanas derivada de tejido fetal humano, se expanden y se recombinan con mesénquima de rata o ratón seleccionado para promover la diferenciación y maduración de células progenitoras a uno o más tipos de células humanas maduras para formar un recombinante de tejido de humano/roedor . Por ejemplo, tales recombinantes de tejido pueden ser células progenitoras pancreáticas humanas (hPED) aisladas y que crecen como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,436,704, las células progenitoras Mullerian humanas aisladas y que crecen como se describe en la patente de E.U.A. No. de Serie 6,416,999, las células progenitoras de ovario humano aisladas y que crecen como se describe en O 01/77303 o células progenitoras humanas de vejiga (hBLA) como se describe en la solicitud de patente pendiente PCT/US03/04547, la enseñanza de la totalidad de las cuales se incorpora específicamente como referencia en la presente. Los ejemplos de otras células progenitoras humanas específicas de tejido o líneas de células humanas que se pueden recombinar con mesénquima de rata o ratón (por ejemplo) para formar un recombinante de te ido, de acuerdo con las enseñanzas de esta invención incluyen pero no se limitan a aquellas de ovario, vejiga, páncreas, pulmón, piel, riñon, colon, tiroide, hígado, corazón, testículos y próstata. En otra modalidad, la fuente de tejido puede ser líneas de células derivadas de mesénquima humano. En otra modalidad adicional, la fuente de tejido puede ser cualquier línea de célula progenitora humana recombinada con tejido de mesénquima de roedor o líneas de células derivadas de mesénquima humano apropiado (por ejemplo mesénquima pancreático (hPE ) combinado con células progenitoras pancreáticas humanas tales como hPED) . En otra modalidad adicional, la célula humana tal como las células de Schwann o células neuroepiteliales se pueden utilizar para implantación en un animal inmunodeficiente . En otras modalidades, los tejidos del párrafo precedente se derivan alternativamente de las células progenitoras o se derivan de tejido fetal o líneas de células adecuadas u otras especies de vertebrados no humanos .

En otra modalidad adicional, la fuente de tejido puede ser cualquier línea de células animales vertebradas de humano u otro diferente de humano que crezcan en una matriz de colágeno u otro material de matriz (por ejemplo un coágulo de plasma, una matriz de EHS, Matrigel, etc.) . Cada tipo de célula se cultiva en un medio diseñado para mantener al fenotipo progenitor. Se preparan células (1-3 x 106) y se combinan con el mesénquima apropiado como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,436,704 y la patente de E.U.A. No. 6,416, 999. En otro aspecto, los tejidos objetivo están infectados, enfermos o son cancerosos. Por ejemplo, las líneas de células derivadas de tumor humano o de otros tejidos enfermos se pueden utilizar. Estas células se pueden obtener de una biopsia o una autopsia, de tumores transplantes transportados en ratones o ratas inmunodeficientes o a partir de líneas de células inmortales establecidas a partir de tumores humanos o transformadas in vi tro. Una vez que se obtienen tejido normal, canceroso, infectado o enfermo de un animal objetivo, el tejido objetivo se implanta después dentro del animal inmunodeficiente . Son posibles diversos sitios de implantación. En una modalidad preferida el tejido o el recombinante de tejido se implanta debajo de la cápsula renal del animal inmunodeficiente . Se conoce en la técnica el uso de ratones atímicos para xenotransplante generalmente de tumores humanos. En otras modalidades, el tejido objetivo o el recombinante de tejido se implanta en la almohadilla grasa, subcutáneamente o en algún otro lugar en el animal inmunodeficíente de manera que el tejido objetivo o el recombinante de tejido puedan desarrollarse y madurar y que se pueda localizar después de un período de tiempo prolongado ípor ejemplo después de un mes o más) . En otra modalidad, los tejidos que contienen tanto elementos epiteliales como de mesénquima se recortan a piezas cúbicas de 1 mm y se colocan debajo de la cápsula renal o se colocan en la almohadilla grasa de un animal inmunodeficíente . Una vez que la fuente de tejido se ha implantado en el animal inmunodeficiente, se