KR20040039295A

KR20040039295A - 감염성의 약독화된 소바이러스설사증 바이러스 클론, 그의생산 방법 및 용도

Info

Publication number: KR20040039295A
Application number: KR10-2004-7002362A
Authority: KR
Inventors: 엘베르스크누트; 메이에르크리스티안느; 본프레이버그마르티나; 메이에르스그레고르
Original assignee: 베링거 인겔하임 베트메디카 게엠베하
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2002-09-05
Publication date: 2004-05-10
Also published as: EP1749885B8; DE10143813A1; MXPA04002124A; EP1749885A2; PL368748A1; DE60213639T2; DK1749885T3; HUP0401585A3; JP2005502361A; WO2003023041A2; CA2457441A1; EP1749885B1; WO2003023041A3; JP4416504B2; ATE335074T1; DE60213639D1; ES2401072T3; UY27434A1; CN1551913A; CA2457441C

Abstract

본 발명은 동물 건강 분야, 특히 소바이러스설사증 바이러스(Bovine Viral Diarrhea virus)(BVDV)에 속하는 것이다. 본 발명은 감염성 BVDV 클론 및 BVDV 클론을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 클론을 약독화시키는 방법, 약독화된 클론 및 약독화된 클론을 포함하는 백신에 관한 것이다.

Description

감염성의 약독화된 소바이러스설사증 바이러스 클론, 그의 생산 방법 및 용도{Infectious and Attenuated Bovine Viral Diarrhea virus Clone, Methods for their production and Use}

소바이러스설사증 바이러스(Bovine Viral Diarrhea virus)(BVDV)는 BVD 및 점막 질환의 병원체이다(Baker, 1987; Moennig and Plagemann, 1992; Thiel et al., 1996). 임신중 태아 감염은 태아 유산, 송아지의 유산 및 BVDV로 지속되는 감염된 면역내성 송아지의 출산을 유발할 수 있다. 이 소는 없거나 매우 낮은 중화항체 역가를 갖고 연속적으로 다량의 바이러스를 흘린다(shed). 급성 감염된 소 다음으로 이들 송아지가 바이러스 확산의 주요원이고 따라서 이 질환의 역학에 있어 매우 중요한다. BVD의 경제학상 주된 영향은 높은 유산율, 사산, 태아 유산, 미이라화, 선천성 기형 및 허약하고 작은 송아지 출산으로부터 온다. 병인에 대한 상세한 설명은 이하 [Moennig and Liess of 1995]를 인용한다.

제한된 교차 중화 항체(neutralizing antibody) 반응(Ridpath et al., 1994)을 나타내는 두개의 BVDV의 주요 항원 그룹(1형 및 2형)이 기술되어 있다(Becher et al., 1999). BVDV 감염의 예방 및 치료에 대한 현 백신은 단점을 갖고 있다 (Oirschot et al., 1999). 통상의 BVDV 1형에 대한 백신은 2형 감염으로부터 단지 부분적으로만 보호하고, 백신화된 동물은 병원성(virulent) BVDV 2형으로 지속되는 감염된 송아지를 생산할 수 있다(Bolin et al., 1991, Ridpath et al., 1994). 이러한 문제는 주요 항원인 당단백질 E2에서 가장 뚜렷한 1형 및 2형사이의 현저한 항원의 다양성에 기인한다고 할 수 있고(Tijssen et al., 1996): 1형 균주에 대한 대부분의 모노클로날 항체는 2형 바이러스에 결합하지 못한다 (Ridpath et al., 1994).

사멸(killed) 백신(전체 바이러스가 불활성화됨) 또는 서브유니트 백신(통상 정제되거나 이질적으로 발현된 정제 바이러스 단백질)은 어쥬번트의 존재하에서도 전체적인 보호 면역 반응을 일으키는 효능에 있어 생(live) 백신보다 열등하다.

생 BVDV 백신은 약독화되어도 주로 대부분은 안정성 문제와 관련된다. 상기 언급한 바와 같이, 임신한 소의 태반을 가로질러 태아에서 임상적 소견을 나타내고/거나 지속되는 감염된 송아지를 유도한다. 따라서, 임신한 소를 포함하는 무리를 사육하는데는 적용시킬 수 없다. 임신한 소는 태아를 보호하기 위하여 백신화된 소로부터 분리하여 두어야 하고 그 단독으로 백신화시켜야 한다. 또한, 약독화된 생 BVDV의 복귀돌연변이주(revertant)는 심각한 위협을 줄 수 있다. 통상의 다중 계대에 의해 약독화된 통상적으로 유래된 바이러스에 대하여, 약독화의 유전적 안정성 및 분자 기원은 공지되어 있지 않은 상태이고, 복귀돌연변이주의 출현은 예측할 수 없다.

약독화에 대한 기초로서 정의된 돌연변이를 갖는 생 백신은 현재의 약독화 백신의 단점을 극복할 수 있을 것이다. 약독화 돌연변이의 추가의 잇점은 필드로부터의 페스티바이러스와 그를 식별하기 위한 약독화된 페스티바이러스에 대한 식별 표지로서 사용할 수 있는 정의된 분자상의 유일성(uniqueness)에 있다.

본 분야에서, 야생형 바이러스와 매우 유사한 정의된 유전자 아이덴터티(identity)를 갖는 BVDV, 특히 BVDV 2형에 대하여 거의 공지된 바 없다. 본 분야에서는 그러한 BVDV을 생산하는 방법에 대하여 오랫동안 요구되어 왔다. 따라서, 본 발명에 내재된 기술적인 문제는 정의된 유전자 아이덴터티를 갖는 BVDV, 특히 BVDV 2형을 제공하는 것이었다.

도면의 간단한 설명

도 1. 감염성 cDNA 클론의 작제. 상단에 BVDV 게놈(kB) 및 코딩 폴리단백질을 스케치하였다. 가운데 부분에는 감염성 cDNA 클론(흰색), 감염성 cDNA 클론 노작에 사용된 PCR 산물(암회색) 및 RT-PCR 산물(밝은 회색)을 나타내고, 하단에는 시험관내 전사를 위한 게놈 cDNA 서열의 말단(밑줄) 및 5' 및 3' 말단에 첨가된 서열을 나타내었다.

도 2. 재조합 바이러스 XIKE-A 및 야생형 BVDV 분리주 VLS#399의 성장 곡선. MDBK 세포를 0.1의 m.o.i로 바이러스를 사용하여 감염시키고 지정된 시점에 냉동 및 해동하여 회수하였다. 새로운 MDBK 세포를 감염시킨 후 72h째 p.i.염색하여 면역형광측정법에 의해 역가를 측정하였다.

도 3. 재조합 바이러스 XIKE-A 및 Erns 돌연변이 XIKE-B(H349Δ) 및 XIKE-C(H300L)의 성장 곡선. MDBK 세포를 0.1의 m.o.i로 바이러스를 사용하여 감염시키고 지정된 시점에 냉동 및 해동하여 회수하였다. 새로운 MDBK 세포를 감염시킨 후 72h째 p.i.염색하여 면역형광측정법에 의해 역가를 측정하였다.

도 4. 각 바이러스로 감염된 MDBK 세포의 조 세포 추출물로부터 재조합 바이러스 XIKE-A(야생형 서열), XIKE-B(H349Δ) 및 XIKE-C(H300L)의 RNAse 활성을 야생형 균주 New York '93/C와 비교하여 측정. 감염시키지 않은 MDBK 세포를 음성 대조군(n.i.)로 사용하였다. 작은 RNA 단편을 상등액으로 유리시키는 마커로서 OD₂₆₀을 측정하여 폴리(U)의 효소 분해를 측정하였다.

도 5. NY'93/C(#275, #612, #1610, 점선) 또는 XIKE-A(동물 번호 #615, #377, #091, 선)으로 감염된 동물의 체온.

도 6. NY'93/C(#275, #612, #1610, 점선) 또는 XIKE-A(동물 번호 #615, #377, #091, 선)으로 감염된 동물의 백혈구(WBC) 계수

도 7. XIKE-A(동물 #387, #388, #418, 점선) 또는 XIKE-B-바이러스(동물 #415, #417, #419, 선)으로 감염된 동물의 체온.

도 8. XIKE-A(동물 #387, #388, #418, 점선) 또는 XIKE-B-바이러스(동물 #415, #417, #419, 선)으로 감염된 동물의 백혈구(WBC) 계수.

발명의 개시

본 명세서에서 사용된 용어의 정의

본 발명을 구체적으로 설명하기 앞서, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형의 "하나", "한개", 및 "그"는 달리 문맥을 명확하게 언급하지 않는 한 복수형을 포함한다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "BVDV 바이러스"에 대한 언급은 복수의 BVDV 바이러스를 포함하고, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 그의 동등물 등을 언급한다. 달리 정의하지 않는 경우, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술자가 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 동일하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치, 및 재료를 기재한다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌에서 보고된, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 세포주, 벡터 및 방법을 기재하고 설명하기 위한 목적으로서 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌이 참고문헌으로서 인용된다. 본 명세서에 어느 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 상기 설명보다 선행하지 못한다고 인정되는 것을 의미하지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "BVDV"는 플라비비리다에과(Flaviviridae)의 페스티바이러스속의 BVDV 1종 및 BVDV 2종에 속하는 모든 바이러스르 언급한다(Becher et al., 1999). 더욱 통상의 BVDV 1형 균주 및 더욱 최근 인지된 BVDV 2형 균주는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에서 일부 제한되었지만 특유의 차이를 나타낸다.

"클론"은 DNA 벡타 또는 상기 벡타가 도입된 숙주 세포주이다. 바람직하게 DNA 벡타는 플라스미드이다.

"감염성 클론"은 감염되기 쉬운 세포내로 도입되었을 때 바이러스의 생성을 유도하는 RNA로 전사되는 주형으로서 작용할 수 있는 DNA 벡타이다. 바람직하게 RNA는 시험관내 전사에 의해 생산되고 본 분야의 기술자에게 공지되어 형질감염 기술에 의해 세포내로 도입된다.

본 명세서에서 사용되는 바, "BVDV 입자" 또는 "바이러스 입자"는 감염되기 쉬운 세포내로 도입되었을 때 바이러스의 생성을 유도하는 RNA를 통해 "감염성 클론으로부터 생산된 BVD 바이러스를 언급한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "약독화된 BVDV 입자" 또는 "약독화된 바이러스 입자"는 본 발명에 따른 방법에 의해 약독화된 BVDV 입자에 관한 것이다(하기 참조).

"감염성"은 플라크 시험에서 특정 수의 플라크 또는 엔드포인트(endpoint) 시험에서 특정 TCID₅₀스코어를 유도하는 바이러스 또는 바이러스 입자의 능력이다.

전장의 RNA는 야생형 분리주에서 발생된 RNA의 서열 적어도 98%를 포함하는 RNA이다. 전장의 상보적 DNA는 야생형 분리주에서 발생된 RNA의 서열 적어도 98%에 상보적인 서열을 포함하는 DNA이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "송아지"는 6개월 미만의 소과 동물을 언급한다.

병원성: 본 명세서에서 사용되는 바, "입증된(authentical) 병원성"은 본 발명에 따른 감염성 BVDV 입자의 병원성과 BVDV RNA, 특히 2형 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자가 유래되는 BVDV 분리주 사이에 적어도 하나의 주된 임상적 파라미터에 대하여 통계학적으로 유의차가 없는 것을 의미한다. 주된 임상적 파라미터의 예는 설사, 열 및/또는 치사이다.

