MXPA04002880A - Reguladores de moleculas organicas pequenas de la proliferacion celular. - Google Patents

Reguladores de moleculas organicas pequenas de la proliferacion celular.

Info

Publication number
MXPA04002880A
MXPA04002880A MXPA04002880A MXPA04002880A MXPA04002880A MX PA04002880 A MXPA04002880 A MX PA04002880A MX PA04002880 A MXPA04002880 A MX PA04002880A MX PA04002880 A MXPA04002880 A MX PA04002880A MX PA04002880 A MXPA04002880 A MX PA04002880A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
substituted
unsubstituted
ring
occurrence
aryl
Prior art date
Application number
MXPA04002880A
Other languages
English (en)
Inventor
L Rubin Lee
Original Assignee
Curis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Curis Inc filed Critical Curis Inc
Publication of MXPA04002880A publication Critical patent/MXPA04002880A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A61K31/422—Oxazoles not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/38—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom
    • A61K31/381—Heterocyclic compounds having sulfur as a ring hetero atom having five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4427—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4436—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof containing further heterocyclic ring systems containing a heterocyclic ring having sulfur as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/50—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D333/52—Benzo[b]thiophenes; Hydrogenated benzo[b]thiophenes
    • C07D333/62—Benzo[b]thiophenes; Hydrogenated benzo[b]thiophenes with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D333/68—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen
    • C07D333/70—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen attached in position 2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Abstract

La presente invencion hace disponibles metodos y reactivos para modular la proliferacion o diferenciacion en una celula o tejido que comprende poner en contacto la celula con un agonista de hedgehog, tal como los compuestos representados en las Figuras 32 y 33. En ciertas modalidades, los metodos y reactivos se pueden emplear para corregir o inhibir un estado de crecimiento anormal o indeseado, por ejemplo, al antagonizar una ruta normal de ptc o al reforzar o agonizar la actividad de smoothened o hedgehog.

Description

REGULADORES DE MOLÉCULAS ORGÁNICAS PEQUEÑAS DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Antecedentes de la Invención La formación de patrones es la actividad por la cual las células embrionicas forman disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados. La complejidad física de los organismos superiores surge durante la embriogénesis a través de la interacción del linaje intrínseco a la célula y la señalización extrínseca a la célula. Las interacciones inductivas son esenciales al modelado embrionico en el desarrollo de los vertebrados a partir del establecimiento anterior del plan corporal, al modelado de los sistemas de órganos, a la generación de diversos tipos celulares durante la diferenciación del tejido (Davidson, E . , (1990) Developrnent 108: 365-389; Gurdon, J. B . , (1992) Cell S8 : 185-199; Jessell, T. M. et al., (1992) Cell 68: 257-270). Son variados los efectos de las interacciones de las células en desarrollo. Típicamente, las células de respuesta se desvían de una ruta de diferenciación celular a otra al inducir células que difieren de ambos estados el inducido y no inducido de las células de respuesta (inducciones) . Algunas veces, las células inducen a sus vecinas para diferenciarse así mismas (inducción homogenética) ; en otros casos una célula inhibe la diferenciación de sus vecinas por sí mismas. REF: 155064 Las interacciones celulares en el desarrollo temprano pueden ser secuenciales , tal que una inducción inicial entre dos tipos de células conduce a una amplificación progresiva de la diversidad. Además, las interacciones inductivas no se presentan sólo en embriones, sino también en células adultas y pueden actuar para establecer y mantener patrones morfogenéticos así como inducir diferenciación (J.B. Gurdon (1992) Cell 68:185-199). Los miembros de la familia Hedgehog de moléculas de señalización medían cualquier proceso de modelado importante de corto y largo alcance durante el desarrollo de invertebrados y vertebrados. En la mosca, un gen individual de hedgehog regula el modelado de discos segméntales e imagínales. En contraste, en los vertebrados, la familia de genes de hedgehog está comprendida en el control de la asimetría izquierda-derecha, polaridad en el CNS , somitas y extremidades , organogénesis, condrogénesis y espermatogénesis . El primer gen de hedgehog se identificó por una detección genética en la mosca de la - fruta Drosophila melanogaster (Nüsslein-Volhard, C. y Wieschaus, E. (1980) Nature 287, 795-801) . Esta detección identificó varias mutaciones qué afectan el desarrollo embrionico y larva'l . En 1992 y 1993, se informó ((C.F., Lee et al. (1992) Cell 71, 33-50) la naturaleza molecular del gen de Drosophila hedgehog (hh) , y desde entonces, se han aislado varios homólogos de hedgehog de varias especies de vertebrados. En tanto que sólo se ha encontrado un gen de hedgehog en Drosophila. y otros invertebrados, están presentes múltiples genes de Hedgehog en los vertebrados . La familia de vertebrados en genes de hedgehog incluye al menos cuatro miembros, por ejemplo, parálogos del gen de hedgehog individual de Drosophila. Los genes de hedgehog de ejemplo y proteínas se describen en las publicaciones PCT W095/18856 y W096/17924. Tres de estos miembros, referidos en la presente como hedgehog desértico (Dhh) , hedgehog sónico [Shh) e hedgehog indio (Ihh) , aparentemente existen en todos los vertebrados, incluyendo peces, aves y mamíferos. Un cuarto miembro, referido en la presente como hedgehog tiggie-winkle (Thh) , parece ser específico de los peces. El hedgehog desértico (Dhh) se expresa principalmente en los testículos, tanto en el desarrollo embrionico del ratón como en el roedor adulto y humanos; el hedgehog indio (Ihh) está comprendido en el desarrollo de los huesos durante la embriogénesis y en la formación de huesos en el adulto; y Shh, que como se describe anteriormente, está comprendido principalmente en actividades morfogénicas y neuroinductivas . Dados los papeles inductivos críticos de los polipéptidos de hedgehog en el desarrollo y mantenimiento de los órganos de los vertebrados, es de suprema importancia la identificación de las proteínas de interacción de hedgehog tanto en el contexto clínico como en el de investigación. Las varias proteínas de Hedgehog consisten de un péptido de señal, una región N-terminal altamente conservada y un dominio C-terminal más divergente. Además de la escisión de la secuencia de señal en la ruta secretoria (Lee, J.J. et al. (1992) Cell 71:33-50; Tabata, T. et al. (1992) Genes De . 2635-2645; Chang, D.E. et al. (1994) Development 120:3339-3353) , las proteínas precursoras de Hedgehog experimentan una escisión autoproteolítica interna que depende de las secuencias conservadas en la porción C-terminal (Lee et al. (1994) Science 266:1528-1537; Porter et al. (1995) Nature 374:363-366). Esta escisión conduce a un péptido N-terminal de 19 kD y un péptido C-terminal de 26-28 kD (Lee et al. (1992) supra; Tabata et al. (1992) supr ; Chang et al. (1994) supra; Lee et al. (1994) supra ; Bumcrot, D.A., et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 15:2294-2303; Porter et al. (1995) supra; Ekker, S.C. et al. (1995) Curr. Biol. 5:944-955; Lai, C.J. et al. (1995) Development 121:2349-2360). El péptido N-terminal está estrechamente asociado con la superficie de las células en la cual se sintetizó, en tanto que el péptido C-terminal es puede difundir libremente tanto in vitro como in vivo (Porter et al. (1995) Nature 374:363; Lee et al. (1994) supra; Bumcrot et al.. (1995) supra; Mart ' , E. et al. (1995) Development 121:2537-2547; Roelink, H. et al . (1995) Cell 81:445-455). De forma interesante, la retención en superficie celular del péptido N-terminal es dependiente de la auto-escisión, como una forma truncada de HH codificada por un ARN que termina precisamente en la posición normal de la escisión interna, se puede difundir in vitro (Porter et al. (1995) supra) e in vivo (Porter, J.A. et al. (1996) Cell 86, 21-34). Los estudios bioquímicos han mostrado que la escisión autoproteolítica de la proteína precursora de HH prosigue a través de un compuesto intermedio de tioéster interno que se escinde subsecuentemente en una sustitución nucleófila. Es probable que el nucleófilo sea una molécula lipófila pequeña que se llega a unir covalentemente al extremo C-terminal del N-péptido (Porter et al. (1996) supra) , uniéndolo a la superficie celular. Son profundas las implicaciones biológicas. Como resultado de la unión, se genera una alta concentración local del péptido N-terminal de hedgehog en la superficie de las células productoras de Hedgehog. Es este péptido N-terminal que tanto es necesario como suficiente para las actividades de señalización del hedgehog de corto y largo alcance en Drosophila y vertebrados (Porter et al. (1995) supra; Ekker et al. (1995) supra ; Lai et al. (1995) supra; Roelink, H. et al. (1995) Cell 81:445-455; Porter et al. (1996) supra; Fietz, .J. et al. (1995) Curr . Biol . 5:643-651; Fan, C.-M. et al. (1995) Cell 81:457-465; Mart ' , E . , et al. (1995) Nature 375:322-325; López-Martínez et al. (1995) Curr. Biol 5:791-795; Ekker, S.C. et al. (1995) Development 121:2337-2347; Forbes, A.J. et al. (1996) Development 122:1125-1135) . Se ha implicado HH en procesos de modelado de corto y largo alcance en varios sitios durante el desarrollo de Drosophila. En el establecimiento de la polaridad del segmento en embriones tempranos, tiene efectos de corto alcance que parecen estar mediados directamente, en tanto que en el modelado de los discos imagínales, induce efectos de largo alcance vía la inducción de señales secundarias. En los vertebrados, se han clonado varios genes de hedgehog en los últimos años. De estos genes, el Shh ha recibido la mayoría de la atención experimental, puesto que se expresa en diferentes centros organizativos que son las fuentes de señales que modelan los tejidos vecinos. La evidencia reciente indica que Shh está comprendido en estas interacciones . La expresión de Shh inician en poco tiempo después del comienzo de la gastrulación en el presunto mesodermo de línea media, el nodulo en el ratón (Chang et al. (1994) supra; Echelard, Y. et al. (1993) Cell 75:1417-1430), la rata (Roelink, H. et al. (1994) Cell 76:761-775) y el pollo (Riddle, .D. et al. (1993) Cell 75:1401-1416), y la capa protectora en el pez cebra (Ekker et al. (1995) supra; Krauss, S. et al . (1993) Cell 75:1431-1444). En los embriones de pollo, el patrón de expresión de Shh en el nodulo desarrolla una asimetría de izquierda-derecha que parece ser responsable del sitio izquierdo-derecho del corazón (Levin, M. et al. (1995) Cell 82:803-814). En el sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en ingles) , el Shh del notocordio y la placa ventral parece inducir los destinos de las células ventrales . Cuando se expresa de manera ectopical , el Shh conduce a una ventralización de regiones grandes del cerebro medio y cerebelo en ratón (Echelard et al. (1993) supra; Goodrich, L.V. et al. (1996) Genes Dev. 10:301-312), Xenopus (Roelink, H. et al . (1994) supra; Ruiz i Altaba, A. et al. (1995) Mol . Cell. Meurosci. 6:106-121), y pez cebra (Ekker et al. (1995) supra; Krauss et al. (1993) supra; Hammerschmidt , M. , et al. (1996) Genes Dev. 10;£47-558). En explantes de neuroectodermo intermedio a niveles de la médula espinal, la proteína Shh induce el desarrollo de neuronas motrices y placa ventral con distintos umbrales de concentración, placa ventral a altas concentraciones y neuronas motrices a menores concentraciones (Roelink et al. (1995) supra; Mart ' et al. (1995) supra; Tanabe, Y. et al. (1995) Curr. Biol . 5:651-658). Además, el bloqueo de anticuerpos sugiere que Shh producido por el notocordio se requiere para la inducción de destinos de neuronas motrices, mediada por el notocordio (Mart ' et al. d (1995) supra) . De esta manera, la alta concentración de Shh en la superficie en células de línea media que producen Shh parece dar cuenta de la inducción de la placa ventral mediada por contacto, observada in vitro (Placzek, M. et al. (1993) Development 117:205-218), y la colocación de linea media de la placa ventral inmediatamente por arriba del notocordio in vivo. Menores concentraciones de Shh liberado del notocordio y la placa ventral inducen presuntamente neuronas motrices en regiones ventrolaterales más distantes en un proceso que se ha mostrado que es independiente del contacto in vitro (Yamada, T. et al. (1993) Cell 73:673-686). En explantes tomados a niveles del cerebro medio y cerebro anterior, el Shh también induce los tipos apropiados de células neuronales, ventrolaterales, precursores dopaminégicos (Heynes, M. et al. (1995) Neuron 15:35-44; Wang, M.Z. et al. (1995) Nature Med. 1:1184-1188) y colinérgicos (Ericson, J. et al. (1995) Cell 81:747-756), respectivamente, indicando que Shh es un inductor común de la especificación ventral sobre la longitud completa del CNS . Estas observaciones formulan la cuestión en cuanto a cómo la respuesta diferencial de Shh se regula en posiciones · anteroposteriores particulares . El Shh de la línea media también modela las regiones paraxiales de los embriones de vertebrados, las somitas en el tronco (Fan et al. (1995) supra) y la mesenquima cerebral, rostral de las somitas (Hammerschmidt et al. (1996) supra) . En explantes del mesodermo paraxial de pollos y ratones, el Shh promueve la expresión de marcadores específicos de esclerotomo tal como Paxl y Twíst, a expensas del marcador dermamiotomal Pax3. Además, los experimentos de barrera de filtro sugieren que Shh media la inducción del esclerotomo directamente en lugar de por activación de un mecanismo secundario de señalización (Fan, C.-M. y Tessier-Lavigne, M. (1994) Cell 79, 1175-1186) . El Shh también induce expresión génica miotomal (Hammerschmidt et al . (1996) supra; Johnson, R.L. et al. (1994) Cell 79:1165-1173; Münsterberg, A.E. et al. (1995) Genes Dev. 9:2911-2922; Weinberg, E.S. et al. (1996) Development 122:271-280), aunque recientes experimentos indican que los miembros de la familia WNT, homólogos de vertebrados de Drosophila wingless, se requieren en conjunto (Münsterberg et al. (1995) supra) . De forma desconcertante, la inducción miotomal en pollos requiere mayores concentraciones de Shh de la inducción de marcadores esclerotomales (Münsterberg et al. (1995) supra) , aunque el esclerotomo se origina de células somíticas colocadas mucho más cerca al notocordio. Se obtuvieron resultados similares en el pez cebra, donde altas concentraciones de Hedgehog inducen una expresión miotomal y reprimen la expresión génica del marcador esclerotomal (Hammerschmidt et al. (1996) supra) . En contraste a las amniotas, sin embargo, estas observaciones están consistentes con la arquitectura del embrión de pez, puesto que aquí, el miotomo es el componente predominante y más axial de las somitas . De esta manera, la modulación de la señalización de Shh y la adquisición de nuevos factores de señalización puede haber modificado la estructura de las somitas durante la evolución de los vertebrados . En el brote de las extremidades de los vertebrados, un subconjunto de células mesenquimales posteriores, la "Zona de actividad polarizante" (ZPA) , regula la identidad de los dígitos anteroposteriores (revisado en Honig, L.S. (1981) Nature 291:72-73). La expresión ectópica de Shh o la aplicación de cuentas remojadas en péptido de Shh imita el efecto de injertos de ZPA anteriores, generando una duplicación de dígitos de imagen en el espejo (Chang et al. (1994) supra; Lopez-Martinez et al. (1995) supra; Riddle et al. (1993) supra) (Fig. 2g) . De esta manera, la identidad de los dígitos parece ser dependiente principalmente de la concentración de Shh, aunque es posible que otras señales puedan transmitir esta información sobre las distancias sustanciales que parecen ser requeridas para el modelado de AP (100-150 µt) . Similar a la interacción de HH y DPP en los discos imagínales de Drosophila, el Shh en los brotes de extremidades de vertebrados activa la expresión de Bmp2 (Francis, P.H. et al. (1994) Development 120:209-218), un homólogo de dpp. Sin embargo, diferente de DPP en Drosophila, el Bmp2 falla en imitar el efecto polarizante de Shh en la aplicación ectópica en el brote de extremidad de pollo (Francis et al. (1994) supra) . Además del modelado anteroposterior, el Shh también parece estar comprendido en la regulación de la excrescencia próximo distal de las extremidades al inducir la síntesis del factor de crecimiento de fibroblastos FGF4 en el reborde ectodérmico apical posterior (Laufer, E. et al. (1994) Cell 79:993-1003; Niswander, L. et al. (1994) Nature 371:609-612). La relación cercana entre proteínas de Hedgehog y BMP probablemente se ha observado en muchos, sino es que probablemente en todos, los sitios de expresión de Hedgehog de vertebrados. Por ejemplo, en el intestino posterior del pollo, el Shh se ha mostrado que induce la expresión de Bmpé, otro homólogo dpp de vertebrado (Roberts, D.J. et al. (1995) Development 121:3163-3174). Además, el Shh y el Brcp2, 4 6 6 muestran una correlación notable en su expresión en células epiteliales y mesenquimales del estómago, del sistema urogenital, el pulmón, los brotes de los dientes y los folículos del pelo (Bitgood, M.J. y McMahon, A.P. (1995) Dev. Biol . 172:126-138). Además, el Ihh, uno de los otros dos genes Hedgehog de ratón, se expresa adyacente a las células que expresan Bmp en el intestino y el cartílago en desarrollo (Bitgood y McMahon (1995) supra) .
La evidencia reciente sugiere un modelo en el cual el Ihh juega un papel crucial en la regulación del desarrollo condrogénico (Roberts et al. (1995) supra) . Durante la formación del cartílago, los condrocitos provienen de un estado de proliferación via un estado pre-hipertrófico intermedio a condrocitos hipertróficos diferenciados. El Ihh se expresa en los condrocitos pre-hipertróficos e inicia una cascada de señalización que conduce al bloqueo de la diferenciación de condrocitos. Su objetivo directo es el pericondrio alrededor del dominio de expresión de Ihh, que responde por la expresión de Glí y patched (ptc) , objetivos transcripcionales conservados de señales Hedgehog (ver posteriormente) . Más probablemente, esto conduce a señalización secundaria que da por resultado la síntesis de proteína relacionada a hormona paratiroide (PTHrP) en el pericondrio periarticula . La PTHrP se señala por sí misma de regreso a los condrocitos prehipertróficos , bloqueando su diferenciación adicional. Al mismo tiempo, la PTHrP reprime la expresión de Ihh, formando de este modo un circuito negativo de retroalimentación que modula la velocidad de diferenciación de los condrocitos . Se identificó originalmente patched en Drosophila como un gen de polaridad del segmento, uno de un grupo de genes de desarrollo que afectan la diferenciación celular dentro de los segmentos individuales que se presentan en una serie homologa a lo largo del eje anterior-posterior del embrión. Ver Hooper, J.E. et al. (1989) Cell 59:751; y Nakano, Y. et al. (1989) Nature 341:508. Los modelos de expresión del homólogo de vertebrado de patched sugieren su implicación en el desarrollo de tubos neurales, esqueleto, extremidades, estructura craneofacial y piel. Los estudios genéticos y funcionales demuestran que patched es parte de la cascada de señalización de hedgehog, una ruta evolutivamente conservada que regula la expresión de varios genes en etapas posteriores. Ver Perrimon, N. (1995) Cell 80:517; y Perrimon, N. (1996) Cell, 86:513. patched participa en la represión transcripcional constitutiva de los genes objetivos; su efecto es opuesto por una glicoproteína segregada, codificada por hedgehog, o un homólogo de vertebrado, que induce activación transcripcional. Los genes bajo el control de esta ruta incluyen miembros de las familias de Wnt y TGF-beta. Las proteínas de patched poseen dos dominios extracelulares grandes, doce segmentos transmembrana, y varios segmentos citoplasmáticos . Ver, Hooper, supra; Nakano, supra ; Johnson, R.L. et al. (1996) Science 272:1668; y Hahn, H. et al. (1996) Cell 85:841. El papel bioquímico de patched en la ruta de señalización de hedgehog no está claro. Sin embargo se ha informado la interacción directa con la proteína de hedgehog (Chen, Y. et al. (1996) Cell 87:553), y patched puede participar en un complejo de receptor de hedgehog junto con otra proteína transmembrana codificada por el gen de smoothened. Ver Perrimon, supra; y Chen, supra. El homólogo humano de patched se clonó recientemente y se correlacionó al cromosoma 9q22.3. Ver Johnson, supra; y Hahn, supra . Esta región se ha implicado en el síndrome nevo de células básales (BCNS) , que se caracteriza por anormalidades de desarrollo incluyendo alteraciones de costillas y craneofaciales , anormalidades de las manos y pies, y espina bífida. El BCNS también predispone a múltiples tipos de tumor, el más frecuente que son carcinomas de células básales (BCC) que se presentan en muchas ubicaciones en el cuerpo y aparecen en las primeras dos décadas de vida. La mayoría de los casos de BCC, sin embargo, no están relacionados al síndrome y surgen esporádicamente en pequeños números en sitios expuestos al sol de persona de edad media o mayor de ascendencia norte-europea. Estudios recientes relacionados a BCNS y BCC esporádicos sugieren que una pérdida funcional de ambos alelos de patched conduce al desarrollo de BCC. Ver, Johnson, supra; Hahn, supra; y Gailani, .R. et al. (1996) Nature Genetics 14:78. Las supresiones de los alelos individuales del cromosoma 9q22.3 se presenta frecuentemente tanto en BCC esporádica como hereditaria. El análisis de enlace reveló que el alelo heredado defectuoso se retuvo y el alelo normal se perdió en tumores de pacientes con BCNS.
Los tumores esporádicos también demostraron una pérdida de ambos alelos funcionales de patched. De doce tumores en los cuales se identificaron mutaciones patched con un ensayo de detección de polimorfismo conformacional de hebra individual, nueve tuvieron supresión cromosómica del segundo alelo y los otros tres tienen mutaciones de inactivación en ambos alelos (Gailani, supra) . Las alteraciones no se presentan en el ADN de línea germinal correspondiente . La mayoría de las mutaciones identificadas dio por resultado codones fanalizadores prematuros o desplazamientos de cuadros. Lench, N.J., et al., Hum. Genet . 1997 Oct ; 100(5-6): 497-502. Sin embargo, varias fueron mutaciones puntuales que conducen a sustitución de aminoácidos en ya sea dominios extracelulares o citoplasmáticos . Estos sitios de mutación pueden indicar importancia funcional para la interacción con proteínas extracelulares o con miembros citoplasmáticos de la ruta de señalización de etapas posteriores. La implicación de patched en la inhibición de la expresión génica y la ocurrencia de frecuentes supresiones alélicas entre patched en BCC soporta una función de supresión de tumor para este gen. Su papel en la regulación de las familias génicas que se conoce que están comprendidas en la señalización celular y comunicación intercelular proporciona un posible mecanismo de supresión de tumor.
Breve Descripción de la Invención La presente invención hace disponible métodos y composiciones para modular la diferenciación o proliferación de una célula. Los compuestos útiles en estos métodos y composiciones incluyen aquellos representados por la fórmula general (I) : Fórmula I en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar y Ar' representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo, sustituidos o insustituidos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N ( ) - , -O- , -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S ((¾)-, -S(O)-, -C (=NOJ) - , -P (=0) (OR) - , y un grupo etileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos tomados conjuntamente representan, eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo , heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo , alguinilo, alguenilo, o alquilo sustituido o insust tuido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy y Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos , sustituidos o insustituidos ; e i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Ar y Ar' representan anillos de fenilo, por ejemplo, insustituidos o sustituidos con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tal como O, N y S. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas modalidades, Y y Ar' se unen a Ar en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido . En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biciclico o de biarilo. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado de sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados de sp3. En ciertas modalidades, Cy incluye una amina dentro de los átomos del anillo o en un sustituyente del anillo, por ejemplo, Cy es piridilo, imidazolilo, pirrolilo, piperidilo, pirrolidilo, piperazilo, etc., y/o tiene un sustituyente amino. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Ar' se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (CH2) palquinilo, - (C¾) parilo, - (CH2) Paralquilo, -(CH2)POH, - (C¾) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2)PN(R)2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (C¾) P R-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5.
En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (II) : Fórmula II en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar y Ar' representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo, sustituidos o insustituidos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)~, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF- , -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados con untamente representan eteno o etino sustituido o insustituido, en donde algunas o todas las ocurrencias de en M forman toda o parte de una estructura cíclica; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo , alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy' representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos , sustituidos o insustituidos; j representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 10, de manera preferente de 2 a 7; e i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF- , -CHOH-, -CH (Me) - , -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Ar y Ar' representan anillos de fenilo, por ejemplo, insustituidos o sustituidos con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tal como 0, N y S. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas modalidades, Y y Ar' se unen a Ar en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas modalidades, en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=C dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol , benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biciclico o de biarilo.
En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Ar' se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) ^alquilo, - (C¾) palquenilo, - (CH2) palquinilo, - (CH2) Parilo, - (C¾) paralquilo, -(CH2)POH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (C¾) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R) 2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (III) Fórmula III en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar y Ar' representan independientemente anillos de heteroarilo o arilo, sustituidos o insustituidos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-/ X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(0)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(0R)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -<¾-, -CHF-, -CHOH-, -Oí(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido/ R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy y Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos, sustituidos o insustituidos ; e i representa, independientemente, para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH (Me) - , -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Ar y Ar' representan anillos de fenilo, por ejemplo, insustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tal como O, N y S. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas modalidades, Y y Ar' se unen a Ar en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2.
En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido . En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto biciclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(-S) -, y -S (02) - . En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N y/o a NR2. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En las modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Ar' se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) Par lquilo , -(CH2)POH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, - (CH2) PS-alquilo inferior, - (CH2) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R) 2/ - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) P R-alquenilo inferior, -NR(C¾)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en los presentes métodos incluyen compuestos representados por la fórmula general (IV) : Fórmula IV en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy' representa un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, incluyendo policiclicos; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N (R) - , -O- , -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(OR)-, .y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; ¾ y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo , carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo , - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(CH2)POH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(C¾)nR, - (C¾) PN(R) 2, - (CH2)PNR-alquilo inferior - (C¾) ENR-alquenilo inferior, -NR(C¾)nR, y formas protegidas de los anteriores; Cy representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos , sustituidos o insustituidos; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5 , de manera preferente de 0 a 2; y p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5.
En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH( e)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o heterocíclico sustituido o insustituido, de. manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con es un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un M¿ adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-/ y -S(02)-.
En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me . En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado de sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy incluye una amina dentro de los átomos del anillo o en un sustituyente del anillo, por ejemplo, Cy es piridilo, imidazolilo, pirrolilo, piperidilo, pirrolidilo, piperazilo, etc., y/o tiene un sustituyente amino. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo . En ciertas modalidades, Rx y R2 presentan, independientemente y conforme lo permita la valencia de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (CH2) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (C¾) palquinilo, -(CH2)P0H, - (CH2) pO-alquilo inferior, - (C¾) pO-alguenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nRi - (CH2) pN(R) 2/ - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR/ y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (V) : Fórmula V en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, incluyendo policíclicos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0) (0R)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH( e)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, eteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Ra y 2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) Palquilo, - (C¾) palquenilo, - (C¾) palquinilo, - (CH2) Parilo, - (C¾) paralquilo, - (CH2 ) pOH , - (CH2) pO-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0(CH2 ) nR , -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S( CH2 ) nR , - (C¾) pN ( R) 2 , - (CH2) PNR- lquilo inferior - (C¾) PNR-alquenilo inferior, -NR (CH2 ) nR , y formas protegidas de los anteriores; Cy' representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos, sustituidos o insustituidos; j representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 10, de manera preferente de 2 a 7; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2/ y p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH (Me) - , -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o heterocíclico sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, tal como benzotiofeno, .benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con es un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo.
En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un i adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0) -, -C(=S) -, y -S(02) -. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferiores, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente, una amina primaria o secundaria. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me . En ciertas modalidades, Ra y R2 se presentan, independientemente conforme lo permita la valencia de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (CH2) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (CH2) Palquinilo, -(CH2)P0H, - (C¾) P0-alquilo inferior, - (CH2)P0-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2)pN(R)2, - (CH2) PNR- lquilo inferior - (C¾) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR/ Y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (VI) : Fórmula VI en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, incluyendo policíclicos ; ?, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alguenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos, sustituidos o insustituidos; Ri y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo, - (C¾) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) paralquilo, - (CH2) POH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) P0-alquenilo inferior, -0(CH2)nR; -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (C¾) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2)PN(R)2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (C¾) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2; y n y , individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF- , -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o heterocíclico sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con es un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectado por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo . En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N 6 N 2. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -s(02)-. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferiores, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente, una amina primaria o secundaria. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado de sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos ibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N y/o a NR2. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En las modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, Ri y R2 se presentan, independientemente conforme lo permita la valencia de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (CH2) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (CH2) palquinilo, -(CH2)P0H, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) P0-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN (R) 2, - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN (R) 2, - (CH2) PNR-alquilo inferior -(CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores. ciertas modalidades, un presente compuesto tiene la estructura de la Fórmula Fórmula Vil en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy representa un heterociclilo o cicloalquilo sustituido o insustituido; Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, incluyendo policiclicos; W es O ó S; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinílo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Ri y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) Palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(CH2)tOH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (C¾)PN(R)2, - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR (CH2) nR, y formas protegidas de los anteriores; n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, por ejemplo, benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol , benzopiridilo, etc. En ciertas modalidades diferentes, Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, para formar un sistema anillo de bi-arilo. En ciertas modalidades, R2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria con uno o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o secundaria. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico saturado, sustituido o insustituido, es decir compuesto de una pluralidad de átomos hibridizados de sp3. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros . En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros directamente unido a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina pueden estar colocados trans en el anillo. En ciertas modalidades, ¾. y R2 presentan, independientemente y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (C¾) Palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) palquinilo, -(CH2)POH, - (CH2) pO-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) pN(R) 2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, un presente compuesto tiene una estructura de la Fórmula VIII: Fórmula VIII en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, U representa un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido fusionado al anillo que contiene nitrógeno; V representa un grupo alquileno inferior, tal como metileno, 1,2-etileno, 1,1-etileno, 1 , 1-propileno, 1,2-propileno, 1 , 3 -propileno, etc.; W representa S u 0, de manera preferente 0; X representa C=0, C=S o S02; R3 representa arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo , heterociclilo , heterociclilalquilo, aralquilo o heteroaralquilo; sustituidos o insustituidos R representa aralquilo o alquilo inferior sustituido o insustituido, tal como fenetilo, bencilo o aminoalquilo, etc.; R5 representa arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo sustituido o insustituido, incluyendo grupos heteroaromáticos o aromáticos, policíclicos . En ciertas modalidades, U representa un anillo de fenilo fusionado al anillo que contiene nitrógeno. En ciertas modalidades, R3 se selecciona de arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, aralquilo y heteroaralquilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, R4 es un grupo alquilo inferior insustituido, o es un grupo alquilo inferior sustituido con una amina terciaria o terciaria. En ciertas modalidades, R5 se selecciona de fenilo o naftilo sustituido o insustituido, o es un grupo diarilalquilo, tal como 2 , 2-difeniletilo, difenilmetilo, etc. Adicionalmente, los compuestos que tienen las estructuras de las fórmulas IX-XII pueden ser útiles en las composiciones y métodos de la presente invención. En ciertas modalidades, un compuesto independiente de hedgehog útil en la presente invención, como se describe anteriormente,' puede tener una EC50 para inducir o aumentar una o más actividades de hedgehog (tal como regulación ascendente de la expresión de gli) de menos de aproximadamente 1000 nm, menos de aproximadamente 100 nm, menos de aproximadamente 10 nm, o aún menos de aproximadamente 1 nm. En ciertas modalidades, un compuesto dependiente de hedgehog útil en la presente invención, tal como se describe anteriormente, que aumenta una o más actividades de hedgehog (tal como regulación ascendente de expresión de gli) por al menos una, dos aún tres órdenes de magnitud. Los compuestos de la invención pueden ser usados en métodos in vivo, para tratar una enfermedad o condición en un animal o paciente, y en métodos in vi tro, por ejemplo, para cultivar células (por ejemplo, como un componente del medio de cultivo), incluyendo células madre o progenitoras , tal como para promover la proliferación, supervivencia y/o diferenciación de las células cultivadas . Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1-31 representan reacciones útiles para sintetizar los compuestos de acuerdo con la presente invención. Las Figuras 32 y 33 ilustran compuestos representativos de acuerdo a la presente invención. Las Figuras 34a y 34b representan resultados de los ensayos de indicadores de ruta de hedgehog que usan compuestos de la presente invención. La Figura 35 representa resultados de ensayo que demuestran la regulación ascendente de Ptc y Gli por agonistas de hedgehog de la presente invención.
Las Figuras 36 y 37 describen la proliferación incrementada de los precursores de neuronas cerebelares en la presencia de los presentes agonistas. Las Figuras 38A y B muestran el efecto de los presentes agonistas en la curación de un medio ciático machacado como se mide en un ensayo de sujeción. Las Figuras 39A-D demuestran el efecto de los presentes agonistas en la curación de nervio ciático machacado como se mide en un ensayo de propagación en uña. La Figura 40 muestra el efecto de los presentes agonistas en combinación con una baja dosis de proteína de hedgehog en tejido de pulmón, escápula, piel y cráneo de ratones en desarrollo. La Figura 41 representa el efecto de los presentes agonistas en, con y sin proteína hedgehog adicionada en tejido de páncreas, riñon, piel y corazón de ratones en desarrollo. La Figura 42 exhibe el efecto de un presente agonista en una extremidad trasera de un ratón recién nacido. La Figura 43 representa el efecto de un presente agonista en las extremidades traseras de un ratón recién nacido a diferentes concentraciones . La Figura 44 delinea los efectos de un presente agonista en tejido de pulmón en desarrollo. La Figura 45 muestra los efectos de un presente agonista en tejidos de riñon en desarrollo.
Las Figuras 46A y B muestran los efectos de los presentes agonistas en te ido de piel de ratón en la presencia y ausencia de proteínas hedgehog. Las Figuras 47A y B comparan la actividad de los presentes agonistas en células indicadoras de ratón y humano. La Figura 48 representa la regulación ascendente de Gli en células HEPM tratadas con un fragmento N-terminal modificado de hedgehog sónico o con un presente agonista. La Figura 49 ilustra los efectos de los compuestos de la invención en lesiones inducidas por malonato. Las Figuras 50 y 51 presentan resultado de los experimentos que prueban un compuesto de la invención para la prevención del daño en un modelo de MCAO de ataque al corazón. Las Figuras 52 y 53 muestran los efectos del tratamiento pos-MCAO con un compuesto de la invención. La Figura 54 delinea el efecto del pre-tratamiento con un compuesto de la invención en un modelo de enfermedad de Parkinson. La Figura 55 exhibe el efecto de usar un compuesto de la invención como un producto terapéutico en un modelo de enfermedad de Parkinson. La Figura 56 representa la proliferación incrementada de células neurales in vivo después de la inyección de un compuesto de la invención. Las Figuras 57 y 58 ilustran proliferación incrementada de células neurales in vivo después de la administración oral de un compuesto de la invención. La Figura 59 muestra el efecto de prote na hedgehog Sónica (Shh) en un modelo de neuropatía diabética. La Figura 60 demuestra el efecto de un agonista de la invención en un modelo de neuropatía diabética. Las Figuras 61 y 62 muestran imágenes de nervorum vasa ciático después de la administración de un agonista de la invención en un modelo de neuropatía diabética. Las Figuras 63-65 ilustran la regulación ascendente de varios factores de crecimiento después de la administración de un agonista de la invención. Mejor Modo Para Llevar a Cabo la Invención Descripción Detallada de la Invención I . Resumen La presente invención se refiere al descubrimiento que las rutas de transducción de señales reguladas por hedgehog, patched (ptc) , gli y/o smoothened se pueden modular, al menos en parte, por moléculas pequeñas. En tanto que no se desea que se una a alguna teoría particular, la activación de una ruta patched-smoothened a través de la alteración de las asociaciones célula-superficie (tal como complejos) pueden ser el mecanismo por el cual actúen estos agentes . La ruta hedgehog se cree que se regula de manera negativa por la asociación de patched y smoothened, tal como en la forma de complejos proteicos, asociación que se perturba por la unión de hedgehog a patched. Por consiguiente, la capacidad de estos agentes para activar la ruta hedgehog puede ser debido a la capacidad de estas moléculas para interactuar con o unirse a patched o smoothened para perturbar de otro modo la asociación de smoothened con patched, o al menos para promover la capacidad de estas proteínas para activar una ruta de transducción de señales mediada por hedgehog, ptc y/o smoothened. Este modo de acción, por ejemplo, la modulación de una ruta dependiente de smoothened, se va a distinguir de los compuestos que modulan la ruta de hedgehog al activar directamente la ruta de cAMP, por ejemplo, por unión a o por interacción con PKA, adenilato-ciclasa, cAMP- fosfodiesterasa, etc. Ciertos agonistas de hedgehog descritos en la presente modulan la actividad de hedgehog en la ausencia de la proteína de hedgehog misma, por ejemplo, los compuestos imitan la actividad de hedgehog, en lugar de sólo complementar o incrementar la actividad de la proteína de hedgehog, por ejemplo, al promover que hedgehog se una a patched. Estos compuestos se refieren en la presente como agonistas independientes de hedgehog y solo pueden imitar el fenotipo o el efecto que resulta del tratamiento con hedgehog. Ciertos compuestos diferentes de la presente invención mejoran la actividad de la proteína hedgehog, y requieren la presencia o adición de la proteína hedgehog para observar el fenotipo o efecto que resulta de la inducción con hedgehog. Estos agonistas dependientes de hedgéhog se pueden usar en preparaciones terapéuticas o tratamientos que incluyen proteína hedgehog, o se pueden usar para incrementar la actividad de la proteína hedgehog producida de forma natural por las células o tej ido que se va a tratar con el agonista. Los agonistas de hedgehog descritos en la presente pueden inducir disociación de un complejo de patched-smoothened o perturbar las alteraciones entre patched y smoofchened, tal como por la unión a patched o smoothened, activando de este modo la ruta de hedgehog. En ciertas modalidades, las composiciones y métodos de la presente invención emplean un compuesto que actúa en uno o más componentes de la membrana extracelular de una célula objetivo. En ciertas modalidades, los agonistas de hedgehog útiles en la presente inducen regulación transcripcional dependiente de hedgehog, tal como expresión de los genes glil o ptc. Estos agonistas pueden inducir o incrementar de esta manera la activación de la ruta dependiente de hedgehog que resulta de, por ejemplo, niveles incrementados de proteínas hedgehog. Por lo tanto, se contempla de manera específica que estas moléculas pequeñas que modulan aspectos de la actividad de transducción de señales de hedgehog, ptc, o s oothened serán igualmente capaces de promover la proliferación (u otras consecuencias biológicas) en células que tienen una ruta ptc-smo funcional. En modalidades preferidas, los presentes agonistas son moléculas orgánicas que tienen un peso molecular de menos de 2500 amu, de manera más preferente menos de 1500 amu, y de manera aún más preferente menos de 750 amu, y son capaces de inducir o aumentar al menos algunas de las actividades biológicas de las proteínas de hedgétiog, de manera más preferentemente específica en células objetivo. La activación de la ruta de hedgehog por un agonista de hedgehog se puede cuantificar, por ejemplo, al detectar el incremento en la trascripción de ptc o gli-1 en la presencia del agonista con relación a un control en la ausencia del agonista. Por ejemplo, un incremento de al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, o aún al menos 50% puede ser indicativo de la activación de la ruta de hedgehog por un compuesto de prueba. En ciertas modalidades, la actividad del agonista de los presentes compuestos no se inhibe por el anticuerpo 5E1 de hedgehog, sino que se inhibe por jervina o un antagonista que tiene la fórmula: Esta cantidad se puede cuantificar, por ejemplo, al determinar si el anticuerpo antagonista induce .una disminución de más de 50%, más de 20%, más de 10%, o aún más de 5% de la regulación ascendente de ptc o gli-l inducida por el agonista en la ausencia del antagonista de hedgehog, etc. En ciertas modalidades, un compuesto útil en la presente invención, tal como se describe anteriormente, puede tener una EC50 para inducir o aumentar una o más actividades de hedgehog (tal como regulación ascendente de la expresión de ptc o gli) de menos de aproximadamente 1000 nM, menos de aproximadamente 100 nM, menos de aproximadamente 10 nM, o aún menos de aproximadamente 1 nM. La secuencia de codificación para genes Gli humanos de ejemplo, incluyen, por ejemplo, la secuencia del gen Gli-l del acceso del GenBank X07384 y la secuencia del gen Gli -2 del acceso del GenBank AB007298. Ver también Kinzler et al. Nature 1988, 332, 371. El nivel de expresión de gli o ptc se puede determinar, por ejemplo, al medir el nivel de ARNm (trascripción) o el nivel de la proteína (traducción) . De esta manera, los métodos de la presente invención incluyen el uso de moléculas pequeñas que antagonizan la inhibición por ptc de la señalización de hedgehog, tal como al activar smoothened o componentes de etapas posteriores de la ruta de la señal, en la regulación de reparación y/o desempeño funcional de una amplia variedad de células, tejidos y órganos. Por ejemplo, el presente método tiene aplicaciones terapéuticas y cosméticas que varían desde la regulación de los tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de la espermatogénesis, regulación del músculo liso, regulación de pulmón, hígado, órganos urogenitales (por ejemplo, vejiga), y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de la función hematopoyética, regulación del crecimiento de la piel y pelo, etc. Además, los presentes métodos se pueden realizar en células que se proporcionan cultivo (in vitro) , o en células en un animal completo (in vivo) . Ver, por ejemplo, publicaciones PCT WO 95/18856 y WO 96/17924 (las especificaciones de las cuales se incorporan de forma expresa como referencia en la presente) . En una modalidad, el presente método puede ser para tratar células epiteliales. En general, una célula epitelial se puede poner en contacto con una cantidad de un agonista de hedgehog para inducir crecimiento y/o formación de tejido epitelial. El presente método se puede llevar a cabo en células epiteliales que ya sea se pueden dispersar en cultivo o ser una parte de un tejido u órgano intacto. Además, el método se puede realizar en células que se proporcionan en cultivo {in vitro) , o en células en un animal completo (in vivo) . Los agonistas de hedgehog de la presente invención se pueden usar como parte de regímenes en el tratamiento de trastornos de, o reparación quirúrgica o cosmética de, estos tejidos epiteliales tal como piel y órganos de piel; tejido corneal, de lente y ocular; membranas mucósicas; y epitelio periodontal . Los métodos y composiciones descritas en la presente proporcionan el tratamiento o prevención de una variedad de tejidos epiteliales y mucósicos dañados. Por ejemplo, el presente método se puede usar para controlar los procesos de curación de heridas, como por ejemplo se puede desear en unión con cualquier cirugía que conprenda tejido epitelial, tal como de cirugías dermatológicas o periodontales. La reparación quirúrgica de ejemplo para la cual pueden ser útiles los agonistas de hedgehog incluyen quemadura severa y regeneración de piel, injertos de piel, yagas por presión, úlceras dérmicas, fisuras, reducción de cicatrices pos-cirugía y colitis ulcerativa. En otro aspecto de la presente invención, se puede usar un agonista de hedgehog para efectuar el crecimiento del pelo, como por ejemplo en el tratamiento de la alopecia por lo que se potencia el crecimiento del pelo. En otra modalidad preferida, el presente método se puede usar como parte de un régimen de tratamiento para meduloblastoma maligno y otros tumores neuroectodérmicos malignos del CNS primario. En otro aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden, como un ingrediente activo, un agonista de hedgehog, antagonista de ptc o agonista de smoothened como se describe en la presente, formulado en una cantidad suficiente para promover, in vivo, la proliferación u otras consecuencias biológicas.