permite que el tejido se desarrolle por la cantidad de tiempo requerida para maduración al fenotipo adulto. Esto puede diferir de un tej ido a otro pero estará en el intervalo de aproximadamente 2 a 52 semanas, preferiblemente de aproximadamente 4 a 36 y de manera más preferible de aproximadamente 6 a 24 semanas para alcanzar la etapa deseada de desarrollo. La etapa deseada de desarrollo se puede determinar al implantar tejido de la fuente fetal (10-24 semanas de desarrollo) y al permitir el desarrollo por una gama de 6 a 24 semanas y al buscar en la histología y la expresión de marcadores conocidos específicos para maduración en el tejido resultante. En general, de acuerdo con los métodos de esta invención, se requiere más tiempo para el crecimiento y maduración de tejidos normales en comparación con el crecimiento de tejidos cancerosos. En una modalidad, los animales que tienen 1-3 tejidos normales que se han implantado debajo de una cápsula renal se permite que maduren. Las células tumorales se pueden implantar en la cápsula renal contraria aproximadamente 0-2 semanas antes de la administración de uno o más agentes. Se puede permitir que el tejido normal madure en un animal y después ese animal es sacrificado y el tejido es extirpado. El tejido madurado se puede dividir en dos o más piezas equivalentes y se puede implantar en dos o más animales receptores para generar animales que presenten piezas pareadas de tejido humano normal. Esto es útil dado que un animal es el control y el otro animal es tratado con uno o más agentes. Las células tumorales se pueden implantar en la cápsula renal contraria en este momento. En otra modalidad, únicamente se implantan tejidos normales dentro del animal receptor. Esto es útil para probar el régimen de tratamiento o un agente terapéutico, por ejemplo, un anticuerpo, para determinar sus efectos en una diversidad de tejidos normales. En algunos casos, el agente, por ejemplo un anticuerpo, se sabe qüe tiene un efecto perjudicial sobre tejido canceroso. Un modelo animal que tenga únicamente tejidos normales puede ser utilizado para determinar si el agente tiene algún efecto perjudicial sobre otro tejido normal sobre una gama de dosis. II . Agentes Los modelos animales que se describen en la presente se pueden utilizar para determinar el efecto de diversos agentes que incluyen, pero que no se limitan a anticuerpos, moléculas pequeñas, péptidos, péptidomiméticos y proteínas. Las moléculas pequeñas que se pueden utilizar incluyen compuestos químicos sintéticos tales como medicamentos que se prueban para aprobación por la FDA. Las proteínas que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a péptidos sintéticos y proteínas, proteínas recombinantes y proteínas que se presentan de manera natural. Se pueden utilizar para administración diversas formulaciones de los agentes terapéuticos de esta invención. En algunas modalidades, el agente se puede administrar sin diluir. En otras modalidades, se administran el agente y el excipiente farmacéuticamente aceptable y pueden estar en diversas formulaciones. Los excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede proporcionar consistencia o actuar como un diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsificantes , sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, amortiguadores y mejoradores de la penetración en la piel . Los excipientes así como las formulaciones para la administración de medicamentos por vía parenteral y no parenteral se establecen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20ava. vigésima edición, Lippincott, Williams & Wilkins, Publishing. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo sales hidrosolubles . Además, las suspensiones de los compuestos activos apropiadas para suspensiones de inyecciones oleosas se pueden administrar. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo aceite de ajonjolí, o ésteres de ácido graso sintético, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos . Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión y que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente , la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden utilizar liposomas para encapsular al agente para su administración al interior de la célula .