약독화: 본 명세서에서 사용되는 바 "약독화 BVDV 입자"는 동일한 투여량, 바람직하게 6 x 10⁵TCID₅₀으로 감염된 동물에서 본 발명에 따른 약독화 방법에 의해 약독화된 본 발명에 따른 약독화 BVDV 입자의 병원성과 약독화 BVDV 입자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주 사이에 주된 임상적 파라미터, 설사, 열 및/또는 치사에 대하여 통계학적으로 유의차가 없는 것을 의미한다. 따라서, 약독화 BVDV 입자는 설사, 열 및/또는 치사를 유발하지 않고 백신으로 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "RACE"는 신속한 cDNA 말단의 증폭을 의미하고 본 분야에 공지되어 있다(Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1988, 85: 8998-9002).

본 명세서에서 사용되는 바, "감염되기 쉬운 세포"는 BVD 바이러스 또는 BVDV RNA가 감염되기 쉬운 세포에 도입되었을 때 감염성 BVDV의 생산을 유도하는 BVD 바이러스로 감염될 수 있거나 BVDV RNA로 형질감염될 수 있는 세포이다.

본 발명에 따른 DNA 분자 또는 감염성 BVDV 클론의 "기능적 변이체"는 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 감염성 BVDV 클론과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적 또는 구조상)을 갖는 DNA 분자 또는 감염성 BVDV 클론이다. 또한, 용어 "기능적 변이체"는 "단편", "기능적 변이체", "축퇴 핵산 코드상에 기초한 변이체" 또는 "화학적 유도체"를 포함한다. 예를 들면, "기능적 단편"은 하나 또는 수개의 핵산 교환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 교환, 결실 또는 삽입은 전체 서열의 10%를 차지할 수 있다. 기능적 변이체는 적어도 부분적으로 그의 생물학적 활성, 예를 들면, 감염성 클론 또는 백신으로서의 기능을 보유하거나, 더욱 개선된 생물학적 활성을 나타낸다.

"축퇴성 유전자 코드에 기초한 변이체"는 수개의 상이한 뉴클레오티드 트리플릿(triplet)에 의해 특정 아미노산이 코딩될 수 있다는 사실로부터 형성된 변이체이다. 기능적 변이체는 적어도 부분적으로 그의 생물학적 활성을 보유하거나, 더욱 개선된 생물학적 활성을 나타낸다.

"융합 분자"는 예를 들면, 방사능표지와 같은 리포터, 형광표지와 같은 화학 분자 또는 본 분야에 공지된 다른 분자에 융합된 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 감염성 BVDV 클론일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 본 발명에 따른 "화학적 유도체"는 정상적으로는 이 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 부위를 포함하거나 화학적으로 변형된 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 감염성 BVDV 클론이다. 이 부위는 분자의 안정성, 흡수율, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다.

양 분자의 뉴클레오티드 서열 또는 생물학적 활성이 실질적으로 유사한 경우, 양 분자는 서로 "실질적으로 유사"하다. 따라서, 두개의 분자가 유사한 활성을 갖는 경우, 뉴클레오티드 서열이 일치하지 않는다면 본 명세서에서 변이체로 간주되고, 두 분자가 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우에도 양 생물학적 활성이 일치하지 않는다면 변이체로 간주된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분 및 가능하게는 반드시 필요한 것은 아니지만 상기 활성 성분의 면역학적 활성을 향상시키는 하나이상의 추가의 성분을 함유하는 약제학적 조성물을 언급한다. 백신은 또한 약제학적 조성물에 전형적인 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 본(original) 형태의 완전한 생 유기체 또는 소위 변형된 살아있는 백신(MLV) 또는 소위 죽은 백신(KV)으로서 적절한 방법에 의해 불활성화된 유기체를 함유할 수 있다. 또다른 형태로, 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 상기 유기체의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유니트 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 유기체 또는 이러한 유기체의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약제학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 도입에 의한 백신을 필요로하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화)제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나이상을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신이고 BVDV에 의해 유발된 질환에 대하여 특이적이고 활성인 면역을 유도하기 위한 목적으로 투여된다. 본 발명의 BVDV 클론은 그것이 포함하는 이뮤노겐 및 때때로 항원과 관련된 유기체에 대한 모계 항체를 통해 수동적으로 전달될 수 있는 활성 면역성을 제공한다.

면역 반응을 향상시키는 추가의 성분은 흔히 어쥬번트라고 불리우는 구성물, 예를들어 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자이다.

"약제학적 조성물"은 본질적으로 투여됐을 때 유기체의 생리학적, 예를들어 면역학적 기능 또는 살아있는 유기체의 표면안 또는 표면상을 변화시킬 수 있는 하나이상의 성분, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 항생제 또는 항기생충제, 및 특정의 다른 목적, 예를들어 제한되는 것은 아니지만 처리 특성, 생식불능, 안정성, 장내 또는 비경구 경로, 예를들어 경구, 비강내, 정맥내, 근육내, 피하. 피내 또는 다른 적절한 경로를 통해서 조성물을 투여함의 용이성, 투여후의 내성, 조절된 방출 성질을 달성하기 위하여 첨가되는 다른 구성 성분으로 구성된다.

발명의 개시

상기 기술상의 문제에 대한 해결안은 설명 및 청구범위에 의해 특징화되는 일면에 의해 달성된다.

예를 들면, 백신으로 사용하기 위한 특정의 약독화된 BVDV를 생산하기 위하여 사용될 수 있는 정의된 서열 및 병원성과 관련된 특이성을 갖는 생 BVDV(소과 바이러스성 설사 바이러스)로 본 분야의 장기간의 요구는 극복되었다. 본 발명자는 최초로 동시에 야생형 바이러스와 매우 유사한 병원성을 갖는 정의된 유전자 아이덴터티의 감염성 클론 및 그의 유도왼 감염성 BVDV 입자를 생산한느 방법을 제공한다. 또한, 본 발명자는 최초로 감염성 2형 클론 및 그의 유도된 감염성 2형 클론 입자를 기술한다. 세번째로, 정의된 서열을 갖는 생 감염성 BVDV 입자를 발명하고, 본 발명자들은 적어도 하나의 정의된 유전자 마커 위치에서 변형되어 약독화될 수 있는 유전자 아이덴터티를 갖는 약독화된 BVDV 입자를 생산하는 방법을 발명하게 되었다. 본 발명을 통해 약독화의 기능적 메카니즘의 이해를 위해 필수적이고 백신용으로서의 질을 평가하는데 도움이 되는 게놈 변형과 약독화사이의 인과 관계를 얻었다.

본 발명의 중요한 첫번째 일면으로, 본 발명은 감염되기 쉬운 숙주 세포내로 도입되었을 때

a) 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량으로 감염시켰을 때 적어도 하룻동안 바이러스혈증 및 백혈구감소증을 유도하고 적어도 하룻동안 지속되는 설사 및/또는 열을 포함하는 그룹의 임상적 증상중 적어도 하나를 유도하는 능력을 갖고;

b) DNA 분자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖고/거나;

c) BVDV를 투여받지 않은 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량의 입자로 감염시켰을 때 21일내 적어도 30%의 송아지에 치명적이고/거나;

d) 서열번호 1에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 포함하는 90% 원래대로 BVDV 입자가 병원성이고/거나;

e) 서열번호 1에 상보적인 서열을 포함하는, 감염성 BVDV 입자의 생성을 유도하는, BVDV RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다.

단계 a)의 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량은 바람직하게 2 x 10⁶i.m.(둔근근육), 2 x 10⁶비강내, 및 2 x 10⁶피하(견갑골)에 투여하여 총 6 x 10⁶을 얻는다. 단계 a)의 임상적 증상은 바람직하게 모든 감염된 동물중 적어도 2/3에서 관찰되어야 한다. 단계 a)의 백혈구감소증은 적어도 연속 이틀동안 기준선 밑으로 적어도 35% 감소하여야 한다(여기에서, "기준선"은 감염 10일전 모든 동물의 평균 값이다). 설사는 BVDV 감염의 전형적 증상이다.

바람직하게, 상기 기술한 본 발명에 따른 DNA 분자에서 단계a)의 열은 적어도 40℃이다.

f) 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량으로 감염시켰을 때 적어도 하룻동안 바이러스혈증 및 백혈구감소증을 유도하고 적어도 하룻동안 지속되는 설사 및/또는 열을 포함하는 그룹의 임상적 증상중 적어도 하나를 유도하는 능력을 갖고;

g) DNA 분자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖고/거나;

h) BVDV를 투여받지 않은 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량의 입자로 감염시켰을 때 감염 후 21일내 적어도 30%의 송아지에 치명적이고/거나;

i) 서열번호 1에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 포함하는 90% 원래대로 BVDV 입자가 병원성이고/거나;

j) 서열번호 1에 상보적인 서열을 포함하는, 감염성 BVDV 입자의 생성을 유도하는, RNA로 전사되기 위한 주형으로서 작용할 수 있는 감염성 BVDV 클론에 관한 것이다.

단계 f)의 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량은 바람직하게 2 x 10⁶i.m.(둔근근육), 2 x 10⁶비강내, 및 2 x 10⁶피하(견갑골)에 투여하여 총 6 x 10⁶을 얻는다. 단계 f)의 임상적 증상은 바람직하게 모든 감염된 동물중 적어도 2/3에서 관찰되어야 한다. 단계 f)의 백혈구감소증은 적어도 연속 이틀동안 기준선 밑으로 적어도 35% 감소하여야 한다(여기에서, "기준선"은 감염 10일전 모든 동물의 평균 값이다).

감염성 BVDV 클론은 바람직하게 1형 또는 2형 클론이다.

감염성 BVDV 클론의 입증된 병원성은 중요하기 때문에 상기 클론을 작제하기 위한 출처로서 사용되는 바이러스를 바람직하게 필드(filed) 분리주로부터 직접 수득하거나 동물로 다시 전달시킨 후 가장 강력한 임상적 증상을 갖는 동물로부터 다시 분리시킨 후 세포 배양액에 2회이하, 바람직하게는 한번 계대 배양하거나 계대 배양하지 않는다. 실시예(실시예 1)은 이를 예시한다. 실시예에 세포 배양액을 수회 계대 배양한 후 소에 다시 전달하고, 다시 분리하고 RNA 시료로 사용된 바이러스 NY93/C의 cDNA-클로닝 및 분리된 바이러스의 세포 배양액을 2회 이하로 계대 배양한 후 cDNA 클로닝이 설명되어 있다.

본 발명의 또다른 중요한 일면은 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 BVDV 클론을 사용하여 전사시키고, 적절한 세포 또는 세포주를 상기 RNA로 형질감염시키고 세포에 의해 생산된 BVDV 입자를 수거하여 생산된 BVDV 입자이다. 또다른 일면은 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 BVDV 클론을 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 DNA 바이러스의 게놈내로 클로닝한 후, 적절한 세포를 감염시켜 세포에 의해 생산된 BVDV 입자이다. 또한 바람직하게, 본 발명에 따른 DNA 또는 감염성 클론을 적절한 세포내로 형질감염시킨 후, van Gennip et. al. (1999)에 의해 기술된 바 같이 세포에 대하여 안정하게 T7 폴리머라제를 발현시키는 돼지 콜레라 바이러스(Classical Swine Fever Virus(CSFV))에 대하여 RNA를 생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 DNA 또는 감염성 클론은 세포로부터 분비될 수 있는 감염섬 BVDV 입자의 생산을 이끄는 진핵세포 에서 진핵세포 생물의 프로모터의 조정하에 발현될 수 있다(예시 V.Racaniello and D. Baltimore for Poliovirus (1981)).