Los presentes tratamientos que usan agonistas de hedgehog, antagonistas de patched o agonistas de smoothened pueden ser efectivos tanto para sujetos humanos como animales. Los sujetos animales a los cuales es aplicable la invención se extienden tanto a animales domésticos como ganado, criados como mascotas o para propósitos comerciales. Los ejemplos son perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos y cabras . II. Definiciones Por conveniencia, se recolectan ciertos términos empleados en la especificación, ejemplos y reivindicaciones anexas. La frase "modificación o mutación anormal" de un gen se refiere a lesiones genéticas tal como por ejemplo supresiones, sustituciones o adición de nucleótidos a un gen, así como re-arreglos cromosómicos ordinarios del gen y/o metilación anormal del gen. Igualmente, la mala expresión de un gen se refiere a niveles anormales de trascripción del gen con relación a aquellos niveles en una célula normal bajo condiciones similares, así como empalme tipo no silvestre del ARNm trascrito desde el gen. "Heridas por quemadura" se refiere a casos donde se han removido grandes áreas superficiales de la piel o se han perdido de un individuo debido a calor y/o agentes químicos. El "corion" o "dermis" se refiere a la capa de piel profunda a la dermis, que consiste de un lecho denso de tejido conectivo vascular, y que conecta los nervios y órganos terminales de sensación. Las raíces del pelo, y glándulas sebáceas y sudoríparas son estructuras de la epidermis que se incrustan profundamente en la dermis. "Tejido dental" se refiere al tejido en la boca que es similar al tejido epitelial, por ejemplo, tejido de encías. El método de la presente invención es útil para tratar enfermedad periodontal . "Úlceras dérmicas de piel" se refiere a lesiones en la piel provocadas por pérdida superficial de tejido, usualmente con inflamación. Las úlceras dérmicas de piel que se pueden tratar por el método de la presente invención incluyen úlcera por decúbito, úlceras diabéticas, úlceras de estasis venosa y úlceras arteriales. Las heridas por decúbito se refieren a úlceras crónicas que resultan de la presión aplicada a áreas de la piel durante periodos prolongados de tiempo. Las heridas de este tipo frecuentemente se llaman llagas o llagas de presión. Las úlceras de estasis venosa resultan del estancamiento de la sangre u otros fluidos de venas defectuosas. Las úlceras arteriales se refieren a piel necrótica en el área alrededor de las arterias que tiene poco flujo sanguíneo. El término "ED50" significa la dosis de un fármaco que produce 50% de su respuesta o efecto máximo. Una "cantidad efectiva" de por ejemplo, un agonista de hedgehog, con respecto al presente método de tratamiento, se refiere a una cantidad del agonista en una preparación que, cuando se aplica como parte de un régimen de dosis deseado provoca, por ejemplo, un cambio en la velocidad de proliferación celular y/o el estado de diferenciación en la célula y/o velocidad de supervivencia de una célula de acuerdo a normas clínicamente aceptables para el trastorno que se va a tratar o el propósito cosmético. Los términos "epitelia" , "epitelial" y "epitelio" se refieren a la cubierta celular de superficies corporales internas y externas (cutáneas, mucosas y serosas) , que incluye las glándulas y otras estructuras derivadas de las mismas, por ejemplo células corneales, esofagíales, epidérmicas y células epiteliales del folículo del pelo. Otros tejidos epiteliales de ejemplo incluyen: epitelio olfativo, que es el epitelio pseudo-estratificado que forra la región olfatoria de la cavidad nasal, y que contiene los receptores para la percepción de olores; epitelio glandular, que se refiere al epitelio compuesto de células secretoras ,-epitelio escamoso, que se refiere al epitelio compuesto de células tipo placa aplanada. El término epitelio también puede referirse a epitelio de transición, tal como el que se encuentra característicamente forrando los órganos huecos que se someten a gran cambio mecánico debido a la contracción y distensión, por ejemplo, tejido que representa una transición entre epitelio escamoso y columnar estratificado.
El termino "epitelialización" se refiere a la curación por el crecimiento de tejido epitelial sobre una superficie desnuda. El término "glándula epidérmica" se refiere a una agregación de células asociadas con la epidermis y especializadas para segregar o excretar materiales no relacionados a sus necesidades metabólicas ordinarias. Por ejemplo, "glándulas sebáceas" son glándulas holocrinas en el corion que segregan una sustancia aceitosa y sebo. El término "glándulas sudoríparas" se refiere a glándulas que segregan sudor, situadas en el corion o tejido subcutáneo, que se abren por un conducto a la superficie del cuerpo . El término "epidermis" se refiere a la capa más exterior y no vascular de la piel, derivada del ectodermo embrionico, que varía en espesor .de 0.07-1.4 mm. En las superficies palmar y plantar comprende, desde dentro hacia fuera, cinco capas: la capa basal compuesta de células columnares arregladas en forma perpendicular; células espinosas o capa espinosa compuesta de células poliédricas aplanadas con procesos cortos o espinas; capa granular compuesta de células granulares aplanadas; capa clara compuesta de varias capas de células transparentes claras en las cuales los núcleos son indistintos o están ausentes; y capa córnea compuesta de células no nucleadas, cornificadas , aplanadas. En la epidermis de la superficie general del cuerpo, la capa clara está usualmente ausente.
"Heridas excisionales" incluyen rasgaduras, abrasión, cortes, picaduras o laceraciones en la capa epitelial de la piel y pueden extenderse a la capa dérmica y aún a la grasa subcutánea y más allá. Las heridas excisionales pueden resultar de procedimientos quirúrgicos o de penetraciones accidentales de la piel . El "estado de crecimiento" de una célula se refiere a la velocidad de proliferación de la célula y/o el estado de diferenciación de la célula. Un "estado de crecimiento alterado" es un estado de crecimiento caracterizado por una velocidad anormal de proliferación, por ejemplo, una célula que exhibe una velocidad incrementada o disminuida de proliferación con relación a una célula normal. El término "pelo" se refiere a una estructura tipo hebra, especialmente la estructura epidérmica especializada o compuesta de queratina y que se desarrolla de una cavidad de papila en el corion, producida sólo por mamíferos y característica de ese grupo de animales. También "pelo" puede referirse al agregado de estos pelos . Un "folículo de pelo" se refiere a una de las invaginaciones tubulares de la epidermis que cierra los pelos, y de la cual crece el pelo. "Células epiteliales del folículo piloso" se refieren a células epiteliales que circundan la papila dérmica en el folículo piloso, por ejemplo, células madre, células de funda de raíz exterior, células de matriz, y células de funda de raíz interior. Estas células pueden ser células normales no malignas, o células transformadas/inmortalizadas. El término "agonista de hedgehog-" se refiere a un agente que potencia o recapitula la bioactivídad de hedgehog, tal como para reprimir la trascripción de los genes objetivo. Los agonistas hedgehog preferidos se pueden usar para imitar o superar la actividad o efecto de la proteína de hedgehog de una manera dependiente de smoothened. El término "agonista de hedgehog" como se usa en la presente se refiere no sólo a cualquier agente que puede actuar al inhibir directamente la función normal de la proteína hedgehog, sino también a cualquier agente que inhiba la ruta de señalización de hedge og, y de esta manera recapitule la función de ptc. El término "pérdida de función de hedgehog" se refiere a una modificación o mutación anormal de un gen ptc, un gen hedgehog, o un gen smoothened, o una disminución (o pérdida) en el nivel de expresión de este gen, que da por resultado un fenotipo que se asemeja al contacto de una célula con una proteína hedgehog, por ejemplo, activación anormal de una ruta de hedgehog. La pérdida de función puede incluir un incremento de la capacidad del producto génico de ptc para regular el nivel de expresión de los genes Ci, por ejemplo, Glil, Gli2 y Gli3. El término "pérdida de función de hedgehog" también se usa en la presente para referirse a cualquier fenotipo celular similar (por ejemplo, que exhiba proliferación reducida) que se presente debido a una alteración en algún lado en la ruta de transducción de señales de hedgehog, incluyendo de manera enunciativa y sin limitación, una modificación o mutación del hedgehog- mismo. Por ejemplo, una célula de tumor con una velocidad de proliferación anormalmente baja debido a la inactivación de la ruta de señalización del hedgehog tendrá un fenotipo de "pérdida de función de hedgehog" , aún si hedgehog no está mutado en esa célula. Como se usa en la presente, "células inmortalizadas" se refiere a células que se han alterado vía medio químico y/o recombinante tal que las células tienen la capacidad de crecer a través de un número ¦ indefinido de divisiones en cultivo. "Tejido epitelial interno" se refiere a tejido dentro del cuerpo que tiene características similares a la capa epidérmica en la piel. Los ejemplos incluyen el forro del intestino. El método de la presente invención es útil para promover la curación de ciertas heridas internas, por ejemplo, heridas que resultan de cirugía. El término "queratosis" se refiere a un trastorno proliferativo de la piel caracterizado por hiperplasia de la capa córnea de la epidermis. Los trastornos queratoticos de ejemplo incluyen queratosis folicular, queratosis palmar y plantar, queratosis faríngea, queratosis pilar y queratosis actínica.
El término "LD50" significa la dosis de un fármaco que es letal en 50% de los sujetos de prueba. El término "uña" se refiere a la placa cutánea córnea en la superficie dorsal del extremo distante de un dedo o dedo del piel . El término "ganancia de función de patched" se refiere a una modificación o mutación anormal de un gen ptc, o un nivel incrementado de expresión del gen, que da por resultado un fenotipo que se asemeja al contacto de una célula con un inhibidor de hedgehog, por ejemplo, desactivación anormal de la ruta de hedgehog. La ganancia de función puede incluir un incremento de la capacidad del producto génico de ptc para regular el nivel de expresión de los genes Ci, por ejemplo, Glil, Gli2 y Gli3. Un "paciente" o "sujeto" que se va a tratar por el presente método puede significar ya sea un humano o un animal no humano . El término "profármaco" se propone para abarcar compuestos que, bajo condiciones fisiológicas, se convierten en los agentes terapéuticamente activos de la presente invención. Un método común para elaborar un profármaco es incluir porciones seleccionadas que se hidrolizan bajo condiciones f siológicas para revelar la molécula deseada. En otras modalidades, el profármaco se convierte por una actividad enzimática del animal hospedador.
Como se usa en la presente, "proliferante" y "proliferación" se refieren a células que sufren mitosis. A todo lo largo de esta solicitud, el término "trastorno proliferativo de piel" se refiere a cualquier enfermedad/trastorno de la piel marcado por proliferación indeseada o anormal de tejido cutáneo. Estas condiciones se caracterizan típicamente por proliferación de células epidérmicas o diferenciación celular incompleta e incluyen, por ejemplo, ictiosis X-enlazada, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, hiperqueratosis epidermolí ica, y dermatitis seborreica. Por ejemplo, la epidermodisplasia es una forma de desarrollo defectuoso de la epidermis. Otro ejemplo es "epidermólisis" , que se refiere a un estado suelto de la epidermis con formación de ampollas y prominencias ya sea de forma espontánea o en el sitio de trauma. El término "piel" se refiere a la cubierta protectora exterior del cuerpo, que consiste del corion y la epidermis, y se entiende que incluye glándulas sudoríparas y sebáceas, así como estructuras de folículo de pelo. A todo lo largo de esta solicitud, el adjetivo "cutáneo" se puede usar, y se debe entender para referirse en general a los atributos de la piel, como es apropiado al contexto en el cual se usan. El término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2500 amu, de manera preferente menos de aproximadamente 2000 amu, de manera aun más preferente menos de aproximadamente 1500 amu, de manera aun más preferente menos de aproximadamente 1000 amu, o de manera más preferente menos de aproximadamente 750 amu. El término "pérdida de función de s oothened" se refiere a una modificación o mutación anormal de un gen smo, o un nivel disminuido de expresión del gen, que da por resultado un fenotipo que se asemeja al contacto de una célula con una proteina hedgehog, por ejemplo, activación anormal de una ruta de hedgehog. En tanto que no se desea que se una por ninguna teoría particular, se señala que ptc no señaliza directamente en la célula, sino más bien interactúa con smoothened, otra proteína unida a membrana localizada en etapas posteriores de ptc en la señalización de hedgehog (Marigo et al., (1996) Nature 384: 177-179). El gen smo es un gen de polaridad de segmento requerido para el modelado correcto de cada segmento en Drosophila (Alcedo et al., (1996) Cell 86: 221-232). Se han identificado homólogos humanos de smo. Ver, por ejemplo, Stone et al. (1996) Nature 384:129-134, y acceso GenBank U84401. El gen smoothened codifica para una proteína de membrana integral con características de los receptores acoplados a proteína G heterotriméricos ; es decir, regiones 7 -transmembrana . Esta proteína muestra homología a la proteína Frizzled (Fz) de Drosophila, un miembro de la ruta de wingless. Se pensó originalmente que smo codifica para un receptor de la señal Hh. Sin embargo, esta sugerencia se desaprobó subsecuentemente, puesto que se obtuvo evidencia para ptc que es el receptor de Hh. Las células que expresan smo fallan en unirse a Hh, indicando que smo no interactúa directamente con (Nusse, (1996) Nature 384: 119-120). En cambio, la unión de hedgehog Sónico (SHH) a su receptor, PTCñ, se piensa que previene la inhibición normal por PTCñ de smoothened (SMO) , una proteína transmembrana de siete intervalos . El término "índice terapéutico" se refiere al índice terapéutico de un fármaco definido como LD5o/ED5o. El término "acilamino" es reconocido en la técnica y se refiere a una porción que se puede representar por la fórmula general : en donde R9 es como se define anteriormente, y R'n representa hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH2)m-Ra, donde m y R8 son como se definen anteriormente. En la presente, el término "grupo alifático" se refiere a una cadena recta, cadena ramificada, o un grupo de hidrocarburo alif tico cíclico e incluye grupos alifáticos saturados e insaturados, tal como grupo alquilo, grupo alquenilo y grupo alquinilo.
El término "alquenilo" y "alquinilo" se refieren a grupos alifáticos insaturados análogos en longitud y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble o triple enlace, respectivamente. Los términos "alcoxilo" o "alcoxi" como se usan en la presente se refieren a un grupo alquilo, como se define anteriormente, que tiene un radical de oxígeno unido al mismo. Los grupos alcoxilo representativos incluyen metoxi, etoxi, propiloxi, ter-butoxi y similares. Un "éter" es dos hidrocarburos enlazados covalentemente por un oxígeno. Por consiguiente, el sustituyente y un alquilo que vuelve a ese alquilo un éter es o se asemeja a un alcoxilo, tal como se puede representar por uno de -O-alquilo, -O-alquenilo, -O-alquinilo, O- (CH2) ra-R8 , donde m y R8 son como se describen anteriormente . El término "alquilo" se refiere al radical de grupos alifáticos saturados, que incluyen grupos alquilo de cadena recta, grupos alquilo de cadena ramificada, grupos cicloalquilo (alicíclico) , grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo, y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En modalidades preferidas, un alquilo de cadena recta o de cadena ramificada tiene 30 ó menos átomos de carbono en su estructura (por ejemplo, Ci-C30 para cadenas rectas, C3-C3o para cadenas ramificadas) , y de manera más preferente 20 ó menos. Igualmente, los cicloalquilos preferidos tienen de 3-10 átomos de carbono en su estructura de anillo, y tienen de manera más preferente 5, 6 ó 7 carbonos en la estructura de anillo . Además, el término "alquilo" (o "alquilo inferior") como se usa a todo lo largo de la especificación, ejemplos y reivindicaciones se propone para incluir tanto "alquilos insustituidos" como "alquilos sustituidos", estos últimos se refieren a porciones de alquilo que tienen sustituyentes que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos de la estructura de hidrocarburo. Estos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, un halógeno, un hidroxilo, un carbonilo, (tal como un carboxilo, un alcoxicarbonilo, un formilo, o un acilo) , un tiocarbonilo (tal como un tioéster, un tioacetato, o un tioformiato) , un alcoxilo, un fosforilo, un fosfato, un fosfonato, un fosfinato, un amino, un amido, una amidina, una imina, un ciano, un nitro, un azido, un sulfhidrilo, un alquiltio, un sulfato, un sulfonato, un sulfamoilo, un sulfonamido, un sulfonilo; un heterociclilo, un aralquilo, o una porción aromática o heteroaromática . Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que las porciones sustituidas en la cadena de hidrocarburo pueden estar sustituidas por si mismas, si es apropiado. Por ejemplo, los sustituyentes de un alquilo sustituido pueden incluir formas sustituidas e insustituidas de amino, azido, imino, amido, fosforilo (incluyendo fosfonato y fosfinato) , sulfonilo (incluyendo sulfato, sulfonamido, suífamoilo y sulfonato) , y grupos sililo, así como éteres, alquiltios, carbonilos (incluyendo cetonas, aldehidos, carboxilatos y esteres), -CF3, -CN y similares. Los alquilos sustituidos de ejemplo se describen posteriormente. Los cicloalquilos pueden estar sustituidos adicionalmente con alquilos, alquenilos, alcoxis, alquiltios, aminoalquilos , alquilos sustituidos con carbonilo, -CF3, -CN y similares. A menos que el número de carbonos se especifique de otro modo, "alquilo inferior" como se usa en la presente significa un grupo alquilo, como se define anteriormente, pero que tiene de uno a diez carbonos, de manera más preferente de uno a seis átomos de carbono en su estructura. Igualmente, "alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tienen longitudes de cadena similares. A todo lo largo de la solicitud, los grupos alquilo preferidos son alquilos inferiores. En modalidades preferidas, un sustituyente designado en la presente como alquilo es un alquilo inferior. El término "alquiltio" se refiere a un grupo alquilo, como se define anteriormente, que tiene un radical de azufre unido al mismo. En modalidades preferidas, la porción "alquiltio" se representa por uno de -S-alquilo, -S-alquenilo, -S-alquinilo y -S- (CH2) m-Ra, en donde m y R8 son como se definen anteriormente. Los grupos alquiltio representativos incluyen metilito, etiltio y similares.
Los términos "amina" y "amino" son reconocidos en la técnica y se refieren tanto a aminas insustituidas como sustituidas, por ejemplo, una porción que se puede representar por la fórmula general : en donde Rs, Ri0 y R'io representan cada uno independientemente un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, -(CH2)m-R8, o R9 y Rio tomados conjuntamente con el átomo N al cual están unidos terminan un heterociclo que tiene de 4 a 8 átomos en la estructura de anillo; R8 representa un arilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un heterociclo o un policiclo; y m es cero o un número entero en el intervalo de 1 a 8. En modalidades preferidas, sólo uno de R9 ó R10 pueden ser un carbonilo, por ejemplo, R9, Rio y el nitrógeno conjuntamente no forman una imida . En modalidades aún más preferidas, el término "amina" no comprende amidas, por ejemplo uno de R9, Ra0 representa un carbonilo. En modalidades aun más preferidas, R9 y Rxo (y opcionalmente R'io) representan cada uno independientemente un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, o -(CH2)m-R8. De esta manera, el término "alquilamina" como se usa en la presente significa un grupo amina, como se define anteriormente, que tiene un alquilo sustituido o insustituido unido al mismo, es decir, al menos uno de R9 y ¾0 es un grupo alquilo, El término "amido" se reconoce en la técnica como un carbonilo sustituido con amino e incluye una porción que se puede representar por la fórmula general : en donde R9, io son como se definen anteriormente. Las modalidades preferidas de la amida no incluirán imidas que pueden ser inestables . El término "aralquilo" , como se usa en la presente, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo arilo (por ejemplo, un grupo aromático o heteroaromático) . El término "arilo" como se usa en la presente incluye grupos aromáticos de anillo individual de 5-, 6- y 7-miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, pirrol , furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol , pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina y similares . Aquellos grupos arilo que tengan heteroátomos en la estructura de anillo también pueden ser referidos como "heterociclos de arilo" o "heteroaromáticos" . El anillo heteroaromático puede estar sustituido en una o más porciones de anillo con sustituyentes tal como se describe anteriormente, por ejemplo, halógeno, azida, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, alcoxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, sulfonamido, cetona, aldehido, éster, heterociclilo, porciones aromáticas o heteroaromáticas , -CH3, -CN o similares. El término "arilo" también incluye sistemas de anillo policxclico que tienen dos o más anillos cíclicos en los cuales dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes (los anillos son "anillos fusionados") en donde al menos uno de los anillos es aromático, por ejemplo, el otro anillo cíclico puede ser cicloalquilos , cicloalquenilos , cicloalquinilos, arilo y/o heterociclilos. El término "carbociclo" , como se usa en la presente, se refiere a un anillo aromático o no aromático en el cual cada átomo del anillo es carbono. El término "carbonilo" es reconocido en la técnica e incluye porciones tal como se puede representar por la fórmula general : en donde X es un enlace o representa un oxígeno o un azufre, y Ru representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo, (CH2)m-R8 ° una sal farmacéuticamente aceptable, R'X1 representa un hidrógeno, un alquilo, un alquenilo o -(CH2)m~ R8, donde m y R8 son como se definen anteriormente. Donde X es un oxigeno y R1 ó R'u no es hidrógeno, la fórmula representa un "éster" . Donde X es un oxígeno, y ¾i es como se define anteriormente, la porción se refiere en la presente como un grupo carboxilo, y particularmente cuando Ru es un hidrógeno, la fórmula representa un "ácido carboxílico" . Donde X es un oxígeno, y R'u es hidrógeno, la fórmula representa un "formiato" . En general, donde el átomo de oxígeno de la fórmula anterior se reemplaza por azufre, la fórmula representa un grupo "tiocarbonilo" . Donde X es un azufre y Ru ó R'u no es hidrógeno, la fórmula representa un "tioéster" . Donde X es un azufre y Ru es hidrógeno, la fórmula representa un "ácido tiocarboxílico" . Donde X es un azufre y u' es hidrógeno, la fórmula representa un "tioformiato" . Por otra parte, donde X es un enlace, y Ru no es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo "cetona" . Donde X es un enlace, y Ru es hidrógeno, la fórmula anterior representa un grupo "aldehido" . El término "heteroátomo" como se usa en la presente significa un átomo de cualquier elemento diferente de carbono o hidrógeno. Los heteroátomos preferidos son boro, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre y selenio. Los términos "heterociclilo" o "grupo heterocíclico" se refieren a estructuras de anillo de 3 a 10 miembros, de manera más preferente a anillos de 3 a 7 miembros, cuyas estructuras de anillo incluyen uno a cuatro heteroátomos . Los heterociclos también pueden ser policiclos. Los grupos de heterociclilo incluyen, por ejemplo, tiofeno, tiantreno, furano, pirano, isobenzofurano, cromeno, xanteno, fenoxatiino, pirrol, imidazol, pirazol, isotiazol, isoxazol, piridina, pirazina, pirimidina, piridazina, indolizina, isoindol, indol, indazol, purina, quinolizina, isoquinolina, quinolina, ftalazina, naftiridina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, pteridina, carbazol, carbolina, fenantridina, acridina, pirimidina, fenantrolina, fenazina, fenarsazina, fenotiazina, furazan, fenoxazina, pirrolidina, oxolano, tiolano, oxazol, piperidina, piperazina, morfolina, lactonas, lactamas tal como azetidinonas y pirrolidinonas, sultanas, sultonas y similares. El anillo heterocíclico puede estar sustituido en una o más posiciones con sustituyentes tal como se describe anteriormente, tal como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehido, éster, un heterociclilo, una porción aromática o heteroaromática, -CF3, -CN, o similares. Como se usa en la presente, el término "nitro" significa -N02; el término "halógeno" designa -F, -Cl, -Br ó I; el término "sulfhidrilo" significa -SH; el término "hidroxilo" significa -OH; y el término "sulfonilo" significa -S02- Una "fosfonamidita" se puede representar en la fórmula general : en donde R9 y Rio son como se definen anteriormente, Q2 representa O, S ó N, y R48 representa un alquilo inferior o un arilo, Q2 representa 0, S ó N. Una "fosforamidita" se puede representar en la fórmula general : en donde R9 y Ra0 son como se definen anteriormente, y Q2 representa 0, S ó N. Un "fosforilo" puede ser representado en general por la fórmula: OR 4.6 en donde Q representa S u O, y R46 representa hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo. Cuando se usa para sustituir, por ejemplo, un alquilo, el grupo fosforilo del fosforilalquilo se puede representar por la fórmula general: en donde ¾ representa S u 0, y cada R46 representa independientemente hidrógeno, un alquilo inferior o un arilo, Q_2 representa O, S ó N. Cuando Qi es S, la porción fosforilo es un "fosforotioato" . Los términos "policiclilo" o "grupo policíclico" se refiere a dos o más anillos (por ejemplo, cicloalquilos, cialoalquenilos , cicloalquinilos , arilos y/o heterociclilos) en los cuales dos o más carbonos son comunes a dos anillos adyacentes, por ejemplo, los anillos son "anillos fusionados" . Los anillos que están unidos a través de átomos no adyacentes se llaman anillos "en puente" . Cada uno de los anillos del policiclo puede estar sustituido por sustituyentes tal como se describe anteriormente, tal como por ejemplo, halógeno, alquilo, aralquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, hidroxilo, amino, nitro, sulfhidrilo, imino, amido, fosfato, fosfonato, fosfinato, carbonilo, carboxilo, sililo, éter, alquiltio, sulfonilo, cetona, aldehido, éster, un heterociclilo, una porción aromática o heteroaromática, -CF3, -CN, o similares. La frase "grupo protector" como se usa en la presente significa sustituyentes temporales que protegen un grupo funcional potencialmente reactivo de las transformaciones químicas indeseadas . Los ejemplos de estos grupos protectores incluyen esteres de ácidos carboxílieos, éteres de sililo de alcoholes, y acétales y cetales de aldehidos y cetonas, respectivamente. El campo de la química de grupos protectores se ha revisado (Greene, T.W.; Wuts, P.G.M Protective Graups in Organic Synthesis, 2n& ed.; Wiley; New York, 1991). Un "selenoalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene un grupo seleno sustituido unido al mismo. Los "selenoéteres" de ejemplo que pueden estar sustituidos en el alquilo se seleccionan de uno de -Se-alquilo, -Se-alquenilo;- -Se-alquinilo, y -Se- (C¾)nr¾f m y ¾ son como se definen anteriormente. Como se usa en la presente, el término "sustituido" se contempla que incluya todas las sustituciones permisibles de los compuestos orgánicos. En .un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos , aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Los sustituyentes ilustrativos incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en la presente anteriormente. Los sustituyentes permisibles pueden ser uno o más y los mismos o diferentes para compuestos orgánicos apropiados . Para propósitos de esta invención, los heteroátomos tal como nitrógeno pueden tener sustituyentes de hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de compuestos orgánicos descritos en la presente que satisfaga las valencias de los heteroátomos . Esta invención no se propone para ser limitada de ningún modo por los sustituyentes permisibles de los compuestos orgánicos . Se entenderá que "sustitución" o "sustituido con" incluye la condición implícita que esta sustitución está de acuerdo con la valencia permitida del átomo sustituido y el sustituyente, y que la sustitución da por resultado un compuesto estable, por ejemplo, que no sufre espontáneamente transformación tal como por re-arreglo, ciclización, eliminación, etc. El término "sulfamoilo" está reconocido en la técnica e incluye una porción que se puede representar por la fórmula general : S-N 11 NR en la cual 9 y Ri0 son como se definen anteriormente. El término "sulfato" se reconoce en la técnica e incluye una porción que se puede representar por la fórmula general : o —0—S-0R41 II O en la cual R4i es como se define anteriormente. El término "sulfonamido" se reconoce en la técnica e incluye una porción que se puede representar por la fórmula general en la cual R9 y R'u son como se definen anteriormente. El término "sulfonato" se reconoce en la técnica e incluye una porción que se puede representar por la fórmula general : en la cual R4i es un par de electrones, hidrógeno, alquilo, cicloalquilo o arilo. Los términos "sulfóxido" o "sulfinilo", como se usa en la presente, se refiere a una porción que se puede representar por una fórmula general : en la cual R44 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, aralquilo o arilo. Se pueden hacer sustituciones análogas a grupos alquenilo y alquinilo para producir, por ejemplo, aminoalquenilos, aminoalquiñi1os , amidoalquenilos , amidoalquinilos, iminoalquenilos , iminoalquinilos , tioalquenilos , tioalquinilos , alquenilos o alquinilos sustituidos con carbonilo. Como se usa en la presente, la definición de cada expresión, por ejemplo, alquilo, m, n, etc., cuando se presenta más de una vez en cualquier estructura, se propone para ser independiente de su definición donde quiera en la misma estructura. Los términos triflilo, tosilo, mesilo y nonaflilo se reconocen en la técnica y se refieren a trifluorometanosulfonilo, p-toluenosulfonilo, metanosulfonilo y nonafluorobutanosulfonilo, respectivamente. Los términos triflato, tosilato, mesilato y nonaflato se reconocen en la técnica y se refieren a éster de trifluorometanosulfonato, éster de p-toluenosulfonato, éster de metanosulfonato y éster de nonafluorobutanosulfonato, grupos funcionales y moléculas que contienen estos grupos, respectivamente. Las abreviaciones Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms representan metilo, etilo, fenilo, trifluorometanosulfonilo, nonafluorobutanosulfonilo, p-toluenosulfonilo y metanosulfonilo, respectivamente. Una lista más comprensiva de las abreviaciones utilizadas por los químicos orgánicos de habilidad ordinaria en la técnica aparece en la primera emisión de cada volumen de Journal of Organic Chemistry; esta lista se presente típicamente en una tabla titulada Lista Estándar de Abreviaciones . Las abreviaciones contenidas en la lista, y todas las abreviaciones utilizadas por los químicos orgánicos de habilidad ordinaria en la técnica se incorporan de este modo como referencia. Ciertos compuestos de la presente invención pueden existir en formas geométricas o estereoisoméricas particulares. La presente invención contempla todos estos compuestos, incluyendo isómeros cis- y trans- enantiómeros R-y S-, diastereómeros , isómeros (D) , isómeros (L) , las mezclas racémicas de los mismos, y otras mezclas de los mismos, como caigan dentro del alcance de la invención. Pueden estar presentes átomos de carbono asimétricos adicionales en un sustituyente tal como un grupo alquilo. Todos estos isómeros, así como mezclas de los mismos, se proponen para ser incluidos en esta invención. Por ejemplo, si un enantiómero particular de un compuesto de la presente invención se desea, se puede preparar por síntesis asimétrica, o por derivación con un auxiliar quiral, donde la mezcla diastereomérica resultante se separa y el grupo auxiliar se escinde para proporcionar los enantiómeros puros deseados. De manera alternativa, donde la molécula contenga un grupo funcional básico, tal- como amino, o un grupo funcional ácido, tal como carboxilo, se pueden formar sales diastereoméricas con un ácido o base óptimamente activo, apropiado, seguido por resolución de los diastereómeros formados de esta manera por cristalización fraccional o medio cromatográfico bien conocido en la técnica, y recuperación subsiguiente de los enantiome os puros. Los equivalentes contemplados de los compuestos descritos anteriormente incluyen compuestos que corresponden de otro modo a los mismos, y que tienen las mismas propiedades generales de los mismos (por ejemplo, la capacidad para inhibir la señalización de hedgehog) , en donde una o más variaciones simples de los sustituyentes se hacen las cuales no afectan de manera adversa la eficiencia del compuesto. En general, los compuestos de la presente invención se pueden preparar por los métodos ilustrados en los esquemas de reacción generales, tal como por ejemplo como se describe posteriormente, o por modificaciones de los mismos, usando materiales de inicio fácilmente disponibles, reactivos y procedimientos de síntesis convencionales. En estas reacciones, también es posible hacer uso de variantes que se conocen en sí mismas pero que no se mencionan. Para propósitos de esta invención, los elementos químicos son identificados de acuerdo con la Tabla Periódica de los Elementos, versión CAS, Handbook de Chemistry and Physics, 67th Ed. , 1986-87, dentro de cubierta. También para propósitos de esta invención, el término "hidrocarburo" se contempla que incluya todos los compuestos permisibles que tengan al menos un hidrógeno y un átomo de carbono . En un aspecto amplio, los hidrocarburos permisibles incluyen compuestos orgánicos acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclacos , aromáticos y no aromáticos que pueden estar sustituidos o insustituidos . III. Compuestos de Ejemplo de la Invención Como se describe en detalle adicional posteriormente, se contempla que los presentes métodos se pueden llevar a cabo usando una variedad de diferentes moléculas pequeñas que se pueden identificar fácilmente, por ejemplo, por ensayos de detección de fármacos tal como se describe en la presente. Por ejemplo, los compuestos útiles en los presentes métodos incluyen compuestos que se pueden representar por la fórmula general (I) : Fórmula I en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar y Ar' representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo, sustituidos o insustituidos; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C (=0) - , , -C (=S) - , -S(02)-, -S(0)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -Oí(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy y Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos , sustituidos o insustituidos ; e i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc.
En ciertas modalidades, Ar y Ar' representan anillos de fenilo, por ejemplo, insustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tal como 0, N y S. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas modalidades, Y y Ar' se unen a Ar en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2 -ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC1 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3 -cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carboclclico o heteroclclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy incluye una amina dentro de los átomos del anillo o en un sustituyente del anillo, por ejemplo, Cy es piridilo, imidazolilo, pirrolilo, piperidilo, pirrolidilo, piperazilo, etc., y/o tiene un sustituyente amino. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Ar' se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(CH2)EOH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (C¾) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR/ - (CH2) PN(R)2, - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) P R-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR/ y formas protegidas de los anteriores en donde p y n, individualmente para cada ocurrencia representan números enteros de 0 a 10, de manera preferent de 0 a 5. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en 1 presente invención se pueden representar por la fórmul general (II) : Fórmula II en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar y Ar' representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo, sustituidos o insustituidos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa ~N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0) (OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa/ independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF- , -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido, en donde algunas o todas las ocurrencias de M en Mj forman toda o parte de una estructura cíclica ; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo , alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy' representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos, sustituidos o insustituidos; j representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 10, de manera preferente de 2 a 7; e i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C{=0)-, etc. En ciertas modalidades, Ar y Ar' representan anillos de fenilo, por ejemplo, insustituidos o sustituidos con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tal como 0, N y S. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de heteroarilo, por eemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas modalidades, Y y Ar' se unen a Ar en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas modalidades, en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3 -metil-benzo (b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CCI3, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo(b)tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Ar' se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) palquilo, - (CH2) palguenilo, - (CH2) Palguinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(CH)pOH, - (C¾) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (C¾) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2)PN(R)2, - (C¾) pNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (III) : Fórmula III en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar y Ar' representan independientemente anillos de heteroarilo o arilo, sustituidos o insustituidos ; Y, independientemente . para cada ocurrencia, está ausente o representa -N (R) - , -0- , -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-; -S(02)-, -S(0)-, -C(=NCM)-; -P(=0)(0R)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF- , -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, eteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy y Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policiclicos , sustituidos o insustituidos ,· e i representa, independientemente, para. cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2- , -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Ar y Ar' representan anillos de fenilo, por ejemplo, insustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo heteroátomos tal como 0, N y S. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Ar' representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, etc. En ciertas modalidades, Y y Ar' se unen a Ar en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biciclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2 -ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHCl2 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como C¾CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3 -cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2 -ilo, ó 3 -metil-benzo (b) tien-2 -ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me.
En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N y/o a NR2. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En las modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Ar' se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, (CH2) paralquilo, ~(CH2)P0H, - (CH2) pO-alquilo inferior, -(CH2)P0-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, - (CH2) PS-alquilo inferior, - (C¾) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN (R) 2, - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) pNR-alquenilo inferior, NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en los presentes métodos incluyen compuestos representados por la fórmula general (IV) : Fórmula IV en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy' representa un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, incluyendo policíclicos ,· Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, ¦ -C(=NCN)-, -P(=0)(0R)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos R tomados con untamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Ra y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) palquinilo, - (CH2) parilo, - (CH2) paralquilo, -(C¾)POH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R) 2, - (C¾) pNR-alquilo inferior - (C¾) P R-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores; Cy representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos, sustituidos o insustituidos; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2; y p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF- , -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o heterocíclico sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de eteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2 -ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3 -fluoro-benzo (b) tien-2 -ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2 -ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHCl2 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3 -cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me.
En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En las modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, ¾ y R2 presentan, independientemente y conforme lo permita la valencia de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (C¾) palquilo , - (CH2) palquenilo, - (CH2) palquinilo, -(CH2 ) pOH , - (CH2) pO-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (C¾) PS-alquenilo inferior, -S(CH2 ) nR , - (CH2 ) PN (R) 2 , - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) P R-alquenilo inferior, -NR(CH2 ) nR , y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (V) : Fórmula V en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, incluyendo policíclicos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,~0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0) (OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me) -, -C(=0) -, etc. , o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Ri y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(CH2)POH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR/ - (CH2)PN(R)2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores ,- Cy' representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policiclicos , sustituidos o insustituidos; j representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 10, de manera preferente de 2 a 7; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2 ; y p y n, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5.
En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o heterocíclico sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos , por ' ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo(b) tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo(b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b)tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo(b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo(b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y-S(02)-. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferiores, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente, una amina primaria o secundari . En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me . En ciertas modalidades, Ri y R2 se presentan, independientemente conforme lo permita la valencia de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (CH2) Palquilo, - (CH2) Palquenilo, - (CH2) palquinilo, -(CH2)pOH, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(C¾)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR/ - (CH2) PN(R) 2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (VI) : Fórmula VI en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, incluyendo policíclicos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(OR)-# y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o 'insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido,- R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos , o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy representa grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policiclicos, sustituidos o insustituidos; Ri y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) palquilo , - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (C¾) Parilo, - (CH2) Paralquilo, -(CH2)POH, - (CH2) P0-alguilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(C¾)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (C¾) PN (R) 2, - (C¾) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2; y n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o heterociclico sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, tal como benzotiofeno , benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos' o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biciclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b)tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo(b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo(b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3 -cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i representa de manera preferente un número entero de 1-2 en un Mi adyacente, si i=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N ó NR2.