La formulación farmacéutica para administración sistémica de acuerdo con la invención se puede formular para administración enteral, parenteral o tópica. En realidad, la totalidad de los tres tipos de formulación se pueden utilizar simultáneamente para obtener administración sistémica del ingrediente activo. Las formulaciones adecuadas para administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o suave, pildoras, tabletas que incluyen tabletas recubiertas, elíxires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de los mismos. Se pueden utilizar diversos métodos para administrar el agente a un modelo animal. En una modalidad preferida, el agente se administra por vía intraperitoneal (i.p.). Otros métodos incluyen, pero no se limitan a la administración oral, subcutánea, intravenosa, subcapsular, intramuscular o la administración directamente dentro del tejido o tumor. La administración se puede mejorar por metodologías de liberación lenta que incluyen formulaciones sólidas tales como un parche cutáneo o una pella o una forma de dosificación encapsulada o recubierta, o si es un líquido, a través de la formulación o administración de un líquido adecuado con un mecanismo de bombeo extracorporeo o soportado internamente. La cantidad que se va a administrar se puede determinar por diversos métodos. En una modalidad, una dosis de un agente, por ejemplo un anticuerpo, se determina por incrementos paulatinos del agente y los efectos son monitoreados . En otra modalidad, una persona experta - en la técnica utiliza una cantidad descrita en la técnica como un punto de inicio para una dosificación y los incrementos paulatinos por encima y por debajo de la cantidad reportada se utilizan para determinar los efectos. En otra modalidad se utiliza una dosificación que refleja la cantidad fisiológica que un individuo (por ejemplo un humano) puede experimentar si experimenta un protocolo de tratamiento o se encuentra en una exposición diaria sistemática. Generalmente, estos agentes se formulan para administración por inyección (por ejemplo por vía intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.), aunque también se pueden utilizar otras formas de administración (por ejemplo oral, por mucosa, etc.). En consecuencia, los agentes terapéuticos de esta invención preferiblemente se combinan con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, sincronización y repetición, dependerán del individuo particular y de los antecedentes médicos de dicho individuo. Generalmente, se puede utilizar cualquiera de las siguientes dosis: una dosis de por lo menos aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal; por lo menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 750 yg/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 500 g/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 250 ug/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 100 g/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 10 g/kg de peso corporal ; por lo menos aproximadamente 1 g/kg de peso corporal o más es lo que se administra. Las consideraciones empíricas, tales como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosificación. Los agentes que son compatibles con el sistema inmunológico humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos se pueden utilizar para prolongar la vida media del anticuerpo y para impedir que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmunológico del hospedador. La frecuencia de administración se puede determinar y ajustar durante el curso del tratamiento y se basa en reducir el número de células cancerosas, mantener la reducción de células cancerosas, reducir la proliferación de células cancerosas o retrasar el desarrollo de metástasis. De manera alternativa, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación continua sostenida de los agentes de esta invención. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para obtener la liberación sostenida.

En una modalidad, las dosif caciones para agente terapéutico se pueden determinar empíricamente en individuos a quienes se les ha administrado una o más administraciones. A los individuos se les proporcionan dosificaciones cada vez mayores de agente terapéutico. Para determinar la eficacia del agente terapéutico, el estado de enfermedad cancerosa específica se puede seguir por métodos tales como medición directa del tamaño del tumor por medio de palpación u observación visual, medición indirecta del tamaño de tumor por rayos X u otras técnicas de generación de imágenes, y mejoramiento determinado por biopsia directa del tumor y examen microscópico de la muestra de tumor, la medición de un marcador de tumor indirecto (por ejemplo PSA para cáncer de próstata) , disminución en el dolor, parálisis, menoscaba