본 발명의 고도로 중요한 일면은 감염성 BVDV 2형 클론이다. 바람직하게, 감염되기 쉬운 숙주 세포내로 도입되었을 때

k) 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량으로 감염시켰을 때 적어도 하룻동안 바이러스혈증 및 백혈구감소증을 유도하고 적어도 하룻동안 지속되는 설사 및/또는 열을 포함하는 그룹의 임상적 증상중 적어도 하나를 유도하는 능력을 갖고;

l) DNA 분자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖고/거나;

m) BVDV를 투여받지 않은 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량의 입자로 감염시켰을 때 21일내 적어도 30%의 송아지에 치명적이고/거나;

n) 서열번호 1에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 포함하는 90% 원래대로 BVDV 입자가 병원성이고/거나;

o) 서열번호 1에 상보적인 서열을 포함하는, 감염성 BVDV 입자의 생성을 유도하는, RNA로 전사되기 위한 주형으로서 작용할 수 있는 감염성 BVDV 2형 클론이다.

바람직하게, 본 발명은

aaa) 야생형 BVDV 2형 균주를 분리하고;

bbb) 야생형 BVDV 2형 균주를 세포 배양액에 계대 배양하고;

ccc) 세포 배양액-계대 배양된 BVDV 2형 균주를 사용하여 소를 감염시키고 BVDV 균주를 가장 심각하게 감염된 동물로부터 다시 분리하고;

ddd) 재분리된 BVDV 2형 균주를 2회 이하, 바람직하게 1번 세포 배양액에 계대 배양하고;

eee) 재분리된 BVDV 2형 균주를 역전사시키고 클로닝하여 전장의 cDNA 클론을 수득하고, 바람직하게 5' 및 3' 말단을 RACE 기술을 사용하여 클로닝하고,

이어서, 감염성 DNA 클론을 적절한 조건하에서 RNA로 전사키고, RNA를 적절한 세포 또는 세포주로 도입하고 생성된 BVDV 2형 입자를 수거하는 단계를 특징으로 하는 방법에 의해 수득할 수 있는 BVDV 2형 클론에 관한 것이다.

클론을 비제한적으로 실시예 1에서 예시하고 서열번호 1의 cDNA 서열에 의해 특징화한다. 따라서, 바람직한 일례는 서열번호 1의 DNA 서열 또는 그의 단편, 기능적 변이체, 축퇴(degenerative) 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체에 관한 것이다. 비제한적으로 실시예 1에 제공된다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 BVDV 클론을 시험관내에서 RNA로 전사시키고, 적절한 세포 또는 세포주를 상기 RNA로 형질감염시키고 상기 세포에 의해 생산된 BVDV 입자를 수거하여 생산된 BVDV 2형 클론에 관한 것이다. 또한, 바람직하게 본 발명에 따른 DNA 또는 BVDV 클론을 적절한 세포내로 형질감염시킨 후, van Gennip et. al. (1999)에 의해 기술된 바 같이 세포에 대하여 안정하게 T7 폴리머라제를 발현시키는 돼지 콜레라 바이러스(Classical Swine Fever Virus(CSFV))에 대하여 RNA를 생산할 수 있다?11. 또한, 본 발명에 따른 DNA 또는 감염성 클론은세포로부터 분비될 수 있는 감염섬 BVDV 입자의 생산을 이끄는 진핵세포 에서 진핵세포 생물의 프로모터의 조정하에 발현될 수 있다(예시 V. Racaniello and D. Baltimore for Poliovirus (1981)).

본 발명의 또다른 고도의 중요한 일면은 전장의 BVDV 2형 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 바람직하게, 상기 DNA 분자는 서열번호 1의 서열에 의해 특징화한다. 따라서, 본 발명은 추가로, 서열번호 1의 DNA 서열을 특징으로 하는 본 발명의 DNA 분자 또는 그의 단편, 기능적 변이체, 축퇴(degenerative) 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체에 관한 것이다. 비제한적으로 실시예 1에 제공된다.

가장 바람직하게 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열을 특징으로 하는 서열로 구성된, 본 발명에 따른 DNA 분자에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 DNA 분자에 상보적인 RNA 분자, 또는 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 BDVD 클론에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 DNA 분자 또는 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 BDVD 클론에 상보적인 RNA 분자에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 중요한 일면은

p) 감염된 동물로부터 바이러스 입자를 분리하고, 바람직하게 적절한 세포 배양액 세포상에 2회 이하로 계대 배양하고;

q) 바이러스 입자로부터 RNA를 제조하고;

r) RNA을 역전사한 후(여기에서, 역전사는 RNA의 2차 구조를 파괴하거나 감소시키기에 충분한 승온에서의 단계, 및 이 승온하에서도 활성인 이 단계를 위한 열안정성의 효소의 사용을 포함한다) 전장의 상보적인 DNA를 생산하고;

s) 적절한 세포의 감염시 상보적 DNA(cDNA)를 BVDV cDNA를 RNA로 전사시킬 수 있는 DNA 바이러스 또는 플라스미드 벡터로 도입시키는 단계를 포함하는, 야생형 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖는 RNA에 상보적인 감염성 BVDV 클론을 야생형 BVDV 분리주로부터 생산하는 방법이다.

또다른 바람직한 일면은

ppp) 바이러스혈증의 감염 동물의 세포 또는 임의로 동물이 죽은 후 그의 기관(들)으로부터 RNA를 분리하고;

qqq) RNA을 역전사한 후(여기에서, 역전사는 RNA의 2차 구조를 파괴하거나 감소시키기에 충분한 승온에서의 단계, 및 이 승온하에서도 활성인 이 단계를 위한 열안정성의 효소의 사용을 포함한다) 바람직하게 DNA 단편으로부터 어셈블리된 전자의 상보적인 BVDV DNA를 생산하고;

rrr) 적절한 세포의 감염시 상보적 DNA(cDNA)를 BVDV cDNA를 RNA로 전사시킬 수 있는 DNA 바이러스 또는 플라스미드 벡터로 도입시키는 단계를 포함하는, 야생형 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖는 RNA에 상보적인 감염성 BVDV 클론을 야생형 BVDV 분리주로부터 생산하는 방법이다.

세포 배양액으로 적절한 세포는 Mardin-Darby 송아지 신장(MDBK) 세포, RD(송아지 고환) 세포 또는 송아지 Turbinat(BT) 세포이다. 추가로 적절한 세포는 본 분야의 기술자에게 공지되어 있다.

본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 감염성 클론은 1형 클론 또는 바람직하게 2형 클론이다.

본 발명의 또다른 중요한 일면은

t) 감염된 동물로부터 바이러스 입자를 분리하고;

u) 적절한 세포 배양액 세포에 2회 이하로; 바람직하게 한번 계대 배양하거나, 계대 배양하지 않고;

v) 바이러스 입자로부터 RNA를 제조하고;

w) RNA을 역전사한 후(여기에서, 역전사는 RNA의 2차 구조를 파괴하거나 축소시키기에 충분한 승온에서의 단계, 및 이 승온하에서도 활성인 이 단계를 위한 열안정성의 효소의 사용을 포함한다) 전장의 상보적인 DNA를 생산하고;

x) 적절한 세포의 감염시 상보적 DNA(cDNA)를 BVDV cDNA를 RNA로 전사시킬 수 있는 DNA 바이러스 또는 플라스미드 벡터로 도입시키는 단계를 포함하는, 야생형 분리주의 90% 원래대로입증된 병원성을 갖는 RNA에 상보적인 감염성 BVDV 클론을 야생형 BVDV 분리주로부터 생산하는 방법이다.

바이러스 입자는 바람직하게 바이러스혈증에서 분리된다(단계 t). 단계 x)의 전장의 상보적인 DNA(cDNA)는 중복부분 cDNA 단편을 어셈블리하여 생산될 수 있다(참조 실시예 1).

본 분야에서 감염성 BVDV의 5' 및 3' 영역을 클로닝하는 것은 특히 어려웠다. 본 발명자들은 입증된 5' 및 3' 영역을 수득하기 위한 방법을 개발하였다. 놀랍게도, RACE-기술을 적용할 수 있었다. 그러나, 발명자에 의한 상기 기술의 변형은 놀랍고 기대밖의 입증된 병원성을 갖는 BVDV 클론을 생산시켰다. 바람직하게 본 발명은 RNA의 5' 말단을 RACE에 의해 생산하는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 놀랍게도, 열안정성 폴리머라제와 결합시켜 RACE 기술을 적용시켜 게놈의 2차 구조에 대한 궁금증을 해소하는데 성공하였다.

표준 분자 생물학 방법은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있고, [Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, sowie in S. Bertram und H. G. Gassen, Gentechnische Methoden, G. Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 1991]에서 찾아볼 수 있다.

바람직하게, 본 발명은 RACE를 적어도 48℃, 바람직하게 50-55℃, 또한 바람직하게 56-60℃의 반응 온도를 허용하는 열안정성 폴리머라제를 사용하여 수행하는 본 발명의 방법에 관한 것이다.

본 발명자는 정의된 서열의 생(live) 감염성 BVDV 입자를 발명하고, 단지 하나의 정의된 유전자 마커 위치에서 약독화된, 정의된 유전자 아이덴터티를 갖는 약독화된 BVDV 입자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 놀랍게도 유전자 마커 사이트의 존재 여부는 단지 본 분야의 기술자에 공지된 분자 생물학적 방법에 의해 측정되어야 필요가 있기 때문에 상기에 의해 복귀돌연변이주의 단순한 측정이 가능하였고 성공적으로 약독화시킬 수 있었다. 실시예 1의 XIKE-B 및 XIKE- C는 정의된 서열의약독화된 BVDV 입자의 비제한적인 예이다.

본 발명의 또다른 일면은 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 DNA 분자 또는 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 감염성 BVDV 클론에 하나 이상의 돌연변이를 도입하여 BVD 바이러스를 약독화시키는 방법이다(여기에서, 돌연변이(들)는 회수된 BVD 바이러스의 약독화된 표현형을 증가시키거나 이를 일으키는 것이다).

그러나, 본 발명의 중요한 또다른 일면은

y) 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 DNA 분자 또는 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 감염성 BVDV 클론에 하나 이상의 돌연변이를 도입하고;

z) DNA가 RNA로 전사되는 감염되기 쉬운 숙주 세포내로 돌연변이 DNA를 도입하거나 상기 DNA로부터 전사된 RNA를 상기 세포로 도입하고;

aa) 이들 세포에 의해 생산된 바이러스 입자를 회수하는 것을 포함하여, 돌연변이 또는 돌연변이들이 약독화를 유발하는, BVDV 균주를 약독화하는 방법이다.

본 발명의 바람직한 일면은 상기 기술한 바와 같은 본 발명의 약독화 방법이다(여기에서, 돌연변이(들)는 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입, 첨가, 또는 그의 조합이다).

본 발명에 따라, "돌연변이"는 소위 "치환", 뉴클레오티드가 또다른 것으로 대체되는 것(예: T 대신 C) 또는 "결실" 또는 "삽입"과 같은 다른 돌연변이를 의미한다. "결실"은 하나 또는 수개의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 제거를 의미한다.