En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferiores, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente, una amina primaria o secundaria. En ciertas modalidades, R representa H o alquilo inferior, por ejemplo, H o Me. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado de sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N y/o a R2. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En las modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a M, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, Ri y R.2 representan, independientemente conforme lo permita la valencia de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (C¾) Palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) palquinilo, -(CH2)P0H, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, ~0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R)2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN (R) 2 , - (CH2) PNR-alquilo inferior -(CH2) pNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, un presente compuesto tiene la estructura de la Fórmula Fórmula VII en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Cy representa un heterociclilo o cicloalquilo sustituido o insustituido; Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido, incluyendo policíclicos ; W es O ó S; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo , heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo, sustituidos o insustituidos, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Ri y R2 representan independientemente, y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionados de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, amido, amidino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (C¾) Parilo, - (C¾) paralquilo, -(CH2)POH, - (C¾) P0-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0{C¾)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (C¾) pN(R) 2, - (CH2) PWR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores; n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, Cy' representa un sistema de anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como de heteroarilo, por ejemplo, benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridilo, etc. En ciertas modalidades diferentes, Cy' representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, para formar un sistema anillo de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2 -ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo(b)tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente , en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria con uno o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o secundaria. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbociclico o heterocíclico saturado, sustituido o insustituido, es decir compuesto de una pluralidad de átomos hibridizados de sp3. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros directamente unido a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina pueden estar colocados trans en el anillo. En ciertas modalidades, Ri y R2 representan, independientemente y conforme lo permita la valencia, de 0-5 sustituyentes en el anillo al cual se unen, seleccionado de halógeno, alquilo inferior, alguenilo inferior, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (CH2) Palquilo, - (C¾) Palquenilo, - (CH3) palquinilo, -(CH2)P0H, - (CH2) P0-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, ~(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN (R) 2, - (CH2) pNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores. En ciertas modalidades, un presente compuesto tiene una estructura de la Fórmula VIII: Fórmula VIII en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, U representa un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido fusionado al anillo que contiene nitrógeno; V representa un grupo alquileno inferior, tal como metileno, 1,2-etileno, 1,1-etileno, 1, 1-propileno, 1,2-propileno, 1, 3-propileno, etc . ; W representa S u 0, de manera preferente O; X representa C=0, C=S o S02; R3 representa arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, alquinilo inferior, carbociclilo, carbociclilalquilo, heterociclilo , heterociclilalquilo, aralquilo o heteroaralquilo; sustituidos o insustituidos R4 representa aralquilo o alquilo inferior sustituido o insustituido, tal como fenetilo, bencilo o aminoalquilo, etc.; R5 representa arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo sustituido o insustituido, incluyendo grupos heteroaromáticos o aromáticos, policíclicos . En ciertas modalidades, U representa un anillo de fenilo fusionado al anillo que contiene nitrógeno. En ciertas modalidades, R3 se selecciona de arilo, heteroarilo, alquilo inferior, alquenilo inferior, aralquilo y heteroaralquilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, R4 es un grupo alquilo inferior insustituido, o es un grupo alquilo inferior sustituido con una amina terciaria o terciaria. En ciertas modalidades, R5 se selecciona de fenilo o naftilo sustituido o insustituido, o es un grupo diarilalquilo, tal como 2, 2-difeniletilo, difenilmetilo, etc. En ciertas modalidades, el presente compuesto incluye compuestos que se representan por la fórmula (IX) : Fórmula IX en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar representa un anillo ' de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido; Z esta ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo, ó heteroarilo sustituido o insustituido, o un alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno sustituido; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-, con la condición de que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, -C(=NCN)-, -P(=0) (OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alguinilo, alquenilo o alquilo inferior ,- M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, carbociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, heterociclilalquilo, carbociclilalquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy y Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policiclicos, sustituidos o insustituidos ,- i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5, de manera preferente de 0 a 2 ; y k representa un número entero de 0 a 3 , de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, i representa 0 para todas las ocurrencias, excepto en la secuencia N-Mi-Y-Ar, donde i representa 1.
En ciertas modalidades, Ar y X representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo sustituidos o insustituidos con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos tal como O, N y S. En ciertas modalidades, al menos Ar representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas modalidades, las ocurrencias de Y unidas a Ar se coloca en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas modalidades, la única ocurrencia presente de Y se une a Mk. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i o k representan de manera preferente 2 en un Mik adyacente, si i/k=0 dará por resultado dos ocurrencias de ? que se unen directamente entre si, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, donde dos ocurrencias de Y se unen a M, al menos una de esta ocurrencia de Y está ausente. En ciertas modalidades, no más de dos ocurrencias de Y están presentes. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido . En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto biciclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biciclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHCl2 y CP3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2 -ilo, ó 3 -metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3 -sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) .
En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-. En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o eterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy incluye una amina dentro de los átomos del anillo o en un sustituyente del anillo, por ejemplo, Cy es piridilo, imidazolilo, pirrolilo, piperidilo, pirrolidilo, piperazilo, etc., y/o tiene un sustituyente amino. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Z, donde Z es un anillo de arilo o heteroarilo, se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosfóralo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) Palquilo, - (C¾) palquenilo, - (C¾) Palquinilo, - (C¾) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(C¾)P0H, - (C¾) P0-alguilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (C¾) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R) 2, - (CH2) PNR-alguilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, Z se une directamente a Ar, o se une a Ar mediante una cadena de uno o dos átomos . En ciertas modalidades, Z-Y-M, tomados conjuntamente, están ausentes. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (X) : Fórmula X en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar representa un anillo de arilo o eteroarilo sustituido o insustituido; Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo, ó heteroarilo sustituido o insustituido, o un alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno sustituido; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-, con la condición de que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente ; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(0)-, -C (=NCN) - , -P(=0) (OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, carbociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, heterociclilalquilo, carbociclilalquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos, sustituidos o insustituidos; representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF- , -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido, en donde alguna o todas las ocurrencias de M en Mj forman toda o parte de la estructura cíclica; j representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 2 a 10, de manera preferente de 2 a 7; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5 , de manera preferente de 0 a 2 ; y k representa un número entero de 0 a 3 , de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, NR2 representa, una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, M representa independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, i representa 0 para todas las ocurrencias, excepto en la secuencia N-Mi-Y-Ar, donde i representa 1. En ciertas modalidades, Ar y X representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo sustituidos o insustituidos con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos tal como O, N y S. En ciertas modalidades, al menos Ar representa un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas modalidades, las ocurrencias de Y unidas a Ar se colocan en una relación meta y/o relación 1,3.
En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas modalidades, la única ocurrencia presente de ? se une a Mk. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i o k representan de manera preferente 2 en un adyacente, si i/k=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente entre si , o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, donde dos ocurrencias de ? se unen a M, al menos una de esta ocurrencia de Y está ausente. En ciertas modalidades, no más de dos ocurrencias de Y están presentes. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido . En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CC13, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHC12 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3-cloro-benzo(b)tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente , en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S) -, y -S «¾) - . En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Z, donde Z es un anillo de arilo o heteroarilo, se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (C¾) palquilo, - (CH2) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (C¾) Parilo, - (CH2) paralquilo, -(CH2)POH, - (C¾) P0-alquilo inferior, - (C¾)P0-alquenilo inferior, -0(C¾)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (C¾) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R) 2, - (CH2) pNR-alquilo inferior - (C¾) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, Z se une directamente a Ar, o se une a Ar mediante una cadena de uno o dos átomos. En ciertas modalidades, Z-Y-M, tomados conjuntamente, están ausentes. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (XI) : Fórmula XI en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido; Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo, ó heteroarilo sustituido o insustituido, o un alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno sustituido; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-,-0-, -S-, ó -Se-, con la condición de que Z no sea un anillo, entonces Y unido a Z está ausente; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, ~S(0)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(OR)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido,- R representa, independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, carbociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, heterociclilalquilo, carbociclilalquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros, por ejemplo, con N; Cy Y" Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policlclicos , sustituidos o insustituidos ,· i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5 , de manera preferente de 0 a 2; y k representa un número entero de 0 a 3 , de manera preferente de 0 a 2. En ciertas modalidades, NR2 representa, una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, representa independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc. En ciertas modalidades, Ar y Z representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo sustituidos o insustituidos con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos tal como O, N y S. En ciertas modalidades, al menos Ar y Z representan un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Z representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas modalidades, las ocurrencias de Y unidas a Ar colocadas en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas modalidades, la única ocurrencia presente de Y se une a k. En las modalidades en donde Y está presente en una posición, i o k representan de manera preferente 2 en un ?±/^ adyacente, si i/k=0 dará por resultado dos ocurrencias de Y que se unen directamente entre si, o una ocurrencia de Y que se une directamente a N. En ciertas modalidades, donde dos ocurrencias de Y se unen a M, al menos una de esta ocurrencia de Y está ausente. En ciertas modalidades, no más de dos ocurrencias de Y están presentes. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido . En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo biciclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto biciclico como heteroarilo, tal como benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo biciclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2-ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) ien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) ien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CCl3, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHCl2 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3 -cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo(b)tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente, en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N y/o a NR2. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar txans en el anillo. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)- y -S(Oa)-. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Z, donde Z es un anillo de arilo o heteroarilo, se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, azido, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, fosforilo, fosfonato, fosfinato, - (CH2) Palquilo, - (C¾) palquenilo, - (CH2) Palquinilo, - (CH2) Parilo, - (CH2) Paralquilo, -(CH2)POH, - (CH2) pO-alquilo inferior, - (CH2) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) PS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (CH2) PN(R) 2, - (CH2) PNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, Z se une directamente a Ar, o se une a Ar mediante una cadena de uno o dos átomos. En ciertas modalidades, Z-Y-M, tomados conjuntamente, están ausentes. En ciertas modalidades, los compuestos útiles en la presente invención se pueden representar por la fórmula general (XII) : Fórmula XII en donde, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido; Z está ausente o representa un anillo arilo, carbociclilo, heterociclilo, ó heteroarilo sustituido o insustituido, o un alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno sustituido; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R) - , -O- , -S-, ó -Se-, con la condición de que Z no sea un anillo, entonces Y unido a 2 está ausente; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-# -S(0)-, -C(=NCN)-, -P(=0)(0R)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos tal como grupos alquinilo, alquenilo o alquilo inferior; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -C¾-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)-, etc., o dos M tomados con untamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R, representa independientemente para cada ocurrencia H, o arilo, heterociclilo, carbociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, heterociclilalquilo , carbociclilalquilo, alquinilo, alquenilo, o alquilo sustituido o insustituido; Cy y Cy' representan independientemente grupos arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policíclicos , sustituidos o insustituidos; y k representa un número entero de 0 a 1. En ciertas modalidades, NR2 representa, una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con dos o más grupos alquilo inferior, grupos arilo, o grupos aralquilo, respectivamente, de manera preferente una amina primaria o amina secundaria. En ciertas modalidades, M representa independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, tal como -CH2-, -CHF-, -CHOH-, -CH(Me)-, -C(=0)~, etc. En ciertas modalidades, Y está ausente de todas las posiciones. En ciertas modalidades, donde Y está adyacente a Mk, ya sea Y está ausente o k=0. En ciertas modalidades, por al menos una ocurrencia de Mk unido a Cy, k=0, opcionalmente para ambas ocurrencias. En ciertas modalidades, para Mk unido a Ar y N, k=l. En ciertas modalidades, Ar y Z representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos, por ejemplo sustituidos o insustituidos con uno o más grupos incluyendo opcionalmente heteroátomos tal como O, N y S. En ciertas modalidades, al menos Ar y Z representan un anillo de fenilo. En ciertas modalidades, al menos uno de Ar y Z representa un anillo de heteroarilo, por ejemplo, un piridilo, tiazolilo, tienilo, pirimidilo, furanilo, etc. En ciertas modalidades, las ocurrencias de Mk unidas a Ar se colocan en una relación meta y/o relación 1,3. En ciertas modalidades, Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido. En ciertas modalidades, Cy' se une directamente a X. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo bicíclico o de heteroarilo sustituido o insustituido, de manera preferente tanto bicíclico como heteroarilo, tal coo benzotiofeno, benzofurano, benzopirrol, benzopiridina, etc. En ciertas modalidades, Cy' es un anillo de arilo o heteroarilo monocíclico sustituido al menos con un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido, es decir, que forma un sistema de bi-arilo. En ciertas modalidades, Cy' incluye dos anillos de heteroarilo o arilo sustituidos o insustituidos , por ejemplo, los mismos o diferentes, directamente conectados por uno o más enlaces, por ejemplo, para formar un sistema de anillo bicíclico o de biarilo. En ciertas modalidades, Cy' representa un benzo (b) tien-2 -ilo, de manera preferente un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, por ejemplo el anillo de benzo se sustituye con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo (por ejemplo, que incluyen halometilo, tal como CHC12 y CF3) , y etilo (por ejemplo, que incluye haloetilo, tal como CH2CCI3, C2F5, etc.), de manera preferente de halógeno y metilo (por ejemplo, incluyendo halometilo, tal como CHCl2 y CF3) . En ciertas modalidades tal como Cy' representan un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, ó 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo de benzo se sustituye con fluoro en la posición 4 (peri al 3-sustituyente en el anillo de tienilo) y, opcionalmente , en la posición 7 ("peri" al S del anillo de tienilo) . En ciertas modalidades, Cy representa un anillo carbocíclico o heterocíclico no aromático, sustituido o insustituido, es decir, que incluye al menos un átomo hibridizado sp3, y de manera preferente una pluralidad de átomos hibridizados sp3. En ciertas modalidades, Cy es un anillo de 5 a 7 miembros. En ciertas modalidades, Cy se une directamente a N y/o a ¾. En modalidades en donde Cy es un anillo de seis miembros unido directamente a N y tiene un sustituyente amino en la posición 4 del anillo con relación a N, el N y los sustituyentes de amina se pueden colocar trans en el anillo. En ciertas modalidades, X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)- y -S(02)~. En ciertas modalidades, los sustituyentes en Ar o Z, donde Z es un anillo de arilo o heteroarilo, se seleccionan de halógeno, alquilo inferior, alquenilo inferior, arilo, heteroarilo, carbonilo, tiocarbonilo, cetona, aldehido, amino, acilamino, ciano, nitro, hidroxilo, sulfonilo, sulfóxido, sulfato, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, - (CH2) Palquilo, - (C¾) Palquenilo, - (CH2).Palquinilo, -(CH2)pOH, - (CH2) pO-alquilo inferior, - (C¾) pO-alquenilo inferior, -0(CH2)nR, -(CH2)PSH, -(CH2)PS-alquilo inferior, - (CH2) pS-alquenilo inferior, -S(CH2)nR, - (C¾) PN( ) 2 , - (C¾) pNR-alquilo inferior - (CH2) PNR-alquenilo inferior, -NR(CH2)nR, y formas protegidas de los anteriores, en donde n y p, individualmente para cada ocurrencia, representan números enteros de 0 a 10, de manera preferente de 0 a 5. En ciertas modalidades, Z se une directamente a Ar, o se une a Ar mediante una cadena de uno o dos átomos. En ciertas modalidades, Z-Y-M, tomados conjuntamente, están ausentes. En ciertas modalidades, los presentes agonistas se pueden elegir en base a su selectividad para la ruta de hedgehog. Esta selectividad puede ser para la ruta de hedgehog contra otras rutas, o para la selectividad entre rutas de hedgehog particulares, por ejemplo, ptc-1, ptc-2, etc. En ciertas modalidades preferidas, los presentes agonistas modulan la transduccion de señales mediada por ptc-smo con una ED50 de 1 mM o menos, de manera preferente de 1 µ o menos, y de manera aún mas preferente de 1 n o menos. Para los agonistas dependientes de hedgehog, los presentes agonistas incrementan la actividad de hedgehog 10 veces, 100 veces ó aún 1000 veces. En modalidades particulares, la molécula pequeña se elige para el uso debido a que es más selectiva para una isoforma patched con respecto a la siguiente, por ejemplo, 10 veces, y de manera más preferente, al menos 100 ó aún 1000 veces más selectiva para una ruta patched (ptc-1, ptc-2) con respecto a la otra. En ciertas modalidades, un compuesto que es un agonista de la ruta de hedgehog se elige para agonizar selectivamente la actividad de hedgehog con respecto a las proteína-cinasas diferentes de PKA, tal como PKC, por ejemplo, el compuesto modula la actividad de la ruta de PKA/hedgehog al menos un orden de magnitud más fuerte que lo que modula la actividad de otra proteína-cinasa, de manera preferente al menos dos órdenes de magnitud más fuertemente, de manera aún más preferente al menos tres órdenes de magnitud más fuertemente. De esta manera, por ejemplo, un activador preferido de la ruta de hedgehog puede activar la actividad de hedgehog con una K¿ al menos un orden de magnitud menor que su ¾. para la activación de PKC, de manera preferente al menos dos órdenes de magnitud menor, de manera aún más preferente al menos tres órdenes de magnitud menor. En ciertas modalidades, la ¾. para la activación de PKA/hedgehog K± es menos de 10 nM, de manera preferente menos de 1 nM, de manera aún más preferente, menos de 0.1 nM. Síntesis de los presentes compuestos Los compuestos de la presente invención se pueden preparar fácilmente por técnicas normales de síntesis orgánica, por ejemplo, de acuerdo a los ejemplos expuestos en la ejemplificación posterior. Por ejemplo, un presente compuesto se puede preparar al hacer reaccionar un compuesto o par de compuestos designados A con un compuesto o par de compuestos designados compuesto designado C, como se expone a continuación . M¡\ /Ar Mi A4 Z ^Mk R' Y B6 ^Mk X Mi R CV De manera similar, un compuesto designado C, anteriormente se puede hacer reaccionar con un compuesto o par de compuestos designados D y un compuesto o par de compuesto designados E.
,Ar. 5 D3 Z' "Y NH, "M, Cy' E2 ~ | Cy' ,-R" E3 M De manera alternativa, un compuesto o par de compuestos designados A anteriormente y un compuesto o par de compuestos designados C anteriormente se pueden hacer 20 reaccionar con un compuesto designado F: Fl Hsi-L M| Cy F2 H2IL .N(R)2 F3 H2N. ^N(R)2 M, Cy M, 25 Las combinaciones de compuestos como se indica . anteriormente se hacen reaccionar de manera preferente entre sí en serie, por ejemplo, los compuestos se hacen reaccionar de forma conjunta, el producto se hace reaccionar con un tercer compuesto, etc, y los compuestos se pueden acoplar en general en serie en cualquier orden, como se entenderá por un experto en la técnica. En ciertas modalidades, los grupos funcionales en uno o más compuestos pueden requerir protección durante una o más reacciones, como es bien entendido en la técnica, y cualquier grupo protector adecuado se puede emplear para este propósito. Un experto en la técnica puede hacer reaccionar fácilmente grupos protectores adecuados para un grupo funcional particular y una reacción particular. Se pueden realizar pasos de elaboración en cualquier momento para modificar los" grupos funcionales o las porciones en el producto de una reacción, por ejemplo, para convertir N(R)2=NH2 a N(R)2 = NHR, por ejemplo, por sustitución nucleófila, alquilación reductiva, o cualquier otro método adecuado . En los compuestos designados A-F, anteriormente, los elementos M, X, Y, Z, Cy, Cy' , Ar, i, k, R, etc., se definen como antes (como se pueda ampliar por la descripción posterior) , y R' independientemente para cada ocurrencia represente H, un grupo protector, o un grupo reactivo lábil, tal como un grupo trialquilsililo (por ejemplo, trimetilsililo) , y R' ' independientemente para cada ocurrencia represente 1) un grupo saliente, tal como un halógeno (por ejemplo F, Cl, Br, o I) , alquiltio, ciano, alcoxi o cualquier otro grupo capaz de ser reemplazado por un nucleófilo de amina cuando se une a X, 2) un grupo activable, tal como OH, que se puede activar por un agente de activación, tal como una carbodiimida (por ejemplo, diisopropilcarbodiimida, diciclohexilcarbodiimida, 1- (3-dimetilaminopropil) -3 -etilcarbodiimida, etc) , reactivos basados en fósforo (tal como BOP-Cl, PyBROP, etc), cloruro de oxalilo, fosgeno, trifosgeno, o cualquier reactivo similar, para dar por resultado un compuesto intermedio reactivo que tiene una susceptibilidad incrementada, con relación al compuesto, en donde R' ' = OH, hacia el acoplamiento con una amina, o 3) X y R' ' tomados conjuntamente representan un grupo electrófilo capaz de reaccionar con una amina, tal como un isocianato, isotiocianato u otra porción reactiva similar. Las varias sub-unidades designadas A-F se pueden combinar usando cualquiera de una plétora de reacciones bien conocidas por aquellos expertos en la técnica, dependiendo de las porciones particulares que se van a acoplar. Por ejemplo, una amina, tal como una de los grupos NH2 indicada en las subunidades A-F, se puede acoplar con un grupo alquilo por alquilación reductiva (por ejemplo, la ocurrencia terminal de M es un aldehido) , por desplazamiento nucleófilo de un grupo saliente (tal como un halógeno, sulfonato u otro sustituyente adecuado) , por abertura nucleófila de un epóxido, o por cualquier otra reacción adecuada, conocida por aquellos expertos en la técnica. De manera similar, se pueden acoplar aminas con derivados activados de ácido carboxílico o derivados de ácido tiocarboxí lico , por ejemplo, preparados in situ a partir de un ácido carboxílico o ácido tiocarboxílico y un agente de activación o preparados como compuestos aislados tal como isocianatos, cloruros de ácido carboxílico, etc, para proporcionar amidas, ureas, tioureas, tioamidas, etc, con ésteres de cloroformiato , cloruros de sulfonilo, u otros compuestos para proporcionar uretanos, sul fonamidas , etc, o con otros reactivos electrófilos que forman un enlace covalente con una amina. Los anillo de arilo y/o heteroarilo se pueden acoplar fácilmente de forma directa usando reacciones de Stille, Suzuki, u otras relacionadas, tal como reacciones de acoplamiento cruzado mediadas por paladio. Los anillos de arilo y/o heteroarilo se pueden acoplar fácilmente a través de un heteroátomo, por ejemplo, usando reacciones tal como la reacción de üllman, cualquiera de varias reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, por sustitución aromática nucleófila, u otras reacciones. De manera similar, las aminas, alcoholes, tioles y otros compuestos que tienen heteroátomos se pueden acoplar a anillos de arilo y/o heteroarilo usando reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución aromática nucleófila, etc. Los anillos de arilo y/o heteroarilo enlazados por cadenas de hidrocarburos sustituidas e insustituidas se pueden preparar por reacciones de Stille, Suzuki, Heck, Friedel-Crafts, y otras como será evidente por aquellos expertos en la técnica. Un reconocimiento de varias reacciones sintéticas comunes potencialmente útiles para preparar los compuestos de la presente invención se describen en mayor detalle posteriormente y en las Figuras 1-31. Los grupos variables incluidos en las subunidades designadas A-F anteriormente se pueden variar para corresponder con cualquiera de las Fórmula I-VIII y X-XII sin que se aparten de los planteamientos de síntesis general resumidos anteriormente. De manera similar, los compuestos de la presente invención se pueden preparar al acoplar una porción adecuada a una estructura parcialmente montada. Por ejemplo, un compuesto de la Fórmula XI se puede preparar por cualquiera de los pasos I-VI mostrados en el esquema de reacción a continuación.
De manera similar, se puede preparar un compuesto de la Fórmula X por cualquiera de los pasos en el esquema de reacción a continuación.
Por analogía, se puede preparar un compuesto de Fórmula XII por cualquiera de los pasos expuestos en esquema de reacción a continuación.
En los esquemas de reacción anteriores, M, Cy, Ar, X, Cy' , Y, Z, R, i, k, R' , y R' ' corresponden a su uso anterior, y se pueden definir más estrechamente como se expone en la descripción de las Fórmulas X-XII o para corresponder a los elementos de las Fórmulas I-VIII, opcionalmente como se modifica por la descripción que acompaña a las Fórmulas I-VIII. Las reacciones adecuadas para realizar el paso I incluyen reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S . Buch ald y otros, sustitución aromática nucleófila, acoplamiento oxidativo, etc.
Las reacciones adecuadas para realizar el paso II incluyen desplazamiento nucleofilo de un grupo saliente en M, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrófilo de ácido carboxílico/tiocarboxílico (cloruro de ácido, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado por BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida u otro reactivo de activación (tal como se usan comúnmente en la técnica de acoplamiento peptidico) ) , u otras reacciones similares, incluyendo aquellas expuestas en detalle en ciertas Figuras 1-31 y la descripción anexa posterior, o, donde M e Y están ausentes, un acoplamiento mediado por paladio como se desarrolla por Buchwald y otros. Las reacciones adecuadas para realizar los Pasos III o IV incluyen la reacción de Y-R' con un derivado electrófilo de acarbonilo o sulfonilo (X-R' ' = cloruro de ácido, isocianato, isotiocianato, cloroformiato, cloruro de sulfonilo, un ácido activado por BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida u otro reactivo de activación (tal como se usan comúnmente en la técnica de acoplamiento peptidico) ) , u otras reacciones similares, tal como aquellas expuestas en detalle en ciertas Figuras 1-31 y la descripción anexa posterior. Las reacciones adecuadas para realizar el Paso V incluyen despl zamiento nucleofilo de un grupo saliente, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrófilo de ácido carboxílico/tiocarboxílico (cloruro de ácido, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado por B0P-C1, PyBrOP, carbodiimida u otro reactivo de activación (como se usan comúnmente en la técnica de acoplamiento peptídico) ) , u otras reacciones similares, incluyendo aquellas expuestas en detalle en algunas de las Figuras 1-31 y la descripción anexa posterior. Las reacciones adecuadas para realizar el Paso VI incluyen desplazamiento nucleófilo de un grupo saliente, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrófilo de ácido carboxílico/tiocarboxílico (cloruro de ácido, isotiocianato, isocianato, un derivado carboxílico activado por B0P-C1, PyBrOP, carbodiimida u otro reactivo de activación (tal como se usan comúnmente en la técnica de acoplamiento peptídico) ) , u otras reacciones similares, incluyendo aquellas expuestas en detalle en algunas de las Figuras 1-31 y la descripción anexa posterior. Las reacciones adecuadas para realizar el Paso VII, donde Y se acopla con una presente ocurrencia de M incluyen desplazamiento nucleófilo de un grupo saliente, alquilación reductiva, reacción de la amina con un derivado electrófilo de ácido carboxilico/tiocarboxílico (cloruro de ácido, isocianato, isotiocianato, o un ácido carboxílico activado por BOP-Cl, PyBrOP, carbodiimida u otro reactivo de activación (tal como se usan comúnmente en la técnica de acoplamiento peptídico) ) , u otras reacciones similares, incluyendo aquellas expuestas en detalle en algunas de las Figuras 1-31 y los dibujos anexos posteriores. En las modalidades donde está ausente la ocurrencia de M, las reacciones de acoplamiento adecuadas incluyen reacciones mediadas por paladio desarrolladas por S. Buchwald y otros, sustitución aromática nucleófila, acoplamiento oxidativo, etc. En modalidades donde M e Y están ausentes y Z represente un anillo de arilo o heteroarilo, las reacciones adecuadas incluyen reacciones de Stille Suzuki y otros para formar sistemas de bi-arilo. Los métodos de la invención incluyen además hacer reaccionar un compuesto de cualquiera de las fórmulas I-VII en donde al menos un R de NR2 representa H bajo condiciones que convierten a este compuesto a un compuesto de la misma fórmula en donde la ocurrencia correspondiente de R representa un grupo alquilo inferior. Por ejemplo, las alquilaciones reductivas con un aldehido y un agente reductor, alquilaciones nucleófilas con un haluro de alquilo tal como Mel, u otras reacciones similares se pueden emplear. En ciertas modalidades, estas reacciones pueden proseguir a través de un compuesto intermedio sililado (por ejemplo, R = Si e3) . Un experto en la técnica apreciará fácilmente que los compuestos de la presente invención se pueden tratar para la síntesis de acuerdo a un amplio arreglo de protocolos bien conocidos en la técnica además de aquellos descritos en la presente, todos los cuales se proponen para que caigan dentro del alcance de la presente invención. IV. Aplicaciones de Ejemplo del Método y Composiciones Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para modular un estado diferenciado, supervivencia y/o proliferación de una célula al poner en contacto la célula con un agonista de hedgehog de acuerdo al presente método y como lo permitan las circunstancias. Por ejemplo, se contempla por la invención que, en vista de los hallazgos de . una implicación aparentemente amplia de hedgehog, ptc y smoothened en la formación de arreglos espaciales ordenados de tejidos diferenciados en vertebrados, el presente método se puede usar como parte de un proceso para generar y/o mantener un arreglo de diferentes tejidos de vertebrados tanto in vitro como in vivo. El agonista de hedgehog, ya sea inductivo o anti-inductivo con respecto a la proliferación o diferenciación de un tejido dado, puede ser, como sea apropiado, cualquiera de las preparaciones descritas anteriormente. Por ejemplo, el presente método es aplicable a técnicas de cultivo de células. Los sistemas de cultivo neuronales in vitro han probado ser herramientas fundamentales e indispensables para el estudio del desarrollo neural, así como para la identificación de factores neurotróficos tal como factor de crecimiento de nervios (NGF) , factores tróficos ciliares (CNTF) , y factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) . Un uso del presente método puede estar en cultivos de células madre neuronales, tal como en el uso de estos cultivos para la generación de nuevas neuronas y glia. En estas modalidades del presente método, las células cultivadas se ponen en contacto con un antagonista de hedgehog de la presente invención a fin de alterar la velocidad de proliferación de las células madre neuronales en el cultivo y/o alterar la velocidad de diferenciación, o para mantener la integridad de un cultivo de ciertas células neuronales terminalmente diferenciadas. En una modalidad de ejemplo, el presente método se puede usar para cultivar, por ejemplo, neuronas sensoriales o, alternativamente, neuronas motoras. Estos cultivos neuronales se pueden usar como sistemas de ensayo convenientes así como fuentes de células implantables para tratamientos terapéuticos . De acuerdo con la presente invención, se pueden perpetuar grandes números de células progenitoras neurales no tumorigénicas , in vitro, y se puede afectar su velocidad de proliferación y/o diferenciación por contacto con antagonistas de hedgehog de la presente invención. En general, se proporciona un método que comprende los pasos de aislar células progenitoras neurales de un animal, perpetuar estas células in vitro o in vivo, de manera preferente en la presencia de factores de crecimiento, de regular la diferenciación de estas células en fenotipos neurales particulares, por ejemplo, neuronas y glia, al poner en contacto las células con un agonista de hedgehog. Se piensa que las células progenitoras están bajo una influencia inhibitoria tónica que mantiene a los progenitores en un estado suprimido hasta que se requiera su diferenciación. Sin embargo, se han proporcionado técnicas recientes que permiten que estas células se proliferen, y diferente de las neuronas que están terminalmente diferenciadas y por lo tanto sin división, se pueden producir en un número limitado y son altamente adecuadas para el transplante a hospedadores heterólogos y autólogos con enfermedades neurodegenerativas. Por "progenitor" se quiere decir una célula madre oligopotente o multipotente que es capaz de dividirse sin límite y bajo condiciones específicas, puede producir células hijas que se diferencian terminalmente tal como en neuronas y glia. Estas células se pueden usar para el transplante en un hospedador heterólogo o autólogo . Por heterólogo se quiere decir un hospedador diferente del animal del cual se derivaron originalmente las células progenitoras . Por autólogo se quiere decir el hospedador idéntico del cual se derivaron originalmente las células.
Se pueden obtener células a partir de tejido neural embrionico, pos-natal, juvenil o adulto de cualquier animal. Por cualquiera animal se quiere decir cualquier animal multicelular que contenga tejido nervioso. De manera más particular, se quiere decir cualquier pez, reptil, ave, anfibio o mamífero y similar. Los donadores más preferibles son mamíferos, especialmente ratones y humanos. En el caso de un animal donador heterólogo, al animal se le puede practicar la eutanasia y se remueven el cerebro y área específica de interés usando un procedimiento estéril . Las áreas del cerebro de interés particular incluyen cualquier área a partir de la cual se puedan obtener células progenitoras que servirán para restaurar la función a un área degenerada del cerebro del hospedador. Estas regiones incluyen áreas del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) que incluyen la corteza cerebral, cerebelo, cerebro medio, tallo cerebral, médula espinal y tejido ventricular, y áreas del sistema nervioso periférico (PNS, por sus siglas en inglés) que incluyen el cuerpo carótido y la médula adrenal . De manera más particular, estas áreas incluyen regiones en los ganglios b sales, de manera preferente cuerpo estriado que consiste del caudado y putamen, o varios grupos celulares tal como globo pálido, el núcleo subtalámico, el núcleo basal que se encuentra que está degenerado en pacientes con enfermedad de Alzheimer, o la sustancia nigra pars compacta que se encuentra que está degenerada en los pacientes con enfermedad de Parkinson. Se pueden derivar células progenitoras neurales heterólogas humanas de tejido fetal obtenido de aborto electivo, o de un donador de órganos post-natal, juvenil o adulto. Se puede obtener tejido neural autólogo por biopsia, o de pacientes que se someten a neurocirugía en la cual se remueve tejido neural, en particular durante la cirugía de epilepsia, y de manera más particular, durante las lobectomias temporales e hipocampalectomias . Se pueden obtener células de tejido donador por disociación de células individuales de la matriz extracelular de conexión del tejido. Se puede obtener la disociación usado cualquier procedimiento conocido, incluyendo tratamiento con enzimas tal como tripsina, colagenasa y similar, o al usar métodos físicos de disociación tal como con un instrumento de punta roma o por picado con un escalpelo a una excrecencia de tipo específico de célula de un tejido. La disociación de células fetales se puede llevar a cabo en medio de cultivo de tejido, en tanto que un medio preferible para la disociación de células juveniles y adultas es fluido espinal, cerebral, artificial (aCSF) . El aCSF regular contiene NaCl 124 nM, C1 5 mM, GC12 1.3 m , CaCl2 2 tt , NaHCQj 26 m , y D-glucosa 10 mM. aCSF de bajo contenido de Ca2+ contiene los mismos ingredientes excepto por MgCl2 a una concentración de 3.2 mM y CaCl2 a una concentración de 0.1 mM.
Las células disociadas se pueden colocar en cualquier medio de cultivo conocido capaz de soportar el crecimiento celular, incluyendo MEM, DMEM, RPMI , F-12 y similares, que contienen complementos que se requieren para el metabolismo celular tal como glutamina y otros aminoácidos, vitaminas, minerales y proteínas útiles tal como transferrina y similares. El medio también puede contener antibióticos para impedir la contaminación con levadura, bacterias y hongos tal como penicilina, estreptomicina, gentamicina y similares. En algunos casos, el medio puede contener suero derivado de bovino, equino, pollo y similares. Un medio particularmente preferido para células es una mezcla de DMEM y F-12. Las condiciones para el cultivo deben estar cercanas a las condiciones fisiológicas. El pH del medio de cultivo debe estar cercano al pH fisiológico, de manera preferente entre pH 6-8, de manera más preferente cerca a pH 7 , de manera aun más particular cerca de pH 7.4. Las células se deben cultivar a una temperatura cercana a temperatura fisiológica, de manera preferente entre 30°C-40°C, de manera más preferente entre 32°C-38°C, y de manera más preferente entre 35°C-37°C. Se pueden cultivar las células en suspensión o en un sustrato fijo, pero la proliferación de los progenitores se realiza de manera preferente en suspensión para generar un gran número de células por formación de "neuroesferas" (ver, por ejemplo Reynolds et al. (1992) Science 255:1070-1709; y Publicaciones PCT O93/01275, O94/09119 , WO94/10292, y W094/16718) . En el caso de la propagación (o división) de células en suspensión, se agitan matraces y las neuroesferas se dejan asentar en la esquina del fondo del matraz. Las esferas entonces se transfieren a un tubo centrífugo de 50 mi y se centrifugan a baja velocidad. El medio se aspira, las células se re-dispersan en una pequeña cantidad de medio con factor de crecimiento, y las células se disocian de manera mecánica y se re-dispersan en alícuotas separadas del medio. Las suspensiones celulares en el medio de cultivo se complementan con cualquier factor de crecimiento que permite a la proliferación de células progenitoras y se siembra en cualquier receptáculo capaz de sostener las células , tal como se expone anteriormente , de manera preferente en matraces de cultivo o botellas giratorias. Las células proliferan típicamente en el espacio de 3-4 días en una incubadora a 37°C, y se puede reiniciar la proliferación en cualquier momento después de eso por disociación de las células y re-dispersión en medio fresco que contiene factores de crecimiento. En la ausencia de sustrato, las células se despegan del fondo del matraz y continúa proliferando en suspensión formando una esfera hueca de células no diferenciadas . Después de aproximadamente 3-10 días in vitro, las agrupaciones proliferantes (neuroesferas) se alimentan cada 2-7 días, de manera más particular cada 2-4 días por centrifugación suave y re-dispersión en medio que contiene factor de crecimiento. Después de 6-7 días in vi tro, las células individuales en las neuroesferas se pueden separar por disociación física de las neuroesferas con un instrumento romo, de manera más particular al triturar las neuroesferas con una pipeta. Se dispersan células individuales de las neuroesferas desasociadas en el medio de cultivo que contiene factores de crecimiento, y la diferenciación de las células se puede controlar en cultivo al colocar en placa (o al re-dispersar) las células en la presencia de un agonista de hedgeho . Para ilustrar adicionalmente otros usos de los presentes agonistas de hedgehog, se señala que el injerto intracerebral ha emergido como un planteamiento adicional a las terapias del sistema nervioso central. Por ejemplo, un planteamiento a la reparación de tejidos dañados del cerebro comprende el transplante de células de animales fetales o neonatales en el cerebro del adulto (Dunnett et al. (1987) J. Exp Biol. 123:265-289; y Freund et al. (1985) J Neurosci 5:603-616) . Las neuronas fetales de una variedad de regiones cerebrales se pueden incorporar exitosamente en el cerebro adulto, y estos injertos pueden aliviar los defectos de comportamiento. Por ejemplo, el trastorno del movimiento inducido por lesiones de salientes dopaminérgicas a los ganglios básales se puede prevenir por injertos en neuronas dopaminérgicas embriónicas. Las funciones cognitivas complejas que se dañan después de lesiones de la neocorteza también se pueden restaurar parcialmente por injertos de células corticales embriónicas. El presente método se puede usar para regular el estado de crecimiento en el cultivo, o donde se usa tejido fetal, especialmente células madre neuronales, se pueden usar para regular la velocidad de diferenciación de las células madre. Las células madre, útiles en la presente invención se conocen en general. Por ejemplo, se han identificado varias células de cresta neural, algunas de las cuales son multipontentes y representan probablemente células de cresta neural, no perpetradas, y otras de las cuales pueden generar solo un tipo de célula, tal como neuronas sensoriales, e igualmente representan células progenitoras perpetradas. El papel de los antagonistas de hedgehog empleados en el presente método para cultivar estas células madre pueden ser para regular la diferenciación del progenitor no perpetrado, o para regular la restricción adicional del destino en desarrollo de una célula progenitora perpetrada para llegar a ser una célula neuronal terminalmente diferenciada. Por ejemplo, el presente método se puede usar in vi tro para regular la diferenciación de células de cresta neural en células gliales, células de schwann, células cromarán, neuronas simpatéticas o parasimpatéticas colinérgicas, así como neuronas peptidérgicas o serotonérgicas . Los antagonistas de hedgehog se pueden usar solos, o se pueden usar en combinación con otros factores neurotróficos que actúan para mejorar más particularmente un destino de diferenciación particular de la célula progenitora neuronal. Además del implante de células cultivadas en la presencia de los presentes agonistas de hedgehog, aun otro aspecto de la invención se refiere a la aplicación terapéutica de un antagonista de hedgehog para regular el estado de crecimiento de las neuronas y otras células neuronales tanto en el sistema nervioso central como en el sistema nervioso periférico. La capacidad de ptc, hedgehog y smoothened para regular la diferenciación neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso y también presumiblemente en el estado adulto indica que, en ciertos casos, los presentes antagonistas de hedgehog se pueden esperar que faciliten el control de las neuronas adultas con respecto al mantenimiento, desempeño funcional, y envejecimiento de células normales; procesos de reparación y regeneración en células química o mecánicamente lesionadas; y tratamiento de la degeneración en ciertas condiciones patológicas. En vista de este entendimiento, la presente invención contempla de manera específica aplicaciones del presente método al protocolo de tratamiento de (prevención y/o reducción de la severidad de) condiciones neurológicas que se derivan de: (i) lesión aguda, y subaguda o crónica, al sistema nervioso, incluyendo lesión traumática, lesión química, lesión vascular y déficit (tal como la isquemia que resulta de ataque) , junto con lesión infecciosa/inflamatoria y lesión inducida por tumor; (ii) enve ecimiento del sistema nervioso que incluye enfermedad de Alzheimer; (iii) enfermedades neurodegenerativas crónicas del sistema nervioso, que incluyen enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, esclerosis lateral amilotrófica y similares, así como degeneraciones espinocerebrales ; y (iv) enfermedades inmunológicas crónicas del sistema nervioso y que afectan el sistema nervioso, incluyendo esclerosis múltiple. Por ejemplo, en el caso específico de la enfermedad de Parkinson, la intervención al incrementar la actividad de hedgehog por un presente agonista puede mejorar la supervivencia in vivo de neuronas dopaminérgicas fetales y de adulto, y de esta manera puede proporcionar un tratamiento más efectivo de esta enfermedad. De esta manera, en una modalidad, el presente método comprende administrar a un animal afligido con la enfermedad de Parkinson, o el riesgo de desarrollar enfermedad de Parkinson, una cantidad de un agonista de hedgehog efectiva para incrementar la proporción de supervivencia de neuronas dopaminérgicas en el animal.