en el habla, visión, respiración u otra incapacidad relacionada con el tumor, apetito aumentado o un incremento en la calidad de vida medido por las pruebas aceptadas o la prolongación de supervivencia. Será evidente para una persona experta en la técnica que la dosificación variará en base en el individuo, el tipo de cáncer, la etapa del cáncer, si el cáncer ha comenzado a generar metástasis en otro lugar en el individuo y en tratamientos anteriores y concurrentes que se estén utilizando . Otras formulaciones incluyen formas de administración adecuadas conocidas en la técnica que incluyen, pero que no se limitan a portadores tales como liposomas. Véase, Mahato et al. (1997) Pharm. Res. 14:853-859. Las preparaciones liposomicas incluyen, pero no se limitan a citofectinas, vesículas multilamelares y vesículas unilamelares. En algunas modalidades puede estar presente más de un agente terapéutico. Tales composiciones pueden contener uno o más de un agente terapéutico (pueden contener por lo menos uno, por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, o por lo menos cinco agentes terapéuticos diferentes) , que sean reactivo contra, por ejemplo, células cancerosas de ovario, pulmón, próstata, páncreas, colon o mama. Una mezcla de agentes terapéuticos, como con frecuencia se indica en la técnica, puede ser particularmente útil para tratar una gama más amplia de población de individuos. La determinación de la enfermedad se realiza utilizando métodos estándar en la técnica tales como métodos de formación de imágenes y marcadores apropiados de monitoreo, como se discute con mayor detalle en lo siguiente. La temporización de la administración del agente dependerá de la naturaleza del agente. En una modalidad, el agente es un anticuerpo que se administra en una cantidad eficaz para reducir el crecimiento de células cancerosas, tej idos cancerosos o tumores . Una persona experta en la técnica puede determinar la eficacia de administraciones múltiples a bajas concentraciones versus una administración única a una concentración superior sin experimentación indebida . El agente se puede administrar una vez o en un protocolo que requiere 1-7 inyecciones o más a la semana, durante un período de semanas. La dosificación, programa de administración y duración generalmente reflejará lo que se muestra como eficaz en el tratamiento de la infección o enfermedad. III. Determinación de la eficacia/modelo de toxicidad Los modelos animales que contienen el implante de tejido o recombinante de tejido se permite que se desarrollen en un fenotipo de tejido parcial o completamente madurado adulto normal. Para generar un modelo animal para determinar los efectos de un agente (por ejemplo toxicidad) , estos animales contienen tejidos objetivo maduros bajo una cápsula renal y después se pueden implementar con las células objetivo enfermas, infectadas o cancerosas debajo de la cápsula renal opuesta (en el otro lado) , y se pueden tratar con el agente (por ejemplo un anticuerpo monoclonal y otro medicamento) . Después del tratamiento se sacrifica al animal y. los xe.noinj ertos de tejido humano enfermo, infectado o canceroso y el tejido normal se extirpan, y se analizan para determinar el efecto del agente. Una persona experta en la técnica puede determinar los efectos del agente tanto en tejido objetivo normal como tejido enfermo, infectado o canceroso al monitorear la morfología general, morfología celular, la cantidad de necrosis o apoptosis, el tamaño del tejido enfermo, infectado o canceroso, así como la función (por ejemplo, secreción de insulina para tejido pancreático), o la presencia o ausencia de marcadores conocidos de funciones celulares normales y anormales. Por ejemplo, la tinción con el anticuerpo con el Ki67 se puede utilizar para visualizar el número de células en división en un tejido (Grogan et al. Blook 75:2714-9,1988). Para anticuerpos terapéuticos, el modelo animal se puede utilizara para identificar a un anticuerpo y la dosificación de un anticuerpo que es eficaz para destruir tejido canceroso o reducir el tamaño del tumor mientras se tiene poco o nulo efecto sobre el tejido normal correspondiente u otros tejidos normales que expresan antígeno unido al anticuerpo. Los métodos para determinar el efecto de un régimen de tratamiento terapéutico en un individuo variarán dependiendo de la condición tratada y el método de tratamiento, así como la gama de tales métodos los cuales son bien conocidos en la técnica. A modo de ilustración y no como limitación, tales métodos incluyen los discutidos en lo anterior y también métodos para determinar hipertrofia, hiperplasia, muerte apoptósica, secreción diferencial de proteínas o esteroides, actividad metabólica o cambios en la morfología.