본 발명의 감염성 BVDV 클론은 야생형 바이러스와 매우 유사한 입증된 병원성을 갖고 동시에 정의한 유전자형을 갖는 바이러스이기 때문에 이 바이러스는 동물 시험에서 양성 대조군으로서 사용되어야 한다. 이 감염성 클론은 예를 들면, 백신화용으로 사용하고자 하는 특정의 약독화된 BVDV 클론의 생산에 우수한 도구가 된다. 본 발명은 당단백질 E^RNS에 존재하는 RNase 활성이 불활성화된 BVDV 클론을 포함한다. 바람직하게, RNase 활성은 결실 및/또는 치환과 같은 다른 돌연변이에 의해 불활성화된다. 바람직하게, 결실 및/또는 다른 돌연변이는 295 내지 307번 위치 및/또는 338 내지 357번 위치의 아미노산에 위치한다.

따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 일면은 돌연변이(들)가 E^RNS에 존재하고 돌연변이 단백질의 기능적의 손실 또는 손상을 유발하는 본 발명에 따른 약독화 방법이다.

본 발명의 더욱 바람직한 일면은 돌연변이가

bb) 당단백질 E^RNS모두 또는 일부의 결실; 및/또는

cc) 서열번호 1의 300번 위치의 히스티딘의 결실 또는 치환; 및/또는

dd) 서열번호 1의 349번 위치의 히스티딘의 결실 또는 치환으로 구성된,본 발명에 따른 약독화 방법이다.

가장 바람직하게, 또다른 중요한 일면은 300번 및/또는 349번 위치의 히스티딘의 코딩 트리플릿(triplet)이 결실 또는 치환된 본 발명에 따른 BVDV 클론의 돌연변이를 포함하는 BVDV 약독화 방법이다.

또다른 중요한 일면은 349번 히스티딘에 대한 코돈이 결실된 본 발명에 따른 BVDV의 약독화 방법이다.

본 발명의 또다른 중요한 일면은 본 발명의 방법에 따라 수득할 수 있는 약독화된 BVDV 클론 또는 BVDV 균주이다.

본 발명의 또다른 중요한 일면은 본 발명의 방법에 따른 약독화된 BVDV 클론 또는 BVDV 균주를, 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 백신이다.

본 발명은 추가로 BVDV 감염의 치료 또는 예방용 백신의 제조에서 본 발명에 따른 약독화된 BVDV 클론 또는 BVDV 균주의 용도에 관한 것이다.

바람직하게, 본 발명의 백신은 하나의 면역학적으로 활성인 성분이 생(live) BVDV이고, 단백질 E^RNS의 RNase 활성이 불활성화된 상기 정의된 백신을 언급한다. 용어 "생백신"은 복제할 수 있는 입자, 특히 복제 활성 바이러스 성분을 포함하는 백신을 언급한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 백신은 본 발명에 따라 약독화된 1형 BVD 바이러스와 함께 본 발명에 따라 약독화된 1형 BVD 바이러스 또는 어느 다른 항원 그룹 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 백신은 복합 백신으로서 투여될 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 약독화된 1형 BVD 바이러스을 먼저 투여한 후 3 내지 4주 후 본 발명에 따라 약독화된 2형 BVD 바이러스를 투여할 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 백신은 단백질 E^RNS의 RNase 활성이 불활성화된 본 발명에 따라 약독화된 1형 BVD 바이러스를 단백질 E^RNS의 RNase 활성이 불활성화된 본 발명에 따라 약독화된 1형 BVD 바이러스 또는 단백질 E^RNS의 RNase 활성이 불활성화된 어느 다른 항원 그룹 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 백신은 복합 백신으로서 투여될 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 약독화된 1형 BVD 바이러스를 먼저 투여한 후 3 내지 4주 후 본 발명에 따라 약독화된 2형 BVD 바이러스를 투여할 수 있다.

바람직하게 본 발명은 상기 기술한 바와 같은 약독화된 BVDV 또는 백신 조성물을 적절한 투여량으로 본 분야의 기술자에게 공지된 방법에 따라 그를 필요로 하는 소에 투여하고 바이러스혈증 및 백혈구감소증 및/또는 열 및/또는 설사와 같은 BVDV 증상의 감소 여부를 모니터하는, 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 약독화된 BVDV로 BVDV-감염 소를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 치료는 반복된다.

하기 예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

재료 및 방법

세포 및 바이러스.MDCK 세포를 American Type Culture Collection (Rockville, Md.)로부터 입수하였다. 10% 우태아 혈청(FCS; 페스티바이러스 및 페스티바이러스에 대한 항체의 부재에 대하여 시험됨) 및 비필수 아미노산으로 보충된 둘베코스-모디파이드 이글스 배지에서 배양하였다.

소 바이러스 설사 균주 New York '93 (필드 분리주 VLS#399)는 E. J. Dubovi (New York State College of Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca)로부터 제공받았다. 이하, 1회 동물 계대 배양된 바이러스를 "New York '93/C"로 정의하였다.

세포 감염, 면역형광측정 및 바이러스 과산화효소 에세이.페스티바이러스는 그의 숙주 세포와 고도로 결합하기 때문에 배양 세포의 재감염을 위해 감염된 세포의 용해물을 사용하였다. 감염 후 3 내지 5일째에 세포를 동결시키고 해동시켜 용해물을 준비하고 -70℃에서 저장하였다. 본 명세서에서 달리 언급하지 않는 한, 0.1의 감염다중도(MOI)를 배양 세포 감염에 사용하였다.

면역형광측정 및 바이러스 과산화효소 에세이를 위해, 감염된 세포를 빙냉 아세톤:메탄올(1:1)에 15분동안 -20℃에서 고정시키고, 대기 건조시키고 인산 완충처리된 염수(PBS)로 다시 수화시켰다. 이어서 세포를 E2에 직접적인 항-BVDV 모노특이성 항체의 혼합물과 인큐베이션시켰다(Weiland et al., 1989). PBS로 세척한 후, 플루오레신이소티오시아네이트(FITC)-컨쥬게이트 래빗 항-마우스 항체(Dianova, Hamburg, Deutschland)를 사용하여 면역형광측정에서 결합한 항체를 검출하였다. 과산화효소 에세이를 위해, 과산화효소-컨쥬게이트 염소 항-마우스 항체(Dianova)를 2차 항체로서 사용하였다. 실온에서 한시간동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 결합한 항체를 50mM 아세트산나트륨 완충액 pH 5.0, 1μM 아미노에틸카바졸 및 0.1% H₂O₂로 구성된 용액을 사용하여 검출하였다.

노던(RNA) 하이브리제이션.상기 기술한 바와 같인 세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 감염 후 48시간째 RNA를 제조하였다(Rumenapf et al., 1989). 겔 전기영동, 프로브의 방사능 표지, 하이브리제이션, 및 포스트하이브리제이션 세척을 상기 기술한 바와 같이 수행하였다(Rumenapf et al., 1989). 균주 New York 93/C로부터의 방사능 표지된 PCR 산물(뉴클레오티드 4301 내지 5302)를 프로브로서 사용하였다.

PCR 및 RT-PCR.

제조사의 권고에 따라Tfl-폴리머라제(Promega, Mannheim, Deutschland) 또는Taq-폴리머라제(Appligene, Heidelberg, Deutschland)를 가지고 약 50-100ng의 DNA 주형 및 25pmol의 각 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 게놈의 5' 말단을 증폭시키기 위하여 사용된 프라이머의 서열은 상류, T₂₅V-프라이머 (Display Systems Biotech, Kopenhagen, Danemark); 및 하류, CM79: CTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG(첫번째 라운드용) 및 CM86: CTCGTCCACATGGCATCTCGAGAC(중첩(nested) PCR용)이었다. 게놈의 3' 말단을 증폭시키기 위하여 사용된 프라이머의 서열은 상류, CM46: GCACTGGTGTCACTCTGTTG(첫번째 라운드용) 및 CM80: GAGAAGGCTGAGGGTGATGCTGATG(중첩 PCR용) 및 하류, nls-: GACTTTCCGCTTCTTTTTAGG이다. 역전사-PCR (RT-PCR)은 제조사의 권고에 따라 주형으로서 2μg의 총 RNA를 사용하여 Titan^TMOne Tube RT-PCR System (Boehringer Mannheim, Deutschland)을 사용하여 수행하였다. E^rns코딩 영역의 증폭을 위한 프라이머는 상류, CM28:GGAGAGAATATCACCCAGTG 및 하류 CM21: CTCCACTCCGCAGTATGGACTTGC이었다.

증폭된 RT-PCR 산물을 분취용 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제한 후 제조사의 권고에 따라 Nucleotrap-Kit (Macherey-Nagel, Duren, Deutschland)로 용출시켰다.

DNA-올리고뉴클레오티드의 인산화 및 RNA 3' 말단으로의 결찰.DNA 프라이머를 바이러스 게놈의 3' 말단에 결찰시키기 위하여, 프라이머를 인산화시켰다. 10μg의 올리고뉴클레오티드 nls+: CCTAAAAAGAAGCGGAAAGTC를 30㎕의 키아제-믹스 (2 mM ATP; 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl₂; 10 mM 디티오트레이톨; 25 μg/ml 소혈청 알부민)중 5 유니트의 T4-폴리뉴크렐오티드 키나제 (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland)와 37℃에서 40분간 인큐베이션시켰다. 프라이머를 세파덱스 G-15-스핀 칼럼(Sambrook et al., 1989)에 통과시키고 추가로 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다.

50㎕의 리가제-믹스(50 mM Tris-HCl, pH 7,8; 10 mM MgCl₂; 10 mM 디티오트레이톨; 1 mM ATP; 40% 폴리에틸렌 글리콜 및 50 유니트의 RNA-가드(Amersham, Freiburg, Deutschland))중 20 유니트의 T4-RNA-리가제(New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland)로 감염된 세포 배양 세포로부터 제조된 5μg의 총 RNA 및 150pmol의 인산화된 올리고뉴크레오티드을 사용하여 16시간도안 17℃에서 결찰시켰다. 산물을 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다.

싱글-스트랜드 DNA의 합성 및 테일링(tailing).제조사의 권고에 따라(반응:65℃에서 10분, 42℃에서 40분, 65℃에서 15분) 감염된 세포로부터의 2μg의 총 RNA 및 100pmol의 프라이머 CM79을 사용하여 디스플레이 Thermo-RT 역전사효소(Display Systems Biotech, Kopenhagen, Danemark)를 사용하여 싱글-스트랜드 (-) DNA를 바이러스 게놈의 5' 말단으로부터 제조하였다(참조 "PCR 및 RT-PCR"). DNA를 페놀/클로로포름 추출 및 1/4의 10M 아세트산암모늄을 사용한 에탄올 침전을 연속 2회하여 정제하였다(Schaefer 1995).