El presente método es aplicable a técnicas de cultivo celular. Los sistemas de cultivo neuronal in vi tro han probado ser fundamentales herramientas fundamentales e indispensables para el estudio del desarrollo neural, así como la identificación de factores neurotróficos tal como f ctor de crecimiento de nervios (NGF) , factor trófico ciliar (CNTF) , y factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) . Una vez que una célula neuronal se ha llegado a diferenciar de forma terminal, típicamente no cambiará a otro tipo celular terminalmente diferenciado. Sin embargo, las células neuronales pueden perder fácilmente en cambio su estado diferenciado. Esto se observa comúnmente cuando están creciendo en cultivo de tejido de adulto, y cuando forman un blastema durante la regeneración. El presente método proporciona un medio para asegurar un ambiente adecuadamente restrictivo a fin de mantener las células dopanimérgicas y GABAérgicas en estados diferenciados, y se puede emplear, por ejemplo, en cultivos celulares diseñados para probar las actividades específicas de otros factores tróficos . En estas modalidades del presente método, un cultivo de células diferenciadas que incluyen células dopanimérgicas y/o GABAérgicas se puede poner en contacto con un agonista de hedgehog a fin de mantener la integridad de un cultivo de células neuronales terminalmente diferenciadas al prevenir la pérdida de diferenciación. El presente método se puede usar en unión con agentes que inducen la diferenciación de precursores neuronales, por ejemplo, células progenitoras o células madre, en neuronas dopaminérgicas o GABAérgicas. La mayoría de los trastornos neurológicos se asocian con la degeneración de poblaciones discretas de elementos neuronales y se pueden tratar con un régimen terapéutico que incluye un agonista de hedgehog. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer se asocia con déficit en varios sistemas de neurotransmisores , tanto aquellos que se proyectan a la neocortez-a y aquellos que residen con la neocorteza. Por ejemplo, el núcleo basal en pacientes con enfermedad de Alzheimer se ha observado que tiene una pérdida profunda (75%) de neuronas en comparación a controles de edad correspondida. Aunque la enfermedad de Alzheimer es por mucho la forma más común de demencia, varios trastornos diferentes pueden producir demencia. Varios de estos,, son enfermedades degenerativas caracterizadas por la muerte de neuronas en varias partes del sistema nervioso central, especialmente la corteza cerebral. Sin embargo, algunas formas de demencia están asociadas con degeneración del tálamo o la materia blanca que está bajo la corteza cerebral. Aquí, la disfunción cognitiva resulta del aislamiento de áreas corticales por la degeneración de eferentes y aferentes . La enfermedad de Huntington comprende la degeneración de neuronas colinérgicas intraestriaels y corticales y neuronas GABAérgicas. La enfermedad de Pick es una degeneración neuronal severa en la neocorteza de los lóbulos temporales frontal y anterior, algunas veces acompañada por muerte de neuronas en el estriado. El tratamiento de pacientes que sufren de estas condiciones degenerativas puede incluir la aplicación de agonista de hedgehog a fin de controlar, por ejemplo, la diferenciación y eventos apoptóticos que ocasionan pérdida de neuronas (por ejemplo, mejorar la supervivencia de neuronas existentes) así como promover diferenciación y repoblación por células progenitoras en el área afectada. Además de las demencias inducidas de forma degenerativa, una preparación farmacéutica de uno o más de los presentes agonistas de hedgehog se puede aplicar de forma oportuna en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos que tienen manifestaciones de temblores y movimientos involuntarios. La enfermedad de Parkinson, por ejemplo, afecta principalmente a las estructuras sub-corticales y se caracteriza por degeneración de la ruta nigrostriatal , núcleos de rafe, locus cereleus, y núcleo motor de vagus . El balismo se asocia típicamente con daño a los núcleos sub-t lmicos, frecuentemente debido a accidente vascular agudo. También se incluyen enfermedades neurogénicas y miopáticas que afectan finalmente la división somática del sistema nervioso periférico y se manifiestan como trastornos neurorausculares . Los ejemplos incluyen atrofias crónicas tal como esclerosis lateral amiotrófica, síndrome de Guillan-Barre y neuropatía periférica crónica, así como otras enfermedades que se pueden manifestar como parálisis bulbares progresivas o atrofias musculares espinales. El presente método se puede adaptar al tratamiento de trastornos del cerebelo que dan por resultado hipotonía o ataxia, tal como aquellas lesiones en el cerebelo que producen trastornos en las extremidades ipsilaterales a la lesión. Por ejemplo, se puede usar una preparación de un agonista de hedgehog para tratar una forma restringida de degeneración cortical cerebelar que comprende los lóbulos anteriores (áreas de vermis y piernas) tal como es común en pacientes alcohólicos. En una modalidad ilustrativa, el presente método se usa para tratar esclerosis lateral amiotrófica. La ALS es un nombre dado a un complejo de trastornos que comprenden neuronas motoras superiores e inferiores. Los pacientes pueden presentar atrofia muscular espinal progresiva, parálisis faulbar progresiva, esclerosis lateral primaria o una combinación de estas condiciones. La principal anormalidad patológica se caracteriza por una degeneración selectiva y progresiva de las neuronas motoras inferiores en la médula espinal y las neuronas motoras superiores en la corteza cerebral . La aplicación terapéutica de un agonista de hedgehog se puede usar sola, o en unión con otros actores neurotróficos tal como CNTF, BDNF o NGF para prevenir y/o invertir la degeneración de neuronas motoras en los pacientes con ALS . Los agonistas de hedgehog de la presente invención también se pueden usar en el tratamiento de trastornos autonómicos del sistema nervioso periférico, que incluyen trastornos que afectan la enervación del músculo liso y tejido endocrino (tal como tejido glandular) . Por e emplo, el presente método se puede usar para tratar taquicardia o arritmias cardiacas atriales que pueden surgir de una condición degenerativa de los nervios que inervan el músculo estriado del corazón. Además, un papel potencial para algunos de los agonistas de hedgehog deriva del papel de las proteínas de hedgehog en el desarrollo y mantenimiento de procesos dendríticos de las neuronas axonales. Los papeles potenciales de los agonistas de hedgehog incluyen en consecuencia guía para salientes axonales y la capacidad de promover la diferenciación y/o mantenimiento de las células inervantes a sus procesos axonales. Por consiguiente, se pueden emplear composiciones que comprenden agonistas de hedgehog para soportar la supervivencia y pre-proyección de varios tipos de neuronas gangliónicas simpatéticas y neuronas sensoriales así como neuronas motoras. En particular, estas composiciones terapéuticas pueden ser útiles en tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, varias neuronas de muerte inducida por lesión asi como para guiar la re-proyección de estas neuronas después de este daño. Estas enfermedades incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, infarto por trauma al CNS, infección (tal como infección viral con varicela-zoster) , enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, agentes tóxicos (tal como tratamiento con cisplatina) . Como sea apropiado, el presente método también se puede usar en la generación de prótesis de nervios para la reparación del daño de nervios centrales y periféricos. En particular, donde se intubulé un axon machacado o cortado mediante el uso de un dispositivo prostético, se pueden adicionar agonistas de hedgehog al dispositivo protésico para regular la velocidad de crecimiento y la regeneración de los procesos dendríticos. En las patentes de los Estados Unidos Nos. 5,092,871 y 4,955,892 se describen canales de guía de nervios de ej emplo . En otra modalidad, el presente método se puede usar en el tratamiento de transformaciones neoplásticas o hiperplásticas tal como puede presentarse en el sistema nervioso central. Por ejemplo, los agonistas de hedgehog se pueden utilizar para provocar que estas células transformadas lleguen a ser post-mitóticas o apoptóticas. El presente método por lo tanto se puede usar como parte de un tratamiento para, por ejemplo, gliomas malignos, meningiomas, meduloblastomas, tumores neuroectodérmicos y ependimomas.
El presente método tiene una amplia aplicabilidad al tratamiento o profilaxis de trastornos que afectan la regulación de los nervios periféricos, incluyendo neuronas gangliónicas periféricas, simpatéticas , neuronas sensoriales y neuronas motoras. En general, el método se puede caracterizar como que incluye un paso de administrar a un animal una cantidad de un agonista de hedgehog efectiva para alterar el estado de proliferación y/o diferenciación de las células de nervio periférico, tratadas. Estas composiciones terapéuticas pueden ser útiles en tratamientos diseñados para rescatar, por ejemplo, ganglios retínales, nervios acústicos y de oído interior y neuronas motoras, de muerte inducida por lesión así como la guía de la re-proyección de estas neuronas después de este daño. Estas enfermedades y condiciones incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, trauma químico o mecánico, infección (tal como infección viral con varicela- zoster) , enfermedad metabólica tal como diabetes, deficiencia nutricional, y agentes tóxicos (tal como tratamiento con cisplatina) . Los objetivos de tratamiento en cada caso pueden ser dobles: (1) eliminar la causa de la enfermedad y (2) aliviar sus síntomas. La neuropatía periférica es una condición que comprende el daño de terminación de nervios en las manos y pies. La neuropatía periférica se refiere en general a un trastorno que afecta los nervios periféricos, más frecuentemente manifestada como una o una combinación de disfunciones neurales motoras, sensoriales, sensorimotoras , o autonómicas. La amplia variedad de morfologías exhibidas por las neuropatías periféricas se pueden atribuir cada una de forma única a una variedad igualmente amplia de causas. Por ejemplo, las neuropatías periféricas se pueden adquirir de forma genética, pueden resultar de una enfermedad sistémica, o se pueden inducir por un agente tóxico. Algunos agentes tóxicos que provocan neurotoxicidades son fármacos terapéuticos, agentes anti-neoplásticos, contaminantes en alimentos o medicinas, y contaminantes ambientales e industriales . En particular, los agentes quimioterapéuticos conocidos que provocan neuropatías sensoriales y/o motoras incluyen vincristina, un fármaco anti-neoplástico usado para tratar malignidades hematológicas y sarcomas. La neurotoxicidad está relacionada a la dosis, y se exhibe conforme se reduce la motilidad intestinal y la neuropatía periférica, especialmente en los músculos distantes de las manos y pies, hipotensión postural, y atonía de la- vejiga urinaria. Se han documentado problemas similares con taxol y cisplatina (Mollman, J. E . , 1990, New Eng Jour Med. 322:126-127) , aunque la neurotoxicidad relacionada a cisplatina se puede aliviar con el factor de crecimiento de nervios (NGF) (Apfel, S. C. et al, 1992, Annals of Neurology 31:76-80).
Aunque la neurotoxicidad es algunas veces reversible después de la remoción del agente neurotóxico, la recuperación puede ser un proceso muy lento (Legha, S., 1986, Medical Toxicology 1:421-427; Olesen, et al., 1991, Drug Safety 6:302-314). Existen varias neuropatías periféricas heredadas, que incluyen: enfermedad de Refsum, abetalipoproteinemia, enfermedad de Tangier, enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Fabry, síndrome de Dejerine-Sottas y otros. De todas estas neuropatías heredadas, la más común es la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. La Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) (también conocida como atrofia muscular peroneal o neuropatía sensorial motora hereditaria (HMSN) ) es el trastorno neurológico hereditario más común. Se caracteriza por debilidad y atrofia, principalmente de los músculos peroneales, debido a la desmielineación segmental de nervios periféricos y degeneración asociada de axones y células córneas anteriores. La herencia dominante autosomal es usual, y los trastornos degenerativos asociados del CNS, tal como ataxia de Friedreich son comunes. En un aspecto, el método de la presente invención se puede usar en el tratamiento y mantenimiento de neuropatías hereditarias. El grupo de neuropatías está llegando hacer ahora cada vez más reconocido debido a los avances dramáticos en genética molecular. Los síntomas de las varias neuropatías hereditarias son ampliamente variables. Un denominador común usualmente es el comienzo temprano de entumecimiento moderado y hormigueo en los pies que progresa lentamente para comprender . las piernas y las manos y posteriormente el resto de las extremidades superiores. La mayoría de las neuropatías hereditarias tienen un componente motor que consiste de debilidad distante en las extremidades inferiores y superiores . La mayoría de los pacientes con neuropatías hereditarias tienen altos arcos en sus pies u otras deformidades óseas. Los síntomas son muy lentamente progresivos y la mayoría de los pacientes aún están caminando dos décadas después del comienzo de sus síntomas . La diagnosis de una neuropatía hereditaria se sugiere usualmente con el comienzo temprano de síntomas neuropáticos, especialmente cuando está presente también una historia familiar positiva. Antes de los avances genéticos recientes, la diagnosis se soportó por hallazgos típicos de desaceleración marcada de estudios de conducción de nervios en electromiografía y una biopsia de nervios. Los hallazgos típicos en una biopsia de nervios incluyen la presencia de los llamados bulbos de cebolla, que indican una desmielinación y re-mielinación recurrente de las fibras nerviosas. Con los avances genéticos más recientes, las dos principales neuropatías hereditarias conocidas como enfermedad de Charcot-Marie-Tooth y la neuropatía hereditaria con obligación a parálisis de presión se pueden diagnosticar con una simple prueba sanguínea que identifica las diferentes mutaciones responsables de estas dos entidades. Las neuropatías hereditarias se provocan por anormalidades genéticas y se transmiten de generación a generación. Para varias de estas, el defecto genético se conoce, y las pruebas están disponibles para diagnosis y asesoramiento prenatal . ¦ Como se expone anteriormente, el presente método se puede usar como parte de un régimen terapéutico en el tratamiento de la Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) . Este es un término general dado a neuropatías sensorimotoras hereditarias. La CMT tipo 1 (CMT 1) está asociada con diesmilacíón o anomalía de las vainas de mielina. Se han identificado varias anormalidades diferentes. La CMT Tipo 1A se provoca más comúnmente por duplicación de un gen que codifica para una proteína de mielina llamada PMP-22, y la CMT Tipo IB se provoca por una mutación en una proteína de mielina llamada la glicoproteína Po. La CMTX es una neuropatía sensorimotora hereditaria que afecta principalmente a los hombres. Se provoca por una mutación en un gen que codifica para una proteína llamada Connexin 32 o el cromosoma X. En otra modalidad, el presente método se puede usar en el tratamiento de neuropatía amiloidótica doméstica y otras neuropatías hereditarias relacionadas. La neuropatía amiloidótica usualmente se presenta con dolor, pérdida de sensación y disfunción autonómica. Se provoca por una mutación en una proteina llamada Trans-tiretina, dando por resultado depósito de la proteína como amiloide en los nervios periféricos. El presente método se puede usar en el tratamiento de porfiria hereditaria, que puede tener componentes de neuropatía periférica. Aun otra neuropatía hereditaria para la cual se pueden usar los presentes métodos para el tratamiento es neuropatía sensoria hereditaria Tipo II (HSN II) . Los métodos y composiciones de la presente invención también se pueden usar en el tratamiento y mantenimiento de neuropatías adquiridas . Por ejemplo, los agonistas de hedgehog se pueden usar para prevenir neuropatías diabéticas. La diabetes es la causa conocida más común de neuropatía. Produce síntomas en aproximadamente 10 % de las personas con diabetes. En la mayoría de los casos, la neuropatía es predominantemente sensorial, con dolor y pérdida de sensación en manos y pies. Pero algunos diabéticos tienen mononeuritis o mononeuritis múltiple que provoca debilidad en uno o más nervios, o plexopatías lumbosacral o amiotrofía que provoca debilidad en las piernas. El presente método también se puede usar en el tratamiento de neuropatías mediadas de forma inmunitaria. La función principal del sistema inmunitario es proteger al cuerpo para que no entren desde el exterior organismos infecciosos. En algunos casos, sin embargo, un sistema inmunitario se vuelca contra el anticuerpo y provoca enfermedad autoinmunitaria . El sistema inmunitario consiste de varios tipos de células sanguíneas blancas, que incluyen linfocitos T, que también regulan la respuesta inmunitaria; linfocitos B o células de plasma, que segregan proteínas especializadas llamadas "anticuerpos". Algunas veces, por razones desconocidas, el sistema inmunitario ataca por error partes del cuerpo tal como los nervios periféricos. Esta es la Neuropatía Periférica "autoinmunitaria" . Hay varios tipos diferentes, dependiendo de la parte del nervio periférico que se ataque y en el tipo de reacción inmunitaria. Los siguientes son breves descripciones de las neuropatías que se median por el sistema inmunitario. Por ejemplo, un agonista de hedgehog se puede usar para tratar el síndrome de Guillain-Barre (GBS) , una neuropatía agua que viene de forma súbita o rápida. El síndrome de Guillain-Barre puede progresar a parálisis y falla respiratoria en el espacio de días o semanas después del comienzo. La neuropatía se provoca cuando el sistema inmunitario destruye las vainas de mielina de los nervios sensoriales y motores. Frecuentemente se precede por infección, vacunación o trauma, y que se piensa que es algo que activa la reacción autoinmunitaria. La enfermedad es autolimitante, con recuperación espontánea en el espacio de seis a ocho semanas. Pero la recuperación frecuentemente es incompleta.
Otras neuropatías que empiezan de forma aguda, y que se pueden tratar por el método de la presente invención, incluyen neuropatía motora agua, neuropatía sensorial aguda, y neuropatía autonómica aguda, en las cuales existe un ataque inmunitario contra los nervios motores, sensoriales o autonómicos, respectivamente. El síndrome de Miller-Fisher es otra variante en la cual existe parálisis de la mirada de los ojos, descoordinación, y andar inestable. Aun otra neuropatía que se puede tratar por el presente método es polineuropatía desmielante inflamatoria crónica (CIDP) . La CIDP se piensa que es un una forma crónica y más indolente del síndrome de Guilian-Barre . La enfermedad progresa ya sea con ataques repetidos, llamados recaídas, de una manera gradual o estable. Como en el GBS, parece haber destrucción de las vainas de mielina por anticuerpos y linfocitos T. Pero puesto que no hay una prueba específica para las CIDP, la diagnosis se basa en características clínicas y de laboratorio. Las polineuropatí s crónicas con anticuerpos a nervios periféricos es aun otra neuropatía periférica para la cual se pueden emplear los presentes métodos para el tratamiento o prevención. En algunos tipos de neuropatías crónicas, se han identificado anticuerpos a componentes específicos de los nervios. Estos incluyen neuropatía desmielinante asociada con anticuerpos a la glicoproteína asociada con mielina (MAG) , neuropatía motora asociada con anticuerpos a los gangliósidos G 1 ó GDla, y neuropatía sensoria asociada con anticuerpos anti-sulfátido o GDlb gangliósido. Los anticuerpos en estos casos se unen al oligosacárido o moléculas tipo azúcar que se enlazan a las proteínas (glicoproteínas) o lípidos (glicolípidos o gangliósidos) en los nervios. Se sospecha que estos anticuerpos pueden ser responsables de las neuropatías. El presente método también es puede usar como parte de un plan terapéutico para tratar neuropatías asociadas con vasculitis o inflamación de los vasos sanguíneos en nervios periféricos. La neuropatía también se puede provocar por vasculitis, una inflamación de los vasos sanguíneos en los nervios periféricos. Produce pequeños "ataques" a lo largo del transcurso de los nervios periféricos, y se puede restringir a los nervios o se puede generalizar, incluyendo salpullido cutáneo, o comprender otros órganos. Varias enfermedades reumatológicas tal como artritis reumatoide, lupus, periarteriris nodosa, o síndrome de Sjogren, se asocian con vasculitis generalizada, que también puede comprender los nervios periféricos. La vasculitis puede provocar polineuritis, mononeuritis , o mononeuritis múltiplex, dependiendo de la distribución y severidad de las lesiones. En aun otra modalidad, el método de la presente invención se puede usar para el tratamiento de plexitis braquial o lumbosacral . El plexo branqueal , que está bajo la axila, contiene los nervios para el brazo y mano. La plexitis braquial es el resultado de la inflamación de ese fajo de nervios, y produce debilidad y dolor en uno o ambos brazos. La plexitis umbosacral, que se presenta en la pelvis, provoca debilidad y dolor en las piernas. Los agonistas de hedgehog también pueden ser adecuados para el uso en el tratamiento de neuropatías asociadas con gammopatías monoclonales . En la gammopatía monoclonal, los clones individuales de las células B o células de plasma en la médula ósea u órganos linfoides se expanden para formar tumores malignos o benignos y segregan anticuerpos. "Monoclonal" es debido a que existen clones individuales de anticuerpos, y "gammopatía" significa gammaglobulinas , que es otro nombre 'para los anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos reaccionan con los componentes de los nervios; en otros, los fragmentos de los anticuerpos forman depósitos amiloides . Aun otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del presente método en el tratamiento de neuropatías asociadas con tumores o neoplasmas. La neuropatía puede ser debido a infiltración directa de nervios por células de tumor o para afectar indirectamente al tumor. Este último se llama neuropatía paraneoplástica . Se han descrito varios tipos. Por ejemplo, los presentes métodos también se pueden usar para manejar la neuropatía sensorial asociada con cáncer de pulmón. Esta neuropatía se asocia con anticuerpos a una proteína llamada Hu, que está presente en las neuronas sensoriales de los nervios periféricos. Igualmente, el presente método se puede usar para tratar neuropatías asociadas con mieloma múltiple. El mieloma múltiple es un tumor óseo que se provoca por células de plasma que segregan anticuerpos en la médula ósea. El tumor está constituido de un clon individual de células de plasma, y los anticuerpos que lo producen son idénticos o monoclonales . Algunas personas con mieloma múltiple desarrollan polineuropatía sensorimotora con degeneración de axones de los nervios periféricos. En otras modalidades, el presente método se puede usar para tratar neuropatías asociadas con macroglobulemia de aldenstrom, leucemia limfocítica crónica, o linfoma de células B. Estos son tumores provocados por linfocitos B que segregan anticuerpos en el bazo, médula ósea o nodulos linfáticos. Estos anticuerpos son monoclonales y reaccionan frecuentemente con los componentes de los nervios periféricos tal como MAG, GM1 o sulfátida. En aun otras modalidades, los agonistas de hedgehog de la presente invención se pueden usar como parte del protocolo terapéutico para el tratamiento de pacientes con cánceres donde la neuropatía es una consecuencia de la irradiación local o se provoca. or medicamentos tal como vincristxna o cisplatina.
La presente invención también contempla el uso de agonistas de hedgehog para el tratamiento de neuropatías asociadas con amil.oidosis . El amiloide es una sustancia depositada en los nervios periféricos e interfiere con su operación; el trastorno es amiloidosis. Hay dos tipos principales. Amiloidosis primaria, en la cual los depósitos contienen fragmentos de anticuerpos monoclonales (ver, gammopatia monoclonal anterior) ; y amiloidosis hereditaria en la cual los depósitos contienen una proteína mutada llamada Trans-tiretina . La amiloidosis primaria se asocia usualmente con gammopatías monoclonales o mieloma. Aun otro aspecto de la presente invención proporciona el presente método como un medio para tratar neuropatías provocadas por infecciones. Las neuropatías periféricas se pueden provocar por infección de los nervios periféricos. Los virus que provocan neuropatías periféricas incluyen virus de SIDA, HIV-I, que provoca lentamente neuropatía sensoria progresiva, Citomegalovirus que provocan una neuropatía paralítica rápidamente progresiva, Herpes zoster que provoca herpes, y poliovirus que provoca una neuropatía motora. Las infecciones por hepatitis B o C se asocian algunas veces con neuropatía vasculítica. Las infecciones bacterianas que provocan neuropatía incluyen lepra, que provoca una neuropatía sensorial desigual, y difteria que puede provocar una neuropatía paralítica rápidamente progresiva. Otras enfermedades infecciosas que provocan neuropatía incluyen enfermedad de Lyme que se provoca por una espiroqueta, y tripanosomiasis que se provoca por un parásito. Ambos presentes comúnmente con una neuropatía multifocal. Las neuropatías provocadas por desequilibrio nutricional también son trastornos candidatos para el tratamiento por el presente método. Las deficiencias de las vitaminas B12, Bl (tiamina) , BS (piridoxina) , o E, por ejemplo, puede producir polineuropatías con degeneración de los axones de los nervios periféricos . Esto puede ser debido a una dieta pobre, o la incapacidad para absorber los nutrientes del estómago o intestino. Además, las mega-dosis de vitamina B6 también pueden provocar una neuropatía periférica, y el presente método se puede usar como parte de un programa de desintoxicación en estos casos. Aun otro uso del presente método es en el tratamiento de neuropatías que surgen en enfermedades de riñon. La falla renal crónica puede provocar una neuropatía periférica predominantemente sensorial con degeneración de los axones de los nervios periféricos . Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para tratar neuropatías hipotiroides . El hipotiroidismo se asocia algunas veces con polineuropatía sensorial dolorosa con degeneración axonal. La mononeuropatía o mononeuropatía múltiplex también puede presentarse debido a la compresión de los nervios periféricos por tejidos hinchados. El presente método también se puede usar en el tratamiento de neuropatías provocadas por alcohol y toxinas . Ciertas toxinas pueden provocar neuropatía periférica. La toxicidad por plomo se asocia con una neuropatía motora; el arsénico o mercurio provocan una neuropatía sensorial, y el talio puede provocar una neuropatía sensorial y autonómica. También varios solventes orgánicos e insecticidas pueden provocar polineuropatía. El alcohol es directamente tóxico a los nervios y el abuso de alcohol es la causa principal de la neuropatía. El presente método se puede usar, en ciertas modalidades, como parte de un programa amplio de desintoxicación. En aún otra modalidad, los métodos y composiciones de la presente invención se pueden usar para el tratamiento de neuropatías provocadas por fármacos . Se conocen varios fármacos que provocan neuropatía. Incluyen, entre otros, vincristina y cisplatina en cáncer, nitrofurantoina, que se usa en pielonefritis, amiodarona, en arritmias cardiacas, disulfram en alcoholismo, ddC y ddl en SIDA, y dapsona que se usa para tratar lepra. Como antes, el presente método se puede usar, en ciertas modalidades, como parte de un programa amplio de desintoxicación. El método de la presente invención también se puede usar en el tratamiento de neuropatías provocadas por trauma o comprensión. Las neuropatías localizadas pueden resultar de la comprensión de los nervios por presión externa o tendones sobrepuestos y otros tej idos . Los más conocidos son el síndrome de túnel carpiano que resulta de la compresión en la muñeca y radiculopatías cervicales y lumbares (ciática) que resultan de la compresión de las raices conforme salen en la espina. Otras áreas comunes de comprensión de nervios incluyen codos, axilas y parte posterior de la rodilla. El presente método también es útil en una variedad de neuropatías idiopáticas. El término "idiopatico" se usa cuando quiera que no se pueda encontrar la causa de la neuropatía. En estos casos, la neuropatía se clasifica de acuerdo a sus manifestaciones, es decir, sensorial, motora o polineuropatía idiomática sensorimotor . El presente método tiene amplia aplicabilidad al tratamiento o profilaxis de trastornos que afligen el tejido muscular. En general, el método se puede caracterizar como que incluye un paso de administrar a un animal una cantidad de un agonista de hedgehog efectivo para alterar el estado proliferativo de un tejido muscular tratado. El modo de administración y los regimenes de dosis variarán dependiendo del (los) tejido (s) muscular (es) que se va a tratar. En un aspecto, la invención se refiere a un factor trófico de músculos, y su uso en la estimulación de crecimiento o diferenciación muscular en mamíferos . Esta estimulación del crecimiento muscular es útil para tratar atrofia, o desaprovechamiento, en particular, atrofia de músculo esquelético, y atrofia de músculo cardiaco. Además, ciertas enfermedades en donde el tejido muscular está dañado, es anormal o está atrofiado, se pueden tratar usando la invención, tal como por ejemplo, envejecimiento normal, atrofia por desuso, desaprovechamiento o caquexia, y varios trastornos secundarios asociados con la edad y la pérdida de la masas muscular, tal como hipertensión, intolerancia a glucosa y diabetes, dislipedemia y enfermedad cardiovascular aterosclerótica. El tratamiento de las miopatías musculares tal como distrofias musculares también se incorpora en la invención. Con la desnervación o desuso, los músculos esqueléticos se someten a una rápida atrofia que conduce a una disminución profunda del tamaño, contenido proteico y resistencia contráctil. Esta atrofia es un componente importante de muchas enfermedades neuromusculares en humanos . En un ambiente clínico, las composiciones que comprenden los presentes agonistas de hedgehog se pueden usar para inhibir la degeneración muscular, por e emplo, para disminuir la pérdida de masa muscular, tal como parte de un tratamiento para trastornos de desaprovechamiento muscular. En modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se administran a pacientes que sufren de un trastorno, es decir, una condición física anormal, una enfermedad o condición patofisiológica asociada con regulación anormal y/o aberrante del tejido muscular. Los trastornos para los cuales se administran las composiciones de la invención son de manera preferente aquellos que producen de manera directa o indirecta un desaprovechamiento (es decir, pérdida) de la masa muscular, es decir, un trastorno de desaprovechamiento muscular. Estos incluyen distrofias musculares, caquexia cardiaca, en enfisema, lepra, mala nutrición, osteomalacia, leucemia aguda en niños, caquexia por SIDA y caquexia por cáncer. Las distrofias musculares son enfermedades genéticas que se caracterizan por debilidad progresiva y degeneración de las fibras musculares sin evidencia de degeneración neural . En la distrofia muscular de Duchenne (DMD) los pacientes exhiben un promedio de reducción de 67 % en la masa muscular, y en la distrofia miotónica, se ha mostrado que la síntesis de proteínas musculares fracciónales disminuye por un promedio de 28 %, sin ninguna disminución correspondiente en la síntesis proteica no muscular (posiblemente debido a la respuesta dañada de órgano terminal a hormonas anabólicas o sustrato) . Se ha demostrado la degradación proteica acelerada en los músculos de pacientes con DMD. El presente método se puede usar como parte de una estrategia terapéutica pare prevenir, y en algunos casos invertir, las condiciones de desaprovechamiento muscular asociadas con estas distrofias.
La insuficiencia cardiaca congestiva severa (CHF) se caracteriza por una "caquexia cardiaca" , es decir, un desaprovechamiento de la proteína muscular tanto de los músculos cardiacos como esqueléticos, con un promedio de 19 % de disminución de peso corporal. La caquexia cardiaca se provoca por una velocidad incrementada de anomalía de proteína miofibrilar . El presente método se puede usar como parte de un tratamiento para la caquexia cardiaca. El enfisema es una enfermedad pulmonar, obstructiva, crónica, definida por un agrandamiento de los espacios aéreos distantes a los bronquios no respiratorios terminales, acompañada por cambios destructivos de las paredes de los alvéolos. Las manifestaciones clínicas del funcionamiento pulmonar reducido incluyen ataque de tos j deante, infecciones respiratorias recurrentes, edema y daño funcional e intervalo de vida acortado. El efluvio de tirosina se incrementa por 47 % en pacientes enfisematosos . También, el flujo de leucina de cuerpo completo permanece normal , se incrementa la oxidación de leucina de cuerpo completo, y se disminuye la síntesis de proteína de cuerpo completo, el resultado es una disminución en la síntesis de proteínas musculares, acompañada por una disminución en el volumen proteico de cuerpo completo y la masa muscular esquelética. Esta disminución llega a ser cada vez más evidente con el progreso de la enfermedad y- el deterioro a largo plazo. Los presentes agonistas de hedgehog se pueden usar para prevenir y/o invertir, las condiciones de desaprovechamiento muscular asociadas con estas enfermedades . En la diabetes mellitus, existe un desaprovechamiento generalizado de músculo pequeño de las manos, que es debido a desnervación parcial crónica (neuropatía) . Esto es más evidente y se empeora con el progreso de la enfermedad a largo plazo y la severidad. El presente método se puede usar como parte de una estrategia terapéutica para el tratamiento de la diabetes mellitus. La lepra se asocia con un desaprovechamiento muscular que se presenta entre los metacarpianos del dedo pulgar y dedo índice. La mala nutrición severa se caracteriza por, ínter alia, desaprovechamiento muscular severo. El presente método se puede usar para tratar los efectos de desaprovechamiento muscular de la lepra. La osteomalacia es un trastorno nutricional provocado por una deficiencia de vitamina D y calcio. Se refiere como "raquitismo" en niños y "osteomalacia" en adultos. Se marca por un ablandamiento de los huesos (debido a mineralización dañada, con acumulación excesiva de osteoide) , dolor, blandura, desaprovechamiento muscular y debilidad, anorexia, y pérdida del peso total. Puede resultar de mala nutrición, preñez y lactancia repetidas (agotamiento o reducción de vitamina D y almacenamiento de calcio) , y resistencia a la vitamina D. El presente método se puede usar como parte de una estrategia terapéutica para el tratamiento de la osteomalacia. En la leucemia aguda de la infancia, existe mala nutrición de energías proteicas que da por resultado desaprovechamiento muscular esquelético. Los estudios han mostrado que algunos niños exhiben el desaprovechamiento muscular aun antes de la diagnosis de la leucemia, con una disminución promedio de 27 % en la masa muscular. También existe un incremento simultáneo de 33 % - 37 % en el tejido adiposo, que no da por resultado cambio neto en el peso corporal relativo y circunferencia de las extremidades. Estos pacientes pueden ser tratables por el tratamiento con un agonista de hedgehog de acuerdo con el método de la presente invención. La caquexia por cáncer es un síndrome complejo que se presenta con incidencia variable en pacientes con tumores sólidos y malignidades hematológicas . Clínicamente, la caquexia por cáncer se manifiesta como pérdida de peso con agotamiento masivo de tejido adiposo y masa muscular sin grasa, y es una causa de muerte que resulta del cáncer. Los pacientes con caquexia por cáncer tienen tiempos de supervivencia acortados , y respuesta disminuida a quimioterapia. Además de los trastornos que producen reaprovechamiento muscular, otras circunstancias y condiciones parecen estar enlazadas de alguna manera con una disminución de la masa muscular. Estas aflicciones incluyen desaprovechamiento muscular debido a dolor crónico de la espalda, edad avanzada, hospitalización a largo plazo debido a enfermedad o lesión, alcoholismo y terapia con corticosteroides . El presente método se puede usar como parte de una estrategia terapéutica para prevenir, y en algunos casos para invertir, las condiciones de desaprovechamiento muscular asociadas con estos cánceres. Los estudios han mostrado que en casos severos de dolor crónico de la espalda inferior, existe desaprovechamiento muscular para-espinal. Disminuyendo el desaprovechamiento muscular para-espinal se alivia el dolor y mejora la función. Un curso de tratamiento para el trastorno puede incluir administración de una cantidad terapéutica de un agonista de hedgehog. También se cree que la debilidad general en edad avanzada es debido a desaprovechamiento muscular. Conforme envejece el cuerpo, una proporción creciente de músculo esquelético se reemplaza por tejido fibroso. El resultado es una reducción significativa en la potencia muscular, no sólo en la reducción marginal en masa libre de grasa. El presente método se puede usar como parte de un tratamiento y estrategias preventivas para prevenir/invertir el desaprovechamiento muscular en pacientes con edad avanzada.
Los estudios han mostrado también que en pacientes que sufren lesiones o enfermedades crónicas, y se han hospitalizado durante periodos prolongados de tiempo, existe desaprovechamiento muscular unilateral de larga duración, con una disminución promedio de 31 % en la masa muscular. Los estudios también han mostrado que esto se puede corregir con fisioterapia intensiva. Sin embargo, puede ser más efectivo para los pacientes aumentar al menos estas terapias con tratamiento por el presente método. En alcohólicos, existe desaprovechamiento del músculo tibial anterior. Este daño muscular proximal se provoca por daño neurogénico, específicamente, adquirirá dañada de la enzima fosforilasa o glicolítica. El daño llega a ser evidente y se empeora conforme dure más el abuso del alcohol. Los pacientes tratados con corticosteroides experimentan pérdida de masa muscular. Estos pacientes también se pueden tratar por el tratamiento del presente método . Los compuestos de la invención se pueden usar para aliviar la pérdida de masa muscular que resulta de las condiciones anteriores, así como otros. Adicionalmente, los agonistas de hedgehog de la presente invención son útiles en aplicaciones de crianza en animales para contrarrestar la pérdida de peso en animales, o para promover el crecimiento. Por ejemplo, la invención también puede encontrar uso para incrementar la eficiencia de la producción de carne de animales. Específicamente, los animales pueden alimentar o inyectar con un agonista de hedgehog a fin de incrementar la masa muscular . esquelética total, por ejemplo, para incrementar el peso de estos animales de granja, tal como vacas, cerdos, ovejas, pollos y salmón. El mantenimiento de tejidos y órganos ex vivo también es altamente deseable. La terapia de reemplazo al tejido está bien establecida en el tratamiento de enfermedades humanas . Hay muchas situaciones donde se desea transplantar células musculares, especialmente células madre musculares, a un hospedador receptor donde las células del receptor están ausentes, dañadas o son células musculares disfuncionales en la enfermedad de desaprovechamiento muscular. Por ejemplo, el transplante de mioblastos normales puede ser útil para tratar la distrofia muscular de Duchenne y otra degeneración muscular y enfermedades de desaprovechamiento. Ver, por ejemplo Partridge (1991) uscle & Nerve 14:197-212. En el caso de mioblastos, se pueden inyectar en varios sitios para tratar enfermedades de desaprovechamiento muscular. El presente método se puede usar para regular el crecimiento de células musculares y tejido in vitro, así como para acelerar el injerto de tejido muscular implantado a un hospedador animal. A este respecto, la presente invención también se refiere a cultivos de mioblastos que se han expandido por tratamiento con un agonista de hedgehog. En una modalidad ilustrativa, este método comprende obtener una muestra muscular, de manera preferente una que incluya mioblastos, tratar opcionalmente la muestra celular de forma enzimática para separar las células. Cultivar, en la presencia de un agonista de hedgehog. Aun otro aspecto de la presente invención se refiere a la observación en la técnica que ptc, hedgehog y/o smoothened están comprendidos en las señales morfogénicas comprendidas en otras rutas organogénicas de vertebrados además de la diferenciación neuronal como se describe anteriormente, teniendo papeles aparentes en otro modelado endodérmico, así como procesos de diferenciación tanto mesodérmicos como endodérmicos . De esta manera, se contempla por la invención que también se pueden utilizar composiciones que comprenden agonistas de hedgehog tanto para el cultivo de células como para métodos terapéuticos que comprenden la generación de tejido no neuronal. En una modalidad, la presente invención hace uso del descubrimiento que ptc, hedgehog y smoothened están comprendidos aparentemente en el control del desarrollo de las células madre responsables de la formación del tracto digestivo, hígado, pulmones y otros órganos que se derivan del intestino primitivo. Shh sirve como una señal inductiva desde el endodermo al mesodermo, que es crítica a la morfogénesis del intestino. Por lo tanto, por ejemplo, los agonistas de hedgehog de la presente invención se pueden emplear para regular el desarrollo y mantenimiento de un hígado artificial que puede tener múltiples funciones metabólicas de un hígado normal. En una modalidad de ejemplo, el presente método se puede usar para regular la proliferación y diferenciación de las células madre del tubo digestivo para formar cultivos de hepatocitos que se pueden usar para poblar matrices extracelulares , o que se pueden encapsular en polímeros biocompatibles , para formar hígados artificiales tanto implantables como extracorporales . En otra modalidad, las composiciones terapéuticas de los agonistas de hedgehog se pueden utilizar en unión con el transplante de estos hígados artificiales, así como estructuras hepáticas embriónicas, para regular la captación del implante intraperitoneal , vascularización, y diferenciación in vivo y mantenimiento del tejido hepático injertado . En aun otra modalidad, el presente método se puede emplear de forma terapéutica para regular estos órganos después del ataque físico, químico o patológico. Por ejemplo, se pueden usar composiciones terapéuticas que comprenden los agonistas de hedgehog en la reparación hepática después de una hepatectomía parcial.