El tejido madurado también se puede utilizar para determinar la eficacia y toxicidad de medicamentos de moléculas pequeñas mediante tratamiento sistémico del animal con un agente y después medir la función del tejido objetivo, por ejemplo, producción de insulina humana por páncreas humano "madurado". Otro uso de este modelo animal es un modelo de eficacia en el cual los animales con diferentes tejidos madurados (tanto normales como enfermos) en cada riñon se utilizan para determinar los efectos del tratamiento a largo plazo (por ejemplo días a meses) , con el agente. EJEMPLOS Ejemplo 1. Generación de modelos animales no humanos Los tejidos de órganos fetales normales (colon, corazón, riñon, hígado, pulmón, ovario y oviducto) se recortan en piezas cúbicas de 1 mm y se colocan en la cápsula renal o en la almohadilla grasa de ratones atímicos (nu/nu) o inmunodeprimidos SCID. Los te idos se dejan en los animales durante 6-40 semanas para permitir transcurrir tiempo para el desarrollo en tejidos maduros. El animal es sacrificado y los tejidos se extirpan y se cortan para realizar tinción H y E (hematoxilina y eosina) y evaluación inmunohistoquímica . La figura 1 muestra los resultados de una serie de implantaciones en donde se permite que los tejidos maduren durante 4 meses. En este ejemplo, todas las referencias a "paneles" se refieren a la figura 1. Los paneles, 1, 2, 3, 6, 7 y 8 muestran implantación debajo de la cápsula renal mientras que los paneles 4 y 5 muestran implantación debajo de la almohadilla grasa. Los paneles 1, 6, 7 y 8 muestran implantación de órganos fetales normales en un ratón atímico (nu/nu) mientras que los paneles 2, 3, 4 y 5 muestran implantación de órganos fetales normales en un ratón SCID. El tejido renal, cardíaco y hepático no se desarrolla cuando se coloca en la cápsula renal (panel 3) . Aunque el tejido renal no se desarrolla y madura cuando se coloca en la cápsula renal (no mostrado) , se desarrollará en la almohadilla grasa (panel 4) . Aunque una pieza cúbica de 1 mm de corazón no se desarrollará en este experimento (panel 5) , en otro grupo de experimentos, piezas largas y delgadas (de 0.6 x 2 mm) de tejido cardíaco que contienen células de la aurícula y el ventrículo sobreviven y se desarrollan en tejido tanto graso como muscular cuando se implantan debajo de la cápsula renal durante 7 meses. La figura 6 muestra tejido bien desarrollado de colon, páncreas, corazón y próstata después de 6 meses en el ratón hospedador. El tejido hepático fetal extirpado no se desarrolla en los sitios de implantación tanto de la ' . almohadilla grasa como de la cápsula renal (panel 5). No obstante, los recombinantes de tejido que utilizan progenitores epiteliales hepáticos humanos y mesénquima de vesícula seminal fetal de rata (rSVM) se diferencian en estructuras con una arquitectura bien definida. Las células progenitoras epiteliales de testículo combinadas con rSVM desarrollan estructuras tubulares similares a ductos, similares a los testículos deficientes en células germinales dado que las células madre de línea germinal testiculares no están presentes en los cultivos originales (véase la figura 7) . El desarrollo de oviducto es extenso (panel 8) mientras que el pulmón y el ovario (paneles 6 y 7) maduros no tienen el mismo desarrollo estructural que los tejidos in vivo. No obstante, el tejido pulmonar se ha permitido que se desarrolle in vivo (cápsula renal) durante 7 meses y se desarrollará con morfología celular adulta que incluye células epiteliales ciliadas. Dado que los ratones con deficiencia inmunológica tienen una duración de vida más corta que la normal, los tiempos de desarrollo prolongados puede requerir el transplante de la pieza de tejido normal a un animal más joven (por ejemplo de 6-10 semanas) después de 5 a 6 meses de desarrollo. Ejemplo 2. Uso de tejidos madurados para modelos de seguridad/eficacia Las piezas normales de próstata y páncreas humanos se colocan debajo de la cápsula renal y se permite que maduren durante 6 semanas. En este momento, las células de cáncer de próstata humana (LnCAP) se colocan debajo de las cápsulas renales contralaterales de los mismos animales y se permite que crezcan durante una semana adicional. En el día 7 después de la implantación de los tumores LnCAP, un animal es tratado