MXPA04002124A

MXPA04002124A - Clon de virus de diarrea viral bovina infeccioso y atenuado, metodos para su produccion y uso.

Info

Publication number: MXPA04002124A
Application number: MXPA04002124A
Authority: MX
Inventors: Meyers Gregor
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2004-07-08
Also published as: EP1749885B8; DE10143813A1; EP1749885A2; PL368748A1; DE60213639T2; DK1749885T3; HUP0401585A3; JP2005502361A; WO2003023041A2; KR20040039295A; CA2457441A1; EP1749885B1; WO2003023041A3; JP4416504B2; ATE335074T1; DE60213639D1; ES2401072T3; UY27434A1; CN1551913A; CA2457441C

Abstract

La invencion pertenece al campo de la salud animal y, en particular, al Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV). La invencion proporciona clones infecciosos de BVDV y metodos para producir dichos clones de BVDV. La invencion se refiere, adicionalmente, a metodos para atenuar dichos clones, clones atenuados de BVDV y vacunas que comprenden dichos clones atenuados.

Description

CLON DEL VIRUS DE DIARREA VIRAL BOVINA INFECCIOSO Y ATENUADO, MÉTODOS PARA SU PRODUCCIÓN Y USO Campo de la invención La invención pertenece al campo de la salud animal y, en particular, al Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) . La invención proporciona clones infecciosos del BVDV y métodos para producir dichos clones de BVDV. La invención se refiere, además, a métodos para atenuar dichos clones, a clones de BVDV atenuados y a vacunas que comprenden dichos clones atenuados . Antecedentes de la invención El Virus de la Diarrea Viral Bovina (BVDV) es el agente causante de la BVD y de la enfermedad mucosa en el ganado (Baker, 1987; Moennig y Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). La infección fetal durante la preñez puede dar como resultado la resorción del feto, abortos, asi como el nacimiento de terneros inmuno-tolérantes que están persistentemente infectados con BVDV. Estos terneros carecen o tienen títulos muy bajos de anticuerpos neutralizantes y expulsan continuamente grandes cantidades del virus. Junto con el ganado con infección aguda,, estos terneros son la fuente principal de difusión del virus y son, por tanto, de enorme importancia en la epidemiología de esta enfermedad. El fuerte impacto económico de la BVD es consecuencia de los elevados REF: 153874 índices de aborto, nacimientos de animales muertos, resorción fetal, momificación, malformaciones congénitas y nacimientos de terneros débiles y de tamaño menor al normal . Para una revisión detallada de la patogenia, se hace referencia aqui al articulo de Moennig y Liess de 1995. Se han descrito dos principales grupos antigénicos de BVDV (tipos 1 y 2) (Becher et al., 1999), que muestran limitadas reacciones cruzadas de anticuerpos neutralizantes ( idpath et al., 1994). Las actuales vacunas para la prevención y tratamiento de las infecciones por BVDV siguen teniendo inconvenientes (Oirschot et al., 1999). Las vacunas contra el tipo 1 clásico del BVDV ofrecen sólo una protección parcial frente a la infección por tipo 2 y las vacas vacunadas pueden parir terneros que están persistentemente infectados con el BVDV tipo 2 virulento (Bolín et al., 1991, Ridpath et al., 1994) . Este problema tiene probablemente su origen en la gran diversidad antigénica entre las cepas de tipo 1 y tipo 2, que es más pronunciada en la glicoproteína E2 , el principal antígeno (Tijssen et al., 1996): la mayor parte de los anticuerpos monoclonales contra las cepas del tipo 1 fracasa en su unión a virus del tipo 2 (Ridpath et al . , 1994) . Las vacunas de virus muertos (virus completo inactivado) o las vacunas de sub-unidades (proteínas virales purificadas de forma convencional o expresadas de manera heterologa) son, con mucha frecuencia, inferiores a las vacunas de virus vivos en lo que respecta a su eficacia para producir una inmunorrespuesta de protección completa, incluso en presencia de coadyuvantes . Las vacunas de BVDV vivos, aunque atenuadas, se asocian con gran frecuencia a problemas de seguridad. Como se ha mencionado anteriormente, atraviesan la placenta de las vacas preñadas y dan lugar a manifestaciones clínicas en el feto y/o a la inducción de terneros persistentemente infectados. Por lo tanto, no se pueden aplicar al ganado de cría que contenga vacas preñadas . Las vacas preñadas se deben mantener separadas del ganado vacunado para proteger los fetos y no deben ser vacunadas. Adicionalmente , los elementos de reversión de los BVDV vivos atenuados representan una grave amenaza para el ganado. Para los virus atenuados derivados de forma convencional, en los que la atenuación se consigue por múltiples pasajes convencionales, el origen molecular y la estabilidad genética de la atenuación siguen siendo desconocidos y la reversión al tipo salvaje virulento es impredecible . Las vacunas vivas con mutaciones definidas, como base de la atenuación, superarían los inconvenientes de la presente generación de vacunas atenuadas. Otra ventaja de dichas mutaciones atenuantes radica en su unicidad molecular definida, que se puede utilizar como marca distintiva para los pestivirus atenuados, con el fin de distinguirlos de los pestivirus de. campo. En la técnica, son escasamente conocidos BVDV de identidad genética definida que se asemejen a los virus de tipo salvaje, sobre todo para el BVDV de tipo 2. En la técnica, existe una prolongada necesidad de métodos que generen tales BVDV. Por consiguiente, el problema técnico que subyace a esta invención era proporcionar un BVDV, en particular un BVDV de tipo 2, de identidad genética definida. Breve Descripción de las figuras Figura 1. Construcción del clon infeccioso de cADN. La parte superior esquematiza un genoma de BVDV (kB) y la poliproteína codificada. La parte central muestra los clones de cADN (blancos) , el producto de TR-PCR (gris claro) y los productos de PCR (gris oscuro) usados para la producción por ingeniería del clon de cADN, y la parte inferior presenta los extremos de las secuencias genómicas de cADN (subrayados) y las secuencias añadidas a los extremos 5' y 3' para la transcripción in vitro. Figura 2. Curvas de crecimiento del virus recombinante XIKE-A y del aislado VLS n° 399 del BVDV de tipo salvaje. Se infectaron células MDBK con los virus a una m.o.i. de 0,1 y se cosecharon por congelación y descongelación en los intervalos indicados. Los títulos se determinaron tras la infección de nuevas células MDBK por tinción de inmunofluorescencia 72 h después de la infección. Figura .3. Curvas de crecimiento del virus recombinante XIKE-A y de los mutantes Ems y XIKE-B (?349?) y XIKE- C (H300L) . Se infectaron células MDBK con los virus a una m.o.i. de 0,1 y se cosecharon por congelación y descongelación en los intervalos indicados. Se determinaron los títulos tras la infección de nuevas células MDBK por tinción de inmunofluorescencia 72 h después de la infección. Figura 4. Determinación de la actividad de ARNsa de los virus recombinantes XIKE-A (secuencia de tipo salvaje) , XIKE-B (?349?) y XIKE-C (H300L) en comparación con la cepa de tipo salvaje New York '93/C, procedente de extractos brutos de células MDBK infectadas con los correspondientes virus. Como controles negativos se utilizaron células MDBK no infectadas (n.i.). La degradación enzimática de poli (U) se determinó midiendo la OD26o como marca de la liberación 'de pequeños fragmentos de ARN en el sobrenadante. Figura 5. Temperaturas corporales de animales infectados con New York X93/C (animales n° 275, n° 612 y n° 1.610, líneas de puntos) o XIKE-A (animales n° 615, n° 377 y n° 091, líneas continuas). Figura 6. Recuentos de leucocitos de animales infectados con New York ? 93/C (animales n° 275, n° 612 y n° 1.610, líneas de puntos) o XIKE-A (animales n° 615, n° 377 y n° 091, líneas continuas) .

Figura 7. Temperaturas corporales de animales infectados con XIKE-A (animal n° 387, n° 388 y n° 418, líneas de puntos) o XIKE-B (animal n° 415, n° 417 y n° 419, lineas continuas) . Figura 8. Recuentos de leucocitos de animales infectados con XIKE-A (animal n° 387, n° 388 y n° 418, líneas de puntos) o XIKE-B (animal n° 415, n° 417 y n° 419, líneas continuas) . Sumario de la Invención Definiciones de los términos usados en la descripción: Frente a las realizaciones de la presente invención, es preciso destacar que, tal como se usa aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno, una, el y la" incluyen también referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un virus BVDV" incluye una pluralidad de tales virus BVDV, la referencia a la "célula" es una referencia a una o más células y equivalentes de las mismas conocidos para los expertos en la técnica, etc. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los mismos significados que los habituales para un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aun cuando se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos aquí en la práctica o comprobación de la presente invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos son los que se describen a continuación. Todas las publicaciones aqui mencionadas se incorporan como referencia al objeto de describir y revelar las líneas celulares, vectores y metodologías sobre las que se informa en las publicaciones que se pueden utilizar en relación con la invención. Nada de lo aquí reseñado se puede entender como admisión de que la invención no está autorizada para adelantarse a dicha descripción en virtud de invenciones anteriores. El término "BVDV" , tal como se usa aquí, se refiere a todos los virus pertenecientes a las especies BVDV1 y BVDV2 en el género pestivirus, dentro de la familia Flaviviridae (Becher et al., 1999). Las cepas BVDV tipo 1, más clásicas, y las cepas BVDV tipo 2, más recientemente descubiertas, muestran algunas diferencias limitadas, pero distintivas, en las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Un "clon" es un vector de ADN o una cepa de célula huésped en la que se ha introducido ese vector. Preferentemente, el vector de ADN es un plásmido. Un "clon infeccioso" es un vector de ADN con la capacidad de servir como modelo para la transcripción en un ARN que induce la generación del virus cuando se introduce en células susceptibles. Preferentemente, el ARN se produce por transcripción in vitro y se introduce e las células por tecnologías de transfección conocidas para el experto en la materia. "Partículas de BVDV" o "partículas virales" , como se usa aquí, hacen referencia a virus de BVD generados por "clones infecciosos" a través de ARN, que inducirá la producción de tales partículas de BVDV cuando se introduzca en células susceptibles . "Partículas de BVDV atenuado" o "partículas virales atenuadas", como se usa aquí, se refieren a partículas de BVDV atenuadas por un método según la invención (véase más adelante) . "Infectividad" es la capacidad de un virus o partícula viral para inducir un determinado número de placas en un ensayo de placa o una cierta puntuación de TCIDS0 en un ensayo de punto final. Un ARN de longitud total es un ARN que comprende al menos 98% de la secuencia de un ARN que se manifiesta en un aislado de tipo salvaje. Un ADN complementario de longitud total es un ADN que comprende una secuencia complementaria a al menos 98% de un ARN que se manifiesta en un aislado de tipo salvaje. Como se usa aquí, "ternero" se refiere a un animal bovino de seis meses de edad o menos. Virulencia: "Virulencia auténtica", como se usa aquí, significa que no existen diferencias estadísticamente significativas entre la virulencia de partículas infecciosas de BVDV, según la invención, y aislados de tipo salvaje de BVDV del que se han derivado dichas moléculas de ADN que contienen una secuencia de nucleótidos complementaria al ARN de BVDV, preferentemente un ARN de tipo 2, para al menos un parámetro clínico predominante. Ejemplos de tales parámetros clínicos dominantes son diarrea, fiebre y/o letalidad. Atenuación: "Una partícula de BVDV atenuada", como se usa aquí, significa que existe una diferencia estadísticamente significativa entre la virulencia de partículas de BVDV atenuadas, según la invención, estando dichas partículas de BVDV atenuadas por un método según la invención, y aislados de BVDV de tipo salvaje, a partir de las cuales se han derivado dichas partículas de BVDV atenuadas, para los parámetros clínicos predominantes diarrea, fiebre y letalidad en animales infectados con la misma dosis, preferentemente 6xl06TCID50. De esta forma, dichas partículas de BVDV atenuadas no provocan diarrea, fiebre ni letalidad y se les puede usar, por tanto, en una vacuna. "RACE" como se usa aquí significa rápida amplificación de extremos de cADN y se conoce como tal en la técnica (Frohman et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA 1988, 85:8998-9002) "Célula susceptible" como se usa aquí es una células que se puede infectar con el virus BVDV o transfectar con ARN de BVDV, en donde dicho virus o ARN, cuando se introduce en dichas células susceptibles, induce la generación de BVDV infeccioso . Un "fragmento", según la invención, es cualquier sub-unidad de una molécula de ADN o clon de BVDV infeccioso, es decir, cualquier sub-conjunto, que se distingue porque está codificado por una molécula de ácido nucleico más corta que la descrita y que todavía se puede transcribir en ARN. Una "variante funcional" de la molécula de ADN o clon infeccioso de BVDV, según la invención, es una molécula de ADN o clon infeccioso de BVDV que posee una actividad biológica (funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la molécula de ADN o clon infeccioso de BVDV según la invención. La expresión "variante funcional" incluye también un "f agmento", "una variante funcional", "una variante basada en el código de ácido nucleico degenerativo" o "derivado químico" . Una "variante funcional" de este tipo puede, por ejemplo, ser portadora de uno o varios intercambios, deleciones o inserciones de ácidos nucleicos. Dichos intercambios, deleciones o inserciones pueden representar 10% de la secuencia completa. Dicha variante funcional conserva al menos su actividad biológica, por ejemplo la función como clon infeccioso o cepa de vacuna o, incluso, muestra una actividad biológica mejorada.