La generación del páncreas e intestino delgado a partir del intestino embriónico depende de la señalización intercelular entre las células endodérmicas y mesodérmicas del intestino. En particular, la diferenciación del mesodermo intestinal en músculo liso se ha sugerido que dependen de señales de células endodérmico adyacentes. Un mediador candidato de las señales endodérmicamente derivadas en el intestino posterior embriónico es hedgehog Sónico. Ver, por ejemplo, Apelqvist et al. (1997) Curr Biol 7:801-4. El gen Shh se expresa a todo lo largo del endodermo del intestino embriónico con la excepción del endodermo del brote pancreático, que en cambio expresa altos niveles de la proteína de homeodeminio Ipfl/Pdxl (factor 1 promotor de insulina/homeocuadro pancreático y duodenal 1) , un regulador esencial del desarrollo pancreático temprano. Apelqvist et al., supra, han examinado si la expresión diferencial de Shh en el tubo del intestino embriónico controla la diferenciación del mesodermo circundante en derivados de mesodermo especializados del intestino delgado y el páncreas. Para probar esto, usaron el promotor del gen Ipfl/Pdxl para expresar selectivamente Shh en el epitelio pancreático en desarrollo. En ratones transgénicos Ipfl/Pdxl- Shh, el mesodermo pancreático desarrollado en músculo liso y células intersticiales de Cajal, característica del intestino, en lugar de mesénquima pancreática y bazo. También, explantes pancreáticos expuestos a Shh experimentaron un programa similar de diferenciación intestinal. Estos resultados proporcionan evidencia que la expresión diferencial de Shh endodérmicamente derivado controla el destino del mesodermo adyacente en diferentes regiones del tubo intestinal . En el contexto de la presente invención, se contempla, por lo pronto, que los presentes agonistas de hedgehog se pueden usar para controlar o regular la proliferación y/o diferenciación del tejido pancreático tanto in vivo como in vi tro. Existe una amplia variedad de condiciones proliferativas y diferenciativas celulares patológicas para los cuales los inhibidores de la presente invención pueden probar beneficios terapéuticos, con la estrategia general que es, por ejemplo, la corrección de la expresión anormal de insulina, o la modulación de la diferenciación. De manera más general, sin embargo, la presente invención se refiere a un método para inducir y/o mantener un estado diferenciado, mejorando la supervivencia y/o afectando la proliferación de células pancreáticas, al poner en contacto las células con los presentes inhibidores. Por ejemplo, se contempla que la invención que, en vista de la implicación aparente de ptc, hedgehog y smoot ened en la formación de arreglos espaciales ordenados de tejidos pancreáticos, el presente método se puede usar como parte de una técnica para generar y/o mantener ese tejido tanto ín vitro como xn vivo. Por ejemplo, se puede emplear la modulación de la función de hedgehog tanto en cultivo celular como en métodos terapéuticos que comprenden la generación y mantenimiento de células ß y posiblemente también para tejido no pancreático, tal como en el control del desarrollo y mantenimiento de tejido del tracto digestivo, bazo, pulmones, y otros órganos que se derivan del intestino primitivo. En una modalidad de ejemplo, el presente método se puede usar en el tratamiento de trastornos hiperplásticos y neoplásticos que afectan al tejido pancreático, particularmente aquellos caracterizados por proliferación anormal de células pancreáticas. Por ejemplo, los cánceres pancreáticos se marcan por proliferación anormal de células pancreáticas que pueden dar por resultado operaciones en la capacidad secretoria de insulina en el páncreas. Por ejemplo, ciertas hiperplasias pancreáticas, tal como carcinomas pancreáticos, pueden dar por resultado hipoinsulinemia debido a la disfunción de células ß o masa celular disminuida de los islotes. Al grado que la señalización de ptc, hedgehog y smoothened anormal se puede indicar en el progreso de la enfermedad, presentes inhibidores, se pueden usar para mejorar la regeneración del tejido después de una terapia anti-tumor. Además, la manipulación de las propiedades de señalización de hedgehog en diferentes puntos puede ser útil como parte de una estrategia para reformar/reparar tejido pancreático tanto in vivo como in vitro. En una modalidad, la presente invención hace uso de la implicación aparente de ptc, hedgehog y smoothened en la regulación del desarrollo del tejido pancreático. En general, el presente método se puede emplear de forma terapéutica para regular el páncreas después del ataque físico, químico o patológico. En aun otra modalidad, el presente método se puede aplicar a técnicas de cultivo celular, y en particular, se puede emplear para mejorar la generación inicial de dispositivos prostéticos del tejido pancreático. La manipulación de la proliferación y diferenciación de tejido pancreático, por ejemplo, al alterar la actividad de hedgehog, puede proporcionar un medio para controlar más cuidadosamente las características de un tejido cultivado. En una modalidad de ejemplo, el presente método se puede usar para aumentar la producción de dispositivos prostéticos que requieren células de islotes ß, tal como se puede usar en los dispositivos de encapsulacion descritos por ejemplo en la patente de los Estados Unidos No. 4,892,538 de Aebischer et al, patente de los Estados Unidos No. 5,106,627 de Aebischer et al, Patente de los Estados Unidos No. 4,391,909 de Lim, y Patente de los Estados Unidos No. 4,353,888 de Sefton. Las células progenitoras tempranas a los islotes pancreáticos son multipotenciales, y coactivan aparentemente de los genes específicos de los islotes desde la primera vez que aparecieron. Conforme prosigue en desarrollo, la expresión de hormonas específicas de los islotes, tal como insulina, llega a ser restringido al patrón de expresión característico de células maduras de islotes. El fenotipo de células maduras de islotes, sin embargo, no es estable en cultivo, puesto que se puede observar una reaparición de rasgos embriónicos en células ß maduras. Al utilizar los presentes agonistas de hedgehog, la ruta de diferenciación o índice proliferativo de las células se puede regular. Además, la manipulación del estado diferenciativo del tejido pancreático se puede utilizar en unión con transplante de páncreas artificial para promover el implante, vascularización, y diferenciación in vivo y mantenimiento de tejido injertado. Por ejemplo, la manipulación de la función de hedgehog para afectar la diferenciación de tejido se puede utilizar como un medio para mantener la viabilidad del injerto. Bellusci et al. (1997) Development 124:53 reporta que hedgehog Sónico regula la proliferación de células mesenquimales de pulmón in vivo. Por consiguiente, el presente método se puede usar para regular la regeneración de tejido de pulmón, por ejemplo, en el tratamiento de enfisema y síndrome de esfuerzo respiratorio. En aun otra modalidad de la presente invención, las composiciones que comprenden agonistas de hedgehog se pueden usar en la generación in vitro de tejido esquelético, tal como de células madre esquelotegénicas , así como en el tratamiento in vivo de deficiencias de tejido esquelético. La presente invención contempla de manera particular el uso de agonistas de hedgehog para regular la velocidad de condrogénesis y/o osteogénesis . Por "deficiencia de tejido esquelético" se quiere decir una deficiencia en hueso u otro tejido conectivo esquelético en cualquier sitio donde se desee restaurar el hueso o tejido conectivo, no importa como se originó la deficiencia, por ejemplo, ya sea como resultado de intervención quirúrgica, remoción de tumor, ulceración, implante, fractura u otras condiciones traumáticas o degenerativas. Por ejemplo, el método de la presente invención se puede usar como parte de un régimen para restaurar la función del cartílago a un tejido conectivo. Estos métodos son útiles por ejemplo en la reparación de defectos o lesiones en tejido de cartílago que es el resultado de desgaste degenerativo tal como aquel que resulta en la artritis, así como otros trastornos mecánicos que se puedan provocar por trauma a la enfermedad, tal como desplazamiento de tejido roto de menisco, meniscectomia, un relajamiento de la articulación por un ligamento roto,, mal alineación de las articulaciones, fractura de hueso, o por enfermedad hereditaria. El presente método reparador también es útil para remodelar la matriz de cartílago, tal como en cirugía plástica o reconstructiva, así como cirugía periodontal . El presente método también se puede aplicar para mejorar un procedimiento reparador previo, por ejemplo, después de la reparación quirúrgica de un menisco, ligamento o cartílago. Además, puede prevenir el comienzo o exacerbación de la enfermedad degenerativa si se aplica suficientemente temprano después del trauma. En una modalidad de la presente invención, el presente método comprende el tratamiento del tejido conectivo afligido con una cantidad terapéuticamente suficiente de un agonista de hedgehog, particularmente un agonista selectivo para la transducción de señales de hedgehog Indio, para regular una respuesta de reparación de cartílago en el tej ido conectivo al manejar la velocidad de diferenciación y/o proliferación de condrocitos incrustados en el tejido. Los tejidos conectivos tal como cartílago articular, cartílago interarticular (meniscos) , cartílago costal (que conecta las costillas verdaderas y el esternón) , ligamentos y tendones son particularmente tratables por el tratamiento en terapias reconstructivas y/o regenerativas usando el presente método . Como se usa en la presente, las terapias degenerativas incluyen tratamiento de estados degenerativos que han progresado al punto del cual se manifiesta previamente el daño al tejido, así como tratamientos preventivos de tejido donde la degeneración est en etapas tempranas o es inminente. En una modalidad ilustrativa, el presente método se puede usar como parte de una intervención terapéutica en el tratamiento de cartílago de una articulación diartroidal, tal como una rodilla, un tobillo, un codo, una cadera, una muñeca, un nudillo del dedo de la mano o del pie, o una articulación tempomandibular . El tratamiento se puede dirigir a los meniscos de la articulación, al cartílago articular de la unión, o a ambos. Para ilustrar adicionalmente , el presente método se puede usar para tratar un trastorno degenerativo de una rodilla, tal como aquella que puede ser el resultado de lesión traumática (por ejemplo, lesión de deportes o desgaste excesivo) u osteoartritis . Los presentes antagonistas se pueden administrar como una inyección en la articulación, con ejemplo, una aguja artroscópica . En algunos casos, el agente inyectado puede estar en la forma de un hidrogel u otro vehículo de liberación lenta descrito anteriormente a fin de permitir un contacto más extendido y regular del agente con el tejido tratado. La presente invención contempla además el uso del presente método en el campo de transplante de cartílagos y terapias con dispositivos protésicos. Sin embargo, surgen problemas, debido a que las características del cartílago y el fibrocartílago varían entre diferente tejido; tal como entre cartílago articular, meniscal y ligamentos y tendones, entre los dos extremos del mismo ligamento o tendón, y entre las partes superficiales y profundas del tejido. El arreglo por zonas de estos tejidos puede reflejar un cambio gradual en las propiedades mecánicas, y puede presentarse una falla cuando el tejido implantado, que no se ha diferenciado bajo estas condiciones, carece de la capacidad para responder de forma apropiada. Por ejemplo, cuando se usa cartílago meniscal para reparar ligamentos cruciformes anteriores, el tejido sufre una metaplasia a tejido fibroso puro. Para regular la velocidad de condrogénesis, el presente método se puede usar para afrontar de forma particular este problema, al ayudar a controlar de manera adaptable las células implantadas en el nuevo ambiente y asemejar de forma efectiva los condrocitos hipertróficos de una etapa de desarrollo anterior del tejido. De una manera similar, el presente método se puede aplicar para mejorar tanto la generación de dispositivos prostéticos de cartílago y su implante. La necesidad de tratamiento mejorado ha motivado la investigación encaminada a crear nuevo cartílago que se ' basa en plantillas de colágeno-glicosaminoglicano (Stone et al. (1990) Clin Orthop Relat Red 252:129), condrocitos aislados (Grande et al. (1989) J Orthop Res 7:208; y Takigawa et al. (1987) Bone Miner 2:449), y condrocitos unidos a polímeros naturales o sintéticos (Walitani et al. (1989) J. Bone Jt Surg 71B-.74; Vacanti et al. (1991). Plast Reconstr Surg 88:753; von Schroeder et al. (1991) J. Biomed Mater Res 25:329; Freed et al. (1993) J. Biomed Mater Res 27:11; y la patente de los Estados Unidos No. 5,041,138 de Vacanti et al). Por ejemplo, los condorcítos se pueden cultivar en cultivo en soportes altamente porosos, biocornpatibles , biodegradables formados de polímeros tal como ácido poliglicólico, ácido poliláctico, gel de agarosa u otros polímeros que se degradan durante el tiempo como función de hidrólisis de la estructura del polímero en monómeros innocuos. Las matrices se diseñan para permitir el intercambio adecuado de nutrientes y gases a las células hasta que se presente el injerto. Las células se pueden cultivar in vitro hasta que se haya desarrollado un volumen celular adecuado y una densidad adecuada para las células que se van a implantar. Una ventaja de las matrices es que se pueden moldear por vaciado o moldear en una forma deseada en una base individual, de modo que el producto final se asemeja cercanamente a la oreja o nariz propia del paciente (a manera de ejemplo) , o se pueden usar matrices flexibles que permitan la manipulación en el momento del implante, como en una articulación. En una modalidad del presente método, los implantes se ponen en contacto con un antagonista de hedgehog durante ciertas etapas del proceso de cultivo a fin de manejar la velocidad de diferenciación de los condrocitos y la formación de condorcitos hipertróficos en el cultivo. En otra modalidad, dispositivo implantado se trata con un antagonista de hedgehog a fin de remodelar de forma activa la matriz implantada y hacerla más adecuada para su función propuesta. Como se expone anteriormente, con respecto a transplantes de tejido, los transplantes artificiales sufren de la misma deficiencia de no ser derivados de un ambiente que sea comprable al ambiente mecánico real en el cual se implanta la matriz. La capacidad para regular los condrocitos en la matriz por el presente método puede permitir que el implante adquiera características similares al tejido para el cual se propone reemplazar. En aun otra modalidad, el presente método se usa para mejorar la unión de los dispositivos protésicos. Para ilustrar, el presente método se puede usar en la implantación de prótesis periodontales, en donde el tratamiento del tejido conectivo circundante estimula la formación del ligamento periodontal a lo largo de la prótesis. En aun modalidades adicionales, el presente método se puede emplear como parte de un régimen para la generación de hueso (osteogénesis) en un sitio en el animal donde está deficiente es tejido esquelético. El hedgehog Indio se asocia de manera particular con los condrocitos hipertróficos que finalmente se reemplazan por los osteoblastos . Por ejemplo, se puede emplear la administración de un agonista de hedgehog de la presente invención como parte de un método para regular la velocidad de pérdida de hueso en un sujeto. Por ejemplo, se pueden emplear preparaciones que conprenden antagonistas de hedgehog, por ejemplo, para controlar la osificación endocondral en la formación de un "modelo" para la osificación.
En aun otra modalidad de la presente invención, se puede usar un antagonista de hedgehog- para regular la espermatogénesis. Las proteínas de hedgehog particularmente, Dhh, se ha mostrado que están comprendidas en la diferenciación y/o proliferación y mantenimiento de células germen testiculares . La expresión de Dhh se inicia en precursores de células Sertoli de forma breve después de la activación de Sry (gen determinante testicular) y persiste en los testículos en el adulto. Los machos son viables pero infértiles, debido a una ausencia completa del esperma maduro. El examen de los testículos en desarrollo en diferentes fondos genéticos sugiere que Dhh regula las etapas, tanto tempranas como posteriores de la espermatogénesis. Bitgood et al. (1996) Curr Biol 6:298. En una modalidad preferida, el antagonista de hedgehog se puede usar como un anticonceptivo. De una manera similar, los antagonistas hedgehog del presente método son potencialmente útiles para modular la función normal de los ovarios. El presente método también tiene amplia aplicabilidad al tratamiento o profilaxis de trastornos que afligen el tejido epitelial, así como en usos cosméticos. En general, el método se puede caracterizar como que incluye un paso de administrar a un animal una cantidad de un antagonista de hedgehog efectiva para alterar el estado de crecimiento de un tejido epitelial tratado. El modo de administración y los regímenes de tratamiento variarán dependiendo del tejido epitelial que se va a tratar. Por ejemplo, se preferirán formulaciones tópicas donde el tejido tratado es tejido epidérmico, tal como tejidos dérmicos o mucósicos. Un método que "promueve la curación de una herida" da por resultado la curación de herida más rápidamente como resultado del tratamiento que una curación similar de heridas en la ausencia del tratamiento. "Promoción de curación de herida" también puede significar que el método regula la proliferación y/o crecimiento de ínter alia, queratinocitos , o que la herida cura con menos cicatrización, una menor contracción de la herida, menos depósito de colágeno y un área más superficial. En ciertos casos, "promoción de curación de herida también puede significar que ciertos métodos de curación de heridas tienen proporciones mejoradas de éxito (por ejemplo, las velocidades de toma de injertos de piel) , cuando se usan conjuntamente con el método de la presente invención. Las complicaciones son un riesgo constante con medidas que no han curado completamente y permanecen abiertas. Aunque la mayoría de las heridas cura rápidamente sin tratamiento, algunos tipos de heridas se resisten a la curación. Las heridas que cubren grandes áreas superficiales también permanecen abiertas durante periodos prolongados de tiempo. En una modalidad de la presente invención, el presente método se puede usar para acelerar la curación de heridas que comprenden tejidos epiteliales, tal como que resultan de cirugía, quemaduras, inflamación o irritación. Algunos de los agonistas de hedgehog de la presente invención se pueden aplicar también de forma profiláctica, tal como en la forma de una preparación cosmética, para mejorar los procesos de regeneración de tejido, por ejemplo, de la piel, cabello y/o uñas de los dedos. A pesar del progreso significativo en las técnicas quirúrgicas de reconstrucción, la cicatrización puede ser un obstáculo importante en la recuperación de la función y apariencia normal de la piel curada. Esto es particularmente cierto cuando la cicatrización patológica tal como queloides o cicatrices hipertróficas de las manos o cara provoca discapacidad funcional o deformidad física. En las circunstancias más severas, esta cicatrización puede precipitar tensión sicosocial y una vida de privación económica. La reparación de heridas incluye las etapas de hemostasis, inflamación, proliferación y remodelación. La etapa proliferativa comprende la multiplicación de fibroblastos y células endoteliales y epiteliales. A través del uso del presente método, la velocidad de proliferación de células epiteliales en y próximas a la herida se puede controlar a fin de acelerar el cierre de la herida y/o reducir al mínimo la formación de tejido de cicatriz . Las quemaduras de espesor completo y parcial son un ejemplo de un tipo de herida que frecuentemente cubre grandes áreas superficiales y por lo tanto requiere periodos prolongados de tiempo para curar. Como resultado, f ecuentemente surgen complicaciones amenazadoras de la vida tal como infección y pérdida de fluidos corporales. Además, la curación en las quemaduras frecuentemente es de forma desordenada, dando por resultado cicatrización y deformidad. En algunos casos, la contracción de la herida debido al depósito excesivo de colágeno da por resultado movilidad reducida de los músculos en la vecindad de la herida. Las composiciones y método de la presente invención ' se pueden usar para acelerar la velocidad de curación de quemaduras y promover los procesos de curación que den por resultado resultados cosméticos más deseables y menos contracción y cicatrización de heridas. Las quemaduras severas que cubren grandes áreas frecuentemente se tratan por autoinjertos de piel tomados de áreas sin daño del cuerpo del paciente . El presente método también se puede usar en unión con injertos de piel para mejorar velocidades de "toma" del injerto al acelerar el crecimiento tanto de la piel injertada como de la piel del paciente que esta próxima al injerto. Las úlceras dérmicas son aun otro ejemplo de heridas que se pueden tratar por el tratamiento del presente método, por ejemplo, para provocar la curación de úlceras y/o para prevenir que la úlcera llegue a ser una herida crónica.
Por ejemplo, uno en siete individuos con diabetes desarrolla úlceras dérmicas en sus extremidades, que son susceptibles a infección. Los individuos con úlceras diabéticas infectadas requieren frecuentemente hospitalización, servicios intensivos, antibióticos costosos y en algunos casos, amputación. Las ulceras dérmicas, tal como aquellas que resultan de enfermedad venosa (ulceras por estasis venosa) , presión excesiva (ulceras decúbito) y ulceras arteriales también se resisten a la curación. Los tratamientos de la técnica anterior se limitan en general a mantener protegida la herida, libre de infección en algunos casos, para restaurar el flujo sanguíneo por cirugía vascular. De acuerdo al presente método, el área afligida de la piel se puede tratar por una terapia que incluye un agonista de hedgehog que promueve la epitelización de la herida, por ejemplo, acelera la velocidad de curación de las ulceras de la piel . El presente tratamiento también puede ser efectivo como parte de un régimen terapéutico para tratar úlceras orales y paraorales, por ejemplo, que resultan de radiación y/o quimioterapia. Estas ulceras se desarrollan comúnmente en el espacio de días después de la quimioterapia o terapia por radiación. Estas ulceras empiezan usualmente como pequeñas lesiones dolorosas de forma irregular usualmente cubiertas por una delicada membrana necrótica gris y circundadas por tejido inflamatorio. En muchos casos, la carencia de tratamiento da por resultado la proliferación de tejido alrededor de la periferia de la lesión en una base inflamatoria. Por ejemplo, el epitelio que rodea la ulcera usualmente demuestra actividad proliferativa, que da por resultado pérdida de continuidad del epitelio superficial. Estas lesiones, debido a su tamaño ? pérdida de integridad epitelial, conducen al cuerpo a infección secundaria potencial. La ingestión de rutina de alimento y agua llega a ser un evento muy doloroso, y si las ulceras proliferan a todo lo largo del canal alimentario, es usualmente evidente diarrea con todos sus factores de complicación. De acuerdo con la presente invención, un tratamiento para estas ulceras que incluye aplicación de un agonista de hedgehog puede reducir la proliferación anormal y diferenciación del epitelio afectado, ayudando a reducir la severidad de los eventos inflamatorios subsiguientes . En otra modalidad de ejemplo, el presente método se proporciona para tratar o prevenir enfermedades gastrointestinales. De forma breve, una amplia variedad de enfermedades se asocian con disrupción del epitelio gastrointestinal o vellos, incluyendo enteritis inducida por quimioterapia o terapia de radiación (es decir, toxicidad de intestino) y mucositis, enfermedad de ulcera péptica, gastroenteritis y colitis, trastornos atrofíeos del vello, y similares. Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos en la terapia de radiación usada en transplante de médula ósea y terapia de cáncer afectan rápidamente a las células proliferantes tanto en los tejidos hematopoyéticos como en el intestino delgado, conduciendo a toxicidades severas y frecuentemente que limitan la dosis. El daño a la barrera mucósica del intestino delgado da por resultado complicaciones serias de sangrado y sepsis. El presente método se puede usar para promover la proliferación del epitelio gastrointestinal e incrementar de este modo las dosis toleradas para radiación y agentes de quimioterapia. El tratamiento efectivo de enfermedades gastrointestinales se puede determinar por varios criterios, incluyendo una puntuación de enteritis, otras pruebas bien conocidas en la técnica. Levine et al. (1997) J. Neurosci 17:6277 muestran que las proteínas de hedgehog pueden regular la mitogénesis y diferenciación de fotorreceptores en la retina de los vertebrados, e Ihh es un factor candidato del epitelio pigmentado para promover la proliferación de progenitores retínales y diferenciación de fotorreceptores . Igualmente, Jensen et al. (1997) Development 124:363 demuestran que el tratamiento de cultivos de células retínales de ratones perinatales con el fragmento amino-terminal de la proteína hedgehog sónica da por resultado un incremento en la proporción de células que incorporan bromodesoxiuridina, en los números totales de células, y en los fotorreceptores de varilla, células amacrinas y células gliales de Muíler, sugiriendo que hedgehog Sónico promueve la proliferación de células precursoras retínales. De esta manera, el presente método se puede usar en el tratamiento de enfermedades degenerativas de las células retínales y para regular la diferenciación de los fotorreceptores . Con la edad, la epidermis se adelgaza y los apéndices de piel sufren atrofia. El cabello llega hacer escaso y disminuyen las secreciones sebáceas con susceptibilidad consecuente a resequedad, agrietamiento y fisuras. La dermis disminuye con pérdida de fibras elásticas y de colágeno. Además, disminuye con la edad la proliferación de queratinocitos (que es indicativo del espesor de la piel y la capacidad proliferativa de la piel) . Se cree que un incremento en la proliferación ' de los queratinocitos contrarresta el envejecimiento de la piel, es decir, arrugas, espesor, elasticidad y reparación. De acuerdo a la presente invención, una forma proliferativa de un agonista de hedgehog se puede usar ya sea de manera terapéutica o cosmética para contrarrestar, al menos durante un tiempo, los efectos del envejecimiento en la piel. Aun otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del presente método para promover el crecimiento del cabello. El cabello básicamente está compuesto de queratina, una proteína resistente y soluble; su principal característica está en su enlace de disulfuro de cisteína. Cada pelo individual comprende un árbol cilindrico y una raíz, y está contenido en un folículo, una depresión tipo frasco en la piel. El fondo del folículo contiene una saliente tipo dedo llamada la papila que consiste del tejido conectivo del cual crece el pelo, y a través del cual los vasos sanguíneos suministran a las células con nutrientes. El árbol es la parte que se extiende hacia fuera desde la superficie de la piel, en tanto que la raíz se ha descrito como la parte enterrada del pelo. La base de la raíz se expande en el bulbo del pelo, que descansa en la papila. Las células de las cuales se produce el pelo crece en el bulbo del folículo; se extruyen en la forma de fibras conforme las células proliferan en el folículo. "Crecimiento" de pelo se refiere a la formación y alargamiento de la fibra de pelo por las células de división. Como es bien conocido en la técnica, el ciclo común del pelo se divide en tres etapas: anágena, catágena y telógena. Durante la fase activa (anágena), las células madre, epidérmicas de la papila dérmica se divide rápidamente. Las células hija se mueven hacia arriba y se diferencian para formar las capas concéntricas del pelo mismo. La etapa de transición, catágena se marca por el cese de la mitosis de las células madre en el folículo. La etapa de reposo se reconoce como telógena, donde el pelo se retiene dentro del cuero cabelludo durante varias semanas antes de que un nuevo pelo emergente se desarrolle, lo desaloje del árbol en la fase de telógena desde su folículo. De este modelo ha llegado a ser claro que entre mayor sea la mezcla de las células madre de división que se diferencian en las células de pelo, más se presentará el crecimiento del pelo. Por consiguiente, los métodos para incrementar o reducir el crecimiento del pelo se pueden llevar a cabo al potenciar o inhibir, respectivamente, la proliferación de estas células madre. De esta manera, en ciertas modalidades, el presente método se puede emplear como una manera para promover el crecimiento el pelo humano, como por ejemplo, para corregir la calvicie, alopecia, u otras enfermedades caracterizadas por pérdida de pelo. El presente método también se puede usar en el tratamiento de una herida de tejido ocular. En general, e daño al tejido corneal, ya sea por enfermedad, cirugía o lesión, puede afectar a células epiteliales, y/o endoteliales , dependiendo de la naturaleza de la herida. Las células epiteliales corneales son las células epiteliales no queratenizadas que forran la superficie externa de la córnea y proporcionan una barrera protectora contra el ambiente externo. La curación de heridas corneales ha sido de interés tanto para facultativos como para investigadores . Los oftalmólogos frecuentemente se ven confrontados con distrofias corneales y lesiones problemáticas que dan por resultado erosión epitelial persistente y recurrente, que conducen frecuentemente a pérdida endotelial permanente. El uso de formas proliferativas de los presentes agonistas de edgehog- se puede usar en estos casos para promover la epitelizacion del tejido corneal afectado. Para ilustrar adicionalmente, los trastornos específicos típicamente asociados con daño celular epitelial en el ojo, y para los cuales el presente método puede proporcionar tratamiento benéfico, incluyen defectos epiteliales corneales persistentes, erosiones recurrentes, ulceras corneales neurotróficas , queratoconjuntivitis sicca, ulceras corneales microbianas, ulceras corneales virales y similares. Los procedimientos quirúrgicos que provocan típicamente lesión a las capas de células epiteliales incluyen procedimientos con láser, realizados en la superficie ocular, cualquier procedimiento quirúrgico refractivo tal como queratotomia radial y queratotomia astigmática, alerones conjuntivales, transplantes conjuntivales, epiqueratoplastía, y legrado corneal. Además, las heridas superficiales tal cerno legrados, erosión superficial, inflamación, etc., pueden provocar pérdida de células epiteliales. De acuerdo con la presente invención, el epitelio corneal se pone en contacto con una cantidad de un agonista de hedgehog efectivo para provocar la proliferación de las células epiteliales corneales para curar apropiadamente la herida.
En otros aspectos de la invención, el presente método se puede usar para inducir diferenciación y/o promover proliferación de tejido epitelialmente derivado. Estas formas de estas moléculas pueden proporcionar una base para la terapia por diferenciación para el tratamiento de condiciones hiperplásticas y/o neoplásticas que comprenden tejido epitelial. Por ejemplo, estas preparaciones se pueden usar para el tratamiento de enfermedades cutáneas en las cuales existe proliferación anormal o crecimiento anormal de células de la piel . El presente método se puede usar para mejorar la "velocidad de toma" de un injerto de piel. Los injertos de tejido epidérmico pueden, si la velocidad de toma del injerto es larga, pueden ampollarse y rasgarse, disminuyendo la probabilidad que el autoinjerto se "tomará", es decir, se adhiera a la herida y forme una membrana base con el tejido subyacente de granulación. Las velocidades de toma se pueden incrementar por el presente método al inducir proliferación de los queratinocitos . El método para incrementar las velocidades de toma comprende poner en contacto el autoinjerto de piel con una cantidad efectiva de curación de heridas de un agonista de hedgehog descrito en el método para promover la curación de heridas y en el método para promover el crecimiento y proliferación de queratinocitos, como se describe anteriormente.
Los equivalentes de piel pueden tener usos no sólo como un reemplazo para piel humana o animal para injerto de piel, sino también como piel de prueba para determinar los efectos de sustancias farmacéuticas y cosméticos en piel . Una dificultad principal en la prueba farmacológica, química y cosmética es la dificultad en la determinación de la eficacia y seguridad de los productos en la piel. Una ventaja de los equivalentes de piel de la invención es su uso como un indicador de los efectos producidos por estas sustancias a través del a prueba in vitro en la piel de prueba. De esta manera, en una modalidad del presente método se puede usar como parte de un protocolo para el injerto de pile de, por ejemplo, áreas desnudas, heridas granulantes y quemaduras. El uso de agonistas de hedgehog puede mejorar estas técnicas de injerto como autoinjertos de espesor dividido y autoinjertos epidérmicos (queratinocitos autogénicos cultivados) y haloinjertos epidérmicos (queratinocitos halogénicos cultivados) . En el caso del haloinjerto, el uso del presente método para mejorar la formación de equivalentes de piel en cultivo ayuda a proporcionar/mantener un suministro disponible de estos injertos (por ejemplo, en bancos de tejido) , de modo que los pacientes puedan ser cubiertos en un procedimiento único con un material que permita que se presente la curación permanente.
A este respecto, la presente invención también se refiere a equivalentes compuestos de piel viva que comprenden una capa epidérmica de células cultivas de gueratinocitos que se han expandido por tratamiento con un agonista de hedgehog. El presente método se puede usar como parte de un proceso para la preparación de equivalentes compuestos de piel viva. En una modalidad ilustrativa, este método comprende obtener una muestra de piel , tratar enzimáticamente la muestra de piel para separar la epidermis de la dermis, tratar enzimáticamente la epidermis para liberar las células de queratinocitos , cultivar, en la presencia de un agonista de hedgehog, los queratinocitos epidérmicos hasta confluencia, en paralelo, o de manera separada, tratar la dermis enzimáticamente para liberar las células de fibroblastos, cultivar las células de fibroblastos hasta sub-confluencia, inocular una membrana d esponja de colágeno reticulada, porosa con las células de fibroblastos cultivadas, incubar la esponja de colágeno inoculada en su superficie para permitir el crecimiento de las células de fibroblastos a todo lo largo de la esponja de colágeno, y luego inocularla con células cultivadas de gueratinocitos, e incubar adicionalmente el complejo compuesto de equivalente de piel en la presencia de un agonista de hedgehcg para promover el crecimiento de las células. En otras modalidades, las hojas de pile que contienen capas tanto epiteliales como mesenquimales se pueden aislar en cultivo y expandir con medio de cultivo complementado con una forma proliferativa de un agonista de hedgehog. Cualquier muestra de piel tratable por las técnicas de cultivo de células se puede usar de acuerdo con la presente invención. Las muestras de piel pueden ser autogénicas o alogénicas. En otro aspecto de la invención, el presente método se puede usar en unión con varios procedimientos periodontales en los cuales se desea el control de la proliferación de células epiteliales y al rededor del tejido periodontal . En una modalidad, los agonistas de hedgehog se pueden usar para mejorar la re-epitelización alrededor de dientes naturales y prostéticos, por ejemplo, para promover la formación de tejido de encías. Los productos génicos de hedgehog son capaces de regular la maduración de los linfocitos T. Ciertos aspectos de la invención se refieren a agonistas de hedgehog y sus usos como agentes inmunomoduladores contra trastornos inmunológicos ya sea adquiridos o hereditarios . Por ejemplo, estas composiciones se pueden usar para incrementar la población de células auxiliares T a niveles óptimos en el hospedador, por ejemplo, para estimular el sistema inmunitario del animal. Estos usos de las presentes composiciones se pueden usar en el tratamiento de infecciones bacterianas o virales, así como para ayudar al cuerpo contra células de cáncer. De manera alternativa, estas sustancias también permiten que el hospedador se ajuste a las enfermedades que surgen del desarreglo de los procesos de autoreconocimiento en los cuales existe ataque excesivo por las células T del hospedador contra tejidos endógenos. En estos casos, las presentes composiciones se pueden usar para reducir la población de células T de modo que se mejoren los signos y síntomas de las enfermedades inflamatorias (autoinmunitarias) autodirigidas tal como artritis reumatoide y esclerosis múltiple. Como se describe en la presente, las proteínas de hedgehog inhiben la maduración de linfocitos T. en base a su efecto inhibidor, la administración de agonistas de hedgehog se sugiere en la presente como un tratamiento para varios tipos de trastornos inmunológicos que comprenden activación indeseada de inmunidad celular, por ejemplo, rechazo de injerto, trastornos autoinmunitarios y similares. En general, el método de la presente invención comprende administrar al animal, o a linfocitos cultivados in vitro, una cantidad de un agonista de hedgehog que produce una respuesta no tóxica por la célula de inhibición de maduración. El presente método se puede llevar a cabo en células que se pueden ya sea dispersar en cultivo o una parte de un tejido u órgano intacto. Además, el método se puede realizar en células que se proporcionan en cultivo (in vi tro) , o en células en un animal completo (in vivo) . La invención también se refiere a métodos para controlar el desempeño funcional de células T mediante el uso de preparaciones farmacéuticas de la invención. Sin que se desee que se una por ninguna teoría particular, el efecto inhibitorio de hedgehog en la maduración de células T puede ser debido al menos en parte a la capacidad de las proteínas de hedgehog para antagonizar (ya sea de manera directa o indirecta) regulación mediada por patched de la expresión génica y otros efectos fisiológicos mediados por esa proteína. El producto génico de patched, una proteína de superficie celular, se entiende que señala a través de una ruta que provoca represión trascripcional de los miembros de las familias Wnt y Dpp/B P de morfógenos, proteínas que imparten información de posición. En otro tejido, la introducción de hedgehog alivia (no reprime) esta inhibición conferida por patched, permitiendo la expresión de programas génicos particulares. En otro aspecto, la presente invención proporciona preparaciones farmacéuticas que comprenden agonistas de hedgehog. Los agonistas de hedgehog para el uso en el presente método se pueden formular de manera conveniente para la administración con un medio biológicamente aceptable, tal como agua, solución salina amortiguada, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , polietilenglicol líquido y similares) o mezclas adecuadas de los mismos. La concentración óptima del (los) ingrediente (s) activo (s) en el medio elegido se puede determinar de forma empírica, de acuerdo a procedimientos bien conocidos por los expertos médicos. Como se usa en la presente, "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión y similares que puedan ser apropiados para la ruta deseada de administración de la preparación farmacéutica. El uso de estos medios para sustancias farmacéuticas activas se conoce en la técnica. Excepto con respecto a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con la actividad del agonista de hedgehog, se contempla su usó en la preparación farmacéutica de la invención. Los vehículos adecuados y su formulación inclusive de otras proteínas se describen, por ejemplo, en el libro Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington' s Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Company, Easton, Pa, USA 1985) . Estos vehículos incluyen "formulaciones de depósito" inyectables. Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir composiciones veterinarias, por ejemplo, preparaciones farmacéuticas de agonistas de hedgehog adecuadas para usos veterinarios, para el tratamiento de animales de granja o domésticos, por ejemplo, perros. Los métodos de introducción también se pueden proporcionar por dispositivos recargables o biodegradables . Se han desarrollado varios dispositivos, poliméricos de liberación lenta, y se han probado in vivo en los años recientes para la distribución controlada de fármacos, incluyendo productos biofarmacéuticos proteináceos . Una variedad de polímeros biocompatibles (incluyendo hidrogeles) , que incluyen polímeros tanto biodegradables como no degradables, se pueden usar para formar un implante para la liberación sostenida de un agonista de hedgéog en un sitio objetivo particular. Las preparaciones de la presente invención se pueden dar de forma oral, parenteral, tópica o rectal. Por supuesto se dan por formas adecuadas para cada ruta de administración. Por ejemplo, se administran en tabletas o en forma de cápsula, por inyección, inhalación, loción para ojos, ungüento, supositorio, parche de liberación controlada, etc., administración por inyección, infusión o inhalación, de forma tópica por loción o ungüento; y de forma rectal por supositorios. Se prefieren las administraciones orales y tópicas. Las frases "administración parenteral" y "administrado en forma parenteral" como se usa en la presente significa modo de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección e incluye, sin limitación, administración intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtractecal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e inyección intraesternal e infusión.
Las frases "administración sistémica" , "administrar de forma sistémica" , "administración periférica" y "administrar en forma periférica" como se usan en la presente significan la administración de un compuesto, fármaco u otro material diferente de directamente en el sistema nervioso central, tal que entra al sistema del paciente y de esta manera se somete al metabolismo y otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea. Estos compuestos se pueden administrar a humanos y otros animales por terapia por cualquier ruta adecuada de administración, incluyendo de forma oral, nasal, como por ejemplo por administración por rociado, rectal, intravaginal , parenteral, intracisternal y tópica, como por polvos, ungüentos o gotas, incluyendo de forma bucal y sublingual. A pesar de la ruta de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que se pueden usar en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosis farmacéuticamente aceptables tal como se describe posteriormente o por otros métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los niveles reales de dosis de los ingredientes activos de las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición, y modo de administración, sin que sea tóxico al paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto particular de la presente invención empleado, o el éster, sal o amida del mismo, la ruta de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el antagonista particular de hedgehog empleado, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica anterior del paciente que se trate, y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Un facultativo o veterinario que tenga experiencia en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo el facultativo o veterinario puede iniciar dosis de los compuestos de la invención empleadas en la composición farmacéutica a niveles menores que los requeridos a fin de lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de un compuesto de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la menor dosis efectiva para producir un efecto terapéutico. Esta dosis efectiva dependerá en general de factores descritos anteriormente. En general, las dosis intravenosas, intracerebroventriculares y subcutáneas de los compuestos de la invención para un paciente varían de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal por día, de manera preferente, de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10 mg por kilogramo de peso corporal por día, de manera aún más preferente, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 mg por kilogramo de peso corporal por día. Si se desea, la dosis diaria efectiva del compuesto activo se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas de manera separada a intervalos apropiados a todo lo largo del día, opcionalmente, en formas de dosis unitarias. El término "tratamiento" se propone para abarcar también profilaxis, terapia y curación. El paciente que recibe este tratamiento es cualquier animal en necesidad, incluyendo primates, en particular humanos, y otros mamíferos tal como equinos, ganado vacuno, cerdos y ovejas, y aves de corral y mascotas en general. El compuesto de la invención se puede administrar como tal o en mezclas con portadores farmacéu icamente aceptables y/o estériles y también se puede administrar en unión con otros agentes antimicrobianos tal como penicilinas, cefalosporinas, aminoglicósidos y glicopéptidos . .La terapia conjuntiva, incluye de esta manera la administración secuencial, simultanea y separada del compuesto activo de una manera tal que los efectos terapéuticos del primer compuesto administrado no desaparezcan completamente cuando- se administra el subsiguiente. V. Composiciones Farmacéuticas En tanto que es posible que un compuesto de la presente invención se administre sólo, se prefiere administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición) . Los agonistas de hedgehog de acuerdo con la invención se pueden formular para la administración en cualquier forma conveniente para el uso en medicina humana o veterinaria. En ciertas modalidades, el compuesto incluido en la preparación farmacéutica puede ser activo por sí mismo, o puede ser un profármaco, por ejemplo, capaz de ser convertido a un compuesto activo y en un ambiente fisiológico. De esta manera, otro aspecto de la presente invención proporciona composiciones farmacéutic mente aceptables que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más de los compuestos descritos anteriormente, formulando conjuntamente con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables (aditivos) y/o diluyentes. Como se describe en detalle posteriormente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular de forma especial para la administración en forma sólida o liquida, incluyendo aquellas adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, pócimas (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas) , tabletas, bolos, polvos, gránulos pastas para la aplicación a la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como por ejemplo una solución o suspensión estéril; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o rociado aplicado a la piel; o (4) de forma intravaginal o intrarectal por ejemplo, como un pesario, crema o espuma. Sin embargo, en ciertas modalidades los presentes compuestos se pueden disolver simplemente o dispersar en agua estéril. En ciertas modalidades, la preparación farmacéutica es no pirogénica, es decir, no eleva a la temperatura corporal de un paciente. La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente significa que la cantidad de un compuesto, material o composición que comprende un compuesto de la presente invención que es efectivo para producir algún efecto terapéutico deseado en al menos una sub-población de células en un animal y bloqueando de este modo las consecuencias biológicas de esa ruta en las células tratadas, a una relación razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico. La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosis que son adecuadas, dentro del alcance del juicio médico acertado, para el uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, . respuesta alérgica, u otro problema o complicación, conmensurable como una relación razonable de beneficio/riesgo. La frase "portador farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, comprendido en la aportación o transporte de los presentes antagonistas desde un órgano, o una porción del cuerpo, a otro órgano, o una porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no dañino al paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tal como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones tal como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa, y sus derivados tal como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) polvo de tragacanto; (5) malta; (S) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tal como manteca de cacao y ceras de supositorio, (9) aceites, tal como aceite de cacahuate, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya; (10) glicoles, tal como propilenglicol ; (11) polioles, tal como glicerina, sorbitol, mannitol y polietilenglicol ; (12) ésteres, tal como oleato de etilo y laureato de etilo; (13) agar; (14) agentes amortiguadores, tal como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; . (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones amortiguadoras de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. Como se establece anteriormente, ciertas modalidades de los presentes agonistas de hedgehog pueden contener un hueco funcional básico, tal como amino o alquilamino, y son, de esta manera, capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con ácidos farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" a este respecto, se refiere a sales de adición de ácido relativamente no tóxicas, inorgánicas y orgánicas de los compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento final y purificación de los compuestos de la invención, o al hacer reaccionar de manera separada un compuesto purificado de la invención en su forma de base libre con un ácido orgánico e inorgánico, y al aislar sal formada de esta manera. Las sales representativas incluyen la sal de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, valereato, oleato, palraitato, estearato, laureato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, gluco eptonato, lactobionato y lau ilsulfonato y similares (ver, por ejemplo Berge et al., (1997) "Pharmaceutical Salts" , J. Pharm. Sci . 66:1-19). Las sales farmacéuticamente aceptables de los presentes compuestos incluyen las sales no tóxicas convencionales o sales de amonio cuaternario de los compuestos, por ejemplo, de ácidos orgánicos o inorgánicos no tóxicos. Por ejemplo, estas sales no toxicas convencionales incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos tal como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, sulfámico, fosfórico, nítrico y similares; y las sales preparadas de ácidos orgánicos tal como acético, propiónico, succínico, glicólico, esteárico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, palmítico, meleico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicíclico, sulfanílico, 2 -acetoxibenzoico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, etano-disulfónico, oxálico, isotiónico, y similares. En otros casos, los compuestos de la presente invención pueden contener uno o más grupos funcionales ácidos y de esta manera, son capaces de formar sales f rmacéuticamente aceptables con bases farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" en estos casos se refiere a las sales de adición de base relativamente no tóxicas, inorgánicas y orgánicas de los compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar igualmente in situ durante el aislamiento final y purificación de los compuestos, o al hacer reaccionar de manera separada el compuesto purificado en su forma de ácido libre con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico farmacéuticamente aceptable, con amoniaco, o con una amina primaria, secundaria o terciaria, orgánica, farmacéuticamente aceptable. Las sales alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen las sales de litio, sodio, potasio, magnesio y aluminio y similares. Las aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilamina, dietilamina, etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares (ver, por ejemplo Berge et al . , supra.) . Los agentes humectantes, emulsionadores y lubricadores, tal como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de revestimiento, edulcorantes, saborizantes y agentes de perfume, conservadores y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones . Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tal como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tal como palmitato de ascorbilo, idroxianisolbutilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propil-galato, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tal como ácido cítrico, ácido etilendiaminatetracético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuados para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual, rectal, vaginal y/o parenteral . Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosis unitaria y se pueden preparar por cualquier método bien conocido en la técnica de farmacia. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del hospedador que se trate, el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosis individual será en general aquella cantidad del compuesto que produzca un efecto terapéutico. En general, de entre cien por ciento, esta cantidad variará de entre 1 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, de manera preferente de aproximadamente 5 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, y de manera más preferente de aproximadamente 10 por ciento a aproximadamente 30 por ciento.