제조사의 권고에 따라 50㎕ TdT-완충액중 50%의 "제 1 스트랜드" 산물, 50 유니트의 말단 트랜스퍼라제, 6,25μM dATP 및 1,5 mM CoCl₂을 사용하여 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(Tdt)(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland)를 사용하여 제 1 cDNA 스트랜드에 가하였다. 37℃에서 30분동안 인큐베이션시킨 후, 산물을 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다.

cDNA 라이브러리즈기 작제 및 뉴클레오티드의 서열화cDNA 합성 및 클로닝 및 라이브러리 스크리닝을 상기 기술된 바와 같이 통상적으로 수행하였다(Meyers et al., 1991). cDNA는 프라이머로서 올리고 BVD13, BVD14 및 BVD15 (Meyers et al., 1991) 및 B22.1R (GTTGACATGGCATTTTTCGTG), 812.1R (CCTCTTATACGTTCTCACAACG), BVD33 (GCATCCATCATXCCRTG^AT_GAT), N7-3-7 (CAAATCTCTGATCAGTTGTTCCAC), B23-RII (TTGCACACGGCAGGTCC) 및 B-3' (GTCCCCCGGGGGCTGTTAAGGGTTTTCCTAGTCCA)를 사용하여 합성하였다. 라이브러리를 스크리닝하기 위하여 사용된 프로브는 BVDV-균주 cp7 (GenBank HinterlegungsnummerU63479, Meyers et al., 1996b)로부터의 cDNA 클론의 XhoI/AatII 삽입체이고; 하이브리제이션을 52℃에서 수행하였다.

엑소뉴클레아제 III 및 뉴클레아제 S1를 사용하여 cDNA 클론의 결실 라이브러리를 구축하였다(Henikoff, 1987). 더블-스트랜드 DNA의 뉴클레오티드 서열화를 BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland)를 사용하여 수행하였다. 결과 cDNA 클론의 양 DNA 스트랜드가 서열화되고; 독립적인 cDNA 사이의 중첩은 적어도 두개의 클론에서 서열화되었다. 전장의 게놈에 대하여 전체 영역이 ~3.8인 총 약 47,000여개의 뉴클레오티드를 분석하였다. 서열 분석 및 배열을 Genetics Computer Group Software으로 수행하였다(Devereux et al., 1984).

전장의 cDNA 클론 작제. 제한, 클로닝 및 다른 일반 방법은 통상적으로 다른 것에 기술된 바와 같이 수행하였다(Sambrook et al., 1989). 제한 및 변형 효소는 New England Biolabs (Schwalbach, Deutschland), Pharmacia (Freiburg, Deutschland), GibcoBRL (Eggenstein, Deutschland) 및 Boehringer Mannheim (Deutschland)로부터 입수하였다.

라이브러리로부터의 5개의 cDNA 클론을 전장의 cDNA 클론 작제에 사용하였다: 플라스미드 C3/8 (뉴클레오티드 35 내지 2411), 플라스미드 C5/11 (뉴클레오티드 22 내지 2400), 플라스미드 8/11 (뉴클레오티드 3400 내지 7814), 플라스미드 13/27 (뉴클레오티드 4783 내지 9910) 및 플라스미드 C4/24 (뉴클레오티드 8658 내지 12322). 2144번 내지 4447번 위치의 뉴클레오티드에 이르는 "RT-E2" 단편은 필드 분리주로 감염된 MDBK 세포로부터의 총 RNA를 주형으로서 사용하여 프라이머 CM29 (GATGTAGACACATGCGACAAGAACC) 및 CM51 (GCTTCCACTCTTATGCCTTG)로 RT-PCR에 의해 수득하였다. 하기 설명에서, 바이러스 cDNA 삽입체의 측면에 위치하는 플라스미드 제한 부위는 밑줄로 표시한다.

우선, 클론 C3/8을AatII 및HindIII로 절단하고, cDNA 삽입체를 동일한 효소를 사용하여 절단된 pACYC177내로 전달하였다. 생성된 플라스미드를 pKANE5로 명명하였다. 동일한 효소로 제한한 후 RT-PCR 산물 "RT-E2"를 상기 플라스미드의NdeI/HindIII 부위내로 삽입하고; 생성된 플라스미드는 pKANE8이었다. 이어서 클론 C5/11으로부터의AatII 단편을 pKANE8의AatII 부위로 전달하여 플라스미드 pKANE14를 수득하였다.

첫번째 cDNA 뉴클레오티드의 상류에 T7 프로모터 서열을 도입하는 프라이머 CM87 (GCTCTAGACGGCCGTAATACGACTCACTATAGGTATACGAGATTAGCTA AAGAACTCGTATATGGATTGGACGTCAAC), 및 CM79을 사용하여 재조합 cDNA의 5' 말단을 생산하고(참조, PCR 및 RT-PCR); 플라스미드 C5/11을 PCR 주형으로서 사용하였다. PCR 산물을 DNA 클론 C5/9의 XbaI- 및 BsrGI 부위내로 결찰시켜, 플라스미드 pKANE22를 수득하였다. 이후, 올리고 CM87는 가성(false) 뉴클레오티드 포함하고 있음을 발견하고 pKANE22를 올리고 CM88 (GACGGCCGTAATACGACTCACTATAGTATACG) 및 CM79를 사요하여 PCR에 의해 수복시켰다. PCR 산물을E. coliDNA 폴리머라제 I (Klenow 단편)로 처리하여 둔단 말단(blunt end)을 형성하고 BsrGI 로 제한하였다.플라스미드 pKANE22의 Spel^둔단/BsrGI 부위내로 클로닝하였다.

cDNA 클론 8/11를XhoI및BamHI로 절단하고 동일한 효소를 사용하여 pACYC177내로 클로닝하고; 생성된 플라스미드르를 pKANE6로 명명하였다. cDNA 클론 13/27의AvrII/BamHI단편을 pKANE6으로 전달하여 플라스미드 pKANE15를 수득하였다. 이어서, pKANE14로부터의 EcoRV/MfeI 단편을 동일한 효소로 분해된 pKANE15내로 삽입하였다. 생성된 플라스미드는 pKANE21이었다. pKANE21을 SacII 및 EcoRV 로 분해하고 pKANE14로부터의 상응하는 단편을 이 부위내로 클로닝하여 플라스미드 pKANE24를 수득하였다. 이어서 pKANE22A로부터의SacII/SacII 단편을 동일한 효소로 절단된 pKANE24 클론로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pKANE28AII이었다.

SrfI부위를 게놈의 3' 말단에 가하는 프라이머 B2-11500 (CCTAACCATGATATATGCCTTCTG) 및 CM81 (CGGAATTCGCCCGGGCTGTTAGAGGTCTTCCCTAGT)을 사용하여 PCR에 의해 게놈의 3' 말단을 생산하였다. PCR 산물을 BamHI 및EcoRI로 절단하고 pACYC177 클론내로 클로닝하여 플라스미드 pKANE17을 수득하였다. 이어서, cDNA 클론 C4/24의SacI/Kpn2I 단편을 pKANE17로 전달하고; 플라스미드를 pKANE20로 명명하였다. StuI/EcoRI단편을 pKANE20으로부터 절단하고EcoRI로 분해되고 StuI로 부분적으로 분해된 플라스미드 pKANE21 클론내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pKANE23이었다. 최종적으로 pKANE28AII로부터의XbaI/PshAI 단편을 동일한 효소로 절단된 플라스미드 pKANE23에 삽입하고 전장의 cDNA 클론 pKANE40을 수득하였다.

지정부위돌연변이(site-directed mutagenesis). 제조사의 권고에 따라 QuikChange 지정부위돌연변이 키트(Stratagene, Amsterdam, Niederlande)를 사용하여 PCR에 의해 돌연변이를 생산하였다. E^rns를 코딩하는 영역내로 돌연변이를 도입하기 위하여 사용한 플라스미드는 초기 cDNA 라이브러리로부터 수득된 클론, C5/9(뉴클레오티드 50 내지 2411)이었다. 돌연변이 H"346"Δ를 생산하기 위한 올리고뉴클레오티드는 CM126 (GAGTGGAATAAAGGTTGGTGTAAC) 및 CM127 (GTTACACCAACCTTTATTCCACTC)이고; 돌연변이 H"297"L를 생산하기 위한 올리고뉴클레오티드는 CM128 (AACAGGAGTCTATTAGGAATTTGGCCA) 및 CM129 (TGGCCAAATTCCTAATAGACTCCTGTT)이었다. 원하는 돌연변이의 존재 및 제 2 부위 돌연변이의 부재는 뉴클레오티드 서열화에 의해 확인되었다.

시험관내 전사 및 RNA 형질감염

RNA 전사 및 MDBK 세포의 형질감염은 상기 기술된 바와 같이 필수적으로 수행하였다(Meyers et al., 1996a). 간략하게, 2μg의 각 cDNA 작제물을 Srfl로 선형화시키고 페놀 추출법 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 15 유니트의 RNA가드(Pharmacia, Freiburh, Germany)의 존재하에 50 유니트의 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 총 용량 50㎕의 전사 믹스(40mM Tris-HCl, pH 7.5; 6mM MgCl₂; 2mM 스퍼미딘; 10mM NaCl; 0.5mM 각 ATP, GTP, CTP 및 UTP; 10mM 디티오트레이톨; 100μg/ml의 송아지 혈청 알부민)중에서 T7 RNA 폴리머라제로(NEB, Schwalbach, Germany)로 전사를 수행하였다. 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후 반응 혼합물을 Sephadex G-50 스핀 칼럼에 통과시키고 추가로 페놀 추출법 및 에탄올 침전에 의해 정제하였다.

달리 언급하지 않는 한, 약 3 x 10⁶의 MDCK 세포 및 DEAE-덱스트란에 결합한 약 0.5μg의 시험관내에서 전사된 RNA(Pharmacia, Freiburg, Germany)의 현탁액을 사용하여 형질감염을 수행하였다. RNA/DEAE-덱스트란 컴플렉스는 100㎕ HBBS(5g의 Hepes, 8g의 NaCl, 0.37g의 KCl, 0.125g의 Na₂HPO₄.2H₂O 및 1리터당 1g의 덱스트로스)에 용해된 RNA를 100㎕의 DEAE-덱스트란(HBSS중 1mg/ml)와 혼합하고 얼음상에서 30분동안 인큐베이션시켜 수득하였다. 펠릿화된 세포를 FCS가 없는 DMEM으로 1회 세척하고, 원심분리한 후 RNA/DEAE-덱스트란 혼합물에서 재현탁시켰다. 30분동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후, 20㎕의 디메틸설폭시드를 가하고 혼합물을 실온에서 2분동안 인큐베이션시켰다. 2ml의 HBSS를 가한 후, 세포를 펠릿화하고 HBSS로 1회 세척하고 FCS가 없는 배지로 1회 세척하였다. 세포를 FCS를 포함하는 DMEM에 재현탁시키고 지름이 10.0cm인 디쉬에 시딩하였다. 감염후 48h째 내지 72h째 세포를 유출시키고 연속된 분석에 적절하도록 시딩하였다.

일렉트로포레이션을 사용하여 RNA의 특정 감염성을 측정하였다. 마그네슘 및 칼슘을 포함하지 않는 인산 완충처리된 염수(PBS) 0.5ml중 3 x 10⁶MDCK 세포를 적절한 양의 RNA와 혼합하고 2mm 일렉트로포레이션 큐베트로 전달시켰다. 일렉트로포레이션을 Hoefer PG 200 Progenetor II에서 960μF의 펄스로, 180 볼트에서 수행하였다. 이후, 세포를 3.5cm 디쉬에 시딩하고 약 20h 후 면역형광측정에 의해 분석하였다.

RNase 활성 측정MDBK 세포를 재조합 바이러스로 감염시키고 48시간동안 배양하였다. 야생형 바이러스로 감염된 세포를 양성 대조군으로 사용하고 감염시키지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. MDBK 세포에서 장시간의 인큐베이션은 상당한 배경활성(considerable background activity)을 나타내기 때문에 세포 제조 및 RNase 활성 측정은 37℃에서 프로브 인큐베이션을 1시간 대신 30분간 수행한다는 것을 제외하고 상기 기술된 바와 같이(Meyers et al. 1999) 수행하였다.

동물 실험. 재조합 바이러스를 시험하여 2개의 동물 시험을 수행하였다. 첫번째 시험에서, 그룹당 암컷 얼룩소 3마리(8 내지 10개월)의 2 그룹에 마리당 10⁵TCID₅₀으로 비강내 접종하였다. 2회째 시험에서 수컷 Holstein 및 Holstein-크로스 송아지(7 내지 10주령) 6 마리에 마리당 10⁵TCID₅₀으로 접종하였다. 감염전 모든 동물에는 BVDV 특이성 항원 및 항체가 없었다. 다른 그룹은 별개의 분리 유니트에서 하우징하였다. 결과부에 언급하는 바와 같이 임상 파라미터를 매일 기록하였다. 결과부에서 지정된 시간에 외경정맥으로부터 혈액을 채취하고 헐청 생산을 위해 사용하지 않는다면 헤파린(약 35 I.U./ml)으로 안정화시켰다.

혈액내 바이러스 존재 여부를 측정하기 위하여, 모든 혈액 샘플로부터 백혈구연층(백혈구연층)을 제조하였다. 5ml의 빙냉 분해 완충액을 분취량의 헤파린 안정화된 혈액(약 10⁷의 백혈구 포함)에 가하고 10분동안 얼음상에서 인큐베이션시키고, 원심분리하였다. 펠릿을 2ml PBS에 재현탁시키기 전에 분해 완충액으로 1회 세척하고 Ca⁺²및 Mg⁺²가 없는 PBS로 2회 세척하였다. 24 웰 플레이트에 시딩된 MDBK 세포를 200㎕의 백혈구연층 시료와 함께 접종하고 5일동안 인큐베이션시켰다. 바이러스 항원은 BVDV E2 mAb 믹스를 사용하여 면역형광현미경검사법에 의해 검출하였다.

바이러스-중화(nertralizing) 항체의 존재여부를 30분동안 56℃에서 인큐베이션하여 불활성화된 혈청 샘플에서 시험하였다. 혈청을 96웰 마이크로티터 플레이트상에서 1:2 스텝으로 희석하고 37℃에서 1시간동안 웰당 균주 New York'93/C/100 TCID₅₀현탁액으로 접종하였다. 10^1.75MDCK 세포를 각 웰에 가하고 5일동안 인큐베이션하였다. 형광측정법에 의해 감염을 분석하고, Kaeber 방법(Mayr et al, 1974)에 의해 산출하고 약 100 TCID₅₀을 중화시키는 50% 엔드포인트 희석율로서 나타내었다.

콧물내 바이러스를 검출하기 위하여, 결과부에 나타낸 시점에 코 면봉을 채취하고 2ml의 이동 완충액(5% FCS, 100 I.U./ml 페니실린 G, 0,1 mg/ml 스트렙토마이신 및 2.5 μg/ml 암포트레신 B로 보충된 PBS)으로 희석시키고 0,2 μm 필터에 통과시켰다. MDBK 세포를 100㎕의 이들 시료로 24웰 플레이트에 접종하고 5일 후 간접적으로 면역형광현미경검사법에 의해 분석하였다.

결과

게놈 분석.균주 NY'93/C는 전체적으로 서열화된 제 BVDV 2형 게놈이다. 노던 블랏 분석을 통해 NY'93/C의 게놈은 균주 890과는 반대로 (Ridpath 및 Bolin, 1995) 다량의 삽입 또는 결실을 포함하지 않는다고 나타났다(데이타 제시하지 않음). 뉴클레오티드 서열 분석을 통해 게놈의 길이는 12332 뉴클레오티드이고 3913 아미노산의 폴리프로테인을 코딩하는 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다고 나타났다.

5' 비해독 영역(1 내지 385번 위치)을 RACE 기술로 측정하였고, 이는 Topliff 및 Kelling (1998)에 의해 공개된 New York '93 서열과 21번 위치를 제외하고 일치하는 것으로 밝혀졌다. 공지된 다른 2형 게놈(Ridpath 1995; Topliff 및 Kelling, 1998)과 반대로, 균주 NY'93/C는 이 위치에 티민 대신 아데닌을 갖는다.

NY'93/C에 대한 감염성 cDNA 클론의 작제 및 분석. 다수의 감염성 cDNA 클론이 CSFV 및 BVDV 1형에 대하여 구축된 바 있지만(Mendez et al., 1998; Meyers et al., 1996a 및 1996b; Moormann et al., 1996; Vassilev et al., 1997; Kummerer 및 Meyers, 2000); BVDV 2형 균주로부터의 감염성 클론은 첫번째 보고이다. T7 폴리머라제를 사용하여 런오프(runoff) 전사하기 위하여 클론을 작제하여 이종의 첨가는 없는 게놈성 RNA를 수득하였다. 개시 파지 라이브러리로부터 선택된 4개의 cDNA 플라스미드 및 2265 및 4301번 위치 사이의 영역을 포함하는 하나의 RT-PCR 산물로부터 전장의 클론을 구성하였다. 시험관내 전사를 위해 5' 말단에 T7 프로모터 서열을 가하고, 플라므시드 선형화를 위해SrfI 부위를 3' 말단에 가하였다(도 1). 전장의 클론을 pKANE40A로 명명하였다.

시험관내 전사에 의해 선형화된 pKANE40A 주형으로부터 생산된 RNA로 MDBK 세포를 형질감염시켰다. NS5B 코딩 영역의 상류 19개 코돈을 종결시키는 플라스미드 pKANE28AII로부터의 런오프 전사를 음성 대조군으로서 사용하였다. 감염 후 3일째, 면역형광 염색 후 pKANE40A로부터의 RNA로 형질감염된 세포에서 BVDV-특이성 시그날이 검출되었지만, 대조군에서는 검출되지 않았다. 감염성 클론 pKANE40A로부터 생산된 바이러스를 XIKE-A로 명명하였다. 형질감염된 세포를 2회 계대 배양하고, 2차 계대 배양 저장액을 모든 추후의 시험에 사용하였다. XIKE-A의 동정을 위한 증거로서 1630번 위치상의 C로부터 T로의 뉴클레오티드 교환을 채택하여 RT-PCR 서열화로 바이러스를 분석하였다.

pKANE40A로부터 유래된 RNA의 특이적 감염성을 야생형 바이러스 NY'93/C로 감염된 세포로부터 제조된 RNA와 비교하여 측정하였다. 최종적으로 MDBK 세포 형질감염에 사용된 샘플중 바이러스 RNA의 농도를 형광영사기(phosphoimager)를 사용하여 노던 블랏팅 및 하이브리제이션 후 정량의 시험관내에서 전사된 RNA와 비교하여 측정하였다. MDBK 세포를 유사량의 RNA로 형질감염시키고, 플라크를 감염후 3일째 계수하였다. 대략 pKANE40A으로부터 유래된 RNA의 감염성은 4,32 x 10²pfu/μg이고, 야생형 RNA는 4 x 10²pfu/μg이었다.

재조합 바이러스의 성장상의 특징을 동일한 시험에서 대조군으로서 기원 필드 분리주 VLS#399를 사용하여 성장 곡선을 통해 분석하였다(도 2). MDBK 세포를 0.1 m. o. i로 감염시키고 샘플을 감염 후 2시간째부터 96시간째 7개의 시점에서채취하였다. 재조합 XIKE-A의 성장 곡선은 VLS#399보다 더욱 완만하였지먼(smoother), 96시간 후에는 바이러스 두개 모두 10^6.39역가에 도달하였다. XIKE-A가 추가의 실험에 적절하다고 간주되었다.

E ^rns 돌연변이의 작제 및 분석.CSFV (Meyers et al., 1999)을 사용한 이전 실험을 통해 당단백질 E^rns의 RNase 활성은 297번 또는 346번의 히스티딘(번호는 CSFV 균주 Alfort/Tubingen내 잔기 번호이다)이 류신 또는 리신으로 치환된거나, 코돈 "H346"의 결실에 의해 파되된다고 나타났다. 돌연변이 바이러스는 생존가능하지만, 임상적으로 약독화되어 있다. BVDV 균주 NY'93/C에서 두개의 히스티딘 잔기는 각각 300번 및 349번에 위치한다. 이 위치상의 돌연변이의 효과가 BVDV 2형 게놈에서 CSFV와 유사한지 시험하기 위하여 두개의 감염성 클론을 코돈 "H349"를 결실시키거나 코돈 "H300"을 류신으로 치환시키는 조작을 하였다. 생성된 재조합 바이러스 돌연변이를 XIKE-B (H349Δ) 및 XIKE-C (H300L)로 명명하였다.

E^rns코딩 영역을 포함하는 RT-PCR 산물의 뉴클레오티드 서열화에 의해 측정된 바 MDBK 세포는 두개의 돌연변이 모두 적어도 5회의 계대 배양동안 안정성이었다. 두개의 돌연변의 성장상의 특징을 야생형의 감염성 클론으로부터 유래된 바이러스와 비교하였다(도 3).

XIKE-A, XIKE-B 및 XIKE-C의 RNase 활성을 감염 후 이틀째 동일한 m.o.i.의 바이러스로 감염된 세포의 조(crude) 세포 추출물에서 측정하였다. 폴리(U)를 분해하는 능력에 대해 분취량의 시료를 시험하였다; 야생형 NY'93/C로 감염된 세포를 양성 대조군으로 사용하고, 감염되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 30분동안 인큐베이션시킨 후, 남은 고분자 RNA를 침전시키고, 상등액의 OD₂₆₀측정을 통해 분해된 작은 RNA 단편의 존재 여부를 밝혀냈다(Meyers et al., 1999). NY'93/C 및 XIKE-A 샘플에서 높은 RNase 활성이 나타난 반면, 동일한 범위에서 돌연변이 XIKE-B 및 XIKE-C는 음성 대조군으로서 나타났다(도 4).

XIKE-A 및 NY'93/C를 사용한 동물 시험.첫번째 동물 시험의 목적은 감염성 cDNA 클롬으로부터 유래된 재조합 바이러스 XIKE-A의 병원성 및 병원성을 야생형 균주 NY'93/C의 것과 비교하는 것이었다. 그룹당 3마리의 동물(8 내지 9개월)의 2 그룹을 각각 10⁵TCID₅₀의 XIKE-A(동물 번호 #615, #377, #091) 또는 NY'93/C(#275, #612, #1610)으로 감염시켰다. 각 그룹을 별개의 분리 유니트에서 하우징시켰다. 체온 및 임상 징후를 매일 기록하였다; 백혈구 계수 및 바이러스 혈증 검출을 위해 혈액 샘플을 0, 2 내지 16 및 21째 p. i. 채취하였다. 0, 7, 14, 21, 29 및 35째 p. i. NY'93/C에 대한 중화 항체의 검출을 위해 송아지 모두로부터의 혈청을 회수하였다. 바이러스 분리용 코면봉을 0, 2 내지 17 및 21째 p. i. 취했다.

표 1 : New York '93/C 또는 XIKE-A로 감염된 동물의 백혈구연층 시료 및 코 면봉으로부터의 바이러스 분리. + 바이러스 검출; - 바이러스 미검출; bac = 박테리아; * 13째 p. i. 동물을 안락사시킴.

양 그룹의 동물 모두 열이 올랐고(도 5) 호흡 증상 및 위장 질환을 포함하는 광범위한 임상 징후를 나타내었다. 동물 #091는 후생문제로 13째 p. i. 죽었다. 양 그룹의 송아지 모두 3째 p. i.를 시작으로 백혈구혈증을 나타내고 15째 p. i.까지 지속되었다(도 6). 5일동안 New York '93/C, 또는 7일동안 XIKE-A로 감염된 동물로부터의 백혈구연층 시료에서 바이러스가 검출되었다. 콧물에서는 1 또는 2일동안 발견되었다(표 1).

동물 모두의 백혈구연층 시료로부터 제조된 RNA로부터의 RT-PCR 산물의 뉴클레오티드 서열화에 의해 바이러스의 아이덴터티를 조사하였다. 총 E^rns코딩 영역(1140 내지 1780번 위치)을 서열화하고 각각 NY'93/C 또는 XIKE-A의 공지된 서열과 일치한다는 것을 발견하였다. 중화 항체가 14째 p. i. 시작으로 송아지 모두의 혈청에서 발견되었다(표 2).

* 13째 p. i. 동물을 안락사시킴.

표 2: New York '93/C 또는 XIKE-A으로 실험적으로 감염시킨 후 송아지 모두의 혈청 샘플에서 측정된 중화 항체 역가. 결과를 New York '93/C에 대한 혈청 -BVDV-특이성 중화 항체의 역수로 나타내었다(10^2.07TCID₅₀).

이 연구 결과는 재조합 바이러스 XIKE-A는 자연발생 숙주에서의 면역반응 유도 및 병원성 모두와 관련하여 야생형 바이러스 NY'93/C와 고도로 유사하다는 것을 입증한다. 따라서, 감염성 클론 pKANE40A에 기초하여 생산된 바이러스 돌연변이에서 관찰될 수 있는 이러한 임상적 상황으로부터의 어느 편향(deviation)이 바람직한 돌연변이에 의해 유발될 수 있음을 가정할 수 있다.

XIKE-B 및 XIKE-A를 사용한 동물 실험2회째 동물 실험에서, RNAse-음성 돌연변이 XIKE-B의 임상 및 면역학적 특성을 XIKE-A와 비교하여 분석하였다. 야생형으로 게놈이 복귀(reversion)할 위험성을 최소화하는데 있어 H349 Δ -돌연변이가 H300L-돌연변이보다 우선하였다.

그룹당 3마리(7 내지 10주령)인 두 그룹 각각 XIKE-A(동물 #387, #388,#418) 또는 XIKE-B-바이러스(동물 #415, #417, #419)을 5 x 10⁵TCID₅₀의 투여량으로 접종하였다. 그룹을 별개의 분리 유니트에서 하우징시켰다. 직장의 온도 및 임상적 증상을 매일 모니터하였다; 코면봉 및 혈액 샘플을 -8, 0, 2 내지 14, 17 및 21째 채취하였다. 혈청 샘플을 0, 8, 12/14, 21, 28 및 38/40째 회수하였다.

감염 후 9 내지 10째, XIKE-A로 감염된 송아지는 3일까지 열을 났고; 추가로 동물 #387는 설사 및 호흡기 증상을 동반하여 3일째 p.i. 열이 났다(도 7). 송아지 #388은 경련을 나타냈다. 현저한 우울증 및 식욕부진 상태에서 12째 p. i. 후생 문제로 그룹을 안락사시켰다. XIKE-B로 감염된 송아지에서는 어느 것도 체온이 오르지 않았다(도 7). 단지 경미한 호흡기 증상만 6일이하의 기간동안 관찰되었다. 백혈구감소증이 동물 모두에서 발견되었지만; 백혈구 수의 감소는 XIKE-B 그룹보다 야생형 XIKE-A으로 감염된 송아지에서 더욱 현저하였다(도 8).

바이러스는 4일째 p. i.를 시작으로 동물 모두에 대하여 백혈구연층에서 발견되었지만; 바이러스혈증은 야생형 서열(φ8 일)로 감염된 바이러스의 경우보다 Erns 돌연변이(φ4 일)에 대하여 더욱 단기간이었다. 콧물의 바이러스가 8일 이하의 기간동안(φ4, 7) XIKE-A 동물에서 관찰되었지만, XIKE-B 동물에서는 최대 1일(φ0.7)동안 관찰되었다(표 3).

표 3 : 재조합 바이러스 XIKE-A (동물 #387, #388 및 #418) 또는 E^rns돌연변이 XIKE-B (동물 #415, #417 및 #419)로 감염된 동물의 백혈구연층 시료 및 코 면봉으로부터의 바이러스 분리. + 바이러스 검출; - 바이러스 미검출; * 12일째 p. i. 동물을 안락사시킴.

다시, 백혈구연층 시료내 바이러스 확인을 위해 전 E^rns코딩 영역을 포함하는 RT-PCR 산물의 뉴클레오티드 서열화를 사용하였다. 예측한 바와 같이, 동물 #387, #388 및 #418로부터의 분리주는 야생형이었다. "H349" 코돈 결실을 동물 #415, #417 및 #419에서 확인하였다. 흥미롭게도, 첨가 점 돌연변이는 세마리의 동물중 2마리(#415 및 #419)로부터의 RT-PCR 산물에서 발견되었다: 1246번 위치의 뉴클레오티드를 구아닌으로부터 티민으로 바꾸어, 아미노산 치환 Q287H을 형성하였다. 중화 항체는 12일째 p. i. XIKE-A로 감염된 송아지 혈청에서 먼저 검출되었고, 14일째 p. i. E^rns돌연변이로 감염된 송아지 혈청에서 검출되었다(표 4).

* 12일째 p. i. 동물을 안락사시킴.

표 4 : XIKE-A (야생형) 또는 XIKE-B (H349 Δ )로 실험상 감염시킨 후 모든 송아지의 혈청 샘플에서 측정된 중화 항체 역가. 결과를 New York '93/C에 대한 혈청 -BVDV-특이성 중화 항체의 역수로 나타내었다(10^1.7TCID₅₀).

실시예 2

실험 디자인

12마리의 임신한 염소를 BVDV 음성 무리로부터 선별하였다. 7마리중 5마리의 염소 그룹이 시험에 포함되었다:

	수	접종	바이러스
그룹 1	5	1회 i.n.투여 3ml(각 콧구멍에)	XIKE-A
그룹 2	5	1회 i.n.투여 3ml(각 콧구멍에)	NY-93

접종하기 8일전 염소를 실험기관으로 이동시켰다. 실험기관으로 이동시킨 후 임신 상태를 확인하였다. 접종일은 임신 60 내지 90일 사이였다. 한 시점에서 6ml의 조직 배양액 상층액에 적용된 2.5 x 10⁴TCID₅₀/ml의 각 바이러스로 모든 동물을 접종시켰다.

관찰 기간동안 염소를 유산을 포함하는 BVDV 감염의 임상적 징후의 존재여부에 관하여 모니터하였다. 감염후 9주째 실험을 마쳤다. 유산되지 않은 소는 도살하고, 자궁을 조사하고 회수하였다. 일반적인 부검기간동안 태아의 기관 샘플을 회수하고 BVDV 감염에 대하여 조사하였다.

태아 감염의 존재 여부가 BVDV-관련하여 죽은 소의 사망수, BVDV-관련하여 유산한 경우의 수 및 종결시 BVD 양성 태아의 마리수를 포함하는 주된 평가 파라미터였다.

결과:

그룹 1

동물 번호	결과
526	BVD 유산
598	BVD 유산
615	BVD 유산
618	BVD 유산
628	BVD에 의한 염소의 사망

그룹 2

동물번호	결과
184	BVD에 의한 염소의 사망
203	BVD 유산
232	BVD에 의한 염소의 사망
233	태아 BVD 양성(바이러스 혈증)
252	BVD 유산
267	BVD에 의한 염소의 사망
306	BVD 유산

실시예 3:

본 연구는 태아 감염에 대한 BVDV 분리주의 효능을 평가하기 위함이었다.

E(RNS) 단백질 XIKE-B(H349Δ)의 RNase 작용이 삭제된 NY93 감염성 카피 유도체 BVDV 재조합형(II형)의 효능을 이질성 I형 접종(challenge)후 태아 감염을 예방하기 위하여 조사하였다.

60일 내지 90일사이가 BVDV에 태아 노출에 대하여 가장 민감한 기간이다. 따라서, 이 시험에서 BVDV가 없는 사육장으로부터 유래되고(BVDV에 대하여 음성혈청반응이 확인된) 염소를 XIKE B로 단일 노출(i.m.)시켜 면역화시켰다. 이후, 염소를 수태시키고, BVDV 태아 감염에 가장 민감한 것으로 가정된 60-90일 사이에 야생형 필드 바이러스로 접종 감염을 실시하였다. 필드에서의 일반적인 감염 경로와 유사하게 접종을 위해 비강내 경로를 선택하였다.

실험 디자인:

염소를 BVDV 음성 무리로부터 선별하였다. 염소를 BVDV에 대하여 혈청학 및 바이러스학적으로 음성인 것을 시험하였다. 하기 염소 그룹이 시험에 포함되었다:

그룹	처리	접종	염소 수
		BVDV	백신화	접종
1	없음	I형	NA	2
2	분리주 XIKE-B	I형	10	4

그룹 1은 접종시까지 처리하지 않고 원래의 염소대로 남겨두었다. 백혈구연층 시료 및 혈청테스트를 위해 혈액 샘플을 백신화 시킨 후 회수하였다.

모든 그룹에 대하여 면역화시킨 후, 4주째 수태를 시작하였다. 접종종 그룹 1을 실험 기관으로 이동시켰다.

백신화 후 4개월 및 10일째 염소를 접종하였다. 접종한 날, 임신 상태는 임신 60 내지 90일 사이였다.

태아 감염의 예방이 주된 평가 파라미터였다.

이벤트 순서 및 타임 스케줄

면역	동물을 기관으로 이동시킨 후 10일째
수태	30일 기간내 면역화시킨 후 약 4주째 개시
접종 기관으로의 2차 이동	접종하기 적어도 10일전
접종	임신 60 내지 90일 사이
관찰	약 2개월동안 연속하여
동물 도살 및 태아 기관 샘플의 바이러스 분리주 시험을 위한 태아 회수	접종후 약 2개월

BVDV 접종 바이러스

바이러스를 BVDV가 없는 배지에서 적절하게 배양하고, 분취하고 -70℃[±10℃]에서 냉동시켰다.

타입/명칭	I형/ncp KE#9
계대 수준	4
조성	저먼 필드로부터 입수한 분리주
접종량	동물 1마리당 10⁵
투여량	동물 1마리당 6ml(콧물당 3ml)
접종 경로	비강내

백신화

백신화 스케줄은 실험 디자인부에 기술한다.

설명	XIKE-B, 생바이러스 BVDV 균주
계대 횟수	10
바이러스양	동물 1마리당 10⁵
투여된 백신량	동물 1마리당 2ml
투여 경로	근육내

결과:

항문 온도

한 경우만을 제외하고 모두에서 온도값은 39℃ 이하였지만, 관찰 기간동안특별한 변동은 없었다. 염소 번호 1249(그룹 1)은 14일째 DPI(감염후 일 수) 39.1℃이었고, 이는 그 다음날 정상값으로 돌아왔다.

백혈구 계수

0 DPI 값을 비교를 위한 각개의 기준선으로 간주하였다. 연구 프로토콜에서 백혈구 계수의 하한선은 정의하지 않았다. 그러나, 40% 이상으로 백혈구 계수가 감소, 즉, 기준값(접종 당일의 값)의 60%에 이르는 값 이하의 값을 생물학적으로 현저하다고 판단하였다.

각각의 평균 백혈구 계수를 하기 표 1에 나타내었다.

*0일째 샘플을 감염전날 회수하였다.

기준의 백혈구 계수는 모든 그룹에서 유사하였다. 그룹 1의 염소 두마리 모두(I형 균주로 감염됨)는 접종 후 백혈구 계수가 생물학적으로 현저히 감소한 반면(회색으로 표시)(4-8일째 DPI 최대로 감소), 상응하는 백신화된 염소(그룹 2)는 백혈구의 계수는 주목할만큼 감소하지 않았다. 예외적으로 단지 1197번 염소만이 단 하루, 14일째 PI 현저히 감소하였다. 바로 그 다음날, 백혈구 계수는 정상(기준으로부터 40% 미만 편향)으로 돌아왔다.

바이러스 분리주 데이타

바이러스 분리주 조사를 위해 적용된 방법은 상기 실시예에 기술되어 있다. (백신 후보물질(XIKE B)로 감염시킨 후의 일수(=DPI)로 기술된) 백혈구연층으로부터의 바이러스 분리주 데이타:

태아 기관으로부터의 바이러스 분리주

모든 염소가 XIKE B로 백신화된 BVDV 감염에 대하여 전형적인 어느 임상적 증상을 나타내지는 않았다. 접종 후 그룹 1의 염소는 적어도 1일동안 바이러스 혈증을 나타내었지만, 그룹 2의 경우 접종 후 어느 날도 바이러스 혈증에 대하여 검출되지 않았다.

그룹 1 염소로부터의 태아 모두 BVDV에 대하여 양성이고(하기 모든 기관인바이러스 분리주에 의한 BVDV에 대하여 양성으로 시험되었다)(창자간막림프절, 소장, 지라, 흉선, 신장, 흉골, 골수, 소뇌); 그룹 2 염소로부터의 태아는 BVDV에 대하여 모두 음성이었다(창자간막림프절, 소장, 지라, 흉선, 신장, 흉골, 골수, 소뇌).

따라서, 감염성 카피 유래된 바이러스는 성공적으로 약독화되었고 태아 감염을 예방하기 위한 백신 바이러스로서의 강력한 용도도 나타냈다.

XIKE B 바이러스는 항원적으로 II형 BVDV 바이러스에 속하고 I형 BVDV 항원 그룹에 속하는 이질성 접종 바이러스로 접종한 후 태아 감염을 예방하는데 유효하다.

Claims

감염되기 쉬운 숙주 세포내로 도입되었을 때

a) 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량으로 감염시켰을 때 적어도 하룻동안 바이러스혈증 및 백혈구감소증을 유도하고 적어도 하룻동안 지속되는 설사 및/또는 열을 포함하는 그룹의 임상적 증상중 적어도 하나를 유도하는 능력을 갖고;

b) DNA 분자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖고/거나;

c) BVDV를 투여받지 않은 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량의 입자로 감염시켰을 때 21일내 적어도 30%의 송아지에 치명적이고/거나;

d) 서열번호 1에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 포함하는 90% 원래대로 BVDV 입자가 병원성이고/거나;

e) 서열번호 1에 상보적인 서열을 포함하는, 감염성 BVDV 입자의 생성을 유도하는, BVDV RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
감염되기 쉬운 숙주 세포내로 도입되었을 때

f) 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량으로 감염시켰을 때 적어도 하룻동안 바이러스혈증 및 백혈구감소증을 유도하고 적어도 하룻동안 지속되는 설사 및/또는열을 포함하는 그룹의 임상적 증상중 적어도 하나를 유도하는 능력을 갖고;

g) DNA 분자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖고/거나;

h) BVDV를 투여받지 않은 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량의 입자로 감염시켰을 때 감염 후 21일내 적어도 30%의 송아지에 치명적이고/거나;

i) 서열번호 1에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 포함하는 90% 원래대로 BVDV 입자가 병원성이고/거나;

j) 서열번호 1에 상보적인 서열을 포함하는, 감염성 BVDV 입자의 생성을 유도하는, RNA로 전사되기 위한 주형으로서 작용할 수 있는 감염성 BVDV 클론.
제 1항에 있어서, 단계 a)의 열은 적어도 40℃인 DNA 분자.
제 1항 또는 제 3항의 DNA 분자, 또는 제 2항의 BVDV 클론을 사용하여 전사시키고, 적절한 세포 또는 세포주를 RNA로 형질감염시키고 세포에 의해 생산된 BVDV 입자를 회수하여 생산된 BVDV 입자.
감염성 BVDV 2형 클론.
감염되기 쉬운 숙주 세포내로 도입되었을 때

k) 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량으로 감염시켰을 때 적어도 하룻동안 바이러스혈증 및 백혈구감소증을 유도하고 적어도 하룻동안 지속되는 설사 및/또는 열을 포함하는 그룹의 임상적 증상중 적어도 하나를 유도하는 능력을 갖고;

l) DNA 분자가 유래되는 야생형 BVDV 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖고/거나;

m) BVDV를 투여받지 않은 송아지에 6 x 10⁶TCID₅₀의 투여량의 입자로 감염시켰을 때 21일내 적어도 30%의 송아지에 치명적이고/거나;

n) 서열번호 1에 상보적인 서열을 갖는 RNA를 포함하는 90% 원래대로 BVDV 입자가 병원성이고/거나;

o) 서열번호 1에 상보적인 서열을 포함하는, 감염성 BVDV 입자의 생성을 유도하는, RNA로 전사되기 위한 주형으로서 작용할 수 있는 감염성 BVDV 2형 클론.
제 5항 또는 제 6항에 있어서, 서열번호 1의 DNA 서열 또는 그의 단편, 기능적 변이체, 축퇴(degenerative) 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체를 특징으로 하는 감염성 BVDV 2형 클론.
시험관내에서 제 5항 내지 제 7항중 어느 한 항의 BVDV 클론을 RNA로 전사시키고, 적절한 세포 또는 세포주를 RNA로 형질감염시키고 세포에 의해 생산된 BVDV입자를 회수하여 생산된 BVDV 2형 클론.
전장의 BVDV 2형 RNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자.
제 9항에 있어서, 서열번호 1의 DNA 서열 또는 그의 단편, 기능적 변이체, 축퇴(degenerative) 핵산 코드에 기초한 변이체, 융합 분자 또는 화학적 유도체를 특징으로 하는 DNA 분자.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 서열번호 1을 특징으로 하는 서열로 구성된 DNA 분자.
제 1항 또는 제 3항 또는 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항의 DNA 분자, 또는 제 2항 또는 제 4항 또는 제 5항 내지 제 7항중 어느 한 항의 BVDV 클론에 상보적인 RNA 분자.
제 1항 또는 제 3항 또는 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항의 DNA 분자, 또는 제 2항 또는 제 4항 또는 제 5항 내지 제 7항중 어느 한 항의 BVDV 클론을 전사시켜 수득할 수 있는 RNA 분자.
p) 감염된 동물로부터 바이러스 입자를 분리하고,

q) 적절한 세포 배양액 세포상에 2회 이하로 계대 배양하고;

r) 바이러스 입자로부터 RNA를 제조하고;

s) RNA을 역전사한 후(여기에서, 역전사는 RNA의 2차 구조를 파괴하거나 축소시키기에 충분한 승온에서의 단계, 및 이 승온하에서도 활성인 이 단계를 위한 열안정성의 효소의 사용을 포함한다) 전장의 상보적인 DNA를 생산하고;

t) 적절한 세포의 감염시 상보적 DNA(cDNA)를 BVDV cDNA를 RNA로 전사시킬 수 있는 DNA 바이러스 또는 플라스미드 벡터로 도입시키는 단계를 포함하는, 야생형 분리주와 비교하여 입증된 병원성을 갖는 RNA에 상보적인 감염성 BVDV 클론을 야생형 BVDV 분리주로부터 생산하는 방법.
u) 감염된 동물로부터 바이러스 입자를 분리하고;

v) 바이러스 입자로부터 RNA를 제조하고;

w) RNA을 역전사한 후(여기에서, 역전사는 RNA의 2차 구조를 파괴하거나 축소시키기에 충분한 승온에서의 단계, 및 이 승온하에서도 활성인 이 단계를 위한 열안정성의 효소의 사용을 포함한다) 전장의 상보적인 DNA를 생산하고;

x) 상보적 DNA(cDNA)를 적절한 세포의 감염시 BVDV cDNA를 RNA로 전사시킬 수 있는 DNA 바이러스 또는 플라스미드 벡터로 도입시키는 단계를 포함하는, 야생형 분리주의 90% 원래대로입증된 병원성을 갖는 RNA에 상보적인 감염성 BVDV 클론을 야생형 BVDV 분리주로부터 생산하는 방법.
제 14항 또는 제 15항에 있어서, RNA의 5' 말단을 RACE를 사용하여 전사시키는 방법.
제 16항에 있어서, RACE를 적어도 42℃의 반응 온도를 허용하는 열안정성 폴리머라제를 사용하여 수행하는 방법.
제 1항 또는 제 3항 또는 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항의 DNA 분자, 또는 제 2항 또는 제 4항 또는 제 5항 내지 제 7항중 어느 한 항의 BVDV 클론내로 회수된 BVD 바이러스의 표현형을 약독화시키거나 이를 증가시키는 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는 BVDV를 약독화하는 방법.
y) 제 1항 또는 제 3항 또는 제 9항 내지 제 11항중 어느 한 항의 DNA 분자, 또는 제 2항 또는 제 4항 또는 제 5항 내지 제 7항중 어느 한 항의 BVDV 클론에 하나 이상의 돌연변이를 도입하고;

z) DNA가 RNA로 전사되는 감염되기 쉬운 숙주 세포내로 돌연변이 DNA를 도입하거나 상기 DNA로부터 전사된 RNA를 상기 세포로 도입하고;

aa) 이들 세포에 의해 생산된 바이러스 입자를 회수하는 것을 포함하여, 돌연변이 또는 돌연변이들이 약독화를 유발하는, BVDV 균주를 약독화하는 방법.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 돌연변이 또는 돌연변이들이 치환, 결실,삽입, 첨가 또는 그의 조합인 방법.
제 18항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이 또는 돌연변이들이 당단백질 E^rns에 존재하고 돌연변이 단백질(들)의 기능을 손상하거나 손실시키는 방법.
제 21항에 있어서, 돌연변이가

bb) 당단백질 E^RNS모두 또는 일부의 결실; 및/또는

cc) 서열번호 1의 300번 위치의 히스티딘의 결실 또는 치환; 및/또는

dd) 서열번호 1의 349번 위치의 히스티딘의 결실 또는 치환으로 구성된 방법.
제 18항 내지 제 22항중 어느 한 항의 방법에 의해 수득할 수 있는 약독화된 BVDV 클론 또는 BVDV 균주.
제 23항에 따른 약독화된 BVDV 클론 또는 BVDV 균주를 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 백신.
BVDV 감염의 예방 및 치료용 백신의 제조에서 제 23항에 따른 약독화된 BVDV클론 또는 BVDV 균주의 용도.