Una "variante basada en la naturaleza degenerativa del código genético" es una variante resultante del hecho de que algún aminoácido puede estar codificado por varios tripletes de nucleótidos diferentes. Dicha variante conserva al menos parcialmente su actividad biológica o, incluso, muestra una actividad biológica mejorada. Una "molécula de fusión" puede ser la molécula de ADN o clon infeccioso de BVDV según la invención, enlazado con, por ejemplo, un informador tal como una marca radiactiva, una molécula química tal como una marca fluorescente o cualquier otra molécula conocida en la técnica. Como se usa aquí, un "derivado químico" según la invención es una molécula de ADN o un clon infeccioso de BVDV según la invención, químicamente modificado o que contiene fracciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la molécula. Estas fracciones pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula . Una molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si ambas moléculas tienen secuencias de nucleótidos o actividad biológica sustancialmente similares . De esta forma, siempre que dos moléculas posean una actividad similar, se las considera variantes, puesto que dicho término se usa aquí si la secuencia de nucleótidos no es idéntica, y dos moléculas que tengan una secuencia de nucleótidos similar se consideran variantes, dado que es el término que se usa aquí, incluso si su actividad biológica no es idéntica. El término "vacuna" como se usa aquí, se refiere a una composición farmacéutica que comprende al menos un componente inmunológicamente activo que induce una respuesta inmunológica en un animal y posible, pero no necesariamente, uno o más componentes adicionales que potencian la actividad inmunológica de dicho componente activo. Una vacuna puede comprender, adicionalmente , otros componentes típicos de composiciones farmacéuticas. El componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender partículas de virus completos tanto en su forma original o como partículas atenuadas en una llamada vacuna viva modificada (MLV) o partículas inactivadas por métodos apropiados en una llamada vacuna muerta (KV) . En otra forma, el componente inmunológicamente activo de una vacuna puede comprender elementos apropiados de dichos organismos (vacunas de sub-unidades) , en donde estos elementos son generados por la destrucción de la partícula completa, o cultivos de crecimiento que contienen tales partículas y, opcionalmente, etapas subsiguientes de purificación que dan como resultados la o las estructuras deseadas, o por procesos sintéticos que incluyen una manipulación adecuada por medio del uso de un sistema apropiado basado, por ejemplo, bacterias, insectos, mamíferos u otras especies, más los procedimientos subsiguientes opcionales de aislamiento y purificación, o por inducción de. dichos procesos sintéticos en el animal que necesita una vacuna por incorporación directa de material genético, utilizando composiciones farmacéuticas adecuadas (vacunación por polinucleótidos) . Una vacuna puede comprender uno o simultáneamente más de uno de los elementos anteriormente descritos . El término "vacuna", como se entiende aquí, es una vacuna para uso veterinario que comprende sustancias antigénicas y se administra con el fin de inducir una inmunidad específica y activa contra una enfermedad provocada por BVDV. El clon de BVDV según la invención confiere inmunidad activa que se puede transferir de forma pasiva a través de anticuerpos maternos contra los inmunógenos que contiene y, en ocasiones, también contra organismos relacionados de manera antigénica. Componentes adicionales para potenciar la respuesta inmunológica son constituyentes normalmente designados como coadyuvantes tales como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, aceites minerales o de otro tipo, o moléculas auxiliares añadidas a la vacuna o generados por el cuerpo tras la correspondiente inducción por tales componentes adicionales, tales como interferones , interleuquinas o factores de crecimiento, sin estar limitados a éstos. Una "composición farmacéutica" consiste básicamente en uno o más ingredientes capaces de modificar funciones fisiológicas,, por ejemplo, inmunológicas, del organismo al que se administra, o de organismos que viven en o sobre el organismo. La expresión incluye, pero no está limitada a, antibióticos o antiparasitarios, así como otros constituyentes normalmente utilizados para alcanzar algunos otros objetivos tales como, pero no limitados a, rasgos de procesamiento, esterilidad, estabilidad, viabilidad para administrar la composición por vías entéricas o parenterales tales como vía oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica u otra vía adecuada, tolerancia tras la administración y propiedades de liberación controlada. Descripción Detallada de la Invención La solución al problema técnico anterior se consigue por la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones . Se ha superado la prolongada necesidad de un BVDV (virus de la diarrea viral bovina) vivo de secuencia definida y especificidad correlacionada con la virulencia, que se pueda utilizar para generar BVDV atenuado específico para usar, por ejemplo, en una vacuna. Los inventores han ofrecido por primera vez un método para generar clones infecciosos y partículas de BVDV infecciosas derivadas del mismo, de identidad genética definida que, al mismo tiempo, tiene una patogenia estrechamente similar a las del virus de tipo salvaje. Además, los inventores han descrito por primera vez un clon infeccioso de tipo 2 y partículas infecciosas de BVDV de tipo 2 derivadas del mismo. En tercer lugar, habiendo inventado partículas vivas e infecciosas de BVDV de secuencia definida, los inventores han desarrollado igualmente un método para generar partículas atenuadas de BVDV con identidad genética, que se pueden atenuar mediante una modificación en un único sitio de marca genética definido. La invención permite generar un enlace causal entre la modificación del genoma y la atenuación, que es esencial para comprender el mecanismo funcional de la atenuación y útil, por tanto, para evaluar la calidad en su uso como una vacuna.

En una primera realización importante, la invención se refiere a una molécula de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria al ARN de BVDV, en donde dicho ARN, cuando se introduce en células huésped susceptibles, induce la generación de partículas infecciosas de BVDV a) con la capacidad de inducir viremia y leucopenia en terneros durante un período de al menos un día y al menos uno de los siguientes síntomas clínicos del grupo que comprende diarrea y/o fiebre de al menos un día de duración cuando la infección de realiza con una dosis de 6xl06TCID50. b) con auténtica virulencia, como se ha definido anteriormente, en comparación con un aislado de BVDV de tipo salvaje de la que se ha derivado tal molécula de ADN; y/o c) que resultan letales, cuando se infectan terneros que no han estado previamente en contacto con BVDV, a una dosis de 6xl06TCID50 de tales partículas, para al menos 30% de tales terneros en un espacio de tiempo de 21 días ; y/o d) con una virulencia no inferior a 90% de partículas de BVDV que comprenden un ARN con una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1; y/o e) que comprenden una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1. Dicha dosis de 6xl06TCID50 de la etapa a) se administra preferentemente como 2xl06 i.m. (músculo glúteo), 2xl06 por vía intranasal y 2xl06 por vía subcutánea (sobre la escápula) para obtener una dosis total de 6xl06. Dichos síntomas clínicos de la etapa a) se deben observar preferentemente en al menos dos tercios de todos los animales infectados. Dicha leucopenia de la etapa a) será preferentemente una reducción de al menos 35% por debajo del nivel inicial en al menos dos días consecutivos, en donde "valor inicial" se refiere a los valores medios de todos los animales, 10 días antes de la infección. Diarrea es un síntoma típico de la infección con BVDV. Preferentemente, en una molécula de ADN según la invención, como se ha descrito anteriormente, la fiebre de la etapa a) es de al menos 40 °C. En una segunda realización importante, la invención se refiere a un clon infeccioso de BVDV, capaz de servir de molde para la transcripción en un ARN, en donde dicho AR , cuando se introduce en células huésped susceptibles, induce la generación de partículas infecciosas de BVDV f) con la capacidad de inducir viremia y leucopenia en terneros durante un período de al menos un día y al menos uno de los siguientes síntomas clínicos del grupo que comprende diarrea y/o fiebre de al menos un día de duración cuando se infecta con una dosis de 6xlOsTCID50 ; y/o g) con virulencia auténtica en comparación con un aislado de BVDV de tipo salvaje, a partir del cual se ha derivado tal molécula de ADN; y/o h) que resultan letales, cuando se infectan terneros de 3 a 6 meses de edad que no han estado previamente en contacto con el BVDV, a una dosis de 6xlOsTCID50 con tales partículas, para al menos 30% de tales terneros en un espacio de tiempo de 21 días después de la infección; y/o i) con una virulencia no inferior a 90% de las partículas de BVDV que comprenden un ARN con una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1; y/o j) que comprenden una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1. Dicha dosis de 6xl06TCID50 de la etapa f) se administra preferentemente como 2x10s i.m. (músculo glúteo), 2xl06 por vía intranasal y 2x1O6 por vía subcutánea (sobre la escápula) para obtener una dosis total de 6xl06. Dichos síntomas clínicos de la etapa f) se deben observar preferentemente en al menos dos tercios de todos los animales infectados . Dicha leucopenia de la etapa f) será preferentemente una reducción de al menos 35% por debajo del nivel inicial durante al menos dos días consecutivos, en donde "valor inicial" se refiere a los valores medios de todos los animales 10 días antes de la infección. Dicho clon infeccioso de BVDV es preferentemente un clon de tipo 1 o tipo 2. Dado que es importante que dicho clon infeccioso de BVOV sea de auténtica virulencia, el virus que sirve como origen para la construcción de ese clon se obtiene, de preferencia, directamente de un aislado de ' campo o retransferido a animales y, a continuación, re-aislado del animal con los síntomas clínicos más intensos, sometiéndolo seguidamente a no más de dos pasajes en cultivo celular, preferentemente uno o ninguno en absoluto. El ejemplo (Ejemplo 1) ilustra este procedimiento. El ejemplo demuestra la clonación de cADN del virus NY93/C que, tras varios pasajes por cultivos celulares, se retransfiere a un animal bovino, se re-aísla y se utiliza para la preparación de ARN y clonación de cADN tras no más de dos pasajes por cultivos celulares del virus re-aislado. Otra realización importante de la invención es una partícula de BVDV generada por transcripción, utilizando la molécula de ADN o el clon de BVDV según la invención, la transfección de células o líneas celulares adecuadas con dicho ARN y la recolección de las partículas de BVDV resultantes producidas por dichas células. Todavía otra realización es una partícula de BVDV generada por la clonación de la molécula de ADN o el clon de BVDV según la invención, en el genoma de un ADN-virus adecuado, siendo dichos ADN-virus conocidos para el técnico, seguido de la infección de células adecuadas, dando como resultado la generación de partículas de BVDV producidas por dichas células. Preferentemente también, el ADN o clon infeccioso según la invención se puede transfectar en células adecuadas que producen, entonces, el ARN según lo han descrito para el virus de la fiebre porcina clásico (CSFV) van Gennip et al. (1999) para células que expresan de forma estable Polimerasa T7. También preferentemente, el ADN o clon infeccioso según la invención se puede expresar bajo control de un promotor eucariota en células eucariotas que conducen a la generación de partículas infecciosas de BVDV capaces de ser secretadas desde la célula (tal como lo ejemplifican V. Racaniello y D. Baltimore para el poliovirus (1981) ) .

Una realización altamente importante de la invención es un clon infeccioso de BVDV tipo 2. Preferentemente, dicho clon infeccioso de BVDV tipo 2, capaz de servir como modelo para la transcripción en un ARN, en donde dicho ARN, cuando se introduce en células huésped susceptibles, induce la generación de partículas infecciosas de BVDV k) con la capacidad de inducir viremia y leucopenia en terneros durante un período de al menos 1 día y al menos uno de los siguientes síntomas clínicos del grupo que comprende diarrea y/o fiebre de al menos un día de duración, cuando se infecta con una dosis de 6xl06TCID50; y/o 1) con auténtica virulencia en comparación con un aislado de BVDV de tipo salvaje, a partir del cual se ha derivado esa molécula de ADN; y/o m) que resultan letales, cuando se infectan terneros de 3 a 6 meses de edad que no han estado previamente en contacto con BVDV, a una dosis de 6xlOsTCID50, con tales partículas, para al menos 30% de tales terneros en un período de 21 días después de la infección; y/o n) con una virulencia no inferior a 90% de las partículas de BVDV que comprenden un ARN con una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1; y/o o) que comprende una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1.