Los métodos para preparar estas formaciones o composiciones incluyen el paso de poner en asociación un compuesto de la presente invención con el portador y opcionalmente , uno o más ingredientes auxiliares. En general, las formulaciones se preparan al poner de forma uniforme e intima en asociación un compuesto de la presente invención con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, formar el producto. Las formulaciones de la invención adecuadas para la administración oral pueden estar en la forma de cápsulas, sobres, pildoras, tabletas, pastillas (usualmente con una base de sabor, usualmente sacarosa y goma de acacia o tragacanto) , polvos, granulos o como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite, líquida, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (tal como con base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia) y/o como lavados bucales y similares, cada uno que contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la presente invención como un ingrediente activo. Un compuesto- de la presente invención también se .puede administrar como un bolo, electuario o pasta. En las formas de dosis sólidas de la invención para la administración oral (cápsulas, tabletas, pildoras, grageas, polvos, granulos y similares) , el ingrediente activo se mezcla con uno o más portadores f rmacéuticamente aceptables, tal como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o entendedores, tal como almidones, lactosa, sacarosa, sucrosa, mannitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes tal como por ejemplo carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinil-pirrolidona, sacarosa y/o acacia; (3) humectantes, tal como glicerol; (4) agentes desintegrantes tal como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato de sodio; (5) agentes retardantes de solución tal como parafina; (6) aceleradores de absorción, tal como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tal como por ejemplo, alcohol etílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tal como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes tal como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurel sulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) agentes colorantes. En el caso de cápsulas, tabletas y pildoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes amortiguadores. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina de relleno suave y duro usando excipiente tal como lactosa, azucares, lácteos, así como polietilenglicoles de alto peso molecular, y similares.
Una tableta se puede elaborar por compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes auxiliares. Las tabletas comprimidas se pueden preparar usando aglutinante (por ejemplo, gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa) , lubricante, diluyente inerte, conservador, desintegrante (por ejemplo, almidón glicolato de sodio o carboximetilcelulosa sódica reticulada) , agente activo en la superficie o dispersante. Se pueden elaborar tabletas moldeadas al moldear en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Las tabletas, y otras formas de dosis sólidas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención, tal como grageas, cápsulas, pildoras y granulos, se pueden marcar opcionalmente o preparar con revestimientos y cubiertas, tal como revestimientos entéricos y otros revestimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. También se pueden formular para proporcionar liberación lenta o controlada del ingrediente activo en el mismo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en porciones variables para proporcionar el perfil deseado de liberación, u otras matrices de polímero, liposomas y/o microesferas. Se pueden esterilizar por ejemplo por filtración a través de un filtro de retención de bacterias, o al incorporar agentes esterilizantes en la forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en agua estéril, o algún otro- medio inyectable estéril inmedia amente antes del uso. Estas composiciones también pueden contener opcionalmente agentes opacificadores y pueden ser de una composición que puedan liberar el ingrediente activo (s) únicamente, o de manera preferencial, en una cierta porción del tracto gastrointestinal, opcionalmente, de forma retrasada. Los ejemplos de composiciones de incrustación que se pueden usar incluyen sustancias poliéricas ligeras. El ingrediente activo también puede estar en la forma microencapsulada, si es apropiado, con uno o más de los excipientes descritos anteriormente. Las formas de dosis líquidas para la administración oral de los compuestos de la invención incluyen emulsiones farmacéuticamente aceptables, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elíxires. Además del ingrediente activo, las formas de dosis líquidas pueden contener diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tal como por e emplo, agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionadores, tal como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de algodón, de cacahuate, maíz, germen, oliva, ricino y ajonjolí) , glicerol, alcohol tetrahidrofuríclico, polietilenglicoles y esteres de ácidos grasos de sorbitan, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes tal como agentes de humectación, agentes de emulsionamiento y suspensión, edulcorantes, saborizantes, colorantes, agentes conservadores y de perfume . Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de dispersión tal como por ejemplo alcoholes isoestearílieos etoxilados, polioxietilensorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, mtahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y rrezclas de los mismos. Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas de la invención para administración rectal o vaginal se pueden presentar como un supositorio, que se puede preparar al mezclar uno o más compuestos de la invención con uno o más excipientes adecuados, no irritantes, o portadores que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol , una cera de supositorio o un salicilato, y que es sólido a temperatura ambiente, pero liquido a la temperatura corporal y por lo tanto se fundirá en el recto o cavidad vaginal y liberará el agonista activo de hedgehog. Las formulaciones de la presente invención que son adecuadas para la administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de rociado que contiene estos portadores como se conoce en la técnica que son apropiados . Las formas de dosis para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, rociados, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo se puede mezclar bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservador, amortiguador, o propulsor que se pueda requerir. Los ungüentos, pastas, cremas y geles pueden contener, además de un compuesto activo de esta invención, excipientes, tal como grasas vegetales y de animales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles , silicones, bentonitas, ácido silícico, talco y óxido de zinc, o mezclas de los mismos. Los polvos y rociados pueden contener, además de un compuesto de esta invención, excipientes tal como lactosa, talco, ácido silícico, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los aerosoles pueden contener adicionalmente propulsores habituales, tal como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos insustituidos volátiles, tal como butano y propano. Los parches transdérmicos tiene la ventaja adicional de proporcionar distribución controlada de un compuesto de la presente invención al cuerpo. Estas formas de dosis se pueden hacer al disolver o dispersar los agonistas de hedgehog en el medio apropiado. También se pueden usar intensificadores de absorción para incrementar el flujo de los agonistas de hedgehog a través de la piel . La velocidad de este flujo se puede controlar ya sea al proporcionar una membrana de control de velocidad o al dispersar el compuesto en una matriz de polímero o gel. También se contemplan formulaciones oftálmicas, ungüentos para ojos, polvos, soluciones y similares como que están dentro del alcance de esta invención. Las composiciones f rmacéuticas de esta invención adecuadas para la administración parenteral comprenden uno o más compuestos de la invención en combinación con una o más soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas, isotónicas, estériles, farmacéu icamente aceptables, o polvos estériles que se puedan reconstituir en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes del uso, que pueden contener an i-oxidantes amortiguadores, bacteriostatos, solutos que vuelven a la formulación isotónica con la sangre del paciente propuesto o agentes de dispersión o espesantes. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tal como glicerol, propilenglicol , polietilenglicol , y similares, y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tal como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tal como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersiones, y por el uso de agentes tensioactivos . Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tal como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de dispersión. Se puede asegurar la prevención de la acción de los microorganismos por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifungales, por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tal como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede ocasionar por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina. En algunos casos, a fin de prolongar el efecto de un fármaco, es deseable alentar la absorción del fármaco de la inyección subcutánea o intramuscular . Esto se puede lograr por el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo que tiene pobre solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco entonces depende de su velocidad de disolución, que a su vez, puede depender del tamaño de cristal y forma cristalina. De manera alternativa, la absorción retrasada de una forma de fármaco parenteralmente administrada se logra al disolver o dispersar el fármaco en un vehículo de aceite.
Las formas de depósito inyectables se elaboran al formar matrices de microencapsulación de los presentes compuestos en polímeros biodegradables tal como poliláctido-poliglicólido . Dependiendo de la relación de fármaco a polímero, y de la naturaleza del polímero particular empleado, se puede controlar la velocidad de liberación del fármaco. Los ejemplos de otros polímeros biodegradables incluyen poli (ortoésteres) y poli (anhídridos) . También se preparan formulaciones inyectables de depósito al atrapar el fármaco en liposomas o microemulsiones que son compatibles con tej ido corporal . Cuando los compuestos de la presente invención se administren como productos farmacéuticos, a humanos y animales, se pueden dar per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, 0.1 a 99.5 % (de manera más preferente, 0.5 a 90 %) de ingrediente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. La adición del compuesto activo de la invención a la alimentación del animal se logra de manera preferente al preparar una premezcla de alimentación apropiada que contiene el compuesto activo en una cantidad efectiva y al incorporar la premezcla en la ración completa. De manera alternativa, un concentrado intermedio o complemento de alimentación que contiene el ingrediente activo se puede mezclar en la alimentación. La manera en la cual estas premezclas de alimentación y raciones completas se pueden preparar y administrar se describe en los libros de referencia (tal como "Applied Animal Nutrition" , W.H. Freedman y CO., San Francisco. EUA., 1969 o "Livestock Feeds and Feeding" O y B books, Corvallis, Ore., EUA., 1977) . VI. Esquemas de Síntesis e Identificación de Antagonistas Activos Los presentes inhibidores, y congéneres de los mismos, se pueden preparar fácilmente al emplear las tecnologías de acoplamiento cruzado de Suzuki, Stille, y similares . Estas reacciones de acoplamiento se llevan a cabo bajo condiciones relativamente moderadas y toleran una amplia variedad de funcionalidades "espectadoras" . a. Bibliotecas de combinación Los compuestos de la presente invención, particularmente bibliotecas de variantes que tienen varias clases representativas de sustituyentes , son tratables a la química de combinación y otros esquemas de síntesis, paralelos (ver, por ejemplo PCT WO 94/08051) . El resultado es que se pueden detectar rápidamente grandes bibliotecas de compuestos relacionados, por ejemplo, una biblioteca variada de compuestos representados anteriormente, en ensayos de alto rendimiento a fin de identificar compuestos guía de antagonistas potenciales de hedgehog, así como para refinar la especificidad, toxicidad y/o perfil citotóxico-cinético de un compuesto guía. Por ejemplo, los ensayos de bioactividad de ptc, hedgehog o smoothened, tal como se puede desarrollar usando células con ya sea una pérdida de función de ptc, ganancia de función de hedgehog o ganancia de función de smoothened, se puede usar para detectar una biblioteca de los presentes conpuestos para aquellos que tiene actividad agonista hacia ptc o actividad antagonista hacia hedgehog o smoothened. Simplemente por ilustración, una biblioteca de combinación para los propósitos de la presente invención es una mezcla de compuestos químicamente relacionados que se pueden detectar conjuntamente para una propiedad deseada. La preparación de muchos compuestos relacionados en una reacción individual reduce en su mayor parte y simplifica el número de procesos de detección que necesitan llevarse a cabo. La detección de las propiedades físicas apropiadas se puede hacer por métodos convencionales . La diversidad en la biblioteca se puede crear en una variedad de diferentes niveles. Por ejemplo, los grupos arilo de sustrato usados en las reacciones de combinación pueden ser diversos en términos de la porción arilo de núcleo, por ejemplo, una variación en términos de la estructura de anillo, y/o se puede variar con respecto a los otros sustituyentes . Están disponibles una variedad de técnicas para generar bibliotecas de combinación de moléculas orgánicas pequeñas tal como los presentes agonistas de hedgehog. Ver, por ejemplo, Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; las patentes de los Estados Unidos 5,359,115 y 5,362,899 de Affymax: la patente de los Estados Unidos 5,288,514 de Ellman: la publicación del PCT WO 94/08051 de Still et al; las patentes de los Estados Unidos 5,736,412 y 5,712,171 de ArQule; Chen et al. (1994) JACS 116:2661: Kerr et al. (1993) JACS 115:252; las publicaciones del PCT WO92/10092, O93/09668 y WO91/07087; y la publicación del PCT WO93/20242 de Lerner et al. Por consiguiente, se pueden sintetizar y detectar para una actividad o propiedad particular una variedad de bibliotecas en el orden de aproximadamente 100 a 1,000,000 o más diversómeros de los presentes agonistas de hedgehog. En una modalidad de ejemplo, se puede sintetizar una biblioteca de agonistas de hedgehog candidatos, diversómeros, utilizando un esquema adaptado a las técnicas descritas en la publicación del PCT WO 94/08051 de Still et al. Por ejenplo, que se enlaza a una cuenta de polímero por un grupo hidrolizable o fotolizable, opcionalmente localizado en una de las posiciones de los antagonistas candidatos o un sustituyante de un compuesto intermedio sintético. De acuerdo a la técnica de Still et al, la biblioteca se sintetiza en un conjunto de cuentas, cada cuenta que incluye un conjunto de marcas que identifican el diversomero particular en esa cuenta. La biblioteca de cuentas entonces se puede "colocar en placa" con las células de sensibles a hedgehog. Los diversómeros se pueden liberar de la cuenta, por ejemplo, por hidrólisis.
Las estructuras de los compuestos útiles en' la presente invención otorgan por si mismas fácilmente síntesis eficientes. La naturaleza de las estructuras de los presentes compuestos, como se expone en general anteriormente, permite el rápido montaje combinatorio de estos compuestos. Por ejemplo, como en el esquema de reacción expuesto posteriormente, un grupo arilo activado, tal como un triflato o bromuro de arilo, unido a una cuenta u otro soporte sólido se puede enlazar a otro grupo arilo al realizar un acoplamiento Stille o Suzuki, con un estannano de arilo o un ácido aril-borónico . Si el segundo grupo arilo se funcionaliza con un aldehido, se puede adicionar un sustituyente de amina a través de una aminación reductiva. De manera alternativa, el segundo grupo de arilo se puede funcionalizar con un grupo saliente, tal como un triflato, tosilato, o haluro, capaz de ser desplazado por una amina. O, el segundo grupo arilo se puede funcionalizar con un grupo amina capaz de sufrir aminación reductiva con una amina, por ejemplo, CKNH. Otras técnicas posibles de acoplamiento incluyen reacciones de arilación de amina mediadas por metales de transición. La amina secundaria resultante entonces se puede funcionalizar por acilación, alquilación o arilación para generar una amina terciaria o amida que entonces se puede escindir de la resina o soporte. Estas reacciones en general son completamente moderadas y se han aplicado de forma exitosa en esquemas de reacción de síntesis de fase sólida de combinación. Además, el amplio intervalo de sustratos y compañeros de acoplamiento adecuados, y disponibles para estas reacciones permiten el rápido montaje de bibliotecas diversas, grandes de compuestos para prueba en ensayos como se expone en la presente . Para .ciertos esquemas, y para ciertas sustituciones en los varios sustituyentes de los presentes compuestos, un experto en la técnica reconocerá la necesidad de enmascarar ciertos grupos funcionales con un grupo protector adecuado. Estas técnicas son bien conocidas y se aplican fácilmente a los esquemas de síntesis de combinación.
Cy-K-NH2 NaBH4 Muchas variaciones en las rutas anteriores y relacionadas permiten la síntesis de bibliotecas ampliamente diversas de compuestos que se pueden probar como agonistas de la función de hedgehog. b. Ensayos de Detección Existe una variedad de ensayos disponibles para determinar la capacidad de un compuesto para agonizar la función de ptc o antagonizar la función de smootheried o hedgehog, muchos de los cuales se pueden colocar en formatos de alto rendimiento . En muchos programas de detección de fármacos que las bibliotecas de prueba de compuestos y extractos naturales, los ensayos de alto rendimiento son deseables a fin aumentar al máximo el número de compuestos examinados en un periodo dado de tiempo. De esta manera, las bibliotecas de productos sintéticos y naturales se pueden mostrar para otros compuestos que son agonistas de hedgehog. Además de los ensayos libres de células, también se pueden probar compuestos de prueba en ensayos basados en células. En una modalidad, la célula que es sensible a la adición de proteína de hedgehog se puede poner en contacto con un agente de prueba de interés, con la puntuación de ensayo para, por e emplo, promoción de la proliferación de la célula en la presencia del agente de prueba. Se han implicado varios productos génicos en la transducción de señales mediada por patched, incluyendo patched, factores de trascripción de la familia cubitus interruptus (ci) , la serina/treonina-cinasa fusionada (fu) y los productos de costal-2, s oothened y s-7Joot ejed y suppressor of f sed.
La inducción de células por proteínas de hedgehog coloca en movimiento una cascada que comprende la activación e inhibición de los efectores de etapas posteriores, la consecuencia final del cual es, en algunos casos, un cambio detectable en la trascripción o traducción de un gen. Los objetivos trascripcionales potenciales de la señalización mediada por hedgehog son el gen patched (Hidalgo y Ingham, 1990 Development 110, 291-301; Marigo et al., 1996) y los homólogos de vertebrados del gen interruptus de drosophila cubitus, los genes GLI (Hui et al. (1994) Dev Biol 162:402-413) . La expresión del gen patched se ha mostrado que se inducen células del brote de extremidades y la placa neural que son sensibles a Shh. (Marigo et al. (1996) PNAS 93:9346-51; Marigo et al., (1996) Development 122:1225-1233). Los genes Gli codifican para factores de trascripción putativos que tienen dominios de unión a ADN de extremidad de zinc (Orenic et al. (1990) Genes & Dev. 4:1053-1067; Kinzler et al. (1990) Mol Cell Biol 10:634-642). La trascripción del gen Gli se ha reportado que está regulada ascendentemente en respuesta a hedgehog en brotes de extremidades, en tanto que la trascripción del gen Gli3 está regulada descendentemente en respuesta a la inducción de hedgehog (Marigo et al., (1996) Development 122:1225-1233). Al seleccionar secuencias reguladoras trascripcionales de estos genes objetivos, por ejemplo, de genes patched o Gli, son responsables de la regulación ascendente y descendente de estos genes en respuesta a la señalización de hedgehog, y que enlazan operativamente estos promotores a un gen indicador, puede derivar un ensayo basado en trascripción que es sensible a la capacidad de un compuesto de prueba específico para modificar las rutas de señalización mediadas por hedgehog. La expresión del gen indicador, de esta manera, proporciona una herramienta valiosa de detección para el desarrollo de compuestos que actúan como agonistas de hedgehog. Los ensayos basados en el gen indicador de esta invención miden la tapa final de la cascada de eventos descrita anteriormente, por ejemplo, modulación transcripcional . Por consiguiente, en la práctica de una modalidad del ensayo, se inserta una construcción del gen indicador en la célula de reactivo a fin generar una señal de detección dependiente de la pérdida de función de ptc, ganancia de función de hedgehog, ganancia de función de smoothened o estimulación por Shh mismo. La cantidad de trascripción del gen indicador se puede medir usando cualquier método conocido por aquellos expertos en la técnica como que es adecuado. Por ejemplo, la expresión de ARNm del gen indicador se puede detectar usando protección de ARNasa o PCR basado en ARN, o el producto de proteína del gen indicador se puede identificar por una mancha característica o una actividad biológica intrínseca. La cantidad de expresión del gen indicador entonces se compara a la cantidad de expresión ya sea en la misma célula en la ausencia del compuesto de prueba o se puede compara con la cantidad de trascripción en una célula sustancialmente idéntica que carece de la proteína receptora objetivo. Cualquier disminución estadísticamente significativa o de otro modo significativa, en la cantidad de trascripción, indica que el compuesto de prueba ha agonizado de alguna manera la señal de petición normal (o antagonizado la señal de hedgehog o smoothened de ganancia de función), por ejemplo, el compuesto de prueba es un agonista potencial de hedgehog. Ej emplificación La invención ahora que se describe en general , esta se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se incluye sólo para propósitos de ilustración de ciertos aspectos y modalidades de la presente invención, y no se proponen para limitar la invención. En la sección experimental posterior, el término "proteína de Hh" se usa para designar octil-Shh-N, una forma lipofílica de un fragmento bacterianamente derivado de proteína de hedgehog sónica humana (aminoácidos 24-198, Shh-N) . Específicamente, Shh-N se ha enlazado covalentemente in vi tro vía su cisteína amino-terminal a un grupo de octil-maleimida. Esta forma modificada, igual que otras descritas recientemente (Pepinsky et al., J. Biol . Chem. 1998, 273, 14037-45) exhiben mayor potencia específica que el fragmento correspondiente no modificado en varios ensayos basados en células de la señalización de hedgehog. Detección de compuestos Para medir la actividad agonista de hedgehog de los compuestos, se usaron células [10T1/2 (sl2) ] que contienen la construcción indicadora Gli-Luc sensible a hedgehog. En cada MTP (Placa de MicroTítulo; placa de 96 cavidades) , se colocaron 10,000-20,000 células por cavidad, en medio completo (FBS al 10%) . Después de aproximadamente 24-48 horas, las placas se cambiaron a medio de bajo contenido de suero (= FBS al 0.5%) . De manera subsiguiente, se adicionó un compuesto de prueba a 1-5 µ en la presencia o ausencia de octil-hedgehog (ver posteriormente) . Después de otras 24 horas, el medio de las MTP se descartó y se reemplazó con mezcla de ensayo de luciferasa, que contiene amortiguador de lisis con sustrato de luciferasa. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 15-30 minutos y se eluyeron en un luminómetro . Detección A Las placas se incubaron durante 48 horas antes del cambio a bajo contenido de suero. Los compuestos se detectaron a 1-2 µ? en la presencia de proteína de Hh (0.01 µg/mL; EC30 = aproximadamente 30% de actividad máxima inducida) .
Detección B Se incubaron placas durante 24 horas antes del cambio a bajo contenido de suero. Los compuestos se detectaron a 5 µ? sin adicionar rutina de Hh. Contra-detección de compuestos (SV-Luc) Para la contra-detección se usaron las células [10T1/2 (SV-Luc) ] que contienen un cartucho de expresión de SV40-luciferasa que permite un nivel constitutivo de actividad de luciferasa en las células. Este ensayo permite valorar la especificidad de los compuestos seleccionados en el ensayo de Gli-Luc, es decir, si los compuestos se estimulan de forma especifica la ruta de señalización de hedgehog únicamente, o construcciones de indicador en general. La colocación en placa de células y el cultivo asi como el manejo de los compuestos se realizaron como en el ensayo de Gli-Luc. En este ensayo, no se adicionó proteina de Hh debido a que la construcción de indicador está ya constitutivamente activa. De la detección A, se identificaron aciertos en las Figuras 32 y 33. La subunidad de 1 , 4-diaminociclohexano de los compuestos de la Figura 32 que incluye esta porción tiene los dos sustituyentes amino-colocados en una relación trans, por ejemplo, ambos sustituyentes ecuatoriales en la subunidad de ciclohexano. Estos aciertos se confirmaron en la detección B. Los datos mostrados en las Figuras 34a y 34b comprendieron esencialmente la dosificación de los dos compuestos en ambos ensayos (Gli-Luc y SV-Luc) . Los datos del ensayo de Gli-Luc se convierten a por ciento de actividad donde la actividad completa con proteina de Hh se ajusta al 100% (Figura 35; Tabla 1) . Los datos muestran que los dos compuestos pueden estimular de manera significativa la actividad en la construcción del indicador de Gli-luc (es decir, activar la señalización de hedgehog) aún en la ausencia de proteina de Hh; intervalo de concentración 0.1-15 µ?, EC50 = 2 µ?, ECmax = 50-70% de actividad máxima inducida con proteina áe Hh) . Además, los compuestos muestran una inducción más sobresaliente en la presencia de hedgehog (EC50 = 0.2-03 µ?, ECmax = 70-90% de actividad máxima inducida con proteina de Hh) , indicando una sinergia entre los compuestos y la proteina de Hh, consistente con los compuestos que sirven como agonistas para la ruta de hedgehog. Tabla 1 Compuesto EC50 (µ?) Compuesto EC50 (µ?) A A' <10 B <10 B' <10 C <1 C <10 D <0.1 D' <10 E <10 E' <10 F <10 F' <10 G <10 G' <10 H <1 H' >10 I >10 I' <1 Los datos del ensayo de SV-Luc (Figura 35) indican que los dos compuestos no afectan la actividad de luciferasa sobre el intervalo de concentraciones (hasta 15 µ?) probadas, sugiriendo que los compuestos no estimulan la actividad de una construcción indicadora per se, pero probablemente son específicos a la ruta de hedgehog. También, la actividad sin afectar sugiere que los compuestos no son intrínsecamente tóxicos a las células. Agonista de Hh: Medición cuantitativa por RT-PCR de aumento de concentración de gli Los compuestos de las Figuras 32 y 33 se probaron para su capacidad para activar la trascripción de dos objetivos bien estudiados de la ruta de hedgehog: el factor de trascripción Gli-1, y el componente Ptc-1 del receptor Hedgehog putativo. Como se representa en la Figura 35, se encontró que, a una concentración del compuesto de 8 µ?, la inducción de ambos objetivos fue de aproximadamente 60% para el compuesto B de p-cianofenilo y 40% para el compuesto A de m-nitrofenilo de aquel obtenido con la concentración óptima de la proteína Hh. Los ensayos se realizaron como sigue: Células C3H 10T1/2 murinas se sembraron a aproximadamente 200,000 células por cavidad en una placa de 24 cavidades en medio completo (FBS al 10%) . Después de 24 horas, se removió el medio y se reemplazó con medio de "inanición" (FBS al 0.5%) que contiene diluciones del compuesto o proteina Hh. Después de 16-18 horas, se preparó el ARN total usando TriZol (Life Technologies, inc.) . Se usaron alícuotas de un microgramo del ARN total para preparar ADNc cebado con hexámero aleatorio con transcriptasa invertida de M- TV (Life Technologies, Inc.) Para medir los niveles relativos de los transcriptos Gli-1 y Ptc-1, se realizaron los ensayos TaqMan (PE Biosystems) con un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7700. Como un control interno, se midieron de manera simultánea los niveles del trascripto GAPDH en cada reacción. Los datos se analizaron usando el detector de secuencia vi .63 (Perkin Elmer) . Inducción de proliferación de precursor de neuronas cerebelares por agonistas de señalización de Hedgehog A fin de probar la eficacia de los agonistas de señalización de Hedgehog, se determinó la capacidad de los agonistas para estimular la proliferación de precursores de neuronas cerebelares. Los precursores de neuronas de gránulos cerebelares se conoce que responden a la proteína Hh por proliferación. Para probar los agonistas, se diseccionaron neuronas cerebelares de cerebros de rata pos-natal (una semana) y se colocaron en cultivo de células primarias. Se adicionaron de una vez los agentes de tratamiento, en el primer día de cultivo (0 DIV) . Las células se dejaron en cultivo hasta 2 DIV, cuando se adicionó 3H-timidina durante 5 horas; la cantidad de incorporación por las células de esta 3H-timidina proporciona una medición del nivel de proliferación de las células . Las células entonces se Usaron, y se determinó la incorporación de 3H-timidina. El control positivo fue la proteina Hh, a 1.0 pg/ml de concentración final. La proteina Hh sola provocó aproximadamente un incremento de 20 veces en la incorporación de 3H-timidina, consistente con la capacidad conocida de Shh para estimular la proliferación de estas células. Las células no estimuladas con proteina Hh, que incluyen las células tratadas con el vehículo de control (DMSO) , tienen niveles muy bajos de proliferación. Sin embargo, los dos de los agonistas de Hh en la Figura 32 que se probaron, A y B, se encontraron que estimulan de manera significativa la incorporación de 3H-timidina en la ausencia del tratamiento con proteina Hh, como se representa en la Figura 36. A 5.0 µ?, el compuesto B de p-cianofenilo provocó una inducción de 10.2 veces de la incorporación de 3H-timidina. La Figura 37 muestra que el agonista D también estimuló fuertemente la incorporación de 3H-timidina ¦ en la ausencia de Shh. A 1.0, 0.3 o 0.1 µ , D provocó una inducción de 16, 17 o 13 veces, respectivamente, la incorporación de 3H-timidina en las células . Estas observaciones de mostraron que los agonistas de hedgehog pueden estimular las respuestas biológicas de hedgehog conocidas en células objetivo.
Ensayo de trituración de nervios Se anestesiaron ratones machos CD-1 con Avertina. El área en el lado ventral de la pata del ratón alrededor de la rodilla se rasuró y limpió con etanol al 70% para remover el cabello seguido por frotación con Betadina. La piel sobre el muslo se enrolló con fórceps y se usaron tijeras pequeñas para hacer un corte de 0.635 cm (0.25 pulgadas) en la piel. Se removió la grasa para exponer el nervio femoral, la arteria y la vena. Co las puntas de los fórceps #7 curvos dando hacia abajo, el músculo se extendió por debajo de la arteria femoral/vena para revelar el nervio ciático profundo en el músculo. En tanto que se usó un par de fórceps para mantener separado el músculo, se usó un segundo par para levantar cuidadosamente el nervio. Se tomó cuidado de no levantar las fibras musculares . Los fórceps se abrieron y se cerraron 3 veces para separar el nervio del músculo. El nervio se mantuvo elevado desde el músculo con los fórceps curvos y se sujetaron en mostatos en el nervio para mantener el nervio en la porción intermedia de los hemostatos. Los hemostatos se mantuvieron en su lugar durante 10 segundos. De esta manera, ambos nervios ciáticos se trituraron o machucaron aproximadamente 1 cm por arriba de la rodilla (y bifurcaciones) . Los hemostatos se liberaron y el nervio cayó de regreso al músculo. La punta (P2) de una pipeta pequeña se usó para aplicar una pequeña cantidad de tinte de marcación de tejido histológico al área triturada o machacada. Se usó una pinza quirúrgica para cerrar la incisión. Se tomó cuidado de no sujetar la piel al músculo. Las pinzas se dejaron en su lugar a todo lo largo del experimento completo. Se realizó una cirugia de control a un grupo de ratones . Esto comprendió el levantamiento del nervio con los fórceps y dejándolos caer de regreso en su lugar sin ninguna trituración o machacado. Este sitio también se marcó con el tinte histológico. El tratamiento con fármaco empezó el dia de la cirugia. Para la proteina Shh, una proteina de fusión de Shh e inmunoglobulina (como se describe en la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. 60/164,025, incorporada en la presente como referencia) administrada a una dosis de 1 mg/kg en una solución de PBS, se dio una inyección subcutánea en el punto intermedio de la parte posterior del animal con una jeringa de insulina de 1/2 ce calibre 28, y se repitió cada dia diferente hasta el dia 12-13. (Se terminó la recuperación por entonces) . Para la administración del agonista, una solución del agonista en DMSO al 43%/PBD (Figuras 38? y 39B) , o en DMSO al 10%/agua (Figuras 38B y 39D), se distribuyó por una minibomba (1 uL/hora) . Se iniciaron las pruebas de comportamiento en el dia 4 después de la cirugia y se continuaron hasta el dia 12 ó 13.
Prueba de comportamiento.- Ensayo de sujeción Se colocó un ratón en una rejilla de alambre metálico de 20.32 x 20.32 cm (8 pulgadas x 8 pulgadas) (tal como un soporte de tubos de ensaye) con aberturas de 1 cm, y la rejilla se invir~ió lentamente 10 veces con un movimiento estable, constante. El número de veces en que el ratón falló en sujetarse con su extremidad trasera izquierda o derecha se registró. El ratón se mantuvo alejado de los bordes de la rejilla al volver a colocar al ratón en la rejilla conforme fuera necesario. Si el ratón solo se enganchó su pata alrededor o a través de la rejilla se consideró una falla. Se repitió una inversión el ratón estaba caminando, y falló en sujetar la rejilla. Se mezclaron las fallas de la pata izquierda y derecha con otros animales de ese grupo experimental (6 animales/grupo x 2 puntuaciones de sujeción de pata/animal = 12 puntuaciones de sujeción/grupo en cualquier punto de tiempo dado) . Los resultados para el agonista D se representan en la Figura 38A. Los animales tratados con vehículo sólo empezaron a recuperarse en general por sí solos por el día 9 después de la cirugía. La Figura 38B representa los resultados . obtenidos usando el agonista D disuelto en un vehículo de DMSO al 10%/agua en el protocolo del tratamiento. Prueba de comportamiento.- Mediciones de propagación de dedo La medición de propagación de dedo comenzó el día 4 después de la cirugía y se midió cada día diferente. El ratón se retuvo por la parte próxima de la cola y se permitió retenerse en la parte superior de alambre de la jaula con sus extremidades frontales. Un pequeño pincel o aplicador de algodón se usó para pintar los dedos posteriores y almohadillas de la pata del ratón. El ratón se dejó caminar a través de una hoja limpia de papel, para dejar al menos dos impresiones clara para cada extremidad posterior. Usando una regla, se trazó una línea a través de las impresiones de dedo más anchas en cada pata y la distancia entre las mismas se midió. Conforme se recuperaron los animales, la distancia se incrementó a mediciones normales. Se promediaron las puntuaciones de las patas izquierda y derecha y se mezclaron con los otros animales de ese grupo experimental (6 animales/grupo x 2 puntuaciones de sujeción de pata/animal = 12 puntuaciones de propagación de dedo/grupo en cualquier punto de tiempo dado) . Los resultados usando el agonista D se representan en las Figuras 39A y B. La Figura 39A representa los efectos del agonista D disuelto en un vehículo de DMSO al 10%/agua en este protocolo. Ensayos de ratones indicadores Los ratones con un transgen de ß-galactosidasa (ratones ptc-lacZ) bajo el control regulador del sitio patched expresan la proteína de ß-galactosidasa en las mismas células donde se expresa el gen patched de ratón endógeno. La proteína de ß-galactosidasa de esta manera se puede usar como un indicador fiel de la expresión del gen patched endógeno. El gen patched es un componente conocido de la ruta de señalización de hedgehog y se aumenta en concentración cuando la ruta de hedgehog se activa. Por lo tanto, en ratones ptc-lacZ, se sobre-expresa la proteina de ß-galactosidasa en ratones en los cuales se ha activado la ruta de hedgehog, dando por resultado tinción azul más intensa (debido a mayores niveles de la enzima de ß-galactosidasa) cuando se tiñen tejidos para la actividad enzimática con el sustrato X-gal. Se dividieron los ratones ptc-lacZ en cuatro grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos o combinaciones de compuestos durante cuatro días, comenzando el día primero después del nacimiento (dipal-Shh = hedgehog Sónico dipalmitoilado) : 1) dipal-Shh 10 mg/kg/inyección 2X/día 2) dipal-Shh 1 mg/kg/inyección 2X/día vehículo 10-15 µ?/inyección 4X/día 3) dipal-Shh 1 mg/kg/inyección 2X/día agonista B 15 mg/kg/inyección 4X/día 4) Ningún tratamiento El vehículo para el agonista fue DMSO al 10% en PBS (pH 7.2) . El agonista se inyectó de una solución concentrada 4.67 mM disuelta en la solución del vehículo. 18 horas después de las últimas inyecciones, los ratones se sacrificaron y se recolectaron los siguientes tejidos: cráneo, riñon, pulmón, escápula, piel y corazón. Todos los tejidos se fijaron en glutaraldehido al 0.2%, EDTA 5 mM (pH 8.0), MgCl2 20 mM, Na2HP04 100 mM durante 30 minutos antes de la tinción en 1 mg/mL de X-gal, ferrocianuro de potasio 12.5 mM, ferricianuro de potasio 12.5 mM, MgCl2 2 mM, desoxicolato al 0.01%, NP-40 al 0.02%, y Na2HP04 100 mM durante 30 horas. Se juzgó a los tejidos para la intensidad relativa y se fotografiaron. Todos los tejidos del grupo 3 de tratamiento (agonista + dipal-Shh a dosis baja) mostraron aumento significativo de concentración de ß-galactosidasa (como se visualiza por tinción azul más intensa) en comparación a aquellos del grupo 2 de tratamiento (vehículo + dipal-Shh de baja dosis), como se ve en la Figura 40, en donde los tejidos del grupo 3 se ¦ representan en el lado derecho de cada cuadro. Las imágenes en la Figura 41 muestran un ejemplo de tejido de cada uno de los cuatro grupos en tratamiento. El aumento en concentración observado en el grupo 3 fue similar a aquel visto en el grupo 1 de tratamiento (dipal-Shh de alta dosis) . El nivel de tinción de ß-galactosidasa en el grupo 2 de tratamiento fue similar a aquel visto en el grupo 4 de tratamiento (ningún tratamiento) . El agonista B fue claramente capaz de aumentar la concentración de la ruta de hedgehog in vivo en la presencia de una baja dosis de dipal-shh que por si misma es insuficiente para producir aumento detectable en la concentración . Figura 42: Se dividieron ratones ptc-lacZ en dos grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos durante tres dias, empezando el primer dia después del nacimiento: ) vehículo 8-15 µ?/inyección 4X/día ) Agonista D 4 mg/kg/inyección 4X/día El vehículo para el agonista fue DMSO al 10% en PBS (pH 7.2). El agonista se inyectó de una solución concentrada a 1.0 mM disuelta en la solución de vehículo. Dieciocho horas después de las últimas inyecciones, los ratones se sacrificaron y las extremidades delanteras posteriores se recolectaron y procesaron como se describe anteriormente. Las extremidades delanteras de los ratones tratados con el agonista mostraron un fuerte aumento en la concentración en los nervios, vasos sanguíneos, cartílago y tejido conectivo. El agonista D fue claramente capaz de aumentar la concentración de la ruta de hedgehog in vivo en la ausencia de dipal-Shh. El aumento en la concentración visto en esta dosis de agonista D es mayor que aquel visto con inyecciones de dipal-Shh a 10 mg/kg/inyección, 2X/día.
En un tercer experimento, se dividieron ratones Ptc-lacZ en cinco grupos de tratamiento y se trataron con los siguientes compuestos durante cuatro días, empezando el primer día después del nacimiento: 1) vehículo 9-•20 µ?/inyección 4X/día 2) agonista D 0. 9 mg/kg/inyección 4X/día 3) agonista D 0. 3 mg/kg/inyección 4X/día 4) agonista D 0. 1 mg/kg/inyección 4X/día 5) octil-shh 1Ci mg/kg/inyección 2X/día El vehículo para el agonista fue DMSO al 10% en PBS (pH 7.2). El agonista se inyectó de soluciones concentradas de 0.3, 0.1 y 0.03 mM disueltas en la solución de vehículo. Dieciocho horas después de las últimas inyecciones, los ratones se sacrificaron y las extremidades delanteras se recolectaron y procesaron como se describe anteriormente. Los resultados de este experimento se representan en la Figura 43, en la cual no se muestra el control de vehículo. Las extremidades delanteras de los ratones tratados con el agonista claramente mostraron fuerte aumento en la concentración en los nervios, vasos sanguíneos, cartílago y tejido conectivo (en comparación al grupo con vehículo) . El grupo de 0.9 mg/kg mostró los niveles más alto de aumento en concentración en este experimento. Tanto el grupo de 0.9 mg/kg como de 0.3 mg/kg mostraron mayor aumento en concentración que el grupo de 10 mg/kg de proteina Hh. El grupo de 0.1 mg/kg mostró muy débil aumento en concentración que fue claramente menor que aquel visto en el grupo con proteina Hh. El agonista D fue claramente capaz de aumentar en concentración la ruta de ' hedgehog ín vivo de una manera sensible a la dosis. El aumento en concentración visto a las dosis de 0.9 y 0.3 mg/kg del agonista D es mayor que aquel visto con inyecciones de proteina Hh a 10 mg/kg/inyección, 2X/día. Ensayo de ramificación de pulmón Se recolectaron pulmones ptc-1 (dll) lacZ ancianos E12.5 y los embriones transgénicos se identificaron por detección de lacZ usando las colas. Se ensamblaron los explantes en filtros de policarbonato de 1 µ?? (Costar) colocados en la parte superior de rejillas plásticas (cámara de incrustación de histología) y se colocaron en placas de cultivo de tejido de 12 cavidades, normales, rellenas con medio de cultivo de explantes de pulmón (basado en DMEM, aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de ratón) durante 48 horas, se fijaron en fijador lacZ, se enjuagaron y se tiñeron para lacZ 0/N a 37°C. Los resultados se representan en la Figura 44. En el panel de control a la izquierda, la expresión de lacZ se puede observar en el mesenquimo inmediatamente adyacente a las puntas de ramificación distantes, un patrón reflexivo de la expresión patched endógena. El tratamiento con 5 µ de agonista B conduce a expresión significativamente incrementada del gen indicador y expansión en dominio de expresión del gen, indicativo del aumento en concentración de la ruta de hedgehog. El panel más a la derecha muestra los resultados del tratamiento con 5 q/ L de proteina Hh. Ensayo de ramificación de riñon Se recolectaron pulmones ptc-1 (dll) lacZ ancianos E13.5 y los embriones transgénicos se identificaron por detección lacZ usando las colas. Se ensamblaron los explantes en filtros de policarbonato de 1 um (Costar) colocados en la parte superior de rejillas plásticas (cámara de incrustación de histología) y se colocaron en placas de cultivo de tejido de 12 cavidades, normales, rellenas "con medio de cultivo de explantes de riñon (basada en DE , aditivos optimizados para el cultivo de pulmones de ratón), durante 48 horas, se fijaron en fijador lacZ, se enjuagaron y se tiñeron para lacZ 0/N a 37°C. Los resultados se representan en la Figura 45. En el panel de control a la izquierda, la expresión de lacZ se puede observar en el mesenquimo inmediatamente adyacente al epitelio uretérico más próximo, un patrón que refleja la expresión patched endógena. El tratamiento con 5 µ? de agonista B conduce a expresión significativamente incrementada de gen indicador y expansión en dominio de expresión del gen, indicativa del aumento en concentración de la ruta de hedgehog. Se señala que la señal permanece localizada al mesenquimo y no se expande en epitelio tubular y uretérico localizado distantemente, indicando que solo el (los) tipo(s) de células de mesenquimales que responden a la señalización de hedgehog en la situación endógena responden al agonista, en tanto que los tipos celulares que usualmente no activan esta ruta están sin afectar por el tratamiento con el agonista. El panel más a la derecha muestra los resultados del tratamiento con 5 g/mL de proteina a Hh. Explantes de piel Piel de crias ptc-1 E17.5 se escindió con un punzón de piel de 2 mm. Estas perforaciones de piel entonces se cultivaron durante 6 dias en medio de control, o medio que incluye ya sea el agonista B o D o proteina Hh, o medio que incluye tanto el agonista como proteina Hh. Los explantes entonces se tiñeron con tinte X-Gal . La Figura 46A muestra los resultados para el agonista B. El tratamiento con el agonista solo muestra mayor tinción que el cultivo con una baja dosis de proteína Hh sola, y el tratamiento con agonista de una baja dosis de proteina Hh muestra tinción similar a aquella de una dosis sustancialmente mayor de proteina Hh. En la Figura 46B se representan los estados análogos para el agonista D.