con 10 pg/g de anticuerpo PA6 (anticuerpo contra EpCAM humano) por inyección i.p. El animal control se trata con inyecciones de solución salina. Se administra durante un período de dos semanas 4 inyecciones. Al final de este período, se mata a los animales y se examinan los xenoinjertos de tejido tumoral y normal. En la figura 2 se muestran los ríñones de los animales. El lado izquierdo de la figura 2 muestra los tumores LnCAP mientras que el lado derecho muestra los te idos normales (9 semanas totales en el animal) . Los paneles superiores son de animales tratados mientras que los paneles inferiores son de los animales control. Los animales tratados adicionales contienen tejido de colon normal . Ejemplo 3. Inmunohistoquímica de tejidos maduros de próstata humana y colon humano La inmunohistoquímica de tejidos maduros de próstata humana y colon humano del experimento se describen en la figura 3. Aunque el tumor tiene impacto por el tratamiento de anticuerpos con la muerte celular y la hemorragia, los tejidos normales no son afectados por el anticuerpo (A-D) . Para determinar si los tejidos contienen el anticuerpo objetivo (EpCAM), los tejidos se tiñen con anticuerpo PA6 etiquetado directamente (anticuerpo contra EPCAM humano). Los tejidos tanto tratados como no tratados muestran unión del anticuerpo. El tejido de próstata humana madurado también se tiñe fuertemente para el antígeno específico para próstata (PSA) , un marcador para células de próstata . Ejemplo 4. Estudio de seguridad/eficacia en anticuerpo mPA7 Se realiza un experimento similar con páncreas fetal humano y te ido de próstata. El tejido de páncreas y de próstata se permite que madure durante 11 semanas antes de la implantación del tejido de tumor de próstata LnCAP en el lado contrario. Se trata a los animales como en el Ejemplo 2, con 50 ug/g x 4 dosis de anticuerpo mPA7. Como se observa en la figura 4A, el tratamiento con anticuerpo provoca que el tejido tumoral desaparezca, dejando únicamente un tejido de cicatrización. Los tejidos normales que se muestran en las secciones teñidas con H y E en 4B no son afectadas por el tratamiento con anticuerpo. Ejemplo 5. Recombinantes de tejido normal desarrollados para células progenitoras humanas y mesénquima fetal de rata Una alternativa a la utilización de piezas completas de tejido fetal para que maduren a fenotipo adulto es utilizar líneas de células progenitoras humanas recombinadas con mesénquima de roedor para derivar un tej ido en el cual una porción de las células, aquellas derivadas de la línea de células progenitoras, son de un fenotipo humano adulto. Un ejemplo de esto se muestra en la figura 5. Aquí, la línea de células hBLA (progenitor epitelial de vejiga humano) se recombina con mesénquima de vejiga fetal de rata para formar un mosaico de tejido que contiene mesénquima de rata y células epiteliales humanas con un fenotipo epitelial de vejiga adulto. Este tejido se muestra en el panel superior teñido para uroplacina, un marcador para células de sombrilla de vejiga humanas. Las mismas células se pueden recombinar con mesénquima de vesícula seminal fetal de rata y se puede permite que madure durante 6 meses in vivo para formar un mosaico de tejido con mesénquima de rata y epitelio humano de próstata de adulto (teñido para antígeno específico de próstata humana (PSA) en el panel inferior) . De manera similar, los recombinantes de tejidos se han elaborado utilizando células hepáticas fetales humanas, células pancreáticas fetales humanas (véase la patente de E.U.A. No. 6,436,704), o células progenitoras uterinas/vaginales/trompa de falopio humanas (véase la patente de E.U.A. No. 6,416,999), recombinadas con mesénquima de rata apropiado para producir tejidos de mosaico humano/rata. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son únicamente con propósitos ilustrativos y que las diversas modificaciones y cambios en base en lo anterior se sugerirán por las personas expertas en la técnica y que se pueden incluir dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y el ámbito de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en la presente se incorporan en este documento como referencia en su totalidad para todos los propósitos en la misma medida en que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera indicada específica e individualmente para que así fuera incorporada como referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un método para generar un modelo animal vertebrado no humano que tiene tejido normal objetivo de fenotipo maduro y tejidos enfermo objetivo ambos de un primer animal vertebrado, el método está caracterizado porque comprende las etapas de: (a) implantar tejido normal objetivo inmaduro o recombinantes de tejido normal elaborados a partir de células inmaduras o progenitoras del primer animal en un segundo animal receptor vertebrado no humano en un lugar suficiente para soportar el crecimiento y la maduración del tejido; (b) permitir que el tejido normal objetivo del primer animal se desarrolle dentro de un tejido con un fenotipo maduro; (c) implantar tejido enfermo objetivo o células enfermas del primer animal en un animal receptor vertebrado no humano en un lugar suficiente para soportar el crecimiento del tejido enfermo; y (d) permitir que el tejido enfermo objetivo o las células enfermas del primer animal crezcan.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tanto el tejido normal objetivo como el tejido enfermo objetivo del primer animal se implantan en lugares diferentes en un solo animal vertebrado no humano .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los tejidos objetivo normal y enfermo se implantan en animales separados.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los animales donador y el normal y el receptor son de especies diferentes.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido normal objetivo implantado y el tejido enfermo objetivo implantado son de origen humano.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido objetivo implantado se deriva de una especie que se selecciona del siguiente grupo: ratones, ratas, conejos, aves, gatos, perros, cerdos, borregos, cabras, venados, caballos, ganado, humanos y primates no humanos .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el primate no humano es un mandril, chimpancé o mono.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el animal receptor vertebrado no humano se selecciona del grupo que consiste de ratones, ratas, conejos, gatos, ranas, aves, perros, cerdos, borregos , chivos y primates no humanos .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el animal es un roedor inmunodef cíente .

10. Un modelo de tejido para evaluación del tejido objetivo de una primera especie de animal vertebrado que tiene un fenotipo maduro presente dentro de un segundo animal receptor u hospedador no humano inmunodeficiente , caracterizado porque el tejido de la primera especie objetivo normal o enfermo se selecciona del grupo que consiste de tejidos de los siguientes sistemas biológicos: sistema nervioso central: Cerebro (materia gris y blanca que contiene neuronas, neuroglia, etc.) y cerebro - cerebelo , ojos, tallo cerebral (protuberancia, médula, cerebro medio), médula espinal; endocrino: (suprarrenal (corteza y médula) , ovario, páncreas (islotes de Langerhans y páncreas exocrino) , paratiroides , hipófisis (adenohipófisis y neurohipófisis) , testículos, tiroides (epitelio folicular, células parafoliculares, coloide, etc.); mama: mama (lóbulos, ductos, células mioepiteliales , etc.); hematopoyético : bazo, amígdalas, timo, médula ósea (linfocitos; monocitos/macrófagos , granulocitos , precursores eritroides, megacariocitos , mastocitos, osteoclastos y osteoblastos) , células de sangre periférica (neutrófilos , linfocitos, monocitos, vasófilos, eosinófilos, eritrocitos y plaquetas); respiratorio: pulmón (bronquios, bronquiolos, alvéolos, etc.); cardiovascular: corazón, vasos sanguíneos (arterias, venas, etc.); gastrointestinal: esófago, estómago (fondo), intestino delgado (íleon, yeyuno o duodeno) , colon, hígado (tríadas portales, células hepáticas, etc.), glándulas salivales; genitourinario: riñon, sistema urinario, vejiga, uréter, uretra, trompas de falopio, vagina, placenta, próstata, útero, cuello uterino; músculo esquelético: músculo esquelético; piel: piel (epidermis, apéndices, dermis); nervios periféricos: nervios periféricos; células mesoteliales : células de revestimiento de la pared del tórax, pared abdominal, pericardio o de la superficie de muestras gastrointestinales, de corazón o pulmón, etc.