Preferentemente, lá invención se refiere a un clon de BVDV tipo 2 que se puede obtener por un método que se distingue por las siguientes etapas: aaa) se aisla una cepa de tipo 2 de BVDV de tipo salvaje; bbb) dicha cepa de tipo 2 de BVDV de tipo salvaje se hace pasar por un cultivo celular; ccc) dicha cepa de tipo 2 de BVDV sometida a pasaje por cultivo celular se utiliza para infectar animales bovinos y se re-aisla una cepa de BVDV del animal más gravemente infectado; ddd) dicha cepa de tipo 2 de BVDV re-aislado se hace pasar no más de dos veces, preferentemente una vez, por un cultivo celular; eee) dicha cepa de tipo 2 de BVDV re-aislado se transcribe inversamente y se clona, dando como resultado un clon cADN de longitud total, clonándose preferentemente los extremos 5' y 3' utilizando la tecnología RACE. Dicho clon infeccioso de ADN se puede transcribir entonces en AR bajo condiciones apropiadas, dicho ARN se introduce en células o líneas celulares adecuadas y se recolecta la partícula de BVDV de tipo 2 resultante. Tal clon se ejemplifica en el Ejemplo 1 no limitante y se caracteriza por la secuencia de cADN SEQ ID N° 1. De esta forma, una realización preferida ' se refiere a un clon infeccioso de BVDV de tipo 2 según la invención, según queda caracterizado por la secuencia de ADN de SEQ ID N° 1, o un fragmento, variante funcional, variante basada en el código de ácido nucleico degenerativo, molécula de fusión o un derivado químico del mismo. En el Ejemplo 1 se ofrece un ejemplo no limitante. La invención se refiere, además, a una partícula de BVDV de tipo 2 generada por transcripción in vitro del clon de BVDV según la invención en ARN, la transfección de células o líneas celulares adecuadas con dicho ARN y la recolección de las partículas de BVDV resultantes, producidas por dichas células. También preferentemente, el ADN o clon infeccioso según la invención se puede transfectar en células adecuadas que, a continuación, producen el ARN como lo han descrito para el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) van Gennip et al. (1999) para células que expresan de forma estable Polimerasa T7. También preferentemente, el ADN o clon infeccioso según la invención se puede expresar bajo el control de un promotor eucariota en células eucariotas que conducen a la generación de partículas infecciosas de BVDV capaces de ser secretadas desde la célula (según lo ejemplifican V. Racaniello y D. Baltimore para el poliovirus (1981) ) . Otro aspecto muy importante de la invención es una molécula de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos complementaria al ARN de BVDV de tipo 2 de longitud total.

Preferentemente, dicha molécula de ADN se distingue por la secuencia SEQ ID N° 1. Por consiguiente, la invención se refiere, además, a una molécula de ADN según la invención, según queda caracterizada por SEQ ID N1 1, o un fragmento, variante funcional, variante basada en el código de ácido nucleico degenerativo, molécula de fusión o un derivado químico de la misma. En el Ejemplo 1 se ofrece un ejemplo no limitante . De forma muy preferente, la invención se refiere a una molécula de ADN según la invención, consistente en una secuencia según queda caracterizada por SEQ ID N° 1. La invención- se refiere, además, a una molécula de ARN complementaria a la molécula de ADN según la invención, como se ha descrito anteriormente, o al clon de BVDV según la invención, como se ha descrito anteriormente. La invención se refiere también a una molécula de ARN que se puede obtener por transcripción de la molécula de ADN según la invención, como se ha descrito anteriormente, o del clon de BVDV según la invención, como se ha descrito anteriormente. Otro aspecto importante de la invención es un método para la producción de un clon infeccioso de BVDV a partir de un aislado de BVDV de tipo salvaje, siendo dicho clon infeccioso de BVDV complementario a un ARN que tiene auténtica virulencia en comparación con dicho aislado de tipo salvaje, que comprende las etapas de p) aislar partículas virales de un animal infectado,- haciéndolas pasar preferentemente no más de dos veces en células de cultivo celular adecuado; g) preparar ARN a partir de las partículas virales; r) generar un ADN complementario de longitud total tras la transcripción inversa del ARN; en donde la transcripción inversa incluye una etapa a temperaturas elevadas suficiente para degradar o reducir las estructuras secundarias del ARN, y el uso de una enzima termoestable para esta etapa, siendo dicha enzima activa a estas temperaturas elevadas; s) incorporar el ADN complementario (cADN) en un vector de plásmido o .en un ADN-virus capaz de dirigir la transcripción de cADN de BVDV en ARN tras la infección de células adecuadas. Dichas partículas virales se aislan, preferentemente, durante la viremia (etapa k) ) . El ADN complementario (cADN) de longitud total ' de la etapa m) se puede generar, preferentemente, ensamblando cADN parcial solapado (véase también el E emplo 1) . Otra realización preferida se refiere a un método para la producción de un clon infeccioso de BVDV a partir de un aislado de BVDV de tipo salvaje, siendo dicho clon infeccioso de BVDV complementario a un ARN que tiene auténtica virulencia, en comparación con dicho aislado de tipo salvaje, que comprende las etapas de ppp) aislar ARN a partir de células de un animal infectado durante la viremia u, opcionalmente , a partir de sus órganos después de sacrificar dicho animal; qqq) generar ADN complementario de BVDV de longitud total que, preferentemente, está ensamblado a partir de fragmentos de ADN, tras la transcripción inversa del ARN; en donde la transcripción inversa incluye una etapa a temperaturas elevadas, suficientes para degradar o reducir las estructuras secundarias del ARN, y el uso de una enzima termoestable para esta etapa, siendo dicha enzima activa a estas temperaturas elevadas; rrr) incorporar el ADN complementario (cADN) en un vector de plásmido o en un ADN-virus capaz de dirigir la transcripción de cADN de BVDV en ARN tras la infección de células adecuadas. Células adecuadas para el cultivo celular son las células renales bovinas de Madin-Darby (MDBK) , células RD (testiculares bovinas) o células bovinas Turbinat (BT) . El experto en la técnica conoce otras células adecuadas . . El clon infeccioso producido por el método según la invención es un clon de tipo 1 o, preferentemente, un clon de tipo 2. Otro aspecto importante de la invención es un método para la producción de un clon infeccioso de BVDV a partir de un aislado de BVDV de tipo salvaje, siendo dicho clon infeccioso de BVDV complementario a un ARN que tiene una virulencia no inferior a 90% de dicho aislado de tipo salvaje, que comprende las etapas de t) aislar partículas virales de un animal infectado; u) hacerlas pasar no más de dos veces en células de cultivo celular apropiadas; preferentemente una sola vez o ninguna en absoluto; v) preparar ARN a partir de las partículas virales; w) generar ADN complementario de longitud total tras la transcripción inversa del ARN; en donde la transcripción inversa incluye una etapa a temperaturas elevadas, suficientes para degradar o reducir las estructuras secundarias del ARN, y el uso de una enzima termoestable para esta etapa, siendo dicha enzima activa a estas temperaturas elevadas; x) incorporar el ADN complementario (cADN) es un vector de plásmido o en n ADN-virus capaz de dirigir la transcripción de cADN de BVDV en ARN tras la infección de células adecuadas. Dichas partículas virales se aislan preferentemente durante la viremia (etapa t) ) . El ADN complementario (cADN) de longitud total de la etapa x) se puede generar preferentemente mediante ensamblaje de fragmentos parciales de 'cADN solapados (véase también el Ejemplo 1). Hubo una particular dificultad técnica para clonar las regiones 5' y 3' de un BVDV infeccioso. Los inventores desarrollaron un método de la invención para obtener auténticas regiones 5' y 3'. Sorprendentemente, esto fue posible aplicando la tecnología RACE. Sin embargo, solamente la modificación efectuada en esta técnica por los presentes inventores condujo a la generación sorprendente e inesperada de clones de BVDV de auténtica virulencia. Preferentemente, la invención se refiere a un método según la invención, en el que el extremo 5' del AR se genera usando RACE. Sorprendentemente, sólo por medio de la aplicación de la tecnología RACE junto con una polimerasa fue posible disolver eficazmente la estructura secundaria del genoma. El experto en la materia conoce los métodos convencionales de biología molecular que también se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York y Bertram, S. y Gasse, H.G., Gentechnische Methoden, Editorial G. Fischer, Stuttgart, Nueva York, 1991. Preferentemente, la invención se refiere a un método según la invención, en el cual se lleva a cabo RACE con una polimerasa termoestable, que permite temperaturas de reacción de al menos 48 °C, preferentemente 50-55 °C, preferentemente también 56-60°C. Habiendo inventado partículas vivas e infecciosas de BVDV de secuencia definida, los inventores desarrollaron también un método para generar partículas atenuadas de BVDV con una identidad genética definida que, preferentemente, se atenúan en solamente un único sitio de marca genética. Esto permite sorprendentemente la simple determinación de revertientes o la atenuación eficaz, dado que sólo se debe determinar la presencia del sitio de marca genética por métodos de biología molecular conocidos para el técnico. XI E-B y XIKE-C del Ejemplo 1 son ejemplos no limitantes de tales partículas atenuadas de BVDV de secuencia definida. Otro aspecto importante de la invención es un método de atenuación del virus de BVD mediante la introducción de una o más mutaciones en la molécula de ADN según la invención, como se ha descrito anteriormente, o el clon infeccioso de BVDV como se ha descrito anteriormente, en donde dicha mutación o mutaciones conducen a o aumentan un fenotipo atenuado del virus de BVD recuperado . Todavía otro aspecto importante de la invención es un método de atenuación de una cepa de BVDV, que comprende las etapas de y) introducir una o más mutaciones en la molécula de ADN según la invención, como se ha descrito anteriormente, o en el clon infeccioso de BVDV según la invención, como se ha descrito anteriormente; z) introducir el ADN mutado en células ' huésped susceptibles, en las que dicho ADN se trascribe en ARN, o introduciendo un ARN trascrito a partir de dicho ADN en dichas células; y aa) recolectar las partículas virales producidas por estas células ; en las que dicha mutación o mutaciones da como resultado la atenuación. Un aspecto preferido de la invención es un método de atenuación según la invención, como se ha descrito anteriormente, en el cual la mutación o mutaciones consisten en una sustitución, deleción, inserción, adición de un nucleótido, o combinaciones de las mismas. De acuerdo con la invención, "mutación" significa reemplazar un nucleótido por otro (por ejemplo, C por T) , la llamada "sustitución" , o cualquier otra mutación tal como "deleción" o "inserción" . "Deleción" significa la eliminación de uno o varios nucleótidos o aminoácidos. Dado que estos clones infecciosos de BVDV según la invención son virus de auténtica virulencia, semejantes a los virus de tipo salvaje y que, al mismo tiempo, tienen un genotipo definido, dicho virus se debe utilizar como control positivo en experimentos con animales. Dichos clones infecciosos son instrumentos excelentes para generar clones de BVDV específicamente atenuados que se usan, por ejemplo, para la vacunación. La invención comprende clones de BVDV en los que la actividad de la ARNsa residente en la glicoproteínaRNS está inactivada. Preferentemente, dicha actividad de ARNsa está inactivada por una deleción y/u otra mutación, tal como una sustitución. Preferentemente, dichas deleciones y/u otras mutaciones están localizadas en los aminoácidos en posición 295 a 307 y/o posición 338 a 357. Así, un aspecto más preferido de la invención es un método de atenuación según la invención, en el cual la o las mutaciones se encuentran en la glicoproteína Erns y producen la alteración o pérdida de función de la proteína mutada. Un aspecto más preferido de la invención es un método de atenuación según la invención, en el cual la mutación consiste en bb) deleción de toda o parte de la glicoproteína Erns; y/o ce) deleción o sustitución de la histidina en posición 300 de la SEQ ID N° 1; y/o dd) deleción o sustitución de la histidina en posición 349 de la SEQ ID N° 1. De forma muy preferible, todavía otra realización importante es un método para la atenuación de BVDV que comprende la mutación de un clon de BVDV según la invención ¦ en las posiciones de histidina 300 y/o 349, en la que el triplete de codificación se elimina o sustituye.