Actividad en células humanas Las Figuras 47A y B comparan la actividad de los presentes compuestos 0 y R en células indicadoras de ratón (células TM3 con construcción indicadora Gli-Luc, como se describe anteriormente) y en células indicadoras humanas (células de mesenquimo palatal embrionico humano (HEP ) con la construcción Gli-Luc) . La Figura 48 muestra un análisis cuantitativo por PCR del ARN expresado del gen objetivo Gli-1 de hedgehog en células humanas tratadas con el vehículo, proteína Hh y agonista O. La activación de la línea de células indicadoras y el mensaje elevado de Gli-1 en respuesta a los compuestos demuestran que este agonista funciona en células humanas . Actividad neurologica in vivo La activación de la ruta de hedgehog (Hh) se ha mostrado que produce efectos benéficos en modelos de animal de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo enfermedad de Parkinson (PD) . Los presentes agonistas de molécula pequeña de la ruta de Hh exhiben propiedades farmacocinéticas favorables y activan de manera efectiva la ruta de Hh en el cerebro de roedores adultos después de la administración oral, como se demuestra por una inducción estriatal de la expresión de Gli-1. La activación de la ruta de Hh vía estos agonistas ejerce efectos protectores y/o degenerativos en modelos in vivo de la enfermedad de Huntington (lesión por Malonato) , ataque (oclusión de arteria cerebral intermedia de ratones, MCAO) y enfermedad de Parkinson ( l-metil-4-fenil-1, 2, 3, ß-tetrahidropiridina de ratón, MPTP) . Estos compuestos pueden producir la proliferación de células precursoras neurales en las dos regiones cerebrales donde se conoce que la neurogénesis continúa a todo lo largo de la vida, la zona sub-ventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la región sub-granular de la circunvolución dentada hipocampal. Parte 1: Agonista de Hh es Neuroprotector en modelo de enfermedad de Huntington por malonato en rata Los estudios previos demostraron que la administración cerebral directa de proteína de Hh fue neuroprotectora en un modelo de animal de la enfermedad de Huntington (HD) , el modelo de lesión por malonato. El malonato es una toxina mitocondrial y los defectos en el metabolismo de la energía mitocondrial se piensa que juegan un papel en la patología de enfermedades neurodegenerativas tal como HD. Cuando se inyecta malonato en el estriado de la rata, se forma una lesión en esta región cerebral. Los experimentos descritos posteriormente probaron si el antagonista de Hh reducirá el tamaño de la lesión estriatal inducida por malonato. Se administró agonista de Hh directamente a los ventrículos cerebrales de ratas SD machos vía una cánula unida a una bomba Alzet osmótica. Las bombas se rellenaron ya sea con vehículo (2-hiddroxipropil-B-ciclodextrina al 5%, mannitol al 4.35%, DMSO al 0.2%) o agonistas de Hh (U' ' que varia de 1-600 mM) y la bomba liberó el compuesto en los ventrículos a velocidad constante de 1 µ?/hr durante 6 días. Después de 6 días de pre-tratamiento con el compuesto, se inyectó malonato directamente en el estriado cerebral y se removió la bomba de Alzet. Cuatro días después a las ratas se les practicó la eutanasia y los cerebros se dividieron en rebanadas de 2 mm. Las rebanadas se colocaron en una solución al 2% (TTC) que tiñe de rojo al tejido vivo y el infarto estriatal de blanco. El tamaño del infarto (% de infarto) se midió usando un programa de cómputo de análisis de imagen y los datos se analizaron por ANOVA unidireccional seguido por pruebas post-hoc apropiadas (p<0.05). En el experimento mostrado en la Figura 49, se pre-trataron las ratas con ya sea vehículo (n = 8) o U' ' a 200 µ? (n = 8) o 300 µ? (n = 7) . Estos datos muestran que la administración cerebral directa del agonista de Hh a una concentración de 300 µ?? redujo el tamaño del infarto inducido por malonato (F2, 20) =5.12, p=0.0159) en comparación a los animales tratados con vehículo. Estos datos muestran que el agonista de Hh es neuroprotector en el modelo de HD por malonato. Además, este resultado muestra que el agonista de Hh puede imitar los efectos neuroprotectores de la proteína de Hh puesto que la proteina se demostró previamente que reduce el tamaño de la lesión estriatal en este sistema modelo. Parte 2: Agonista de Hh es neuroprotector en el modelo de ataque por MCAO en ratón En este modelo de animal, se inserta una sutura pequeña en la arteria carótida común y se enrolla directamente en el sistema circulatorio del cerebro. La sutura se coloca tal que bloquea el flujo sanguíneo a través de la arteria cerebral intermedia (oclusión de MCA) , que es la fuente principal de sangre al cerebro anterior. Después de un periodo establecido de tiempo, aquí 90 minutos, la sutura se remueve y se restaura (re-perfusión) el flujo al cerebro anterior. El bloqueo temporal de flujo sanguíneo al cerebro anterior da por resultado síntomas de comportamiento y patología cerebral que imita a aquellos vistos en pacientes humanos con ataque. En el cerebro, en el espacio de 24 horas después de la oclusión de MCA, es decir un infarto usando un tinte (TTC) que tiñe de rojo el tejido viviente y de blanco el área infartada. El infarto después de MCAO de 90 minutos comprende usualmente regiones cerebrales tanto corticales como sub-corticales . Tratamiento pre-MCAO con agonista de Hh En este estudio, se trataron ratones durante 3 días (1/día) antes de MCAO con ya sea vehículo (metilcelulosa al 0.5%, T een 80 al 0.2%/NaCl al 0.9%, n=12) o el agonista de Hh X' ' (20 mg/kg, po, n=ll) . Los animales se sometieron entonces a CAO de 90 minutos seguido por reperfusión. Aproximadamente 24 horas después del inicio de la oclusión (23.5 horas de reperfusión) los ratones se sometieron a eutanasia y el cerebro se seccionó en rebanadas de 2 rnm. Las rebanadas cerebrales se tiñeron con TTC para mostrar el área infartada del cerebro. El área infartada/cerebro anterior total (% de infarto) se analizó por medición y se analizó de forma estadística. La Figura 50 muestra que el tamaño total de infarto se redujo de forma dramática en los ratones pre-tratados con el agonista de Hh en comparación a los controles tratados con vehículo (p = 0.057) . La Figura 51 muestra el porcentaje del infarto que estaba en la corteza y el porcentaje que fue sub-cortical (incluyendo estriado, tálamo e hipocampo) Estos datos muestran una reducción marcada en el tamaño de infarto cortical (p = 0.052) . Por lo tanto, el pre-tratamiento con el agonista de Hh fue neuroprotector en este modelo de ataque en animal. Tratamiento post- CAO con agonista de Hh Ratones machos (7-8 semanas de edad) se sometieron a MCAO de 90 minutos seguido por reperfusión. Los animales se trataron con ya sea vehículo (n=ll) o el agonista de Hh X" (20 mg/kg, po, n=12) al comienzo de la reperfusión (90 minutos después de la oclusión) . Veinticuatro horas después del comienzo de la MCAO los ratones se sometieron a eutanasia, el cerebro se dividió en rebanadas de 2 mm y las rebanadas se tiñeron con TTC para el análisis del tamaño del infarto. La Figura 52 muestra que el tratamiento post- CAO con agonista de Hh disminuyó de manera significativa el tamaño del infarto en ratones (p < 0.05) . De manera similar, la Figura 53 muestra que el tratamiento con el agonista pos-MCAO redujo dramáticamente el tamaño de lesión tanto cortical como sub-cortical . Tomados conjuntamente estos datos muestran que la administración oral de agonista de Hh es neuroprotectora y neuro-restauradora en el modelo de ataque por MCAO en ratones . Parte 3: Tratamiento oral con agonistas de Hh es eficaz en el modelo de enfermedad de Parkinson por MPTP en ratón Los estudios previos demostraron que la proteína de SHh es eficaz en los modelos de animales de PD. La l-metil-4-fenil-1,2,3, 6-tetrahidropiridina, MPTP, es una neurotoxina dopaminérgica y las inyecciones sistémicas de este compuesto en ratones provocan una reducción en los niveles de dopamina similar a aquella vista en los pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) . Los experimentos descritos posteriormente se diseñaron para probar si la administración de agonistas de Hh a ratones reducirá la pérdida de dopamina y tirosina-hidroxilasa vista con el tratamiento de MPTP.
Pretratamiento con agonista de Hh atenúa daño provocado por lesión con MPTP Los datos mostrados en la Figura 54 son de un experimento en el cual a los ratones se les administró oralmente agonista de Hh, X'' (0.3, 1 3, y 10 mg/kg, po) durante 3 días antes del tratamiento con MPTP. Siete días después del tratamiento con MPTP, los ratones se sometieron a eutanasia y los niveles de dopamina (DA) y tirosina-hidroxilasa (TH) se midieron en el estriado. La Figura 54 muestra que el pretratamiento con el agonista de Hh atenúa de manera significativa (aproximadamente por debajo de 260%) el daño a la ruta micro estriatal, como se determina por DA estriatal (Figura 54) y la actividad de TH, en comparación a ratones tratados con vehículo siete días después de la lesión. Tratamiento post-MPTP con agonista de Hh es eficaz Los datos mostrados en la Figura 55 son de un experimento en el cual el tratamiento con agonista de Hh inició 3 días después de MPTP. Los niveles de DA estriatal (Figura 55) y de la actividad de TH son significativamente mayores (aproximadamente más de 250%) en comparación a ratones tratados con vehículo cuando el tratamiento con el agonista se inició tres días después de la lesión con MPTP. Estos hallazgos demuestran claramente que la activación de la ruta de Hh por agonistas de Hh de molécula pequeña ejerce efectos tanto protectores como restaurativos en la ruta nigrostriatal . De forma colectiva, estos datos tienen duplicaciones importantes con respecto al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la enfermedad de Parkinson. Parte 4 : Tratamiento con agonista de Hh incrementa la proliferación de células precursoras neurales en roedores adultos En el cerebro de adulto, se conoce que la generación de nuevas neuronas continúa en dos regiones cerebrales, la zona subventricular de los ventrículos laterales (SVZ) y la zona sub-granular (SG) de la circunvolución dentada hipocampal. Se conoce que la proteína de Shh induce la proliferación de células precursoras en varios sistemas in vitro, incluyendo neuronas granulares cerebelares. Los experimentos descritos posteriormente probaron si el tratamiento con agonistas de Hh afectará la proliferación de células precursoras neurales endógenas en cerebro de roedores adultos . Administración cerebral directa de agonista de Hh a ratas adultas incrementó la proliferación de células precursoras de SVZ Se administró el agonista de Hh directamente a los ventrículos cerebrales de ratas SD machos vía una cánula unida a una bomba Alzet osmótica. Las bombas se rellenan con ya sea vehículo (2-hidroxipropil-B-ciclodextrina al 5%, mannitol al 4.35%, DMSO al 0.2%) o agonista de Hh (U" que varía desde 10-600 µ?) y la bomba liberó compuesto en los ventrículos a velocidad constante de 0.5 µ?/hr durante 6 días. Después de 6 días de pre-tratamiento con el compuesto, los animales se inyectaron con bromo de desoxiuridina (BrdU, 50 mg/kg, ip) para marcar las células en división. Dos horas después del tratamiento con BrdU, las ratas se sometieron a eutanasia y se impregnó con fijador. Se recolectaron los cerebros y se procesaron para la inmunohistoquímica de BrdU. El número de células inmunorreactivas a BrdU- (BrdU-IR) se contó entonces en el SVZ en ambos lados del cerebro con (ipsilateral) y sin (contralateral) la cánula. La Figura 56 muestra datos de un experimento en el cual se trataron animales con ya sea vehículo (n=3) o agonista de Hh (200 µ?, n=3) . El número de células de BrdU-IR se incrementó dramáticamente en ambos lados del cerebro después de 6 días del tratamiento con agonista (* p<0.05). Estos datos demuestran que la administración cerebral directa de agonista de Hh incrementa la proliferación de células precursoras endógenas en el cerebro de la rata adulta. Administración oral de agonista de Hh incrementa proliferación de células precursoras neurales en ratón adulto Para probar si la administración oral del agonista de Hh afectará la proliferación de células precursoras, se dosificaron diariamente ratones (una vez o dos veces/día, po) con ya sea vehículo o el agonista de Hh X'' durante 1-7 días.
En el día apropiado, se inyectaron los ratones con BrdU (ip) y 2 horas después se sometieron a eutanasia, se impregnaron con fijador y los cerebros se procesaron para la inmunohistoquimica de Brdü. El número de células de BrdU-IR se contó tanto en SVZ como en la zona subgranular de la circunvolución dentada hipocampal (SG) . Los datos mostrados en las Figuras 57 y 58 son de un estudio en el cual los ratones se dosificaron oralmente durante 7 días (BID) con ya sea vehículo (n=4) o agonista de Hh, X" (10 mg/kg, n=3 o 25 mg/kg, n=3) . El día después de la dosis final, los ratones se inyectaron con Brdü y 2 horas más tarde los cerebros se recolectaron, se procesaron y analizaron como se describe anteriormente. La Figura 57 muestra que el tratamiento oral con agonista de Hh durante 7 días incrementó el número de células marcadas con BrdU en la SVZ en comparación a los controles tratados con vehículo (*p<0.05). Los datos en la Figura 58 muestran que la administración oral de agonista de Hh también incrementó el número de células en proliferación que en el SG de la circunvolución dentada. Estos datos muestran que la dosificación oral con agonista de Hh incrementa la proliferación en células precursoras neurales en ambas regiones del cerebro donde se conoce que la neurogénesis continúa a todo lo largo de la vida. Este efecto en la proliferación de células madre puede ser un mecanismo por el cual los agonistas de Hh son neuroprotectores/neuroregeneradores en varios modelos de enfermedad y/o lesión neural . Parte 5: Fomento en concentración de tejidos sensibles a Hh por agonistas oralmente administrados en animales adultos El aumento en concentración del factor de trascripción qlL-1 sensible a Hh se usó como un marcador para demostrar la eficacia biológica de los agonistas de Hh oralmente distribuidos in vivo. Los compuestos seleccionados representativos de la invención se administraron oralmente en animales adultos como dosis individuales, con los animales sacrificados y el tejido recolectado en 24 horas más tarde. Se midió la expresión de Gli-1 usando un ensayo de PCR en tiempo real, cuantitativo, estándar con GapDH como el gen de referencia. Se demostró que Gli-1 se 'aumenta en concentración por el agonista en el cerebro, médula espinal, nervio periférico, corazón y pulmón. Combinado con los datos de los modelos terapéuticos del CNS y enfermedad periférica, estos resultados demuestran que los tejidos sensibles a la ruta de Hh responden de una manera esperada a agonistas oralmente distribuidos para producir efectos biológicos y terapéuticos significativos. Parte 6: Tratamiento de neuropatía diabética en modelos de rata diabética por estreptozotocina (STZ) En el modelo de neuropatía diabética en rata por STZ, se mostró que la proteína SHh-Ig normaliza tanto la velocidad de conducción de medios sensoriales como motores, un punto terminal de ensayo clínico estándar (Figura 59) . Resultados similares también se mostraron para el agonista D oralmente administrado para NCV motor (Figura 60) . Además, el flujo sanguíneo a los nervios dañados se .mejoró como se mide por formación de imágenes por reperfusión Doppler de láser de vasa nervorum ciático (Figura 61) y formación de imágenes fluorescentes de lectina BS-1 de vasa nervorum ciático (Figura 62) . Además, tanto SHh-Ig como el agonista D dieron por resultado niveles incrementados de factor de crecimiento de nervios ' (NGF) en el nervio ciático (Figura 63), que se considera una indicación de curación mejorada de nervios Se realizaron estudios para valorar si los factores implicados en la función y reparación de nervios se aumentaron en concentración después del tratamiento de SHh. Los fibroblastos derivados del perineurio de nervios se cultivaron ±n vitro en la presencia de la proteína de SHh. Los fibroblastos tratados demostraron aumento en la concentración de BDNF e IGF-1 (Figura 64), que se piensa que ayudan a mediar el crecimiento y reparación de nervios así como VEGF (Figura 65) y angiopoyetina II (Figuras 66) que son factores de crecimiento angiogénicos que median la reparación y crecimiento de los vasos sanguíneos . También se ha mostrado que VEGF tiene efectos tróficos directos en nervios cultivados. Tomados conjuntamente, estos datos demuestran que la activación de la ruta de Hh con SHh o agonista conduce a aumento en concentración del número de factores de crecimiento claves para tejido de nervio y da por resultado reparación de nervios. Además, estos resultados demuestran que el tratamiento con proteina de SHh o agonista tiene utilidad terapéutica potencialmente amplia en enfermedades vasculares para promover el crecimiento de vasos sanguíneos y flujo sanguíneo mejorado. Métodos : Inducción, monitorizacion y mantenimiento de diabetes Se indujo diabetes en ratas Wistar machos (Charles River, RU o Harían, San Diego, EÜA) con una inyección intraperitoneal (55 mg/kg) de estreptozotocina (STZ; Sigma) dada después de ayuno durante la noche. El fármaco se disolvió recientemente en solución salina estéril inmediatamente antes de la inyección. Tres dias más tarde, se midió la glucosa sanguínea de la vena de la cola por un fotómetro de reflectancia operado con tira y cualquier rata tratada con STZ con glucosa <15 mmol/1 se removió del estudio. Las ratas se alojaron por grupos con acceso libre a alimento y agua en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Al final de cada estudio, se recolectaron muestras sanguíneas de todas las ratas, se extrajo plasma y se midieron los niveles plásticos de glucosa por ensayo espectrofotométrico usando un equipo comercial (Sigma, San Luis, MO) .
Tratamientos con fármaco Para los ensayos in vitro, la proteina de SHh usada ya sea estaba sin modificar (SHh) o se modificó al reemplazar la cisteina N-terminal con 2 moléculas de isoleucina (II-SHh) (F.R. Taylor et al., Enhanced potency of human sonic hedgehog by hydrophobic modification . 2001. Bicchemistry 40:4359-4371) . Para estudios in vivo, la SHh modificada se fusionó adicionalmente con IgGI (SHh-IgG) . La SHh-IgG se expresó en Pichia pastorus y se purificó usando cromatografía de SP sefarosa, proteina A-sefarosa y CM poros. La proteína de fusión intacta se mezcló, se filtró y dializó en 2X PBS para almacenamiento. Se prepararon alícuotas diarias al inicio de cada estudio, se codificaron de modo que los experimentos estuvieron sin percibir el grupo de tratamiento, y se almacenaron a -70°C. Se congelaron los productos inyectables a temperatura ambiente, inmediatamente antes del uso y se diluyeron con agua para lograr una concentración final de vehículo de IX PBS. A las ratas se les dio SHh-IgG dos veces por semana (lunes, miércoles, viernes) a dosis de 0.3, 1.0 o 3.0 mg/kg s.c. a la nuca del cuello. Todos los animales que no recibieron SHh-IgG se inyectaron con vehículo. Se iniciaron los tratamientos después de 4-8 semanas de diabetes y se mantuvieron durante 4 semanas adicionales de modo que la duración total de la diabetes fue de 8-12 semanas, dependiendo del estudio particular.
Mediciones de velocidad de conducción de nervios Se anestesiaron las ratas con ya sea halotano o isoflurano antes de valorar las velocidades de conducción de nervios (NCV) . Se midió la velocidad de conducción de nervios motores (MNCV) de las latencias de las sondas del compuesto del electromiograma en la extremidad posterior, y se midió la velocidad de conducción de nervios sensoriales (SNCV) de las latencias de reflexión H en el mismo sistema. Los estudios preliminares que comprenden trans-sección selectiva de las raices dorsales pero no ventrales establecieron la validez de las presentes mediciones de ondas H (APM, datos no publicado) . Se realizó la estimulación del medio en la muesca ciática y el tendón de Aquiles y se registraron los electromiogramas provocados de los músculos interoseus del pie. La temperatura del nervio del muslo intermedio se mantuvo a 36 + 0.5°C a todo lo largo del procedimiento. Formación de imágenes de perfusión Doppler de láser del vasa nervorum ciático El procedimiento se realizó como se describe por P. Schratzberger et al. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. 2001. J. Clin. Invest. 107(9): 1083-92. Formación de imágenes fluorescentes por lectina BS-1 de vasa nervorum ciático El procedimiento que usa lectina BS-1 se realizó como se describe por P. Schratzberger et al. Reversal of experimental diabetic neuropathy by VEGF gene transfer. 2001. J. Clinn. Invest. 107(9): 1083-92. Ensayos de proteínas de factor de crecimiento de nervios (NGF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) Se midió el NGF en extractos de segmentos del nervio ciático por ELISA como se describe por P. Fernyhough et al. El factor de crecimiento de nervios, recombinante, humano, reemplaza el soporte neurotrórfico deficiente en la rata diabética. 1995. Eur. J. Neurosci. 7:1107-1110. Se midió el VEGF por un ensayo estándar de ELISA, ensayos de VEGF, de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , ARNm de factor -1 de crecimiento tipo insulina (IGF-1). Los 3 factores de crecimiento se midieron por la tecnología de PCR en tiempo real, cuantitativa, estándar, usando GapDH como el gen de referencia. Preparación de Compuestos de Ejemplo de la Presente Invención a. Esquemas de síntesis ilustrativos Los esquemas de síntesis de ejemplo para generar antagonistas de hedgehog útiles en los métodos y composiciones de la presente invención se muestran en las Figuras 1-31. Las condiciones de reacción en los esquemas ilustrados de la Figura 1-31 son como sigue: 1) RiCH2CN, NaNH2, tolueno (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242) 2) H2S0 , H20, reflujo (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242) 3) EtOH, refluj (Arzneim-Forsch, 1990, 40, 11, 1242) 4) NaOH, EtOH, reflujo 5) (Boc)20, 2M NaOH, THF 6) LiHDMS, RiX, THF (Solicitud de patente de Merck # WO 96/06609) 7) Pd-C, H2, MeOH 8) t-BuONO, CuBr, HBr, H20 (J. Org. Chem. 1977, 42, 2426) 9) ArB(OH)2, Pd(PPh3)4, Dioxano (J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223) 10) R12 (H) C=CR13Ri4, Pd(OAc)2, Et3N, DMF (Org. React. 1982, 27, 345)' 11) Tf20, THF (J. Ara. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486) 12) ArSnBu3, Pd(PPh3) , Dioxano (J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5478-5486) 13) KMn04, Py, H20 (J. Med. Chem. 1996, 39, 217-223) 14) NaORi, THF 15) NaSRa, THF 16) HNR1R13, THF 17) HONO, NaBF4 (Adv. Fluorine Chem. 1965, 4, 1-30) 18) Pd(OAc)2, NaH, DPPF, PhCH3, RaOH (J. Org. Chem. 1997, 62, 5413-5418) 19) i. RiX, Et3N, CH2C12, ii . R13X 20) SOCl2, cat DMF 21) CH2N2, Et20 22) Ag20, Na2C03, Na2S203, H20 (Tetrahedron Lett. 1979, 2667) 23) Ag02CPh, Et3N, MeOH (Org. Syn., 1970, 50, 77; J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 5432) 24) LiOH, THF-MeOH 25) (EtO)2P(0)CH2C02R, BuLi, THF 26) Me02CCH (Br) =P (Ph) 3, benceno 27) KOH o KOtBu 28) Base, X(CH2)nC02R 29) DPPA, Et3N, tolueno (Synthesis 1985, 220) 30) HONO, H20 31) S02, CuCl, HC1, H20 (Synthesis 1969, 1-10, 6) 32) La esson's reagent, tolueno (Tetrahedron Asym. 1996, 7, 12, 3553) 33) R2M, solvente 34) 30% H202, glacial CH3C02H (Helv. Chim. Acta. 1968, 349, 323) ) trifósgeno, CH2C12 (Tetrahedron Lett. , 1996, 37, 8589) 36) i. (EtO)2P(0)CHLiS02Oi-Pr, THF, ii . Nal 37) Ph3PCH3I, NaCH2S (0)CH3, DMSO (Synthesis 1987, 498) 38) Br2, CHC13 u otro solvente (Synthesis 1987, 498) 39) BuLi, Bu3SnCl 40) C1S020TMS, CCI4 (Chem. Bex. 1995, 128, 575-580) 41 MeOH-HCl, reflujo 42 LAH, Et20 o LiBH4, EtOH o BH3-THF (Tetrahedron Lett . , 1996, 37, 8589) 43 MsCl, Et3N, CH2C12 (Tetrahedron Left. , 1996, 37, 8589) 44 Na2S03, H20 (Tetrahedron Lett. , 1996, 37, 8589) 45 R2R4NH, Et3N, CH2C12 46 R2M, solvente 47 CH3NH(OCH3), EDC, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF (Tetrahedron Lett, 1981, 22, 3815) 48 MeLi, THF 49 mCPBA, CH2C12 0) HONO, Cu20, Cu(N03)2, H20 (J. Org. Chem. 1977, 42, 2053) RiM, solvente HONO, NaS(S)COEt, H20 (Org. Synth. 1947, 27, 81) HSR2 o HSR4, C¾C12 i-BuOC(0)Cl, Et3N, NH3, THF R2R4NH, CH2C12, NaBH(OAc)3 R2R4NH, MeOH/CH3C02H, NaBH3CN R2OH, EDC, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF R2OH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF R2R4NH, EDC, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF R2R4NH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF R2R4NCO, solvente R2OC(0)Cl, Et3N, solvente R2C02Hr EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF R2X, Et3N, solvente (CH3S)2C=N(CN) , DMF, EtOH (J. Med. Chem. 1994, 37, 57-66) R2S02C1, Et3N, CH2C12 R2- o R3- o R4CHO, McOH/CH3C02H, NaBH3CN (Synthesis 1975,135-146) Boc(Tr)-D o L-CysOH, HBTU, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF Boc(Tr)-D o L-CysH, NaBH3CN, MeOH/CH3C02H (Synthesis 1975, 135-146) 71) S-Tr-N-Boc cisteinal, C1CH2CH2C1 o THF, NaBH(0Ac)3 (J. Org. Chem. 1996, 61, 3849-3862) TFA, CH2C12, Et3SiH o (3:1:1) tioanisol/etanoditiol/DMS TFA, CH2C12 DPPA, Et3N, tolueno, HOCH2CH2SiCH3 (Tetrahedron Lett. 1984, 25, 3515) TBAF, THF Base, TrSH o BnSH Base, R2X o R4X R3NH2 , MeOH/CH3C02H, NaBH3CN N2H4, KOH Pd2(dba)3, P(o-tol)3, RNH2 , NaOtBu, Dioxano, R] H2 (Tetrahedron Lett. 1996, 37, 7181-7184) . Cianamida . Fmoc-Cl, bicarbonato de sodio. BnCOCl, bicarbonato de sodio. AlilOCOCl, piridina. Bromuro de bencilo, base. Cloruro de oxalilo, DMSO. RCONH2 - Carbonildiimidazol, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, DMF, THF, tolueno) . 89) Tiocarbonildiimidazol, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, DMF, THF, tolueno) . 90) Bromuro de cianógeno, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, DMF, THF, tolueno) . 91) RCOC1, Trietilamina 92) RNHNH2, EDC . 93) R02CCOCl, Et3N, DCM. 94) sOH, Piridina (J. Het . Chem., 1980, 607.) 95) Base, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, tolueno, THF) . 96) H2NOR, EDC. 97) RCSNH2. 98) RCOCHBrR, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, DMF, THF, tolueno), (Org. Proc. Prep . Intl., 1992, 24, 127). 99) CH2N2, HC1. (Synthesis, 1993, 197). 100) NH2NHR, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, DMF, THF, tolueno) . 101) RS02C1, DMAP . (Tetrahedron Lett., 1993, 34, 2749). 102) Et3N, RX. (J. Org. Chem., 1990, 55, 6037). 103) NOCI o Cl2 (J. Org. Chem., 1990, 55, 3916). 104) H2NOH, solventes neutrales (por ejemplo., DCM, DMF, THF, tolueno) . 105) RCCR, solventes neutrales (DCM, THF, Tolueno) . 106) RCHCHR, solventes neutrales (DCM, THF, Tolueno) . 107) H2NOH, HC1. 108) Tiocarbonildiimidazol, Si02 o BF3OEt2. (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228) . 109) Tiocarbonildiimidazol, DBU o DBN. (J. Med. Chem., 1996, 39, 5228) . 110 HN02, HC1. 111 ClCH2C02Et (Org. Reactions, 1959, 10,143). 112 Morfolina-enamina (Eur. J. Med. Chem., 1982, 17, 27). 113 RCOCHR ' CN 114 RCOCHR'C02Et 115 Na2S03 116 H2NCHRC02Et 117 Et02CCHRNCO 118 RCNHNH2. 119 RCOC02H, (J. Med. Chem., 1995, 38, 3741). 120 RCHO, KOAc. 121 2-Fluoronitrobenceno . 122 SnCl2, EtOH, DMF. 123 RCHO, NaBH3CN, HOAc . 124 NH3, MeOH. 125 2, 4, 6-Me3PhS02NH2. 126 Et2NH, CH2C12 127 MeOC(0)Cl, Et3N, CH2C12 128 R2 H2 , EDC, HOBT, Et3N, CH2C12 129 DBU, PhCH3 130 BocNHCH (CH2STr)CH2NH2, EDC, HOB , Et3Nr CH2C12 131 R2NHCH2C02Me, HBTU, HOBT, Et3N, CH2C12 132 BocNHCH (CH2STr)CH2OMs, LiHMDS, THF 133) R2NHCH2C02 e, NaBH(OAc)3, C1CH2CH2C1 o THF 134) R2NHCH2CH (OEt) 2, HBTU, HOBT, Et3N, CH2C12 135) NaBH(OAc)3, C1CH2CH2C1 o THF, AcOH. 136) Piperidina, DMF. 137) Pd(Ph3P)4, Bu3SnH. 138) RC02H, EDC, HOBT, Et3N, DCM. 139) RNH2, solventes neutrales. 140) RCHO, NaBH3CN, HOAc. 141) RNCO, solvente. 142) RC02H, EDC o HBTU, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF. 143) RCOC1, Trietilamina 144) RS02C1, Et3N, CH2C12. 145) SnCl2, EtOH, DMF. 146) RNH2, EDC, HOBt, DIEA, CH2C12 O DMF . 147) Dibromoetano, Et3N, CH2C12 148) Cloruro de oxalilo, solventes neutrales. 149) LiOH, THF-MeOH. 150) Carbonildiimidazol, solventes neutrales (por ejemplo DCM, DMF, THF, tolueno) . 151) RNH2, Et3N, CH2C12. 152) Base, RX. 153) DBU, PhCH3 154) DPPA, Et3N, tolueno (Synthesis 1985, 220) 155) SOCl2, cat DMF. 156) ArH, Ácido de Lewis (A1C13, SnCl4, TiCl4) , CH2C12. 157) H2NCHRC02Et, solventes neutrales. 158) BocHNCHRC02H, EDC OR HBTU, HOBt, DIEA, CH2C12 o DMF. 159) TFA, CH202. b. Preparación ilustrativa de subunidades de arilo Se pueden funcionalizar subunidades de arilo usando una amplia variedad de reacciones conocidas por aquellos expertos en la técnica. La química de los anillos aromáticos y heteroaromáticos es rica, y sólo se presenta en la presente un muestreo de las reacciones útiles. Varios ejemplos ilustrativos, particularmente útiles para generar la porción de diarilo de los presentes compuestos, se muestran a continuación. Acoplamiento de Suzuji No. 1: Acoplamiento de Suzuki No. 2: Acoplamiento de Stille No. 2 Acoplamiento de Stille + Acoplamiento de Stille No. 3 c. Preparación ilustrativa de sustratos de acoplamiento Los miembros de las clases generales de sustratos de acoplamiento resumidos anteriormente, aril-estannanos , ácidos aril-borónicos , triflatos de arilo y haluros de arilo, están disponibles de los heterociclos de origen. En general, las transformaciones requeridas para preparar un sustrato de acoplamiento son confiables y tratables para la puesta en escala. Se muestran a continuación ejemplos ilustrativos. Preparación de Yoduro de arilo: Preparación de Aril-Estannano Preparación de Triflato de Arilo Preparación de ácido Aril-Borónico Síntesis en fase sólida de presentes compuestos General : Protocolo de Lavado Método 1: agua (3x) , acetona (2), ?,?,-dimetilformamida (3x) , agua (2x) , cetona (lx) , N,N-dimetilformamida (3x) , agua (2x) , acetona (3x) , metanol (3x) , acetona (3x) y metanol (3x); Método 2: diclorometano, hexano, N,N-dimetilformamid , diclorometano, hexano, diclorometano y hexano Método 3: agua, N, N-dimetilformamida, agua, solución acuosa hidróxido de sodio 1.0 M, agua, N-N-dimetilformamida, agua, solución acuosa de hidróxido de sodio 1.0, agua, N, -dimetilformamida, diclorometano, metanol, diclorometano y metanol. Método 4: N, -dimetilformamida, diclorometano, N,N-dimetilformamida, diclorometano, metanol, diclorometano, Metanol (2x) , y éter (2x) .
Esquema de Reacción General: Paso A.- Preparación de (Nitrofen-4 ' -iloxicarboxi) benz-4-iloximetil-poliestireno- (poliestireno de carbonato PNP de Wang) Hidroxibenz-4-iloximetil-poliestireno (resina de Wang) Se adicionó lentamente metóxido de sodio (233 g, 4.31 mol) a una mezcla agitada de clorometil-poliestireno (2.4 kg, 3.6 mol carga funcionalizada) y alcohol 4-hidroxibencílico (581 g, 4.68 mol) en N, -dimetilacetamida (10 L) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Después de la dilución con N, N-dimetilacetamida (13 L) , la mezcla se calentó a 50°C durante 5 horas y luego se filtró vía cánula a través de una malla de P-ETTE (70 µ??). El producto crudo se lavó en forma extensiva usando la secuencia del método 1, luego se secó bajo vacío a 60°C para dar 2630 g de la resina del título. Nitrofen- ' -iloxicarboxi) -4-iloximetil-poliestireno- (poliestireno de carbonato de PNP de Wang) Se adicionó gota a gota 4-metilmorfolina (660 mL, 6.0 mol) durante 2 horas a una mezcla agitada de hidroxibenz-4-iloximetil-poliestireno (2000 g, 2.5 mol de carga f ncionalizada) y cloroformiato de 4-nitrofenol (1209 g, 6.0 mol) en diclorometano (22 L) a (0°C bajo nitrógeno). La mezcla se calentó gradualmente a temperatura ambiente, se agitó durante la noche y se filtró vía cánula a través de una malla de P-ETFE (70 um) . La resina cruda se lavó extensivamente usando la secuencia del método 2, luego se secó bajo vacio a temperatura ambiente para dar 2728 g de una mezcla de la resina de titulo y clorhidrato de 4-metilmorfolina . Paso B.- La preparación de diaminas unidas a resina de Wang Método general (para piperazina, homopiperazina y trans-1,4-diaminociclohexano) : Se hinchó (nitrofen-4 ' -iloxicarboxi ) benc-4-iloximetil-poliestireno crudo (1002.5 g, aproximadamente 0.9 mol de carga funcionalizada) durante 15 minutos en una mezcla al 50% v/v de diclorometano anhidro y N, -dimetilformamida (9 L) bajo nitrógeno. Se adicionaron N, -diisopropilamina (626 mL, 5 mol equivalentes) y la diamina apropiada (5 mol equivalente) y la mezcla se agitó vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de una malla de P-ETFE (70 µp?) , se lavó extensivamente usando la secuencia del método 3 y se secó bajo vacio a 60 °C para dar la diamina unida a resinas. Etilendiamina unida a resina de Wang Se hinchó (nitrofen- ' -ilosicarboxi) benc-4-iloximetil-poliestireno crudo (1002.5 g, aproximadamente 0.9 mol de carga funcionalizada) durante 15 minutos en diclorometano (7 L) bajo nitrógeno se trató con (etilendiamina (181 mL, 2.7 mol). La suspensión amarilla espesa resultante se diluyó con diclorometano (2 L) y se agitó de forma vigorosa durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de una malla de P-PETFE (70 pm) , se lavó extensivamente usando la secuencia del método 3 y se secó bajo vacio a 60°C para dar la diamina unida a resina del titulo. m-Xilileno-diamina unida a resina de ang Se hinchó (nitrofen-4 ' -ilosicarboxi) benc-4-iloximetil-poliestireno crudo (1002.5 g, aproximadamente 0.9 mol de carga funcionalizada) en tetrahidrofurano (7 L) durante 15 minutos bajo nitrógeno y se trató con una solución de m-xililendiamina (828 mL, 6.27 mol en tetrahidrofurano (1 L) . La suspensión amarilla espesa resultante se diluyó con diclorometano (2 L) y se agitó vigorosamente durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de una malla de P-ETFE (70 pm) , se lavó extensivamente usando la secuencia del método 3 y se secó bajo vacio a 60°C para dar la diamina unida a resina. Paso C: Preparación del bloque de construcción usando un procedimiento de acoplamiento de Suzuki Una suspensión del bromuro de arilo apropiado (1 equivalente) y carbonato de potasio (2.2 equivalentes) en tolueno (13 volúmenes) se agitó y se desgasificó a temperatura ambiente. Se adicionó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) (0.01 equivalente) y el recipiente de reacción se evacuó y se purgó con nitrógeno (tres veces) . Después de 15 minutos, se adicionó vía cánula una solución desgasificada de ácido 2-metoxi-5-formilfenilborónico (1.2 equivalentes) en etanol (6.3 volúmenes), entonces la mezcla se calentó bajo reflujo y se agitó durante la noche bajo nitrógeno. Después del enfriamiento, el sólido se filtró de las soluciones y se lavó completamente con tolueno. El filtrado se evaporó a sequedad bajo presión reducida para dar el producto crudo. Esto se trituró con eterdietilico (5 volúmenes) y la suspensión espesa resultante se filtró, se lavó con éter dietilico y se secó bajo vacío. El aldehido de diarilo se obtuvo como un polvo amarillo. Paso D: Carga de bloque de construcción en diamina de Wang Alquilación reductiva La resina apropiada (1 equivalente, aproximadamente 0.75 mmol de carga funcionalizada) se hinchó en una mezcla de tetrahidrofurano, trimetilortoformiato y diclorometano (1:1:1, v/v/v, 10 mL) durante 15 minutos, luego se agitó suavemente y se trató con el aldehido apropiado (2 equivalentes) . Después de la agitación suave durante la noche a temperatura ambiente, la resina se filtró, se lavó completamente con tetrahidrofurano y se secó bajo vacío a 40°C. La resina seca entonces se hinchó en tetrahidrofurano durante 15 minutos y se trató con ácido acético (0.12 equivalente) y triacetoxiborohidruro de sodio (5 equivalentes) . La suspensión de resina se agitó suavemente durante la noche a temperatura ambiente, luego se filtró, se lavó extensivamente usando la secuencia del método 4 y se secó bajo vacío a 60°C. Remate con cloruro ácido La resina apropiada (1 equivalente) se hinchó en diclorometano (10 volúmenes) durante 10 minutos y se trató con el cloruro de ácido apropiado (3 equivalente) y N,N-diisopropiletilamina (3 equivalentes) . La suspensión de resina se agitó suavemente durante la noche a temperatura ambiente, se filtró y se lavó extensivamente usando la secuencia del método 4 y se secó bajo vacío a 40°C. Síntesis de fase de solución de los presentes compuestos El siguiente esquema de reacción de ejemplo ilustra una ruta a través de la cual se pueden preparar los agonistas de hedgehog de la presente invención. Las variaciones en esta ruta de ejemplo se comprenderán fácilmente y se ejecutarán por aquellos expertos en la técnica, permitiendo la preparación de una amplia variedad de compuestos que caen dentro de las fórmulas generales descritas. Los números de compuesto usados en este esquema de reacción son consistentes con los procedimientos posteriores, y son independientes de los números de compuesto usados en otro lado de la solicitud, tal como las figuras.