11. Un roedor inmunodeficiente que tiene modelo de tejido humano para tejido humano normal objetivo que tiene fenotipo maduro y tejido humano enfermo, caracterizado porque el tejido humano normal se selecciona del grupo que consiste de pulmón, próstata, riñon, páncreas, vejiga, piel, hígado, corazón, colon, duodeno, estómago, tiroides, glándula salival y timo.

12. Un método para determinar el efecto de un tratamiento terapéutico dirigido contra un tejido enfermo objetivo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) aplicar dicho tratamiento a un animal receptor vertebrado no humano inmunodeficíente de una especie que tiene por lo menos uno de cada uno de tejido normal objetivo que tiene fenotipo maduro y tejido enfermo objetivo de otra especie animal vertebrada, y (b) determinar el efecto del tratamiento sobre los tejidos objetivo normal y enfermo.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el tratamiento terapéutico se selecciona del grupo que consiste de radioterapia, quimioterapia o terapia radiof rmacéutica o radioinmunoterapia .

14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el tratamiento terapéutico comprende la administración de agentes útiles para formación de radioimágenes de tumores.

15. Un método para determinar una dosis de un ¦agente que es tóxico para un tejido objetivo, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) administrar un agente a un animal receptor inmunodeficiente que tiene por lo menos un tejido normal objetivo que tiene un fenotipo maduro y un tejido canceroso objetivo de un animal donador, y (b) determinar cualquier efecto tóxico del agente en los tejidos objetivo normal y canceroso.

16. Un método para identificar un agente que es tóxico para células objetivo enfermas o cancerosas en un grado mayor en comparación con células normales, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) administrar un agente a un animal receptor inmunodef iciente que tiene un tejido normal objetivo que tiene un fenotipo maduro y un tejido objetivo enfermo o canceroso de un animal donador, y (b) identificar el agente que reduce el crecimiento o que destruye a los tejidos objetivo enfermos o cancerosos en un mayor grado en comparación con los tejidos normales.

17. Un método para determinar una cantidad eficaz de un agente que es tóxico para células enfermas o cancerosas en un grado mayor en comparación a las células normales, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) administrar un agente a un animal receptor inmunodeficiente que tiene un tejido objetivo normal que tiene fenotipo maduro y un tejido humano canceroso de un animal donador, y (b) determinar una cantidad del agente que es eficaz en los tejidos objetivo normal y enfermo o canceroso .

18. Un ensayo de determinación sistemática o cribado, basado en un animal completo, caracterizado porque comprende el uso de animales hospedadores no humanos que ya han recibido implantes de tej ido objetivo, de acuerdo con la Invención, o partes de los mismos, para probar las propiedades citotóxicas, ci tostát icas , antimicrobianas, antiinflamatorias u otras propiedades terapéuticas de tratamientos administrados a los animales, o para probar la actividad de tales tratamientos en el control o inhibición del desarrollo de cáncer, infecciones o de enfermedades.

19. Un método para cribado e identificación o para prueba de un tratamiento, medicamento u otra sustancia para determinar actividad contra el desarrollo o en el tratamiento del cáncer, infección o enfermedad, caracterizado porque comprende las etapas de : (a) tratar al animal hospedador no humano que ya ha recibido implantes de tejido objetivo de acuerdo con las enseñanzas de esta invención, o una parte de la misma, con el tratamiento, medicamento u otra sustancia relacionada, y (b) detectar o anotar cualquier incidencia reducida en el desarrollo de cáncer, infección y/o enfermedad, y una reducción en la morbilidad, en comparación con animales correspondientes que no han sido tratados con el tratamiento, medicamento o sustancia o detectar o anotar la eficacia en el mantenimiento, restauración o mejoramiento de la función corporal .