Todavía otro aspecto importante es un método para la atenuación del BVDV según la invención, en la que el codón para histidina 300 se sustituye por un codón para leucina. Todavía otra realización importante es un método para la atenuación de BVDV según la invención, en el que se elimina el codón para histidina 349. Otra realización importante de la invención es un clon atenuado de BVDV o cepa de BVDV que se puede obtener por un método según la invención. Otra realización importante de la invención es una vacuna que comprende un clon o cepa de BVDV atenuado según la invención, opcionalmente en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente compatible. La invención se refiere, además, al uso de un clon o cepa de BVDV atenuado según la invención en la fabricación de una vacuna para la prevención y el tratamiento de infecciones por BVDV. Preferentemente, una vacuna de la invención se refiere a una vacuna como se ha definido anteriormente, en la cual un componente inmunológicamente activo es un BVDV vivo en el que la actividad de ARNsa en su proteína ?™e está inactivada. La expresión "vacuna viva" se refiere a una vacuna que comprende una partícula capaz de replicación, en particular un componente viral de replicación activa. Preferentemente, una vacuna según la invención comprende un virus de BVD de tipo 1 atenuado según la invención, combinado con un virus BVD de tipo 2 atenuado, según la invención, o cualquier otro grupo antigénico y un vehículo o excipiente farmacéuticamente compatible. Dicha vacuna se puede administrar como vacuna combinada. De forma muy preferente, dicho virus de BVD de tipo 1 atenuado según la invención se puede administrar en primer lugar, seguido de la administración de un virus de BVD de tipo 2 atenuado según la invención, tres a cuatro semanas más tarde. Preferentemente, una vacuna según la invención comprende un virus de BVD de tipo 1 atenuado según la invención, en el que la actividad de ARNsa en su proteína Ems está inactivada, combinado con un virus de BVD de tipo 2 atenuado según la invención, en el que la actividad de ARNsa en su proteína Ews está inactivada, u otro cualquier grupo antigénico en el que la actividad ARNsa en su proteína Ems está inactivada, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente compatible. Dicha vacuna se puede administrar como una vacuna combinada. Deforma muy preferente, dicho virus de BVD de tipo 1 atenuado según la invención, como se ha descrito anteriormente, se puede administrar en primer lugar, seguido de la administración de un virus de BVD de tipo 2 atenuado según la invención, como se ha descrito anteriormente, tres a cuatro semanas más tarde . La invención se refiere preferentemente a un método para tratar un animal bovino infectado por BVDV con un BVDV atenuado según la invención, como se ha descrito anteriormente, en el que dicho BVDV" atenuado o la composición de vacuna, como se ha descrito anteriormente, se administra al animal bovino que la necesita a una dosis adecuada, según los conocimientos de los expertos en la técnica, monitorizando la reducción de los síntomas de BVDV tales como viremia y leucopenia y/o fiebre y/o diarrea. Preferentemente, este tratamiento se puede repetir. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar adicionalmente la presente invención; pero los mismos no se deben considerar como limitantes del alcance de la invención aguí descrita. Ej emplo 1 MATERIALES Y MÉTODOS Células y virus. Se obtuvieron células MDBK de la American Type Culture Collection (Rockville, Md) . Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado con suero de ternero fetal al 10% (FCS; analizado para comprobar la ausencia de pestivirus y anticuerpos contra pestivirus) y aminoácidos no esenciales. La cepa de la diarrea viral bovina New York ' 93 (aislado de campo VLSn°399) fue gentilmente proporcionada por E.J. Dubovi (Facultad de Medicina Veterinaria del Estado de Nueva York, Universidad Cornell, Ithaca) . El virus se sometió a un pasaje por animal y se designó posteriormente como "New York ¾93/C" . Infección de células, ensayo de inmunofluorescencia y ensayo de peroxidasa viral. Puesto que los pestivirus se asocian en gran medida con sus células huésped, se utilizaron lisados de células infectadas para la re-infección de las células de cultivo. Los lisados se prepararon congelando y descongelando células 3 a 5 días después de la infección y se almacenaron a -70 °C. A menos que se indique lo contrario en el texto, se usó una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0,1 para la infección de las células de cultivo. Para los ensayos de inmunofluorescencia y peroxidasa, las células infectadas se fijaron con aceton : metanol (1:1) helados durante 15 min a -20 °C, se secaron al aire y se rehidrataron con solución salina de tampón fosfato (PBS) . A continuación, las células se incubaron con una mezcla de anticuerpos monoespecífieos anti-BVDV dirigidos contra E2 (Weiland et al., 1989) . Después de tres lavados con PBS, se utilizó un anticuerpo anti-ratón de conejo conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Dianova, Hamburgo, Alemania) para detectar los anticuerpos fijados en los ensayos de inmunofluorescencia . Para los ensayos de peroxidasa, se utilizó un anticuerpo anti-ratón de cabra (Dianova) conjugado con peroxidasa como segundo anticuerpo. tras la incubación durante una hora a temperatura ambiente, las células se lavaron tres veces con PBS . Los anticuerpos fijados se detectaron con una solución compuesta por tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,0, aminoetílcarbazol 1 µ? y H202 al 0,1%. Hibridación de Northern (ARN) . Se preparó AR 48 horas después de la infección por centrifugación de gradiente de densidad de cesio, como se ha descrito anteriormente (Rümenapf et al., 1989). Se llevaron a cabo electroforesis sobre gel, mareaje radiactivo de la sonda, hibridación y lavados post-hibridación de la forma anteriormente descrita (Rümenapf et al., 1989). Como sonda se utilizó un producto de PCR marcado radiactivamente (nucleótidos 4301 a 5302) de la cepa New York 93 /C. PCR y RT-PCR. Se efectuó la PCR con Tfl-Polimerasa (Promega, Mannheim, Alemania) o con Taq-Polimerasa (Appligene, Heidelberg, Alemania) , siguiendo las recomendaciones del fabricante y utilizando aprox. 50-100 ng de modelo de ADN y 25 pmol de cada cebador. Las secuencias de los cebadores usados para la amplificación del extremo 5' del genoma fueron, aguas arriba, cebador T25V (Display Systems Biotech, Copenhague, Dinamarca); y aguas abajo, CM79: CTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG para el primer ciclo y CM86: CTCGTCCACATGGCATCTCGAGAC para la PCR anidada. Los cebadores usados para la amplificación del extremo 3' del genoma fueron, aguas arriba, CM46: GCACTGGTGTCACTCTTTG para el primer ciclo y C 80: GAGAAGGCTGAGGGTGATGCTGATG para la PCR anidada, y aguas abajo, nls-: GACTTTCCGCTTCTTTTTAGG . La PCR de transcripción inversa (RT-PCR) se llevó a cabo con el sistema de RT-PCR Titan° de Un Tubo (Boehringer Mannheim, Alemania) , usando 2 g de ARN total como modelo y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los cebadores para la amplificación de la región de codificación de Erns fueron, aguas arriba: C 28: GGAGAGAATATCACCCAGTG ; y aguas abajo, CM21 : CTCCACTCCGCAGTATGGACTTGC . Los productos de RT-PCR amplificada se purificaron por electroforesis sobre gel de agarosa preparativa y elución con el kit Nucleotrap (Macherey-Nagel , Düren, Alemania) , según las recomendaciones del fabricante. Fosforilación y unión de los ADN-oligonucleótidos a los extremos 3' de ARN. Para la unión de un cebador de ADN al extremo 3' del genoma del virus, el cebador se fosforiló. Se incubaron 10 µg del oligonucleótido nls+: CCTAAAAAGAAGCGGAAAGTG con 5 unidades de oligonucleótido-quinasa T4 (New England Biolabs, Schwalbach, Alemania) en 30 1 de una mezcla de guinasas (ATP 2 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM, 25 µg/ml de albúmina de suero bovino) durante 40 min a 37°C. El cebador se hizo pasar a través de una columna de rotación Sephadex G-15 (Sambrook et al., 1989) y se purificó adicionalmente por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol.

La unión se llevó a cabo usando 5 µg de AR total preparado a partir de células de cultivo infectadas y 150 pmol del oligonucleótido fosforilado con 20 unidades de T4-ARN-Ligase (New England Biolabs, Schwalbach, Alemania) en 50 µ? de mezcla de ligasas (Tris-HCl 50 mM pH 7,8, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM, polietilenglicol al 40% y 50 unidades de guardia de ARN (Amersham, Friburgo, Alemania) durante 16 horas a 17 °C. El producto se purificó por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Síntesis y adición de colas de ADN de cadena sencilla. Se generó ADN (-) de cadena sencilla a partir del extremo 5' del genoma viral con DisplayThermo-RT transcriptasa inversa (Display Systems Biotech, Copenhague, Dinamarca) usando 2 µg de ARN total procedente de células infectadas y 100 pmol de cebador CM79 (Véase "PCR y RT-PCR") y siguiendo las instrucciones del fabricante (reacción: 65 °C durante 10 min, 42 °C durante 40 min, 65 °C durante 15 min) . El ADN se purificó mediante dos extracciones secuenciales de fenol/cloroformo y precipitaciones de etanol con 1/4 vol de acetato de amonio 10 M (Schaefer, 1995) . Se añadió una cola poli-dA a la primera cadena de cADN con desoxinucleotidil-transferasa Terminal (TdT) (Roche Molecular Biochemicals , Mannheim, Alemania) usando 50% del producto de "primera cadena" , 50 unidades de transferasa terminal, dATP 6,25 µ? y CoCl2 1,5 mM en 50 µ? de tampón TdT, según recomienda el fabricante. Tras la incubación a 37 °C durante 30 min, el producto se purificó por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Construcción de una biblioteca de cADN y secuenciación de nucleótidos . La síntesis de cADN, clonación y análisis de la biblioteca se llevaron a cabo por lo general de la forma anteriormente descrita ( eyers et al., 1991). La síntesis de cADN se cebó con óligos BVD13, BVD14 y BVD15 (Meyers et al., 1991), así como con B22.1R (GTTGACATGGCATTTTTCGTG) , B12.1R (CCTCTTATACGTTCTCACAACG) , BVD33 (GCATCCATCATXCC-RTGATGAT) , N7-3-7 (CAAATCTCTGATCAGTTGTTCCAC) , B23-RII (TTGCACACGGCAGGTCC) y B-3' (GTCCCCCGGGGGCTGTTAAGGGT-TTTCCTAGTCCA) . La sonda usada para el análisis de la biblioteca fue el inserto Xhol/Aatll de un clon de cADN de la cepa de BVDV cp7 (n° de acceso de GenBank U63479, Meyers et al., 1996b); la hibridación se llevó a cabo a 52 °C. Se utilizaron exonucleasa III y nucleasa SI para establecer bibliotecas de deleción de clones de cADN (Henikoff , 1987) . La secuenciación de nucleótidos de ADN de cadena doble se llevó a cabo con un Kit de Secuenciación BigDye Terminator Cycle (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) . Como norma, se secuenciaron las dos cadenas de los clones de cADN; los solapamientos entre clones de cADN independientes se secuenciaron en al menos dos clones. En total, se analizaron alrededor de 47.000 nucleótidos, lo que equivale a una cobertura global de - 3,8 para todo el genoma. Los análisis de alineaciones de secuencias se realizaron con el software de Genetics Computer Group (Devereux et al., 1984) . Construcción del clon de cADN de longitud total. Los procedimientos de restricción, clonación y otros convencionales se llevaron a cabo, por lo general, de la forma descrita en la bibliografía (Sambrook et al., 1989) . Las enzimas de restricción y de modificación se adquirieron en New England Biolabs (Schwalbach, Alemania) , Pharmacia (Friburgo, Alemania) , GibcoBRL (Eggenstein, Alemania) y Boehringer Mannheim (Alemania) . Para la construcción del clon de cADN de longitud total se utilizaron cinco clones de cADN de la biblioteca: plásmido C3/8 (nucleótidos 35 a 2411) , plásmido C5/11 (nucleótidos 22 a 2400) , plásmido 8/11 (nucleótidos 3400 a 7814) , plásmido 13/27 (nucleótidos 4783 a 9910) y plásmido C4/24 (nucleótidos 8658 a 12322) . Por RT-PCR se obtuvo un fragmento "RT-E2" que iba desde la posición de nucleótido 2144 hasta la posición 4447 con cebadores CM29 (GATGTAGACACATGCGACAAGAACC) y CM51 (GCTTCCACTCTTATGCCTTG) , usando ARN de células MDBK infectadas con el aislado de campo VLSn°399 como modelo. En la descripción siguiente, se subrayan los sitios de restricción del plásmido que flanquean los insertos de cADN viral . En primer lugar, se cortó el clon 3/8 con AatlI e HindIII y se transfirió el inserto de cADN a pACYC177 cortado con las mismas enzimas. El plásmido resultante se designó pKANE5. El producto de RT-PCR "RT-E2" se insertó en los sitios iVdel / HindIII de este plásmido tras la restricción con las mismas enzimas; el plásmido resultante fue ?????d . A continuación, el fragmento Aatil del clon 5/11 se transfirió en el sitio AatlI de pKANE8 , dando lugar al plásmido pKANE14. El extremo 5' del clon de cADN ' recombinante se generó por PCR con cebadores CM87 (GCTCTAGACGGCCGTAATAC-GACTCACTATAGGTATACGAGATTAGCTAAAGAACTCGTATATGGATTGGACGTCAAC) que introduce una secuencia promotora T7 aguas arriba del primer nucleótido de cADN, y CM79 (véase "PCR y RT-PCR") ; se utilizó el plásmido C5/11 como modelo de PCR. El producto de PCR se unió a los sitios Xbal y BsrGI del clon de cADN C5/9, dando como resultado el plásmido pKA E22. Posteriormente, se observó que el óligo CM87 contenía un nucleótido falso y se reparó pKA E22 por PCR con los óligos CM88 (GACGGCCGTAATACGACTCACTATAGTATACG) y CM79. El producto de PCR se trató con ADN-polimerasa I de E. coli (fragmento de Klenow) para producir extremos romos y a continuación se restringió con BsrGI. Se clonó en los sitios Spelromo / BsrGI de pKANE22, dando como resultado el plásmido pKANE22A. El inserto del clon de cADN 8/11 se cortó con Xhol y BamHI y se clonó en pACYC177 cortado con las mismas enzimas; el plásmido resultante se denominó pKANE6. El fragmento Avrll / BawEI del clon de cADN 13/27 se transfirió a p ANE6, dando el plásmido pKANE15. A continuación, se insertó el fragmento BcoRV / Mfel de pKANE14 en pKANE15, digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante fue pKA E21. pKA E21 se digirió con SacII y EcóRV y se clonó un fragmento correspondiente de pKANE14 en estos sitios, conduciendo al plásmido pKA E24. Entonces, se clonó el fragmento SacII /SacII de pKANE22A en pKA E24, cortado con la misma enzima. El plásmido resultante fue pKANE28AII. El extremo 3 ' del genoma se generó por PCR con cebadores B2-11500 (CCTAACCATGATATATGCCTTCTG) y CM81 (CGGA-ATTCGCCCGGGCTGTTAGAGGTCTTCCCTAGT) que añade un sitio Srfl al extremo 3' del genoma. El producto de PCR se cortó con BairíHI y EcoRI y se clonó en pACYC177, dando como resultado el plásmido pKANEi . A continuación, se transfirió el fragmento SacI I Kpn21 del clon de cADN C4/24 a pKA E17; el plásmido se denominó pKA E20. Se escindió el fragmento Stul / EcoRI de pKANE20 y se clonó en el plásmido pKA E21, que se digirió con BcoRI y fue parcialmente digerido con Stul . El plásmido resultante fue pKANE23. Por último, se insertó el fragmento Xbal / Pshhl de pKANE28AII en el plásmido pKANE23 cortado con las mismas enzimas, dando lugar al clon de cADN de longitud total pKANE40.

Mutagé esis dirigida al sitio. Todos los mutantes se generaron por PCR usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene, Amsterdam, Holanda) siguiendo las instrucciones del fabricante. EL plásmido utilizado para introducir mutaciones en la región que codifica Erns fue C5/9, un clon obtenido de la biblioteca de cADN inicial (nucleótidos 50 a 2411) . Los oligonucleótidos para generar ?"3 6"? fueron CM126 (GAGTGGA7ATAAAGGTTGGTGTAAC) y C 127 (GTTACACCAACCTTTATTCCACTC) , los óligos para el imitante H"297"L fueron CM128 (AACAGGAGTCTATTAGGAATTTGGCCA) y CM129 (TGGCCAAATTCCTAATAGACTCCTGTT) . La presencia de las mutaciones deseadas y la ausencia de mutaciones de segundo sitio se verificaron por secuenciacion de nucleótidos. Transcripción in vitro y transfeccion de ARN La transcripción de ARN y la transfeccion de células MDBK se efectuaron básicamente de la forma anteriormente descrita ( eyers et al., 1996a). En pocas palabras, se linealizaron 2 µ9 de la correspondiente construcción de cADN con Srfl y se purificaron por extracción de fenol y precipitación de etanol . La transcripción con ARN-polimerasa T7 (NEB, Schwalbach, Alemania) se llevó a cabo en un volumen total de 50 µ? de mezcla de transcripción (Tris-HCl 40 mM, pH 7,5; MgCl2 6 mM; espermidina 2 mM; NaCl 10 mM; ATP, GTP, CTP y UTP 0,5 mM para cada uno; ditiotreitol 10 mM; 10 µg/ml de albúmina de suero bovino) con 50 unidades de ARN-polimerasa T7 en presencia de 15 unidades de guardia ARN (Pharmacia, Friburgo, Alemania) . Tras la incubación a 37 °C durante 1 h, la mezcla de reacción se hizo pasar a través de una columna de rotación de Sephadex G-50 y se purificó adicionalmente por extracción de fenol y precipitación de etanol. Si no se especifica lo contrario, la transfección se llevó a efecto con una suspensión de aprox. 3xl06 células MDBK y alrededor de 0,5 µ9 de ARN trascrito in vi tro unido a DEAE-dextrano (Pharmacia, Friburgo, Alemania) . El complejo ARN/DEAE-dext ano se estableció mezclando ARN disuelto en 100 µ? de HBSS (5 g de Hepes, 8 g de NaCl, 0,37 g de KC1, 0,125 g de Na2HP04-2H20 y 1 g de dextrosa por litro; pH 7,05) con 100 µ? de DEAE-dextrano (1 mg/ml en HBSS) e incubación durante 30 minutos sobre hielo. Las células granuladas se lavaron una vez con DMEM sin FCS, se centrifugaron y se volvieron a suspender en la mezcla de ARN/DEAE-dextrano. Después de 30 minutos de incubación a 37 °C, se añadieron 20 µ? de dimetilsulfóxido y la mezcla se incubó durante 2 minutos a temperatura ambiente. Tras la adición de 2 mi de HBSS, las células se aglomeraron y lavaron una vez con HBSS y una vez con medio sin FCS. Las células se re-suspendieron en DMEM con FCS y se sembraron en una placa de 10,0 cm de diámetro. 48 h a 72 h después de la transfección, las células se separaron y sembraron de forma apropiada para posteriores análisis. Se utilizó electroporación para la determinación de la infectividad especifica del AR . Se mezclaron 3xl06 células MDBK en 0,5 mi de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin magnesio ni calcio, con cantidades adecuadas de ARN y se transfirieron a una cubeta de electroporación de 2 mm. La electroporación se realizó con un pulso de 960 µ?, 180 voltios en un Progenetor II Hoefer PG 200. A continuación, las células se sembraron en placas de 3,5 cm y se analizaron por inmunofluorescencia aproximadamente 20 h más tarde. Determinación de la actividad de ARNsa. Las células MDBK se infectaron con los virus recombinantes y se cultivaron durante 48 horas. Las células infectadas con un virus de tipo salvaje sirvieron como controles positivos y se usaron células no infectadas como controles negativos. La preparación de las células y la medición de la actividad de ARNsa se llevaron a cabo de la forma descrita anteriormente (Meyers et al., 1999), con la excepción de que la incubación de las sondas a 37°C fue de 30 min en lugar de 1 hora, porque una incubación más prolongada dio como resultado una actividad de. fondo considerable en las células MDBK. Experimentos animales. Se llevaron a cabo dos experimentos con animales para ensayar los virus recombinantes . En el primer experimento, se inocularon por vía intranasal 3 animales de ganado bovino manchado (8 a 10 meses de edad) con 105TCID50 por animal. En el segundo experimento, se infectaron por vía intranasal 6 terneros machos Holstein y Holstein cruzados (7 a 10 semanas de edad) con 5xl05TCID50. En el experimento de estimulación, los animales se inocularon con 5xl06TCID50. Antes de la infección, se comprobó que todos los animales estuvieran libres de antígenos y anticuerpos específicos para BVDV. Los diferentes grupos se albergaron en unidades de aislamiento separadas. Se registraron los parámetros clínicos a diario, según se indica en la sección de resultados. Se extrajo sangre de la vena yugular exteARJSf en los tiempos indicados en la sección de resultados y se estabilizó con heparina (aprox. 35 U.I./ml), a menos que se usara para la producción de suero. Con el fin de determinar la presencia de virus en sangre, se prepararon capas leucocíticas (en inglés, "buffy coats") a partir de todas las muestras de sangre. Se añadieron 5 mi de tampón de lisis helado a una parte alícuota de sangre estabilizada con heparina (que contenía aprox. 107 leucocitos) y se incubó sobre hielo durante 10 min, seguido de centrifugación. El granulado se lavó una vez con tampón de lisis y dos veces con PBS sin Ca2+ ni g2+ antes de volver a suspenderlo en 2 mi de PBS. Las células MDBK sembradas en placas de 24 pocilios se inocularon con 200 µ? de las preparaciones de capas leucocíticas y se incubaron durante 5 días. El antígeno viral se detectó por microscopía de inmunofluorescencia con la mezcla BVDV E2 mAb (véase más arriba) .

La presencia de anticuerpos neutralizantes del virus se ensayó en muestras de suero que habían sido inactivadas por incubación a 56 °C durante 30 min. Los sueros se diluyeron en etapas de 1:2 en placas de microtitulación de 96 pocilios y se inocularon con una suspensión de la cepa New York *93/C (100 TCID50 por pocilio) durante 1 hora a 37°C. S añadieron 101,75 células DBK a cada pocilio y se incubó durante 5 días. La infección se analizó por inmunofluorescencia, se calculó por el método de Kaerber ( ayr et al., 1974) y se expresó como la dilución final al 50% que neutralizó aprox. 100 TCID50. Para detectar virus en las secreciones nasales, se recogieron muestras de dichas secreciones en los tiempos indicados en la sección de resultados, se diluyeron en 2 mi de tampón de transporte (PBS suplementado con FCS al 5%, 100 U.I./ml de penicilina G, 0,1 mi de estreptomicina y 2,5 µ9/p?1 de anfotericina B) y se hizo pasar a través de un filtro de 0,2 µp?. Se inocularon células MDBK en placas de 24 pocilios con 100 µ? de estas preparaciones y se analizaron por microscopía de inmunofluorescencia indirecta después de 5 días . RESULTADOS Análisis del genoma. La cepa ??'93/C es el segundo genoma de BVDV de tipo 2 que ha sido completamente secuenciado. El análisis de transferencia de Northern demostró que, al contrario que la cepa 890 (Ridpath y Bolín, 1995) , el genoma de ??'93/C no contiene grandes inserciones o deleciones (datos no mostrados) . El análisis de secuencia de nucleótidos reveló que el genoma tiene 12332 nucleótidos de longitud y contiene un marco de lectura abierta que codifica una poliproteína de 3913 aminoácidos. La región 5' no traducida (posición 1 a 385) se determinó por tecnología RACE y demostró ser idéntica a la secuencia de New York '93 publicada por Topliff y Kelling (1998), excepto la posición 21. Al contrario que otros genomas de tipo 2 conocidos (Ridpath, 1995; Topliff y Kelling, 1998), la cepa ??'93/C tiene en esta posición adenina en lugar de timina. Construcción y análisis de un clon de cADN infeccioso para ??'93/C. Aunque se ha establecido una serie de clones de cADN infecciosos para CSFV y BVDV de tipo 1 (Méndez et al., 1998; eyers et al., 1996a y 1996b; Moormann et al., 1996; Vassilev et al., 1997; Kümmerer y Meyers, 2000), este es el primer informe de un clon infeccioso de una cepa de BVDV de tipo 2. El clon se diseñó para la transcripción de segunda vuelta con ARN-polimerasa T7, que da como resultado un ARN semejante al genoma sin ninguna adición heterologa. El clon de longitud total se constituyó a partir de cuatro plásmidos de cADN seleccionados de la biblioteca inicial de fagos y un producto de RT-PCR que incluyó la región entre las posiciones 2265 y 4301. En el extremo 5', se añadió la secuencia del promotor T7 para la transcripción in vi tro y se añadió un sitio Srfl al extremo 3' para la linealización del plásmido (Fig. 1). El clon de longitud total se denominó pKANE40A. Se transfectaron células MDBK con ARN generado a partir del modelo linealizado pKANE40A por transcripción in vitro. Como control negativo sirvió un transcrito de segunda vuelta del plásmido pKA E28AII que termina 19 codones aguas arriba de la región de codificación NS5B . Tres días después de la transfección, se detectaron señales específicas de BVDV tras la tinción inmunofluorescente en células transfectadas con ARN de pKA E40A, pero no así en los controles. El virus generado a partir del clon infeccioso pKANE40A se denominó XIKE-A. Las células transfectadas se sometieron a dos pasajes y el stock del segundo pasaje se usó para todos los experimentos posteriores. El virus se analizó por secuenciación de RT-PCR, considerando el intercambio de nucleótidos de C a T en la posición 1630 como prueba de la identidad de XIKE-A. La infectividad específica del ARN derivado de pKANE40A se determinó en comparación con el ARN preparado a partir de células infectadas con el virus de tipo salvaje ??'93/C. A tal efecto, se midió la concentración de ARN viral en muestras usadas para la transfección de células MDBK, en comparación con cantidades definidas del ARN trascrito in vitro tras transferencia Northern e hibridación, utilizando un dispositivo de imágenes fosforescentes. Se transíectaron células MDBK con cantidades similares de ambos ARNs y se contaron las placas tres días después de la transfección . En promedio, la infectividad del ARN derivado de pKANE40A fue 4,32 x 102 ufp/ g y el ARN de tipo salvaje dio 4 x 102 u£p/µg.

Se analizaron las características de crecimiento del virus recombinante a través de una curva de crecimiento, usando el aislado de campo original VLSn°399 como control en el mismo experimento (Fig. 2) . Se infectaron células MDBK con una m.o.i. de 0,1 y se tomaron muestras a siete intervalos desde 2 horas hasta 96 horas después de la infección. La curva de crecimiento del XIKE-A recombinante es algo más plana que la de VLSn°399, pero ambos virus alcanzan un título de 106'39 después de 96 horas. Se consideró, por tanto, que XIKE-A es adecuado para posteriores experimentos. Construcción y análisis de imitantes Erns . Experimentos previos con CSFV (Meyers et al., 1999) habían demostrado que la actividad de ARNsa de la glicoproteína Erns se destruye por la sustitución de histidina 297 ó 346 (las cifras representan las posiciones del residuo en la cepa de CSFV Alfort/Tübingen) por leucina o lisina, o por deleci.n del codón "H346" . Los virus mutantes son viables, pero están clínicamente atenuados. En la cepa de BVDV ??'93/C, los dos residuos de histidina están localizados en las posiciones 300 y 349, respectivamente. Para ensayar si los efectos de mutaciones en estas posiciones pudiesen ser similares a CSFV en el genoma del BVDV de tipo 2, se desarrollaron por ingeniería dos clones infecciosos con una deleción del codón "H349" o una sustitución del codón "H300" por leucina. Los mutantes virales resultantes se denominaron XIKE-B (?349?) y XIKE-C (H300L) . Ambos mutantes fueron estables en células MDB durante al menos cinco pasajes, según se determinó por secuenciación de nucleótidos de productos de RT-PCR que comprenden la región de codificación Erns . Las características de crecimiento de los dos virus mutantes se compararon con el virus derivado del clon infeccioso de tipo salvaje XIKE-A (Fig. 3) . Se determinó la actividad de AR sa de XIKE-A, XIKE-B y XIKE-C en extractos celulares brutos de células infectadas con la misma m.o.i. de cualquiera de los virus dos días después de la infección. Se analizó la capacidad de degradar poli (U) de partes alícuotas de las preparaciones; las células infectadas con la cepa de tipo salvaje ??'93/C sirvieron como control positivo y se usaron células no infectadas como controles negativos. Después de 30 min de incubación, precipitó el ARN de alto peso molecular, residual, y la medición de OD2So de los sobrenadantes reveló la presencia de pequeños fragmentos degradados de AR (Meyers et al., 1999) . Se encontró una elevada actividad de ARNsa en las muestras de ??'93/C y XIKE-A, en tanto que los dos mutantes, XIKE-B y XIKE-C, se encontraron al mismo nivel que el control negativo (Fig. 4) . Experimentos animales con XIKE-A y ?'93/C. El propósito del primer experimento animal fue comparar la virulencia y patogenia del virus recombinante XIKE-A derivado del clon de cADN infeccioso con la cepa de tipo salvaje ??'93/C. Se infectaron dos grupos de tres animales (8 a 9 meses de edad) con 105TCID50 de XIKE-A (animales n° 615, n° 377, n° 091) o ??'93/C (animales n° 275, n° 612, n° 1610) . Cada grupo se albergó en una unidad de aislamiento separada. Se registraron a diario la temperatura corporal y signos clínicos; se tomaron muestras de sangre en los días 0, 2 a 16 21 después de la infección para el recuento de leucocitos y detección de viremia. Se recogieron sueros de todos los terneros para la detección de anticuerpos neutralizantes contra ??'93/C en los días 0, 1, 14, 21, 19 y 35 después de la infección. Se realizaron frotis nasales para aislamiento del virus en los días 0, 2 a 16 y 21 después de la infección.

Aislamiento de virus a partir de preparaciones Aislamiento de virus a partir de frotis de capas leucocíticas nasales Día p.i. n° n° " n° n° n° n° n° n° n° n° n° n° 275 612 1610 615 377 091 275 612 1610 615 377 091 -26 - - - - - - - 0 - - - - - - - 2 - - - - - - - 3 ++ - - -+ ++ ++ - 4 -+ ++ ++ ++ ++ -+ - 5 ++ ++ +- ++ ++ ++ - 6 ++ ++ ++ ++ ++ ++ - 7 ++ -+ ++ ++ ++ ++ - 8 ++ - - ++ ++ ++ - 9 - - - - ++ - ++ +- - ++ ++ ++ 10 - - - - - - bac +- bac +- 11 ++ - - - - - bac - - - - - 12 - - - - - - - 13 - - - - - ++ - 14 - - - - - * * 15 - - - - - * * 16 - - - - - * * 21 - - - - - * * Total ø 7 4 4 6 7 7 1 1 0 2 1 2 5 6,7 0,7 1,7 Tabla 1: aislamiento de virus a partir de preparaciones de capá leucocítica y frotis nasales de animales infectados con New York '93/C o XIKE-A. + Virus detectado; - ausencia de detección de virus; bac = bacterias; * el animal se sometió a eutanasia el día 13 después de la infección. Todos los animales en ambos grupos desarrollaron fiebre (Fig. 5) y un amplio espectro de signos clínicos, incluidos síntomas respiratorios y trastornos gastrointestinales. El animal n° 091. fue sacrificado el día 13 después de la infección por motivos humanitarios . Todos los terneros de ambos grupos mostraron leucopenia que se inició el día 3 después de la infección y que persistió hasta el día 15 después de la infección (Fig. 6) . El virus se detectó en las preparaciones de capa leucocítica de animales infectados con NY' 93/C "durante 5 días y con XIKE-A durante 7 días. Se observó secreción nasal durante 1 ó 2 días (Tabla 1) . La identidad de los virus se comprobó por secuenciación de nucleótidos de productos de RT-PCR de ARN preparado a partir de las preparaciones de capa leucocítica de todos los animales. Se secuenció la totalidad de la región de codificación Ems (posiciones 114-0 a 1780) y se demostró que era idéntica a las secuencias conocidas de ??'93/C o XIKE-A, respectivamente. Se encontraron anti-cuerpos neutralizantes en el suero de todos los terneros a partir del día 14 después de la infección (Tabla 2) Días p.i. 615 377 091 275 612 1610 -26 <2 <2 <2 <2 <2 <2 0 <2 <2 <2 <2 <2 <2 7 <2 <2 <2 <2 <2 <2 13/14 645 323 406 256 128 40 21 1024 1290 * 1290 512 51 29 2580 4096 * 813 2580 2580 35 3251 3251 * 8192 2580 5161 * El animal se sometió a eutanasia el día 13 Tabla 2. Títulos de anticuerpos neutralizantes determinados en muestras de suero de todos los terneros después de la infección experimental con New York '93/C o XIKE-A. Los resultados se expresan como el recíproco de los títulos de anticuerpos neutralizantes específicos para BVDV en suero contra New York ¾93/C (102'07TCID50) . Los resultados de este estudio demostraron que el virus recombinante XIKE-A es muy similar al virus de tipo salvaje New York ' 93/C con respecto tanto a la patogenia como a la inducción de una respuesta inmunológica en el huésped natural. Resulta, por tanto, posible suponer que cualquier desviación de este cuadro clínico que pudiera observarse en un mutante viral generado sobre la base del clon infeccioso pKANE40A estaría causada por la mutación deseada. Experimento animal con XIKE-B y XIKE-A. En el segundo experimento con animales, se analizaron las características clínica e inmunológicas del mutante ARNsa-negativo XIKE-B, en comparación con XIKE-A. El mutante ?349? recibió precedencia sobre el mutante H300L para minimizar el riesgo de reversión genómica al tipo salvaje. En dos grupos de tres terneros cada uno (de 7 a 10 semanas de edad) se inoculó una dosis de 5xl05TCID50 de XIKE-A (animales na 387, n° 388, n° 418) o virus XIKE-B (animales n° 415, n° 417, n° 419) . Los grupos se albergaron en unidades separadas de aislamiento. Diariamente se controlaron la temperatura rectal y los síntomas clínicos; se tomaron frotis nasales y muestras de sangre en los días -8, 0, 2 a 14, 17 y 21. Se recogieron muestras de suero en los días 0, 8, 12/14, 21, 28 y 38/40. 9 a 10 días después de la infección, los terneros infectados con XIKE-A desarrollaron fiebre por un período de hasta 3 días; además, el animal n° 387 tuvo fiebre el día 3 después de la infección (Fig. 7) , que se acompañó de diarrea y síntomas respiratorios. El ternero n° 388 sufrió convulsiones. El grupo se sometió a eutanasia por razones humanitarias el día 12 después de la infección, en un estado de marcada depresión y anorexia. Ninguno de los terneros infectados con XIKE-B mostró aumento de la temperatura corporal (Fig. 7) . Sólo se observaron leves síntomas respiratorios hasta el día 6. Se observó leucopenia en todos los animales; sin embargo, el descenso del número de leucocitos fue más pronunciado en los terneros infectados con XIKE-A de tipo salvaje que en el grupo XIKE-B (Fig. 8) . Se detectó el virus en las preparaciones de capas leucocíticas de todos los animales a partir del día 4 después de la infección; no obstante, la viremia fue más breve para el mutante E™5 (0 4 días) que para el virus con la secuencia de tipo salvaje (0 8 días) . Se pudo observar secreción nasal del virus durante un período de hasta 8 días (0 4,7) en los animales de XIKE-A, pero sólo durante un máximo de 1 día (0 0,7) en los animales de XIKE-B (Tabla 3).

Aislamiento de virus a partir de preparaciones Aislamiento de virus a partir de frotis de capa leucocítica nasales Días n° n° n° n° n° n° n° n° n° n° n° n° p.i. 415 417 419 387 388 418 415 417 419 387 388 418 -8 - - - - - - - - - - - - o - - - - - - - - - - - - 2 - - - - - - - - - - - - 3 - - - - - - - - - - - - 4 +- +- - ++ ++ ++ - - - - - - 5 ++ +- +- ++ ++ ++ - - - - - +- 6 ++ +- ++ ++ ++ ++ - +- - - - +- 7 ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - +- +- - +- 8 - +- - ++ ++ ++ - - - - - +- 9 - - - ++ +- ++ - - - ++ ++ +- 10 - - - ++ +- +- - - - +- +- ++ 11 - - - ++ +- ++ - - - +- - +- 12 - - - - - - - - - - - ++ 13 * - - - * * - - - * * * 14 - * * * - - * * - - - * 17 - - - * * * - * * * - - 21 * * * - - - - - - * * * tota! 4 5 3 8 8 8 0 1 4 2 8 0 4 8 0,7 1 4,7 Tabla 3. Aislamiento de virus a partir de preparaciones de capa leucocítica y frotis nasales de animales infectados con el virus recombinante XI E-A (animales n° 38, n° 388 y n° 418) o el mutante Ems XIKE-B (animales n° 415, n° 417 y n° 419) . + Virus detectado, - ausencia de detección de virus, * animales sometidos a eutanasia el día 12 después de la infección. Nuevamente, se utilizó la secuenciación de nucleótidos de productos de RT-PCR que comprendían la totalidad de la región de codificación Ems para la identificación del virus en las preparaciones de capa leucocítica. Como era de esperar, los aislados de los animales n° 387, n° 388 y n° 418 fueron del tipo salvaje. Se confirmó una deleción del codón "H349" para los animales n° 415, n° 417 y n° 419. Es interesante destacar que se encontró una mutación puntual adicional en los productos de RT-PCR de dos de estos animales (n° 415 y n° 419) : la posición de nucleótido 1246 cambió de guanina a timina, dando como resultado la sustitución del aminoácido Q287H. Se detectaron por primera vez anticuerpos neutralizantes el día 12 después de la infección en el suero de terneros infectados con XIKE-A y el día 14 después de la infección en el suero de terneros infectados con el mutante Ems (Tabla 4) . Días p.i. 387 388 418 415 417 419 0 <2 <2 <2 <2 <2 <2 8 <2 <2 <2 <2 <2 <2 12/14 20 8 128 51 203 64 21 * * * 512 1024 406 28 * * * 2048 1024 4096 38/40 * * 8182 4096 4096 * los animales se sometieron a eutanasia el día 12.

Tabla 4 : Títulos de anticuerpos neutralizantes determinado en muestras de suero de todos los terneros después de 1 infección experimental con XIKE-A (secuencia de tipo salvaje) o XIKE-B (H346?) . Los resultados se expresan como el recíproco de los títulos de anticuerpos neutralizantes específicos para BVDV en suero contra New York ' 93/C (lO^TCIDso) . Ejemplo 2 Diseño experimental Se seleccionaron 12 novillas preñadas de un rebaño negativo para BVDV. Se incluyó en el ensayo el siguiente grupo de 5/7 novillas: N° Inoculación Virus Grupo 1 : Una administración i.n., 3 mi en cada XIKE-A fosa nasal Grupo 2: Una administración i.n., 3 mi en cada NY-93 fosa nasal Las novillas se trasladaron a las instalaciones experimentales 8 días antes de las inoculaciones. Se confirmó la preñez después del transporte a la instalación experimental. Las novillas estaban en el día 60 a 90 de gestación el día de la inoculación. La inoculación se llevó a efecto en todos los animales en un mismo momento con 2,5 x 104 TCID50/ml del correspondiente virus, aplicados en 6 mi de sobrenadante de cultivo de tejido.

En las novillas se controló la presencia de signos clínicos de infección por BVDV, incluido el aborto,- durante el período de observación. El experimento finalizó 9 semanas después de la infección. Las vacas que no abortaron se sacrificaron y se examinaron y recolectaron sus úteros. Se tomaron muestras de los órganos fetales durante la necropsia • de rutina y se examinaron en busca de infección por BVDV. La presencia de infección fetal fue el principal parámetro de evaluación, compuesto por el índice de mortalidad de vacas relacionada con el BVDV, el número de abortos relacionados con el BVDV y el número de fetos BVDV- positivos a término.

Resultados : Grupo 1 Animal n° Conclusión 526 Aborto por BVD 598 Aborto por BVD 615 Aborto por BVD 618 Aborto por BVD 626 Novilla muerta por BVD Grupo 2 Animal n° Conclusión 184 Novilla muerta por BVD 203 Aborto por BVD 232 Novilla muerta por BVD 233 Feto BVD-positivo (virémico) 252 Aborto por BVD 267 Novilla muerta por BVD 306 Aborto por BVD Ej emplo 3 : El estudio pretendió evaluar la eficacia de aislados de BVDV contra la infección fetal. Se investigó la eficacia de la copia infecciosa de NY93, derivado del BVDV recombinante (tipo II) con una deleción de la función de ARNsa en la proteína Ems , XIKE-B (?349?) , para prevenir la infección fetal tras una estimulación heteróloga de tipo I . Entre los días 60 y 90 es el período más sensible para la exposición fetal al BVDV. Por lo tanto, en este ensayo, novillas procedentes de una granja libre de BVDV (y con confirmación de seronegatividad) se inmunizaron por medio de una única exposición con XIKE-B. (i.m.) . A continuación, las novillas se inseminaron y, entre los días 60-90, es decir, el período en que se supone que los animales son altamente sensibles a la infección fetal por BVDV, se llevó a cabo una infección de estímulo con un virus de campo de tipo salvaje. Se seleccionó la vía intranasal de estimulación puesto que imita mejor la vía normal de infección en el campo. Diseño experimental: Las novillas se seleccionaron de un rebaño negativo para BVDV . Se demostró serológica y virológicamente su negatividad para BVDV . Se incluyeron en el ensayo los siguientes grupos de novillas: El grupo 1 se mantuvo sin tratamiento en el rebaño de origen hasta la estimulación. Se tomaron muestras de sangre después de la vacunación para la preparación de capas leucocíticas y serologí . Las inseminaciones se iniciaron 4 semanas después de la inmunización en todos los grupos. El grupo 1 se trasladó a las instalaciones experimentales antes de la estimulación. Las novillas se estimularon 4 meses y 10 días después de la vacunación. En el día de la inoculación, la preñez se encontraba entre los días 60 y 90. El parámetro principal de evaluación fue la prevención de la infección fetal .

Secuencia de acontecimientos y programación en el tiempo Virus de estimulación con BVDV El virus se cultiva en un medio exento de BVDV según considere apropiado, se divide en partes alícuotas y congela a -70°C (± 10°C) .

Vacunaciones El programa de vacunación se describe en la sección de Diseño Experimental.

Descripción: XIKE-B, virus vivo de cepa BVDV Número de pasajes: 10 Dosis de virus: 105 por animal Volumen aplicado de vacuna: 2 mi por animal Vía de aplicación: Intramuscular (i.m.) Resultados : Temperaturas rectales Los valores de temperatura fueron inferiores a 39 °C en todos, excepto un caso y no se registraron fluctuaciones inusuales durante el período de observación. La novilla n° 1249 (Grupo 1) tuvo "una temperatura de 39,1°C el día 14 después de la infección (DPI = día después de la infección) , que se normalizó al día siguiente. Recuentos de leucocitos Los valores de 0 DPI se consideraron como los iniciales individuales para comparación. No se definió ningún límite inferior para los recuentos de leucocitos en el protocolo del estudio. Sin embargo, se consideró biológicamente significativa una reducción de los recuentos de leucocitos de 40% o más, es decir, valores que alcanzaran 60% del valor inicial (establecido el día de la estimulación) , o inferiores . Los recuentos medios individuales de leucocitos se muestran en la siguiente Tabla 1.

Tabla 1. Recuentos medios individuales de leucocitos Grupo 1 Grupo 2 *Las muestras del día 0 se tomaron el día previo a ¦ la infección Los valores iniciales de los recuentos de leucocitos fueron similares en todos los grupos. Mientras que las dos novillas del Grupo 1 (infectadas con la cepa de Tipo I) experimentaron una reducción biológicamente significativa de los recuentos de leucocitos (valores destacados con color gris) tras la estimulación (descenso máximo registrado 4-8 DPI) , las novillas correspondientes vacunadas (Grupo 2 ) no mostraron reducciones destacables de los leucocitos. La única excepción fue la novilla n° 1197, que evidenció un descenso significativo en un solo día, el día 14 después de la infección. Al día siguiente, el recuento de leucocitos retornó a los valores considerados normales (desviación inferior a 40% del valor inicial) .

Datos de aislamiento de virus Los métodos aplicados para las investigaciones de aislamiento de virus se detallan en los ejemplos anteriores.

Datos de aislamiento de virus a partir de capas leucociticas (descritos como día después de la infección (= DPI) con candidato de vacuna (XI E-B) : Aislamiento de virus a partir de órganos fet Grupo ID Ganglios Intestino Bazo Timo Riñon Médula Cerebelo Placenta animal linfáticos delgado ósea del mesentéricos esternón 1 1126 + + + + + + + + 1 1249 + + + + + + + + 2 1197 - - - - - - - - 2 1200 - - - - - - - - 2 1214 - - - - - - - - 2 1217 - - - - - - - - Ninguna de las novillas mostró síntomas clínicos típicos de la infección por BVDV tras la vacunación con XIKE-B. tras la estimulación, las novillas del grupo 1 mostraron, al menos durante un día, viremia, en tanto que en el grupo 2 no se pudo detectar viremia ningún día después de la estimulación.

Todos los fetos de las novillas del grupo 1 fueron positivos para BVDV (todos los siguientes órganos fueron positivos para BVDV por aislamiento de virus (ganglios linfáticos mesentéricos ; intestino delgado, bazo, timo, riñon, esternón, médula ósea, cerebelo) ) ; los fetos de las novillas del grupo 2 fueron negativos en todos los casos (consistentemente en todos los órganos analizados: ganglios linfáticos mesentéricos; intestino delgado, bazo, timo, riñon, esternón, médula ósea, cerebelo) para BVDV. Por consiguiente, el virus infeccioso derivado de la copia fue eficazmente atenuado y se demostró el potencial de uso como virus de vacuna destinado a prevenir la infección fetal . Desde el punto de vista antigénico, el virus XIKE-B pertenece a los virus de BVDV de tipo II y es eficaz en la prevención de la infección fetal tras la estimulación con un virus de estimulación heterólogo perteneciente al grupo antigénico de BVDV de tipo I.

Bibliografía Baker, J.C. 1987. Bovine viral diarrhea virus: a review. J. AM. Vet. Med. Assoc. 190: 1449-1458 Becher, P., Orlich, M., Kosmidou, A., Kónig, M. , Baroth, M. , Thiel, H.J., 1999. genetic ' Diversity of Pestivirus: Identification of Novel Groups and Implications for Classification. Virology 262: 64-71.

Bolin, S.R., Littledike, E.T. and Ridpath, J.F. (1991) : Serologic detection and practical consequences of antigenic diversity among bovine viral diarrhea viruses in a vaccinated herd. Am. J. Vet. Res. 52:1033-1037.

Devereux, J. , Haeberli, P. and Smithies, O. (1984) : A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic Acids Res. 12:387-195.

Flores, E.F., Gil., L.H., Botton, S.A., Weiblen, R. , Ridpath, J.F., Kreutz, L.C., Pilati, C, Driemeyer, D. , Moojen, V. and Wendelstein, A.C. (2000) : Clinical, pathological and antigenic aspects of bovine viral diarrhea virus (BVDV) type 2 isolates identified in Brazil. Vet. Microbiol . 77:175-83.

Henikoff, S. (1987) : Unidirectional digestión with exonuclease III in ADN sequence analysis. Methods Enzymol. 155:156-165.

Hulst, M.M. , Panoto, F.E., Hoekman, A. , van Gennip, H.G. and Moormann, R.J. (1998) : Inactivation of the ARNse activity of glycoprotein E(rns) of classical s ine fever virus results in a cytopathogenic virus. J. Virol. 72:151-7.

Kümmerer, B.M., Tautz, N. , Becher, P., Thiel, H. and Meyers, G. (2000) : The genetic basis for cytopathogenicity of pestiviruses . Vet. Microbiol. 77:117-28.

Mayr, A. , Bachmann, P.A., Bibrack, B. and Wittmann, G. (1974): Virologische Arbeitsmethoden Band I. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart .

Méndez, E . , Ruggli, N. , Collett, M.S. and Rice, C.M. (1998): Infectious bovine viral diarrhea virus (strain NADL) ARN from stable cADN clones : a cellular insert determines NS3 production and viral cytopathogenicity. J. Virol. 72:4737-45.

Meyers, G. , Tautz, N. , Dubovi, E.J. and H.-J- Thiel (1991): Viral cytopathogenicity correlated with integration of ubiquitin-coding seguences. Virology 180:602-616. Meyers, G. , Thiel, H.J. and Rumenapf, T. (1996a): Classical swine fever virus: recovery of infectious viruses fron cADN constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles. J. Virol. 70:1588-95.

Meyers, G. , Tautz, N. , Becher, P. , Thiel, H.-J., Kümmerer, B.M. (1996b) : Recovery of cytopathogenic and noncytopathogenic bovine viral diarrhea viruses from cADN constructs. J. Virol. 70:8606-13 (erratum J. Virol. 1997, 71:173) Meyers, G. , Saalmüller, A. and Büttner, M. (1999): Mutations abrogating the AR se activity in glycoprotein Erns of the pestivirus classical swine fever virus leads to virus attenuation. J. Vi ol. 73: 10224-10235.

Moennig, V. and Liess, B. 1995. Pathogenesis of Intrauterine Infections with Bovine Viral Diarrhea Virus. 11: (3), 477-487.

Moennig, V. and Plagemann, J. 1992. The pestiviruses . Adv. Virus Res. 41:53-91.

Moormann, R.J., van Gennip, H.G., Miedema, G.K., Hulst, M.M. and van Rijn, P.A. (1996) : Infectious ARN transcribed from an engineered full-length cADN témplate of the genome of a pestivirus. J. Virol. 70:763-70.

Oirschot van, J.T., Bruschke, C.J.M., Rijn van, P.A., 1999. Vaccination of cattle against bovine viral diarrhea. Veterinary Microbiology, 64:169-183.

Racaniello, V.R. and Baltimore, D. , 1981. Cloned poliovirus complementary ADN is infectious in mammalian cells. Science 214 ¡916-919.

Ridpath, J.F., Bolin, S.R. and Dubovi," E.J. (1994) : Segregation of bovine viral diarrhea virus into genotypes . Virology 205:66-74.

Ridpath, J.F. and Bolin, S.R. (1995): The genomic seguence of a virulent bovine viral diarrhea virus (BVDV) from the type 2 genotype: detection of a large genomic insertion in a noncytopathic BVDV. Virology 212:39-46. Ridpath, J.F., Neill, J.D. (2000) : Detection and characterization of genetic recombination in cytopathic type 2 bovine viral diarrhea viruses. J. Virol . 74:8771-4.

Ridpath, J.F., Neill, J.D., Frey, M. , Landgraf, J.G. (2000): Phylogenetic, antigenic and clinical characterization of type 2 BVDV from North America. Vet. Microbiol . 77:145-55.

Rümenapf, T . , Meyers, G. , Stark, R. and Thiel H.-J. (1989) : Hog cholera virus characterization of specific antiserum and identification of cADN clones. Virology 171:18-27.

Sambrook, S.E., Fritsch, F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Schaefer, B.C. (1995) : Revolutions in Rapid Amplification of cADN Ends : New Strategies for Polymerase Chain Reaction Cloning of Full-Length cADN Ends. Anal. Biochem. 227:255-273.

Thiel, H.-J., Stark, R., Weiland, E. , Rümenapf, T. and Meyers, G. (1991) : Hog cholera virus: molecular composition of virions from a pestivirus . J. Virol . 65:4705-4712.

Thiel, H.-J., Plagemann, G.W. and Moennig, V. 1996. The pestiviruses . In Fields Virology, eds. Fields, B.N. , Knipe, D.M., and Howley, P.M. (Lippincott-Raven, Philadelphia) , pp. 1059-1073.

Tijssen, P. Pellerin, C, Lecomte, J. (1996): Immunodominant E2 (gp53) seguences of highly virulent bovine viral diarrhea group II viruses indícate a close resemblance to a subgroup of border disease viruses. Virology 217:356-361.

Topliff, C.L. and Kelling, C.L. (1998) : Virulence markers in the 5' untranslated región of genotype 2 bovine viral diarrhea virus isolates. Virology 250:164-72.

Van Gennip, H.G., van ijn, P.A., Widjojoatmodjo, M.N. , Moormann, R.J. (1999) : Recovery of infectious classical swine fever virus (CSFV) from full-length genoraic cADN clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 ARN polymerase. J. Virol . Methods 78:117-128.

Vassilev, V.B., Collett, M.S. and Donis, R.O. (1997): Authentic and chimeric full-length genomic cADN clones of bovine viral diarrhea virus that yield infectious transcripts. J. Virol. 71:471-8.

Weiland, E . , Thiel, H.-J., Hess, G. and Weiland, F. (1989): Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pre-treatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide . J. Virol. Methods. 24:237- 244.

* Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 1 LISTADO DE SECUENCIAS <110> Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH <120> Virus infeccioso de la diarrea viral bovina <130> 1-1249 <140> no asignada <141> 2001-09-06 <160> 25 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 12332 <212> DNA <213> irus de la diarrea viral bovina (BVDV) 2 <400> 1 gtatacgag .ttagct aag aactcgtata tggattggac gtcaacaaat ttttaattgg 60 caacgtaggg aaccttáccc tcagcgaagg ccgaaaagag gctagccatg cccttagtag 120 gactagcaaa agtaggggac tagcggtagc agtgagttcg ttggatggcc gaacccctga 180 gtacagggga gtcgtcáatg gttcgacact ccattagtcg aggagtctcg agatgccatg 240 tggacgaggg catgcccacg gcacatctta acccatgcgg gggttgcatg ggtgaaagcg 300 ctattcgtgg cgttatggac acagcctgat agggtgtagc agagacctgc tattccgcta 360 gtaaaaactc tgctgtacat ggcacatgga gttgttttca aatgaacttt tatacaaaac 420 atataaacaa aaaccagcag 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atgaagaact aatgaaggtc ttcgactgct taaagatccc 10550 agagctgaag gaatcgtatg atgaagtttc atgggaacaa ttagaagccg ggataaaccg 10620 taagggtgca gcaggctatc tagagagcaa gaacataggg gaagtcctag acacagagaa 10680 acacatagta gagcagctga tcaaggatct gaggaagggg aagaagatta ggtactatga 10740 aacagccatc cccaagaatg agaagagaga cgtcagcgac gactgggaag ccggagagtt 10800 cgttgatgaa aagaaaccaa gagtaatcca gtacccggac gccaaggtga gactggccat 10850 tacaaaagtg atgtacaaat gggtaaagca aaaaccagtg gtgatacccg gctatgaagg 10920 taaaacacct ctatttgaca tattcaacaa agtgaagaag gaatgggatt cattccagga 10980 ccccgtagca gtgagctttg acaccaaagc gtgggataca caagtcacca gtagagacct 11040 aatgttgata aaggatatcc agaaatatta tttcaagaga agtatacaca aatttttaga 11100 tacaataaca gaacacatgg tggaggtacc tgtcattaca gcagacggtg aagtttacat 11160 aaggaatggt cagaggggta gtggccaacc cgacacaagt gctggtaata gtatgttgaa 11220 tgtcctaacc atgatatatg ctttctgtaa aagtacaggc ataccttaca ggggattcag 11280 cagagtggca agaatccatg tgtgtggtga tgatggcttt ttgataacag agagaggact 11340 gggactgaaa ttctctgaga agggtatgca gatattacat gaggccggga agccccagaa 11400 aataactgaa ggggacaaaa tgaaagtggc- atacagattc gaggacatag agttttgttc 11460 ccatactccc gtgccagtca gatgggcaga taacaccagt agttacatgg cagggaggag 11520 cacagccact atactagcta agatggcaac caggctggat tccagcggag agaggggtag 11580 cacagcttat gagaaggccg tagccttcag cttccttttg atgtactcat ggaatcccgt 11540 agttagaagg atctgcttac tggtgttgtc acagtttcca gaaatatccc catccaaaaa 11700 cacaatatac tactaccaag gggatcccat agctgcgtac agagaagtga tagggaaaca 11760 gctgtgtgaa ctgaaaagaa caggatttga gaagctggct ggtctgaatt tgagtatgac 11820 cactctaggc atctggacaa aacatactag taaaagacta atccaagcct gtgtagaaat 11880 aggtaagaga gaaggtaoct ggttagttaa tgctgacaga ctgattgcag gaaagactgg 11940 gaagttttac atcccaagca ctggtgtcac tctgttggga aaacactatg aggaaattaa 12000 cttaaagcaa aaggcggcac aaccgccgat agagggggtt gacagatata agttgggccc 12060 catagttaat gttatcttga gaaggctgag ggtgatgctg atgacagttg ccagcggaag 12120 ctggtgaatc cgtccggagc gtcgtgccct cactcaaggt ttttaattgt aaatattgta 12180 aatagacagc taagatattt attgtagttg gatagtaatg cagtgatagt aaatacccca 12240 atttaacact acctccaatg cactaagcac tttagctgtg tgaggttaac tcgacgtcca 12300 cggttggact agggaagacc tctaacagcc ce 12332 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artificial 220> 223 > Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR 6 <400> 2 ctccatgtgc catdtacagc agag 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 3 ctcgtccaca tggcatctcg agac 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 4 gcactggtgt cactctgttg 20 7 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 5 gagaaggctg agggtgatgc tgatg 25 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 6 gactttccgc ttctttttag g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA 8 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 7 ggagagaata tcacccagtg 20 <210> 8 <211> 8 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 8 ctccactccg cagtatggac ttgc 24 <210> 9 <211> 21 ! <212> DNA I <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido 400> 9 ctaaaaaga agcggaaagt c 210> 10 211> 21 212> DNA 213> Secuencia artificial <220> <:223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleóti* <400> 10 gttgacatgg catttttcgt g 21 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 11 cctcttatac gttctcacaa cg 10 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 12 gtatccatca tccrtgatga t 21 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 13 caaatctctg atcagttgtt ccac 24 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Secuencia artificial 11 <220> I <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 14 ttgcacacgg caggtcc 17 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 15 gtcccccggg ggctgttaag ggttttccta gtca 35 210> 16 211> 25 212> DNA 213> Secuencia artificial Descripción de secuencia artificial: cebador de PC 12 gatgtagaca catgcgacaa gaacc <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Secuencia artificial 220> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 17 gcttccactc ttatgccttg <210> 18 <211> 78 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 18 13 gctctagacg gccgtaatac gactcactat aggtatacga gattagctaa 60 agaactcgta tatggattgg acgtcaac 78 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 19 gacggccgta atacgactca ctatagtata cg 32 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 20 cctaaccatg atatatgcct tctg 24 14 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR <400> 21 cggaattcgc ccgggctgtt agaggtcttc cctagt 36 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido <400> 22 gagtggaata aaggttggtg taca 24 <210> 23 <211> 24 <212> DNA

Claims

73

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Molécula de ADN caracterizada porgue contiene una secuencia de nucleótidos complementaria a un ARN de virus de la diarrea viral bovina, en donde dicho ARN, cuando se introduce en células huésped susceptibles, induce la generación de partículas infecciosas de BVDV a) con la capacidad de inducir viremia y leucopenia en terneros, durante un período de al menos 1 día y al menos uno de los siguientes síntomas clínicos del grupo que comprende diarrea y/o fiebre de al menos un día de duración, cuando se les infecta con una dosis de 6xl06TCIDS0; y/o b) con auténtica virulencia en comparación con un aislado de BVDV de tipo salvaje, a partir del cual se ha derivado esa molécula de ADN; y/o c) que resultan letales, cuando se infectan terneros que no han estado previamente en contacto con el 3VDV con una dosis de 6xl06TCID50 con tales partículas, para al menos 30% de tales terneros, dentro de un período de 21 días; y/o d) con una virulencia no inferior a 90% de las partículas de BVDV que comprenden un ARN con una secuencia 74 complementaria a SEQ ID N° 1; y/o e) que comprenden una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1. 2. Clon infeccioso de BVDV, capaz de servir como modelo para la transcripción en un AR , caracterizado porque cuando se introduce en células huésped susceptibles, induce la generación de partículas infecciosas de BVDV f) con la capacidad de inducir viremia y leucopenia en terneros durante un período de al menos 1 día y al menos uno de los siguientes síntomas clínicos del grupo que comprende diarrea y/o fiebre de al menos un día de duración cuando se les infecta con una dosis de 6xlOsTCID50; y/o g) con auténtica virulencia en comparación con un aislado de BVDV de tipo salvaje, a partir del cual se ha derivado esta molécula de ADN; y/o h) que resultan letales, cuando se infectan terneros que no han estado previamente en contacto con el BVDV con una dosis de 6xl06TCID50 con tales partículas, para al menos 30% de tales terneros, dentro de un período de 21 días después de la infección; y/o i) con una virulencia no inferior a 90% de las partículas de BVDV que comprenden un ARN con una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1; y/o j) que comprenden una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1.
3. Molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 75 1, caracterizada porque la fiebre de la etapa a) es de al menos 40°C.
4. Partícula de BVDV generada por transcripción, usando la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 ó 3 , o el clon de BVDV de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizada para la transfección de células o líneas celulares adecuadas con dicho ARN y la recolección de las partículas de BVDV resultantes producidas por tales células.
5. Clon infeccioso de BVDV caracterizado porque es de tipo 2.
6. Clon infeccioso de BVDV de tipo 2, capaz de servir como modelo para la transcripción en ARN, caracterizado porque cuando se introduce en células huésped susceptibles, induce la generación de partículas infecciosas de BVDV k) con la capacidad de inducir viremia y leucopenia en terneros durante un período de al menos 1 día y al menos uno de los siguientes síntomas clínicos del grupo que comprende diarrea y/o fiebre de al menos un día de duración, cuando se les infecta con una dosis de 6XIO6TCID50; y/o 1) con auténtica virulencia en comparación con un aislado de BVDV de tipo salvaje, a partir del cual se ha derivado esa molécula de ADN; y/o m) que resultan letales, cuando se infectan terneros de 3 a 6 meses de edad que no han estado previamente en contacto 76 con el BVDV, con tales partículas a una dosis de 6xl06TCID50, para al menos 30% de tales terneros en un período de 21 días después de la infección; y/o n) con una virulencia no inferior a 90% de las partículas de BVDV que comprenden un ARN con una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1; y/o o) que comprenden una secuencia complementaria a SEQ ID N° 1.
7. Clon infeccioso de BVDV de tipo 2, de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado por la secuencia de ADN de SEQ ID N° l o un fragmento, variante funcional, variante basada en el código de ácidos nucleicos degenerativos, molécula de fusión o un derivado químico de la misma .
8. Partícula de BVDV de tipo 2 generada por transcripción in vi tro del clon de BVDV, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en ARN, caracterizada por la transfección de células o líneas celulares adecuadas con dicho ARN y la recolección de las partículas de BVDV resultantes producidas por dichas células.
9. Molécula de ADN caracterizada porque contiene una secuencia de nucleótidos complementaria al ARN de BVDV de tipo 2 de longitud total .
10. Molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada por SEQ ID N° l o un fragmento., variante funcional, variante basada en el código 77 de ácidos nucleicos degenerativos, molécula de fusión o derivado químico de la misma.
11. Molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque consistente de la secuencia SEQ ID N° 1.
12. Molécula de ARN caracterizada porque complementa a la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, o cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o al clon de BVDV de la reivindicación 2 ó 4 o las reivindicaciones 5 a 7.
13. Molécula de ARN caracterizada porque se puede obtener por transcripción de la molécula de ADN de conformidad con las reivindicación 1 ó 3, o cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o del clon de BVDV de la reivindicación 2 ó 4 o las reivindicaciones 5 a 7.
14. Método para la producción de un clon infeccioso de BVDV a partir de un aislado de BVDV de tipo salvaje, siendo el clon infeccioso de BVDV complementario a un ARN, que tiene auténtica virulencia en comparación con dicho aislado de tipo salvaje, caracterizado porque comprende las etapas de p) aislar partículas virales de un animal infectado; q) someterlas a no más de dos pasajes sobre células de cultivo de células adecuadas; r) preparar ARN a partir de las partículas virales; s) generar ADN complementario de longitud total tras la transcripción inversa del ARN; en donde la transcripción 78 inversa incluye una etapa a temperaturas elevadas suficientes para degradar o reducir las estructuras secundarias del ARN, y el uso de una enzima termoestable en esta etapa, siendo dicha enzima activa a estas temperaturas elevadas; t) incorporar el ADN complementario (cADN) en un vector de plásmido o en un ADN-virus capaz de dirigir la transcripción de cADN de BVDV en ARN tras la infección de células adecuadas.
15. Método para la producción de un clon infeccioso de BVDV a partir de un aislado de BVDV de tipo salvaje, siendo el clon infeccioso de BVDV complementario a un ARN que tiene una virulencia no inferior a 90% de dicho aislado de tipo salvaje, caracterizado porque comprende las etapas de u) aislar partículas virales de un animal infectado; v) preparar ARN a partir de las partículas virales ; ) generar ADN complementario de longitud total tras la transcripción inversa del ARN; en donde la transcripción inversa incluye una etapa a temperaturas elevadas suficientes para degradar o reducir las estructuras secundarias del ARN, y el uso de una enzima termoestable para esta etapa, siendo dicha enzima activa a estas temperaturas elevadas ; x) incorporar el ADN complementario (cADN) en un plásmido o en un ADN-virus capaz de dirigir la transcripción de cADN 79 de BVDV en ARN tras la infección de células adecuadas .
16. El. método de conformidad con la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porgue el extremo 5' del ARN se transcribe usando RACE.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porgue se lleva a cabo RACE con una polimerasa termoestable gue permite temperaturas de reacción de al menos 42°C.
18. Método de atenuación de BVDV, o que comprende introducir una o más mutaciones en la molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 ó 3 o cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o en el clon infeccioso de BVDV de la reivindicación 2 ó 4 o de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porgue la mutación o las mutaciones dan lugar o aumentan un fenotipo atenuado del virus de BVD recuperado.
19. Método de atenuación de una cepa de BVDV, caracterizado porque comprende las etapas de y) introducir una o más mutaciones en la molécula de ADN de la reivindicación 1 ó 3 o una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o en el clon infeccioso de BVDV de la reivindicación 2 ó 4 o de las reivindicaciones 5 a 7; z) introducir el ADN mutado en células huésped susceptibles, en las que dicho ADN se transcribe en ARN, o introduciendo un ARN trascrito a partir de dicho ADN en dichas células; y 80 aa) recolectar las partículas virales producidas por estas células ; en el que dicha mutación o mutaciones dan como resultado una atenuación.
20. Método de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque la mutación o mutaciones es una sustitución, deleción, inserción, adición o una combinación de las mismas.
21. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque la mutación o mutaciones se efectúa en la glicoproteína Erns y provoca una alteración o pérdida de función de la o las proteínas mutadas .
22. Método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la mutación consiste en bb) deleción de toda o parte de la glicoproteína Erns; y/o ce) deleción o sustitución de la histidina en la posición 300 de SEQ ID N° 1; y/o dd) deleción o sustitución de la histidina en la posición 349 de SEQ ID N° 1.
23. Clon atenuado de BVDV o cepa de BVDV caracterizado porque se puede obtener por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22.
24. Vacuna caracterizada porque comprende un clon o cepa atenuada de BVDV de conformidad con la reivindicación 81 23, opcionalmente en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente compatible.
25. Uso de un clon o cepa atenuada de BVDV de conformidad con la reivindicación 23, en la fabricación de una vacuna para la prevención y el tratamiento de infecciones por BVDV.