Síntesis de clorhidrato del ácido 3-cloro-benzo [b] tiofeno-2-carboxilico, (4' -ciano-6-metoxi-bifenil-3-ilmetil ) - (4-metilaminociclohexil) -amida Ester ter-butílico del ácido (4-amino-ciclohexil) -carbámico (1) Se adicionó lentamente bajo nitrógeno durante 3 horas una solución de di-t-butil-dicarbonato (12.0 g, 54.7 mmol) y tetrahidrofurano (250 mL) a una suspensión de 1,4-diaminociclohexano (50.0 g, 0.44 mol) en tetrahidrofurano (250 mL) en tanto que se mantiene la temperatura por debajo de 10°C. La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó de manera subsiguiente durante 16 horas, luego se filtró. El filtrado se concentró in vacuo para dar un residuo. Se adicionó agua (500 mL) al residuo, seguido por agitación durante aproximadamente 15 minutos, después de lo cual la mezcla se filtró y la capa acuosa se extrajo con diclorometano (3 x 200 mL) . Los extractos orgánicos se combinaron y se concentraron para dar un residuo que se disolvió en éter t-butilmetílico (350 mL) y se lavó con agua (3 x 50 mL) . El éter ter-butilmetilico se removió in vacuo para dar el compuesto del titulo 1 (8.1 g, 69%) como un sólido d? (360 MHz: CDC13) 1.06-1.24 (m, 4H) , 1.43 (s, 9H) , 1.83 (d, 2H), 1.98 (d, 2H) , 2.56-2.66 (m, 1H) , 3.30-3.35 (m, 1H) , y .31-4.38 (m, 1H) . N-metil-ciclohexano-1, 4-diamina (2) Se adicionó lentamente amina 1 (15.0 g, 0.7 mol) durante 45 minutos a una solución 1N de hidruro de aluminio y litio en THF (450 mL, 0.36 mol) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente, luego se calentó a reflujo durante 5-6 horas bajo nitrógeno. Se adicionó agua (13.2 mL) a la mezcla seguido por hidróxido de sodio acuoso al 15% (13.2 mL) , y agua (39.7 mL) . La mezcla entonces se agitó durante 15-30 minutos. El sólido se filtró completamente y se lavó con éter t-butilmetilico (200 mL) diclorometano (200 mL) y éter t-butilmétilico (200 mL) . Los extractos orgánicos se recolectaron, se secaron (MgS04) y se filtraron. El agente de secado entonces se lavó con diclorometano y los extractos orgánicos se combinaron y se concentraron in vacuo para dar el compuesto del titulo 2 (7.52 g, 84%) como un sólido amarillo pálido: d? (360 MHz: CDC13) 1.04-1.20 (q, 4H) , 1.51 (br s, 3H) , 1.80-1.96 (m, 4H) , 2.25-2.35 (m, 1H) , 2.41 (s, 3H) , 2.61-2.72 (m, 1H) . Ester t-butllico del ácido ( -amino-ciclohexil) -metil-carbámico (3) Se adicionó benzaldehido (12.8 mL, 0.13 mol) en una porción única a una solución de N-metilamina 2 (16.2 g, 0.13 mol) y tolueno (150 mL) bajo nitrógeno. La mezcla resultante se calentó a reflujo usando un aparato de Dean-Stark durante 4 horas. Después de permitir que la mezcla se enfrie a temperatura ambiente, se adicionó en porciones bicarbonato de di-t-butilo (27.5 g, 0.13 mol) y la mezcla se agitó durante 16 horas. La mezcla se concentró in vacuo para dejar una aceite amarillo, al cual se adicionó sulfato ácido de potasio acuoso 1 N (90 mL) seguido por agitación vigorosa hasta que la TLC indicó que la reacción estaba completa (aproximadamente2.5 horas). La mezcla se extrajo con éter (3 x 100 mL) y la capa acuosa se hizo alcalina (pH aproximadamente 12) con hidróxido de sodio acuoso. La capa acuosa entonces se saturó con cloruro de sodio y el producto se extrajo en cloroformo (3 x 40 mL) . Los extractos combinados se concentraron in vacuo para dar el compuesto del titulo 3 (16.3 g, 59%) como un aceite amarillo: d? (360 MHz : CDC13) 1.11-1.34 (mr 5H) , 1.45 (s, 9H) , 1.66 (br, d, 2H) , 1.90 (br, d, 2H), 2.56-2.66 (m, 1H) , 2.71 (s, 3H) , y 3.98 (br, s, 2H) .
Ester ter-butílico del ácido { 4- [ ( 4 ' -ciano-6-metoxi-bi enil- 3-ilmetil) -amino] -ciclohexil } -metil-carbamico (5) Se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 16 horas una solución de amina 3 (5.0g, 21.92 mmol), aldehido 4 (5.19 g, 21.92 mmol) y ortoformiato de trimetilo (50 mi). Entonces se adicionó en porciones triacetoxiborohidruro de sodio (6.5 g, 30.7 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta que se terminó la reacción, como se determina por análisis de LC-MS. Se adicionó agua cuidadosamente y la mezcla se agitó durante 5 minutos, seguida por separación de las capas. La capa de ortoformiato de trimetilo se vertió en sulfato ácido de potasio acuoso 1 N (100 mL) y se agitó durante 15 minutos. El sólido precipitado se filtró, se lavó con agua (50 mL) , éter metílico de tributilo frío (3 x 30 mL) . El precipitado lavado entonces se dispersó en diclorometano (150 mL) al cual se adicionó carbonato ácido de sodio acuoso saturado (50 mL) y el pH se hizo alcalino (pH aproximadamente 10) en tanto que se mantiene una agitación vigorosa. La capa de diclorometano se lavó con agua, y salmuera, y el extracto orgánico se secó (MgS04) y se concentró in vacuo para dar el compuesto del título 5 (6.9 g, 69%) como un sólido completamente blanco: d? (360 MHz: CDC13) 1.18-1.31 (m, 4H) , 1.43 (s, 9H) , 1.68 (d, 2H) , 2.01 (d, 2H) , 2.44-2.56 (m, 1H) , 2.69 (s, 3H) , 3.76 (s, 2H), 3.80 (s, 3H) , 6.92 (d, 1H) , 7.24 (s, 1H) , 7.29 (d, 1H) , 7.61 (d, 2H) y 7.66 (d, 2H) .
Ester ter-butílico del ácido {4- [ (3-cloro-benzo [b] tiofeno-2-carbonil ) - ( 4 ' -ciano-6-metoxi-bifenil-3-ilmetil ) -amino] -ciclohexil } -metil-carbamico (6) Se adicionó N, N-diisopropiletilamina (2.1 mL, 12.1 nnmol) a una solución de amina 5 (m2.2 g, 4.9 mmol) , cloruro de 3-clorobenzo [b] tiofeno-2-carbonilo (1.3 g, 5,86 mmol) y diclorometano anhidro (22 mL) , con agitación bajo argón. Una vez que se ha consumido todo el material de inicio como se monitorea por TLC (aproximadamente 2.5 horas), la mezcla se lavó con agua, carbonato ácido de sodio acuoso saturado, y salmuera. La capa orgánica se secó ( gS0,j) y se concentró in vacuo. El residuo amarillo entonces se purificó por cromatografía en gel de sílice usando hexano/acetato de etilo 3:1 para dar el compuesto del título 6 (2.93 g, 93 %) como un sólido amarillo pálido. Clorhidrato de la (4' ciano-6-metoxi-biefenil-3-ilnietil) - (4-metilamino-ciclohexil ) -amida del ácido 3-clorobenzo [b] tiofeno-2-carboxílico (7 ) Se adicionó ácido clorhídrico concentrado (27.5 mL) a unasolucion del compuesto 6 (11.0 g, 17.1 mmol) y etanol (82.5 mL) . La mezcla se agitó hasta que la reacción estaba completa como se monitoreó por. LC. La mezcla se concentró in vacuo y el diclorometano se adicionó y se concentró nuevamente, esto se repitió hasta que se obtuvo un sólido. El sólido entonces se agitó con éter ter-butil-metílico (30 mL) , se filtró y la capa orgánica se secó (MgS04) y se concentró in vacuo para dar el compuesto 7 del titulo (10.0 g, 99%): d? (360 MHz: CDC13) 1.30-1.50 (m, 2H) , 1.85 (br, s, 4H) , 2.12 (br, d, 2H), 2.48 (s, 3H), 2.91 (br, t, 1H) , 3.81 (s, 3H) , 3.87 (br, s, 1H) , 4.71 (s, 2H), 7.14 (d, 1H) , 7.29 (s, 1H) , 7.40 (d, 1H) , 7.57-7.68 (m, 4H), 7.80-7.90 (m, 3H) , 8.09 (d, 1H) , 8.82 (br, s, 2H) . Síntesis de materiales de inicio seleccionados Síntesis de trans-4- (BOC metilamino) ciclohexilamina Ester n-butílico del ácido trans-4- (aminociclohexil) -carbámico Una solución de n-butilcloroformiato (102 mL, 0.79 mol, 0.5 equivalente) en diclorometano (1.8 L, 10 vol) se adicionó a una solución de 1, 4-trans-diaminociclohexano (180 g, 1.58 mol, 1.0 equivalente) en diclorometano (1.80 L, 10 vol) agitado bajo nitrógeno en tanto que se mantiene la temperatura entre 0 a 5°C (baño de hielo/sal) . La suspensión resultante se agitó durante 60 a 70 minutos adicionales luego se dejó calentar a 5 a 10°C. Se adicionó una solución recién preparada de carbonato de sodio (Na2C03 92.0 g, 0.8 mol, 0.5 eq. En agua 720 mL, 4 vol) y se agitó durante 5 minutos adicionales en tanto que se calienta a temperatura ambiente . Las fases se separaron y la fase acusa se lavó con diclorometano (720 mL, 4 vol) . Las fases de diclorometano se combinaron y se secaron sobre sulfato de sodio (360 g, 2 pesos), se filtró y se concentró a sequedad en un evaporador giratorio a 40°C para dar una mezcla cruda de diamina, bis, y mono-carbamato . El material crudo (164 g, 1 peso) se dispersó en agua (410 mL, 2.5 vol) y se agitó vigorosamente durante 10 a 15 minutos a 20 a 25 °C. El bis-carbamato sólido se removió por filtración y la tarta del filtro se lavó con agua (164 mL, 1 vol) . El filtrado acuoso se extrajo con 3x TBME (3 x 3.28 L, 20 vol) . Las capas de TBME se combinaron y se volvieron a lavar con agua (246 mL, 1.5 vol), se secaron sobre sulfato de sodio (492 g, 3 pesos) , se filtraron y se concentraron en un evaporador giratorio a 35 a 40°C para dar producto de mono-carbamato sólido (87.5 g, 52%). RMN 1H (400 MHz) (CDC13) : 4.47 (1H, bs) ; 3.97 (2H, m; 3.36 (1H, bs) ; 2.57 (1H, m) ; 1.94 (2H, m) ; 1.78 (2H, m) ; 1.51 (2H, m) ; 1.38 (2H, sextet) ; 1.13 (6H, m) , 0.86 (3H, t) . Trans-4- (metilamino) ciclohexilamina El carbamato (102 g) en THF (1 L: 10 vol) se adicionó durante 30 minutos una suspensión de hidruro de aluminio y litio (90.4 g; 5 equivalente) en THF (2 L: 20 vol) enfriado en hielo. Una vez que se terminó la adición, la reacción se calentó a reflujo durante 2 horas (completo por tic) y se dejó enfriar durante la noche. La reacción se enfrió a 0-5°C y se enfrió rápidamente al adicionar agua (90 mi), hidróxido de sodio al 15% (90 mL) y más agua (270 mL) . La suspensión entonces se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora antes del filtrado y lavado de la torta del filtro con TBME (2 x 2 L) . Los solventes se removieron por evaporación y agua residual y n-butanol se removieron por formación de azeótropo con tolueno (2 L) . Rendimiento = 62 g, que contuvo 10.6% en peso de tolueno por R N. Esto es igual a 55.4 g (91%) . Trans-4- (BOC-metilamino) ciclohexilamina La metilamina (55.4 g) y benzaldehido (46 mL; 1.05 equivalente) se disolvieron en tolueno (554 mi; 10 vol) y se calentó a reflujo con un aparato de Dean-Stark durante 6 horas. El volumen calculado de agua (7.5 mL) se removió. Se adicionó a porciones anhídrido de BOC (103.7 g; 1.1 equivalente) a la solución enfriada durante 15 minutos y la reacción se agitó durante aproximadamente 3 horas (mostrada que es completa por RMN) . El solvente se removió para dejar 160 g de un sólido aceitoso (8% en peso de tolueno significa 147.2 g (107%) del producto). El sólido se dispersó en KHS04 1 M (1.47 L; 10 vol). Se usó agua adicional (200 mi) y TBME (100 mi) para dar el material de inicio residual. Después de 4 horas, la reacción se extrajo con TBME (600 mi, luego 3 x 300 mi) . La fase acuosa se hizo básica a pH 13 con hidróxido de sodio 6 M (675 mi) y se extrajo con DCM (2 x 735 mi) . Las capas combinadas de DCM se lavaron con salmuera (2 x 500 mi) antes del secado con a2S04. La solución se filtró y se evaporó para dejar un aceite (69.54 g) que contiene DCM (2.4 % en peso) . Rendimiento = 67.8 g (69%) . Rendimiento total de carbamato = 64% y 16.5% de trans-1, -diaminociclohexano . Síntesis de cloruro de 3-cloro-4 , 7-difluorobenzo [b] tiofeno-2-carbonilo Preparación de 2 , 5-difluorobenzaldehído Una solución de 1 , -difluorobenceno (10 g, 87.6 mmol, 1 peso) en THF (175 mL, 17.5 vol) se agitó bajo nitrógeno y se enfrió a -75 a -78°C. Se adicionó n-butilitio (82 mL de una solución 1.6 M en hexano, 131.4 mmol, 1.5 equivalente) a la mezcla de reacción durante aproximadamente 20 minutos en tanto que se mantiene la temperatura a <-65°C. Después de una hora adicional, se adicionó DMF (10.16 mL, 131.4 mmol, 1.5 equivalente) durante aproximadamente 10 minutos en tanto que se mantiene la temperatura a <-65°C. La mezcla de reacción se enfrió rápidamente después de 10 minutos por la adición de ácido acético (17.5 mL, 1.75 rnL) seguido directamente por agua (440 mL, 36.4 vol) . Esto provocó que la reacción fuera exotérmica a 5°C. El baño en frió entonces se removió, se adicionó TBME (220 mL, 22 vol) y la reacción se agitó durante 5 minutos. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con TBME (2 x 220 mL, 22 vol) . Las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con HC1 0.2 M (220 mL, 22 vol), Na2C03 2 N (220 mL, 22 vol) luego salmuera saturada (220 mL, 22 vol) , se secó sobre sulfato de magnesio (50 g, 5 pesos) y se concentró en un evaporador giratorio para dar el producto crudo (11.07 g) . La purificación por destilación Kugelrohr dio el producto como un aceite incoloro, claro (7.52 g, 60%). Preparación de ácido 2 , 5-difluorocinnámico Se adicionó piperidina (2 mL, 20.2 mmol, 0.168 vol) a una mezcla agitada de 2 , 5-difluorobenzaldehido (12.07 g, 85.0 mmol, 1 peso) y ácido masónico (18.28 g, 175.6 mmol, 1.51 peso) en piridina (50 mL, 4.14 vol) . La mezcla de reacción se calentó bajo nitrógeno y se mantuvo a reflujo (baño en aceite, 100°C) durante 2 horas, se observó fluorescencia durante aproximadamente 90 minutos, inicialmente vigorosa luego disminuyendo. La mezcla de reacción entonces se dejó enfriar a 20 a 25°C y se vertió en ácido clorhídrico a 2 M agitado (310 mL, 25.7 vol) (pH grabado como 1) . El precipitado resultante se envejeció a 20 a 25°C durante 1 hora luego se filtró. La torta del filtró se lavó con agua (2 x 50 mL, 4.1 vol) luego se dejó secar durante 1 hora adicional. El producto sólido se secó al disolverlo en TBME (250 mL, 20.7 vol), separando las fases y la fase de agua se lavó con TBME (100 mL, 8.3 vol) . Las fases de TBME se combinaron, se secaron sobre sulfato de magnesio (25 g, 2 pesos) , se filtraron y se concentraron en evapporador giratorio para dar el producto como un sólido blanco (13.4 g, 85.7%) . Preparación de cloruro de 3-cloro-4 , 7-difluorobenzo [b] -tioifeno-2-carbonilo Se mezclaron ácido 2 , 5-difluorocinnámico (26 g, 0.14 mol) y cloruro de tionilo (36.1 mL; 0.49 mol) en un matraz equipado con un tren de depuración de gas . La adición de piridina (2.85 mL, 35 mmol) provocó mucha emisión de gas. La mezcla de reacción se calentó ( ext = 140°C) durante la noche. Se calentó a reflujo heptano (260 mi; 10 vol) y la mezcla de reacción se adicionó. El matraz de reacción se lavó con heptano caliente (2 x 25 mL) y las soluciones combinadas se enfriaron a 0°C. El precipitado se filtró, se lavó con heptano (2 x 25 mi) y se secó bajo una corriente de nitrógeno. Rendimiento = 17.4 g (46%) . Todas las publicaciones y patentes citadas en la presente se incorporan de este modo como referencia en su totalidad.
Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar usando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades especificas de la invención descrita en la presente. Estos equivalentes se propone que se abarquen por las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (71)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un compuesto representado en la fórmula general (IX) :
  2. Fórmula XI caracterizado porque, como lo permita la valencia y estabilidad, Ar representa un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(O)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 alquiles inferiores; Y está ausente para cada ocurrencia; Z está ausente o representa un anillo de arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o insustituido, o un sustituyente de alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; Cy representa un grupo arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policiclicos , sustituidos o insustituidos; Cy' representa un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, o 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo benzo está sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo y etilo; i representa 0 para todas las ocurrencias, excepto en la secuencia N-Mi-Y-Ar, en donde i representa 1; y k representa 0. 2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Cy incluye al menos un átomo hibridizado de sp3.
  3. 3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque Cy incluye además al menos un átomo de nitrógeno en el anillo, o un sustituyente amino en el anillo.
  4. 4. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Cy incluye o está sustituido con una amina primaria, secundaria o terciaria.
  5. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque Cy es un anillo de ciclohexilo sustituido con una amina primaria o secundaria.
  6. 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la amina es un grupo metilamino .
  7. 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anillo benzo está sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halógeno y metilo.
  8. 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el anillo benzo es un anillo de 1 , 4-difluorobenceno .
  9. 9. Un compuesto representado en la fórmula general (X) : Fórmula X caracterizado porque, como lo permita la valencia estabilidad, Ar representa un anillo de arilo o heteroarilo sustituido o insustituido; X se selecciona a partir de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(C>2) -, -S(0)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 alquilos inferiores; Y está ausente para cada ocurrencia; Z está ausente o representa un anillo de arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o insustituido, o un sustituyente de alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno; R representa, independientemente para cada ocurrencia, H o alquilo inferior sustituido o insustituido; Cy' representa un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, o 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo benzo está sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo y etilo; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido, en donde algunas o todas las ocurrencias de M en Mj forman toda o parte de una estructura cíclica; j representa un número entero de 2 a 7; i representa 0 para todas las ocurrencias, excepto en la secuencia N-Mi-Y-Ar, en donde i representa 1; y k representa 0.
  10. 10. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque j incluye un anillo de cicloalquilo que tiene 5-7 átomos de anillo.
  11. 11. El compuesto de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque NR2 representa NHMe.
  12. 12. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque Cy es un anillo de ciclohexilo sustituido con una amina primaria o secundaria.
  13. 13. El compuesto de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la amina es un grupo metilamino .
  14. 14. El compuesto de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anillo benzo está sustituido con de 1-4 sustituyentes seleccionados de halógeno y metilo.
  15. 15. El compuesto de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el anillo benzo es un anillo de 1, 4-difluorobenceno .
  16. 16. Un compuesto representado por la fórmula general (XI) : Fórmula XI caracterizado porque, conforme lo permita la valencia y estabilidad, Ar representa un anillo de heteroarilo o arilo sustituido o insustituido; X se selecciona a partir de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(C>2)-, -S(0)-, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 alquilos inferiores; Y está ausente para cada ocurrencia; Z está ausente o representa un anillo de arilo, carbociclilo, heterociclilo o heteroarilo sustituido o insustituido, o un sustituyente de alquilo inferior, nitro, ciano, o halógeno; R representa, independientemente para cada ocurrencia, H o alquilo inferior sustituido o insustituido; Cy representa un 3-cloro-benzo (b) tien-2-ilo, 3-fluoro-benzo (b) tien-2-ilo, o 3-metil-benzo (b) tien-2-ilo, en donde el anillo benzo está sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halógeno, nitro, ciano, metilo y etilo; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, o dos tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; Cy representa un grupo arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo, incluyendo policiclicos , sustituidos o insustituidos; i representa 0 para todas las ocurrencias, excepto en la secuencia N-Mj-Y-Ar, donde i representa 1; y k representa 0.
  17. 17. El compuesto de ' conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque Cy es un anillo de ciclohexilo sustituido con una amina primaria ó secundaria.
  18. 18. El compuesto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la amina es un grupo metilamino.
  19. 19. El compuesto de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anillo de benzo está sustituido con de 1 a 4 sustituyentes seleccionados de halógeno y metilo.
  20. 20. El compuesto de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el anillo benzo es un anillo de 1 , 4-difluorobenceno .
  21. 21. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un excipiente estéril de un compuesto de acuerdo a la reivindicación 1.
  22. 22. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un excipiente estéril de un compuesto de acuerdo a la reivindicación 9.
  23. 23. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un excipiente estéril de un compuesto de acuerdo a la reivindicación 16.
  24. 24. Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto de la reivindicación 1.
  25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agonista de hedgehog agoniza la transducción de señales mediada por hedgehog con una ED50 de 1 µ? o menos .
  26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agonista de hedgehog agoniza la transducción de señales mediada por hedgehog con una ED50 DE 1 n o menos .
  27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agonista de hedgehog se administra a un paciente como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.
  28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de regulación de tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de espermatogénesis, regulación de músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de la función hematopoyética, y regulación del crecimiento de piel y pelo.
  29. 29. Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto de la reivindicación 9.
  30. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agonista de hedgehog agoniza la transducción de señales mediada por hedgehog con una ED50 de 1 µ? o menos .
  31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agonista de hedgehog agoniza la transducción de señales mediada por hedgehog con una ED50 DE 1 nM o menos .
  32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agonista de hedgehog se administra a un paciente como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.
  33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de regulación de tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de espermatogénesis, regulación de músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de la función hematopoyética, y regulación del crecimiento de piel y pelo.
  34. 34. Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con un compuesto de la reivindicación 16.
  35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agonista de hedgehog agoniza la transducción de señales mediada por hedgehog con una ED50 de 1 µ? o menos .
  36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agonista de hedgehog agoniza la transducción de señales mediada por hedgehog con una ED50 DE 1 nM o menos .
  37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agonista de hedgehog se administra a un paciente como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.
  38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de regulación de tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de espermatogénesis, regulación de músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de función hematopoyética, y regulación del crecimiento de piel y pelo.
  39. 39. Una preparación farmacéutica, caracterizada porque comprende un excipiente farmacéutico estéril y un compuesto representado en la fórmula general (I) . Fórmula 1 en donde Ar y Ar' representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo, sustituidos o insustituidos ; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R}-, -0-, -S- o -Se-; X se selecciona de -C(=0)-, -C(=S)-, -S(02)-, -S(0)-, -C(=NCN)-, -P (=0) (0R2) -, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de alquilo inferior, alguenilo y alquinilo; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, o dos M tomados con untamente representan eteno o etino sustituido o insustituido; R representa, independientemente para cada ocurrencia, H o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros; Cy y Cy' representan independientemente arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo sustituido o insustituido; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5; y n, individualmente para cada ocurrencia, representa un número entero de 0 a 10.
  40. 40. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque Y está ausente en todas las posiciones.
  41. 41. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido .
  42. 42. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque X se selecciona a partir de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-.
  43. 43. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque Cy incluye al menos un átomo hibridizado de sp3.
  44. 44. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque Cy' es arilo o heteroarilo sustituido o insustituido.
  45. 45. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque Cy incluye o está sustituido por una amina primaria, secundaria o terciaria.
  46. 46. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un excipiente estéril farmacéuticamente aceptable y una molécula orgánica representada en la fórmula general (II) : Fórmula II en donde Ar y Ar' representan independientemente anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-, -0-, -S- o -Se-; X se selecciona a partir de -C(=0)-, -C(=S)-, S(02)-/ -S(0)-, -C(=NCN)-, -P (=0) (0R2) -, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados de grupos de alquilo inferior, alquenilo y alquinilo; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, o dos M tomados conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido, en donde algunas o todas las ocurrencias de M en Mj forman todo o parte de una estructura cíclica; R representa, independientemente para cada ocurrencia, H o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo o alquilo sustituidos o insustituidos, o dos R tomados conjuntamente pueden formar un anillo de 4 a 8 miembros ; Cy' representa arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquxlo sustituido o insustituido; j representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 10; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5; y n, individualmente para cada ocurrencia, representa un número entero de 0 a 10.
  47. 47. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque Y está ausente en todas las posiciones .
  48. 48. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido .
  49. 49. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque X se selecciona a partir de -C(=0)-, -C(=S)-, y -S(02)-.
  50. 50. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo o grupos aralquilo. ·
  51. 51. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido.
  52. 52. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque Cy' es biciclico.
  53. 53. Una preparación farmacéutica caracterizada porque comprende un excipiente estéril farmacéuticamente aceptable y un compuesto representado en la fórmula general (III) : Fórmula III en donde Ar y Ar' representan independientemente anillos arilo o heteroarilo sustituidos o insustituidos; Y, independientemente para cada ocurrencia, está ausente o representa -N(R)-, -O-, -S- o -Se-; X se selecciona a partir de -C(=0)-, ~C(=S)-, -S(02)-, -S(O), -C(=NCN)-, -P (=0) (OR2) -, y un grupo metileno opcionalmente sustituido con 1-2 grupos seleccionados a partir de grupos de alquilo inferior, alquenilo y alquinilo; M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido, o dos M tomadas conjuntamente representan eteno o etino sustituido o insustituido, en donde algunas o todas las ocurrencias de M en Mj forman toda o parte de una estructura cíclica; R representa, independientemente para cada ocurrencia, H o arilo, heterociclilo, heteroarilo, aralquilo, heteroaralquilo, alquinilo, alquenilo o alquilo sustituido o insustituido, o dos R tomados conjuntamente para formar un anillo de 4 a 8 miembros; Cy y Cy' representan independientemente arilo, heterociclilo, heteroarilo o cicloalquilo sustituido o insustituido; i representa, independientemente para cada ocurrencia, un número entero de 0 a 5; y n, individualmente para cada ocurrencia, representan un número entero de 0 a 10.
  54. 54. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque Y está ausente de todas las posiciones.
  55. 55. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque M representa, independientemente para cada ocurrencia, un grupo metileno sustituido o insustituido.
  56. 56. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque X se selecciona a partir de -C(=0)-, -C-(=S)-, y -S(02)-.
  57. 57. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque NR2 representa una amina primaria o una amina secundaria o terciaria sustituida con uno o dos grupos alquilo inferior, grupos arilo o grupos aralquilo .
  58. 58. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque Cy' es un arilo o heteroarilo sustituido o insustituido .
  59. 59. La preparación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada porque Cy' es biciclico.
  60. 60. Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una preparación de la reivindicación 39.
  61. 61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el agonista de hedgehog se administra a un paciente como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.
  62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la aplicación terapéutica cosmética se selecciona de regulación de tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de espermatogénesis, regulación de músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de función hematopoyética, y regulación de crecimiento de piel y pelo.
  63. 63. Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una preparación de la reivindicación 46.
  64. 64. Un método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el agonista de hedgehog se administra a un paciente como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.
  65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de regulación de tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de espermatogénesis, regulación de músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de función hematopoyética, y regulación de crecimiento de piel y pelo.
  66. 66. Un método para modular la proliferación o diferenciación de una célula, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula con una preparación de la reivindicación 53.
  67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque el agonista de hedgehog se administra a un paciente como parte de una aplicación terapéutica o cosmética.
  68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la aplicación terapéutica o cosmética se selecciona de regulación de tejidos neurales, formación y reparación de hueso y cartílago, regulación de espermatogénesis, regulación de músculo liso, regulación de pulmón, hígado y otros órganos que surgen del intestino primitivo, regulación de función hematopoyética, y regulación de crecimiento de piel y pelo.
  69. 69. ün método para tratar o prevenir una condición del sistema nervioso central, caracterizado porque comprende administrar en forma oral a un paciente un compuesto de la reivindicación 1, 9 o 16, o una preparación de la reivindicación 39, 46 o 53.
  70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque la condición es enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, o isquemia.
  71. 71. Un método para regular el crecimiento, diferenciación, o supervivencia de una célula in vitro, que comprende administrar de forma oral a un paciente un compuesto de la reivindicación 1, 9 o 16r o una preparación de la reivindicación 39, 46 o 53.
MXPA04002880A 2001-09-26 2002-09-18 Reguladores de moleculas organicas pequenas de la proliferacion celular. MXPA04002880A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/964,276 US6683192B2 (en) 2000-03-30 2001-09-26 Small organic molecule regulators of cell proliferation
PCT/US2002/029522 WO2003027234A2 (en) 2001-09-26 2002-09-18 Small organic molecule regulators of cell proliferation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA04002880A true MXPA04002880A (es) 2005-06-20

Family

ID=25508346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA04002880A MXPA04002880A (es) 2001-09-26 2002-09-18 Reguladores de moleculas organicas pequenas de la proliferacion celular.

Country Status (19)

Country Link
US (1) US6683192B2 (es)
EP (1) EP1436287A4 (es)
JP (1) JP4563028B2 (es)
KR (2) KR101051535B1 (es)
CN (1) CN1578779B (es)
AU (1) AU2002336580B2 (es)
BR (1) BR0212825A (es)
CA (1) CA2461709A1 (es)
EA (1) EA200400355A1 (es)
GE (1) GEP20063855B (es)
HU (1) HUP0402307A2 (es)
IL (3) IL161104A0 (es)
MX (1) MXPA04002880A (es)
NO (1) NO20041260L (es)
NZ (1) NZ531970A (es)
PL (1) PL371343A1 (es)
UA (1) UA78225C2 (es)
WO (1) WO2003027234A2 (es)
ZA (1) ZA200402322B (es)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7230000B1 (en) 1999-10-27 2007-06-12 Cytokinetics, Incorporated Methods and compositions utilizing quinazolinones
US7671200B2 (en) 1999-10-27 2010-03-02 Cytokinetics, Inc. Quinazolinone KSP inhibitors
US6683108B1 (en) * 2000-03-30 2004-01-27 Curis, Inc. Agonists of hedgehog signaling pathways and uses related thereto
US7354932B2 (en) * 2001-12-21 2008-04-08 Anormed, Inc. Chemokine receptor binding heterocyclic compounds with enhanced efficacy
MXPA04006136A (es) * 2001-12-21 2004-11-01 Anormed Inc Compuestos heterociclicos que se unen a receptor de quimiocina con eficacia incrementada.
US6924376B2 (en) 2002-04-17 2005-08-02 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions and methods
CA2485148A1 (en) 2002-05-09 2003-11-20 Cytokinetics, Inc. Pyrimidinone compounds, compositions and methods
US7361368B2 (en) 2002-06-28 2008-04-22 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Device and method for combining a treatment agent and a gel
US7632679B2 (en) * 2002-07-16 2009-12-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Systems and methods for screening for modulators of neural differentiation
US7390659B2 (en) 2002-07-16 2008-06-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for inducing differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US20040224302A1 (en) * 2002-07-16 2004-11-11 Thomas Jessel Systems and methods for screening for modulators of neural differentiation
FR2842422B1 (fr) * 2002-07-16 2006-06-30 Univ Aix Marseille Ii Compositions destinees au traitement des neuropathies peripheriques, preparation et utilisations
US6949538B2 (en) 2002-07-17 2005-09-27 Cytokinetics, Inc. Compounds, compositions, and methods
US8383158B2 (en) * 2003-04-15 2013-02-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Methods and compositions to treat myocardial conditions
CA2547338A1 (en) * 2003-12-19 2005-07-07 Curis, Inc. Composition and methods for modulating cns activity
PL1789390T3 (pl) 2004-09-02 2012-04-30 Genentech Inc Pirydylowe inhibitory szlaku sygnałowego hedgehog
US20070281040A1 (en) * 2004-09-30 2007-12-06 The University Of Chicago Combination therapy of hedgehog inhibitors, radiation and chemotherapeutic agents
US20060165739A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-27 Mary Kay Inc. Alcohol-free microemulsion composition
US9539410B2 (en) 2005-04-19 2017-01-10 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Methods and compositions for treating post-cardial infarction damage
US20080125745A1 (en) 2005-04-19 2008-05-29 Shubhayu Basu Methods and compositions for treating post-cardial infarction damage
US8828433B2 (en) 2005-04-19 2014-09-09 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Hydrogel bioscaffoldings and biomedical device coatings
US8187621B2 (en) 2005-04-19 2012-05-29 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Methods and compositions for treating post-myocardial infarction damage
US8303972B2 (en) 2005-04-19 2012-11-06 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Hydrogel bioscaffoldings and biomedical device coatings
EP2258359A3 (en) 2005-08-26 2011-04-06 Braincells, Inc. Neurogenesis by muscarinic receptor modulation with sabcomelin
JP2009506069A (ja) 2005-08-26 2009-02-12 ブレインセルス，インコーポレイティド ムスカリン性受容体調節による神経発生
CA2625153A1 (en) 2005-10-21 2007-04-26 Braincells, Inc. Modulation of neurogenesis by pde inhibition
US20070112017A1 (en) 2005-10-31 2007-05-17 Braincells, Inc. Gaba receptor mediated modulation of neurogenesis
US20080058521A1 (en) * 2006-01-26 2008-03-06 Wyeth Processes for the preparation of compounds
TWI401248B (zh) * 2006-02-15 2013-07-11 Dendreon Corp Ｔｒｐ-ｐ８活性的小分子調節劑
WO2007104035A1 (en) * 2006-03-08 2007-09-13 Braincells, Inc. Modulation of neurogenesis by nootropic agents
US20100216734A1 (en) * 2006-03-08 2010-08-26 Braincells, Inc. Modulation of neurogenesis by nootropic agents
EP2377531A2 (en) 2006-05-09 2011-10-19 Braincells, Inc. Neurogenesis by modulating angiotensin
US20100009983A1 (en) * 2006-05-09 2010-01-14 Braincells, Inc. 5 ht receptor mediated neurogenesis
US7678808B2 (en) 2006-05-09 2010-03-16 Braincells, Inc. 5 HT receptor mediated neurogenesis
US9242005B1 (en) 2006-08-21 2016-01-26 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Pro-healing agent formulation compositions, methods and treatments
US20100184806A1 (en) 2006-09-19 2010-07-22 Braincells, Inc. Modulation of neurogenesis by ppar agents
CA2663347A1 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Braincells, Inc. Ppar mediated modulation of neurogenesis
KR101563010B1 (ko) * 2006-10-31 2015-10-26 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈 평활화 폴리펩티드 및 사용 방법
WO2008057468A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-15 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
WO2008057497A2 (en) * 2006-11-02 2008-05-15 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
WO2008057469A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-15 Wyeth Small organic molecule regulators of cell proliferation
US9005672B2 (en) 2006-11-17 2015-04-14 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Methods of modifying myocardial infarction expansion
US20080177389A1 (en) * 2006-12-21 2008-07-24 Rob Gene Parrish Intervertebral disc spacer
WO2009042646A1 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Curis, Inc. Anti-proliferative agents
EA201001203A1 (ru) * 2008-01-29 2011-04-29 Новартис Аг ПРИМЕНЕНИЕ АГОНИСТОВ Hedgehog ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С КОСТНО-МЫШЕЧНОЙ СИСТЕМОЙ НАРУШЕНИЙ
US8969081B2 (en) * 2008-12-10 2015-03-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Caudal motor neuron derived from embryonic stem cells under conditions essentially free of any retinoid
US20100216805A1 (en) 2009-02-25 2010-08-26 Braincells, Inc. Modulation of neurogenesis using d-cycloserine combinations
US9677042B2 (en) 2010-10-08 2017-06-13 Terumo Bct, Inc. Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system
US9708299B2 (en) 2011-01-03 2017-07-18 Genentech, Inc. Hedgehog antagonists having zinc binding moieties
GB201201298D0 (en) 2012-01-26 2012-03-07 Universitat Leipzig Therapeutic use of activators of zinc finger protein gli3
US9248128B2 (en) 2012-01-27 2016-02-02 New York University Method for enhancing remyelination using GLI1 inhibitors
US8940742B2 (en) 2012-04-10 2015-01-27 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
WO2015051241A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
JP6466924B2 (ja) 2013-10-04 2019-02-06 インフィニティー ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 複素環式化合物及びその使用
WO2015073691A1 (en) 2013-11-14 2015-05-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for treating cancer by activation of bmp signaling
US9617506B2 (en) 2013-11-16 2017-04-11 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
US9775844B2 (en) 2014-03-19 2017-10-03 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
EP3198006B1 (en) 2014-09-26 2021-03-24 Terumo BCT, Inc. Scheduled feed
US9708348B2 (en) 2014-10-03 2017-07-18 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Trisubstituted bicyclic heterocyclic compounds with kinase activities and uses thereof
WO2016142427A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method ank kit for reprogramming somatic cells
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
CN105130978B (zh) * 2015-07-22 2017-11-21 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种化合物及其在帕金森疾病方面的应用
CA2998469A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Solid forms of isoquinolinones, and process of making, composition comprising, and methods of using the same
CN109069426B (zh) 2015-12-14 2021-10-29 X4 制药有限公司 治疗癌症的方法
WO2017106332A1 (en) 2015-12-14 2017-06-22 X4 Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer
DK3393468T3 (da) 2015-12-22 2022-12-19 X4 Pharmaceuticals Inc Fremgangsmåder til behandling af en immundefektsygdom
WO2017161116A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Isotopologues of isoquinolinone and quinazolinone compounds and uses thereof as pi3k kinase inhibitors
JP2019510785A (ja) 2016-04-08 2019-04-18 エックス４ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 癌を処置する方法
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US10919914B2 (en) 2016-06-08 2021-02-16 Infinity Pharmaceuticals, Inc. Heterocyclic compounds and uses thereof
US11332470B2 (en) 2016-06-21 2022-05-17 X4 Pharmaceuticals, Inc. CXCR4 inhibitors and uses thereof
JP7084624B2 (ja) 2016-06-21 2022-06-15 エックス４ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｃｘｃｒ４阻害剤およびその使用
ES2870920T3 (es) 2016-06-21 2021-10-28 X4 Pharmaceuticals Inc Inhibidores de CXCR4 y usos de los mismos
SG10201910821XA (en) 2016-12-30 2020-01-30 Frequency Therapeutics Inc 1h-pyrrole-2,5-dione compounds and methods of using them to induce self-renewal of stem/progenitor supporting cells
WO2018129470A1 (en) * 2017-01-09 2018-07-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Reversing deficient hedgehog signaling restores deficient skeletal regeneration
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
EP3656842A1 (en) 2017-03-31 2020-05-27 Terumo BCT, Inc. Cell expansion
WO2019048898A1 (en) 2017-09-05 2019-03-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION
US20200397901A1 (en) * 2018-01-24 2020-12-24 The University Of Tokyo Photoresponsive smoothened ligand
US10548889B1 (en) 2018-08-31 2020-02-04 X4 Pharmaceuticals, Inc. Compositions of CXCR4 inhibitors and methods of preparation and use
WO2020106755A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 New York University Inhibitors of gli1 as therapeutic agents
EP3883932B1 (en) 2018-11-19 2023-03-29 New York University Inhibitors of gli1 as therapeutic agents
CN112898178A (zh) * 2021-01-25 2021-06-04 蚌埠产品质量监督检验研究院 一种N-Boc-反式-1,4-环己二胺的制备方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3612974A1 (de) * 1986-04-17 1987-10-29 Basf Ag 1,4-cyclohexandiamine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als fungizide
IL96019A0 (en) * 1989-10-31 1991-07-18 Fujisawa Pharmaceutical Co Imidazole derivatives,processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same
JPH0625250A (ja) * 1992-07-13 1994-02-01 Tooa Eiyoo Kk チエノ〔３，４−ｄ〕イミダゾール誘導体、その製造法およびそれを含有する循環器官用剤
CA2128014A1 (en) * 1992-12-07 1994-06-23 Toshikazu Shimizu Process for the preparation of imidazopyridine derivatives and intermediates
DE4326344A1 (de) * 1993-08-05 1995-02-09 Thomae Gmbh Dr K Carbonamide, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung
US6281332B1 (en) * 1994-12-02 2001-08-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Hedgehog-derived polypeptides
CA2302780A1 (en) * 1997-08-29 1999-03-04 Ontogeny, Inc. Regulation of muscle tissues by hedgehog-like polypeptides, and formulations and uses related thereto
AU753540B2 (en) * 1998-03-05 2002-10-24 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Non-peptide GnRH agents
US6291516B1 (en) * 1999-01-13 2001-09-18 Curis, Inc. Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto
CA2373892A1 (en) * 1999-05-17 2000-11-23 Novo Nordisk A/S Glucagon antagonists/inverse agonists
AU780846B2 (en) * 1999-09-16 2005-04-21 Curis, Inc. Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto
EP1227805B2 (en) * 1999-10-14 2011-02-23 Curis, Inc. Mediators of hedgehog signaling pathways, compositions and uses related thereto
DK1272168T3 (da) * 2000-03-30 2006-02-13 Curis Inc Sma organiske molekyler som celleproliferationsregulatorer

Also Published As

Publication number Publication date
IL228106A0 (en) 2013-09-30
KR20040045003A (ko) 2004-05-31
PL371343A1 (en) 2005-06-13
WO2003027234A3 (en) 2003-12-18
US20020198236A1 (en) 2002-12-26
WO2003027234A2 (en) 2003-04-03
JP2005520788A (ja) 2005-07-14
CA2461709A1 (en) 2003-04-03
CN1578779A (zh) 2005-02-09
NO20041260L (no) 2004-05-26
US6683192B2 (en) 2004-01-27
WO2003027234A9 (en) 2004-02-19
GEP20063855B (en) 2006-06-26
IL161104A (en) 2013-08-29
CN1578779B (zh) 2013-09-18
KR20100105784A (ko) 2010-09-29
KR101051535B1 (ko) 2011-07-22
BR0212825A (pt) 2005-05-10
NO20041260D0 (no) 2004-03-25
JP4563028B2 (ja) 2010-10-13
UA78225C2 (en) 2007-03-15
KR101039198B1 (ko) 2011-06-03
AU2002336580B2 (en) 2008-10-30
NZ531970A (en) 2006-11-30
HUP0402307A2 (hu) 2005-02-28
EP1436287A4 (en) 2005-10-26
EP1436287A2 (en) 2004-07-14
ZA200402322B (en) 2005-06-23
IL161104A0 (en) 2004-08-31
EA200400355A1 (ru) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2404413C (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
AU2002336580B2 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US8129425B2 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6613798B1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US6683108B1 (en) Agonists of hedgehog signaling pathways and uses related thereto
AU2001249664A1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
AU2002336580A1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US8273747B2 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US20050070578A1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US20080182859A1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
WO2008057469A1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
US8852937B2 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
AU2005244542B2 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation
EP1645275A1 (en) Small organic molecule regulators of cell proliferation

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration