MXPA03003557A - Mejoradores para la desinfeccion microbiologica y apoptosis objetivo. - Google Patents

Abstract

ßcidos carboxilicos simples, en particular acidos dicarboxilicos tal como acido citrico, muestran una habilidad inesperada para mejorar la energia antimicrobiana de un amplio rango de agentes desinfectantes y/o antibioticos. Tan poco como 1% de citrato mejora grandemente la habilidad de los antibioticos para matar o inhibir un amplio rango de especies bacterianas incluyendo cepas resistentes al antibiotico. El citrato solo es eficaz para prevenir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaqueta y en suspensiones de globulos rojos de la sangre. Las concentraciones eficaces de citrato causan poco sino es que nada de dano a las celulas sanguineas. Ademas de mejorar la energia de los antibioticos, el citrato tambien mejora las propiedades antimicrobianas de tintes organicos desinfectantes tales como violeta cristalino y azul de metileno. Ademas, el citrato mejora las propiedades antimicrobianas de polifenoles de origen vegetal. Los desinfectantes a base de yodo tambien se mejoran sin aumentar la desnaturalizacion de la proteina. Ademas el citrato tambien mejora la habilidad de los glucocorticoides para aumentar la apoptosis de celulas linfoides.

Description

MEJORADO ES PARA LA DESINFECCIÓN ICROBIOLÓGICA Y APÓPTOSIS OBJETIVO Antecedentes de la Invención Área de la técnica La presente invención trata con la eliminación de organismos de la enfermedad y células malignas en el área médica y en agentes particulares que potencian grandemente la actividad de agentes antimicrobianos, de desinfección y antineoplásticos.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR Se ha conocido por mucho tiempo que varios agentes químicos pueden ser utilizados para matar o de otra manera limitar el crecimiento de agentes infecciosos tales como las bacterias y virus. Así mismo, químicos tóxicos son conocidos, que pueden matar células enfermas tales como las células del cáncer. Muchos de los materiales de desinfección iniciales, estuvieron activos, incluso cáusticos, químicos tales como el "ácido carbónico" (fenol) utilizado por Lister en días remotos de la teoría de germen de la enfermedad. En el último siglo agentes antiinfecciosos de origen biológico tal como la penicilina, fueron descubiertos y ampliamente explotados. Medicamentos antibióticos utilizados para tratar enfermedades infecciosas han proliferado y fueron utilizados liberalmente en países desarrollados después de la Segunda Guerra Mundial. Estos medicamentos son ampliamente utilizados no solo para tratar enfermedades sino para obtener el crecimiento mejorado de animales de i * granja viviendo frecuentemente bajo condiciones subestándar de "granja de fábrica". Como un resultado de este tipo de uso excesivo y mala utilización de pacientes, muchos nuevos organismos resistentes a los antibióticos han evolucionado. Compañías de medicamentos e investigadores están activamente buscando nuevos compuestos para eliminar a estos organismos de la enfermedad resistentes. La mayoría de su investigación es de cualquier manera dirigida para encontrar compuestos químicos simples o combinaciones de compuestos químicos que actúan en estos organismos. Similarmente, agentes antineoplásticos anteriores fueron venenos celulares generales. Más tarde, medicamentos anti-cáncer frecuentemente atacan los mecanismos de división de células ya sea por la prevención de la repetición de ácido nucleico o inhibición de la formación de huso. Se ha encontrado que algunos agentes anti-cáncer actualmente operan promoviendo la muerte celular programada (apóptosis) de células susceptibles. En términos antibióticos, terapias de combinación han estado alrededor por muchos años como se demostró en el libro "Combination Antibiotic Therapy in the Compromised Host", editado por J. Klastersky y MJ Staquet, New York, Raven Press, 1982. Otro trabajo más reciente en terapias de combinación es el trabajo hecho con fluoroquinolonas (Meyer RD, J, Antimicrob, Chemother., 1991 , 28, 623). La idea general de la terapia de combinación es desarrollar una combinación de medicamento sinergístico o de alguna manera mejorar la actividad de un antibiótico conocido o incluso algún otro desinfectante o agente anti-infeccioso. En muchos casos las terapias de combinación son buscadas como medios para vencer a los organismos de la enfermedad resistentes a los medicamentos. Por ejemplo, penicilina, el primer antibiótico utilizado ampliamente, ha perdido ahora mucha de su utilidad debido a los organismos resistentes. Una forma de resistencia a penicilina involucra la producción de enzimas que destruyen la penicilina (penicilinasa) por organismos de la enfermedad. Por consiguiente, un tipo de terapia de combinación es combinar los compuestos que inhiben la penicilinasa con la penicilina. Este planteamiento puede ampliamente restaurar la sensibilidad de los organismos resistentes a la penicilina. Los antibióticos son compuestos biológicos naturales frecuentemente de origen fúngico o bacterial. Muchos de nuestros medicamentos son de origen vegetal. Por consiguiente es difícilmente sorprendente que mucha investigación está siendo ahora dirigida en el área de la calidad antimicrobiana de hierbas, extractos de frutas y otros materiales de origen vegetal. Para la mayor parte, las compañías e investigadores están estudiando la eficacia de extractos de materiales de plantas, sola o la eficacia de moléculas especificas purificadas de los extractos de materiales de plantas. Una serie de patentes por Walker ef al. (Patentes de E.U. Números 5,474,774, 5,525,341 , 5,646, 178 y 5,650, 432) describen el aislamiento y purificación de compuestos específicos de arándano para su utilización como antimicrobianos. En particular se demostró que estos agentes interfieren con la adhesión de bacterias a las células endoteliales del tracto urinal. El presente inventor ha purificado compuestos coloreados antimicrobianos del arándano y otros materiales de plantas. Estos compuestos actualmente tienen actividades bacterioestáticas así como bactericidas y virucidas como se describe en la Patente de E.U. Número 6,093,401 . El presente inventor ha tenido desde hace tiempo interés en desinfectar la sangre y los productos de la sangre. Aparte de este interés el apenas mencionado interés en productos de plantas antimicrobianos desarrolladas. De sus muchos años de experiencia con la fracción de la sangre y la producción de los productos de la sangre el presente inventor estaba extremadamente familiarizado con el uso de varios químicos como anticoagulantes en la sangre y en los productos de la sangre. Anticoagulantes comunes son EDTA, heparina, ácido oxálico, ácido cítrico y sus sales. De estos, todos menos la heparina , funcionan primariamente reduciendo el nivel de iones de calcio. Uno de los experimentos del inventor con el objetivo de desinfectar el plasma de la sangre inadvertidamente removió el ácido cítrico (actualmente citrato de sodio) utilizado como un anticoagulante con la precipitación resultante (coagulación) del plasma. Se hicieron intentos para superar este problema a través de la adición de ácido cítrico extra. Esto resultó en el presente descubrimiento de las propiedades inesperadas del ácido cítrico, el cual forma la sustancia de la presente invención. Se deberá apreciar que existe una necesidad de presión para la desinfección de sangre y productos de la sangre utilizada para la transfusión y otras terapias médicas. En primer lugar, la sangre reunida virtualmente está siempre contaminada con bacteria comúnmente presente en la piel del donante de sangre. La aguja utilizada para la donación de la sangre recoge estos organismos y los contribuye a la sangre donada.

Estas bacterias especialmente causan problemas con los concentrados de la plaqueta cuya vida útil es actualmente limitada a cinco días debido al crecimiento de bacterias mientras que la vida biológicamente útil de los concentrados es al menos de varios días adicionales. Con la presente escasez de sangre donada esta forma obsoleta rápida de concentrados de plaqueta es especialmente dificultosa. Otra razón para la desinfección es la que le ocurre a la mayoría de la gente preocupada por la seguridad de la sangre-es decir enfermedad originada por la sangre. Cuando el donante de sangre está infectado con agentes virales u otros de enfermedad, la infección puede extenderse a través de la transfusión de la sangre o recepción de productos de la sangre hechos de la sangre infectada. Actualmente un proceso basado en detergente, originado por el presente inventor, es utilizado para inactivar muchos virus presentes en el plasma de la sangre. Esto resulta en un plasma más seguro y productos de la sangre hechos del mismo. De cualquier manera los detergentes no pueden ser utilizados en toda la sangre porque dañan o destruyen células sanguíneas. Así, existe una gran necesidad de métodos para desinfectar toda la sangre y fracciones celulares de la misma. Además, el presente proceso de detergente no inactiva todos los virus originados por la sangre. Por consiguiente, existe además una necesidad de presión para la desinfección de plasma mejorada. El presente inventor ha descubierto que el aumento de la concentración de citrato a niveles más altos que los usuales para la anticoagulación resulta en descensos significantes en bacterias y crecimiento de bacterias en la sangre y fracciones de la sangre. Además, el citrato muestra un efecto sinergístico inesperado cuando se combina con una amplia variedad de antibióticos, agentes antimicrobianos, desinfectantes, y antineoplásticos incluyendo yodo y productos de plantas naturales tales como los de la uva o arándano. El citrato ha sido utilizado en enjuagues bucales y es ampliamente utilizado como anticoagulante y agente regulador en alimentos, materiales farmacéuticos y de limpieza. De cualquier manera, los efectos sinergísticos antimicrobianos del citrato no han sido apreciados hasta ahora.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ácidos carboxílicos simples, en particular ácidos dicarboxílicos tal como ácido cítrico muestran una habilidad inesperada para mejorar la energía antimicrobiana de un amplio rango de agentes desinfectantes y/o antibióticos. Tan poco como 1 % de citrato mejora grandemente la habilidad de antibióticos para matar o inhibir un amplio rango de especies bacterianas incluyendo cepas resistentes al antibiótico. El citrato solo es eficaz para prevenir el crecimiento bacteriano en concentrados de plaqueta y en suspensiones de glóbulos rojos de la sangre. Las concentraciones eficaces de citrato causan poco sino es que nada de daño a las células sanguíneas. Además de mejorar la energía de los antibióticos, el citrato también mejora las propiedades antimicrobianas de tintes orgánicos desinfectantes tales como violeta cristalino y azul de metileno. Además, el citrato mejora las propiedades antimicrobianas de polifenoles de origen vegetal. Los desinfectantes a base de yodo también se mejoran sin aumentar la desnaturalización de la proteína. Este aumento se extiende aún a agentes antineoplásticos. La adición de citratos aumenta la actividad de medicamentos anticáncer. Esto es especialmente verdad de canceres de linfoide en donde la sensibilidad de las células anormales a los corticosteroides es marcadamente mejorada.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción es proporcionada para permitir a cualquier persona experta en el arte hacer y utilizar la invención y estableces los mejores modos contemplados por el inventor para llevar a cabo su invención. Varias modificaciones, de cualquier manera, permanecerán prontamente aparentes a aquellos expertos en el arte, ya que los principios generales de la presente invención han sido definidos aquí específicamente para proporcionar un método para mejorar grandemente los efectos antimicrobianos de los antibióticos, productos de plantas naturales, químicos desinfectantes y agentes antineoplásticos.

Efecto del Citrato en Plaquetas y células rojas Dos alícuotas de 50 mi de plasma rico en plaquetas fueron preparadas por medio de centrifugación. Se trajo una de las muestras al 2% en peso de ácido cítrico. Como se explico arriba, los concentrados de plaqueta humana están ordinariamente contaminados con bacterias de la piel humana. Estas bacterias crecen incluso si los concentrados de plaqueta se mantienen a bajas temperaturas. Tal crecimiento bacterial acorta significativamente la vida útil de estas preparaciones de plaqueta.

En este experimento ia solución fue incubada en un rotor a temperatura ambiente. Tales condiciones son ideales para la preservación de la función de plaquetas pero son también excelentes para el crecimiento bacterial. Las muestras fueron removidas cada día y contadas para determinar el estado de las plaquetas. Ya fue determinado en otros experimentos que estos niveles de citrato fueron muy efectivos para matar o inhibir bacterias. La pregunta fue sí el citrato dañaría las plaquetas.

Estos resultados indican que las plaquetas no muestran un daño obvio después de la exposición al 2% de citrato. El conteo de plaquetas parece ser aproximadamente el mismo ya sea con o sin el citrato. A través del tiempo el número de plaquetas gradualmente disminuye. De cualquier manera, la disminución es más lenta en la presencia de citrato sugiriendo que este agente puede de hecho estabilizar o conservar las plaquetas. Otros estudios han mostrado que las plaquetas mantienen una función adecuada por al menos siete días, pero las soluciones no son utilizadas más allá de cinco días por el excesivo crecimiento bacterial.

Similarmente, el 2% de citrato no parece dañar los glóbulos rojos de la sangre (RBCs). Normalmente, las células rojas son muy sensibles cuando a agentes agregados. El daño a la membrana de la célula roja puede ser observado como hemolisis (fuga de hemoglobina de las células) o como un incremento de potasio (K+) o dehidrogenasa de lactato (LHD) ambos de los cuales carecen de células rojas dañadas. En este experimento, la muestra de sangre ya sea con o sin citrato (2%) fue probada en un periodo de siete días. Control 2% de Citrato Estos resultados indican que el incremento de citrato puede tener un efecto muy insignificante en las células rojas (incremento porque el 0.5% de citrato es comúnmente utilizado como anticoagulante). De cualquier manera, esto es mucho menos dañino que muchos otros agentes que han sido utilizados en un intento para desinfectar las células rojas. Por consiguiente, el citrato puede ser combinado con otros agentes para desinfectar las células rojas incrementando el daño a las células rojas. Un punto importante es que el citrato agregado puede ser prontamente reducido o removido con materiales de intercambio de anión. Citrato v Antibióticos Los efectos del 5% y el 8% (peso por volumen) del ácido cítrico en caldo bacteriológico fue investigado. En cada caso el pH del caldo fue ajustado con NaOH para ponerlo en rangos de crecimiento normales si es necesario. La cantidad de crecimiento es valorado de mínimo (+) a máximo (4+). Si no ocurre el crecimiento, el tratamiento es marcado "NG". Cada muestra de caldo fue inoculada con 1X103 organismos de Enterococcus resistente a vancomicina. El caldo inoculado fue incubado por 2 horas a 35°C por 2 horas y entonces se colocó en placas en el medio de crecimiento, que le fue permitido incubar toda la noche bajo condiciones de crecimiento óptimas. Medio Nivel de crecimiento Caldo solo 4+ Caldo + 5% de citrato 4+ Caldo + 8% de citrato 3+ Caldo + 250 pg/ml de vancomicina 3+ Caldo + 5% de citrato + 250 pg/ml 1 + de vancomicina Caldo +8% de citrato + 250 pg/ml NG de vancomicina Estos resultados muestran que ya sea el 8% de citrato o 250 pg/ml de vancomicina solo causa alguna inhibición del crecimiento bacterial. Este nivel de vancomicina fue seleccionado porque sería suficiente para completamente inhibir la bacteria no resistente. La combinación de citrato con la vancomicina completamente inhibe la bacteria resistente. Esto muestra que el efecto sinergístico de la vancomicina con el citrato es suficiente para superar la resistencia bacterial. El citrato es también eficaz con otras combinaciones de bacterias/antibióticos. En el siguiente experimento una suspensión de 1 X1 03 célula/ml de Klebsiella pneumoniae fue preparada en caldo de soya de tripcasa. Alícuotas de diez mi se trataron con el citrato y/o antibióticos. Después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente, 0.1 mi de muestras de cada tratamiento se extendieron en agar de caldo de tripcasa de soya e incuban toda la noche a 35°C. Las placas fueron marcadas por el crecimiento bacterial con los siguientes resultados: Estos resultados muestran que el efecto del antibiótico citrato se extiende a más de una sola combinación de especies de antibióticos- bacterias. Experimentos adicionales (información no mostrada) han demostrado que el citrato mejora la actividad de un amplio rango de antibióticos contra un gran número de especies bacterianas y tipos silvestres de caldo de cepas y tipos resistente a antibióticos. Mejora de Citrato de Pigmentos Antimicrobianos Se ha sabido desde hace tiempo que una variedad de tintes orgánicos muestran propiedades antimicrobianas. Se extendió mucho estudio en estos compuestos antes del descubrimiento de antibióticos modernos. Algunos de los tintes "desinfectantes" tales como el violeta cristalino (gentian) siguen manteniendo algún uso. He descubierto en otro trabajo que una combinación de dos de los tintes desinfectantes-es decir violeta cristalino más azul de metileno, son especialmente efectivos en la prevención del crecimiento de un amplio rango de bacterias. He además descubierto previamente que los pigmentos de polifenol los cuales se precipitan durante el envejecimiento de las uvas de vino (llamadas sedimentos) además exhiben propiedades antibacteriales. El siguiente experimento fue llevado a cabo para ver si las propiedades sinergísticas del citrato se extienden a tales pigmentos antimicrobianos. Existe alguna indicación en ia literatura que el ácido ascórbico puede también mostrar algunas propiedades sinergísticas con tales antimicrobianos. Por consiguiente, el ascorbato de sodio fue también probado. Una solución acuosa de iguales pesos de azul de metileno y violeta cristalino (0.0057% de cada uno) se preparó. Además una solución acuosa de sedimentos de vino rojo (0.25%) fue también preparada. Las soluciones del tratamiento se prepararon agregando ya sea citrato de sodio o ascorbato de sodio a 1.5% en peso de una solución de inventario.

Las alquilotas de control no contienen ni citrato ni ascorbato. Para propósitos de prueba cada muestra fue inoculada con 1X104 de células de ya sea Escheríchia eoli o Staphylococcus epidermidis. La muestra fue entonces incubada a temperatura ambiente por 60 minutos con agitación. Al final del periodo de agitación las muestras fueron colocadas en placas medio de crecimiento TSA e incubadas toda la noche a 35°C. Las placas fueron entonces marcadas por número de colonias con NG indicando "no crecimiento" y 4+ indicando máximo crecimiento.

Estos resultados indican que ambos la mezcla del tinte sedimentos muestran propiedades antibacteriales significantes. Cuando ya sea el tinte o sedimentos son combinados con 1 .5% de citrato de sodio todas las células bacteriales son matadas o prevenidas de un crecimiento adicional. El ascorbato muestra alguna habilidad para potenciar el efecto de la mezcla de tinte pero no tiene efecto aparente en los sedimentos. Citrato Comparado con EDTA EDTA (ácido etilenodiaminetetraacético ) es un anticoagulante quelante de calcio que es conocido por tener alguna actividad antimicrobiana. El diacetato de sodio es otro material quelante con propiedades antimicrobianas y de anticoagulación conocidas. Los agentes quelantes se compararon incubando la suspensión de 1 X103 células/ml de Escherichia coli o Staphylococcus epidermis en plasma humano por 60 min a temperatura ambiente por 60 min antes de incubar 100 µ? de suspensión (potencialmente 100 células) bajo condiciones óptimas por 12 hrs. El plasma humano representa un medio de crecimiento rico y se espera un crecimiento bacterial importante. Todos los compuestos agregados se expresan como porcentaje en peso.

Estos resultados que EDTA, el oxalato de sodio y heparina de sodio incluso en la concentración considerablemente más alta que la utilizada en la anticoagulación muestra propiedades antibacteriales limitadas. Al alto nivel de 8% de diacetato de sodio completamente previene el crecimiento de E. coli. A 8% de tanto citrato de sodio como ácido cítrico completamente previene el crecimiento bacterial. A 2% de citrato de sodio causa una inhibición considerable de E. coli. Se debe mantener en mente que este porcentaje sigue siendo cuatro veces la cantidad normal utilizada por la anticoagulación. Ya que la habilidad anticoagulante de ambos, EDTA, oxalato y citrato se relacionan con la habilidad de estos compuestos para quelar iones de calcio, parece aparente que el efecto antibacterial del citrato no es debido a su efecto en iones de calcio o por lo menos no solamente a su efecto sobre el ion de calcio. Como el citrato el diacetato tiene múltiples grupos de ácido carboxílico por molécula. Efecto del Citrato en Yodo Povidona Una alícuota de 50 mi de 2% (en peso) de citrato de tri-sodio en caldo de crecimiento bacterial se preparó y clavó con Escherichia coli (1 X103 células / mi). El caldo clavado se dividió en seis alícuotas de 8 mi. Una alícuota de 25 mi da caldo clavado sin citrato se utilizó como un control. El control de la alícuota se dividió en tres muestras de 8 mi. Las muestras se tomaron en 30 minutos, 6 horas y 24 horas mientras las alícuotas se incubaron a temperatura ambiente. Para las muestras de yodo 400µ? de 1 0% de povidona-yodo [PVP-l]se agregaron a la muestra 5 minutos antes del muestreo. Las muestras se colocaron en placas en agar de soya de tripsicasa (TSA) y se permitió el crecimiento toda la noche bajo condiciones óptimas antes del conteo. Para revisar, a la muestra de 30 minutos se le permitió crecer por 30 minutos. Entonces se agrego PVP-I a la muestra apropiada y se removió material para la colocación en placas después de 5 minutos. Las muestras de 6 horas crecieron por 6 horas antes de la adición de PVP-I seguido por la colocación en placas; las muestras de 24 horas crecieron por 24 horas antes de la adición de PVP-I.

Medio 30 min. 6 hrs. 24 hrs. Caldo + 2% de 3+ 4+ 4+ citrato Caldo + PVP-I 3+ 3 + 4+ Caldo + 2% de 1 + NG NG citrato +PVP-I Estos resultados sugieren que el citrato aumenta el poder de matar del PVP-I y/o células crecidas en la presencia del citrato fueron debilitadas y hechas más susceptibles al yodo. Efecto del Citrato en la Inactivación Viral a Base de Yodo Los siguientes experimentos representan un refinamiento de experimentos de yodo inicial que resultaron en el descubrimiento del efecto del citrato. El proceso de la inactivación del yodo es el resultado de muchos años de investigaciones. La idea general es exponer una muestra de una solución viralmente contaminada (aquí plasma humano) a una fuente de yodo activo y después remover el yodo antes de que el daño se haga a proteínas delicadas. En el caso del plasma es posible monitorear enzimas sensibles coagulantes de la sangre para verificar la desnaturalización de proteínas. El proceso que ha sido desarrollado involucra la utilización dé una resina que contiene yodo para donar yodo a la solución y una resina de unión de yodo/yoduro para remover el yodo y cualquier yoduro resultante. Un desarrollo sorprendente de esta línea de investigación fue que el pasaje repetido a través de una columna mezclada de resina que dona el yodo y que absorbe el yodo/yoduro fue especialmente efectivo en la inactivación del virus mientras se retenía la actividad de las enzimas coagulantes de la sangre. Ese trabajo es ahora la Patente de E. U. No. 6,045,787 la cual es incorporada aquí para referencia. En el presente experimento una muestra de 1500 mi de plasma humano se clava con aproximadamente 1 X106 partículas de Parvo Virus Porcino (PPV) y 5X105 partículas de Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV). El plasma se llevo entonces a 8% de sodio de citrato. El plasma fue entonces ciclado 4 veces a través de una larga columna de yodo y resina mezclada de captura de yodo (1 :8). Después de cada paso residual, yodo (l2) y yoduro ( ) se midieron utilizando un electrodo sensible al yoduro (Orion Research Instruments). El electrodo leyó la concentración del yoduro directamente. El ascorbato de sodio se agregó a cada muestra para determinar la concentración del yodo. Cualquier incremento en la lectura del yodo represento !a reducción de yodo a yoduro por ascorbato. No se esperó tanto si cualquier yodo o yoduro sería representado debido al gran exceso de la resina de unión de yodo/yoduro en la columna. Yodo y Yoduro por Paso La concentración de los diversos virus se determinó utilizando un Ensayo Final Viral (VEPA). Brevemente, las muestras a ser probadas se colocaron en una monocapa de células apropiadas (es decir, células huésped para el virus particular). Después del periodo de incubación, la presencia de los virus se determino por la formación de la placa. Cada muestra se probó sobre un rango de diluciones de dos-pliegues seriales, de manera que la mayor dilución que sigue mostrando la formación de la placa podría ser determinada. La concentración viral se calculó a partir de este ensayo de dilución utilizando una formula bien conocida. Como ha sido determinado a partir de la investigación pasada, el tratamiento de columna resultada en algún tipo de daño latente al virus. Se encontró que mantener la muestra por hasta 24 horas antes de la colocación en placas en un cultivo de células resultaría en el aumento de la inactivación viral. Inactivación PPV Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Concentración control 4 4 4 4 4 4 4 4 2 0 0 0 6.3 0 hrs P1 4 4 4 4 4 4 4 1 0 0 0 0 5.4 P2 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 3.8 P3 4 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2.8 P4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.4 6 hrs P1 4 4 4 4 3 0 0 0 0 0 0 0 3.7 P2 4 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2.8 P3 4 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.6 P4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.7 24hrs P1 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.2 P2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Inactivación BVDV Estos resultados muestran que el BVDV es un de alguna manera más sensible que el PPV, y que ambos virus muestran un aumento en matar si las muestras son incubadas por hasta 24 horas antes de ser colocadas en placas en el cultivo celular. En experimentos recientes sin el nitrato fue necesario para hacer por lo menos seis pasos e incubar por 24 horas obtener una completa eliminación de estos virus muy resistentes. También, aunque la resina utilizada para la captura de yodo/yoduro tiene además alguna afinidad para el citrato, el citrato parece no interferir con la captura de yodo/yoduro. Parece probable que todos los sitios de citratos se vuelven saturados durante el primer paso. Después de esto, el yoduro meramente intercambia el citrato durante el proceso de captura. El experimento de arriba se repitió con una muestra de plasma de 2000 mi con la adición de una muestra de citrato de sodio ai 2% a la muestra de citrato de sodio al 8%. Además las muestras se incubaron hasta por 48 horas antes de colocarse en placas en el ensayo de célula VEPA. Los resultados con la medición de yoduro/yodo son esencialmente como antes. Yoduro y Yodo por Paso Tratamiento Yoduro (ppm) Yodo (ppm) Control (2% Citrato) (sin columna de 0 0 tratamiento) Paso 1 (2% Citrato) 0 0 Paso 2 (2% Citrato) 0 0 Paso 3 (2% Citrato) 0 0 Paso 4 (2% Citrato) 1 0 Paso 1 (4% Citrato) 0 0 Paso 2 (4% Citrato) 0 1 Paso 3 (4% Citrato) 0 0 Paso 4 (4% Citrato) 0 0 Inactivación PPV (8% de Citrato) Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 Concentración Control 4 4 4 4 4 4 4 4 3 0 0 0 6.5 0 hrs P1 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 5.2 P2 4 4 4 4 4 3 0 0 0 0 0 0 4.4 P3 4 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2.8 P4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .7 6 hrs P 1 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 3.8 P2 4 4 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2.4 P3 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .4 P4 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.9 24 hrs P 1 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .4 P2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48 hrs P 1 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 .7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Inactivación BVDV (8% de citrato) Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 Concentración Control 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 5.2 0 hrs P1 4 4 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 3.5 P2 4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .7 P3 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .4 P4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.4 6 hrs P 1 4 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .8 P2 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .1 P3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P4 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 hrs P1 4 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .1 P2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48 hrs P1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 P4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Inactivación BVDV 2% citrato Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Concentración Control 4 4 4 4 4 4 4 4 1 0 0 0 6.0 0 hrs P1 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 5.9 P2 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 5.9 P3 4 4 4 4 4 4 4 4 2 0 0 0 6.3 P4 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 5.9 6 hrs P1 4 4 4 4 4 4 4 4 1 0 0 0 6.0 P2 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 5.9 P3 4 4 4 4 4 4 4 2 0 0 0 0 5.6 P4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 5.2 24hrs P1 4 4 4 4 4 4 4 4 3 0 0 0 5.8 P2 4 4 4 4 4 4 1 0 0 0 0 0 4.7 P3 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 0 3.8 P4 4 4 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 3.5 48 hrs P1 4 4 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 5.9 4 4 4 4 4 4 0 0 0 0 0 0 4.5 4 4 4 4 2 0 0 0 0 0 0 0 3.5 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 .4 Inactivación BVDV (2% de citrato) Estos resultados muestran que el 8% de citrato es dramáticamente más efectivo que el 2% de citrato. Los resultados del citrato son relativamente paradójicos en que una mezcla de citrato y yodo de povidona resultará en la formación de yoduro probablemente de la oxidación del citrato por el yodo. Eso llevaría esperar que agregando el citrato resultaría en bloquear la desinfección del yodo así como el citrato se vuelve oxidado en lugar de las proteínas virales o ácidos nucleicos. Una posibilidad es que el citrato oxidado proporcione algún tipo de compuesto intermedio activado que preferentemente reaccione con los componentes virales. Si este es el caso, el intermediario deberá reaccionar solo con ácidos nucleicos ya que los ensayos de la enzima coagulante (no mostrados) demuestran que la concentración de citrato incrementada no resulta en la desnaturalización de proteínas incrementada. Los resultados preliminares indican que puede haber beneficio a la preincubación con el citrato antes de la adición de yodo u otro agente desinfectante. Efecto del Citrato en Células Anormales (Cáncer) Sorprendentemente, el efecto de mejorar de citrato se extiende incluso a los compuestos de "desinfección"que tienen la intención de matar o inhibir células anormales tales como las células del cáncer. Ha sido desde hace tiempo hipotetizado que la células neoplásticas tienen diferencias metabólicas de células normales. Estas diferencias son explotadas por medicamentos antineoplásticos (anti-cáncer). Muchos medicamentos anti cáncer toman ventaja del índice más alto mitótico de células malignas bloqueando la replica de ácido nucleico o interfiriendo con un paso esencial en la mitosis tal como la formación de huso. Recientemente, se ha comprendido que algunas células malignas están "adheridas" en un estado juvenil. La aplicación de algún agente activador que "forza" a las células a madurar puede conducir a la muerte celular programadas (apóptosis).

Las hormonas de glucocorticoide (GC) son ampliamente conocidas por tener un efecto "linfolítico". Como tales son frecuentemente utilizadas para controlar la inflamación y otras respuestas inmunes inapropiadas (por ejemplo, autoinmunidad) reduciendo significativamente el número de Iinfocitos activos. Aparentemente el GC causa que las células linfocíticas padezcan muerte celular rápida. Desafortunadamente, la administración crónica de GC puede ser tóxica. Existe un gran beneficio para lograr la apóptosis del linfocito a una concentración más baja del GC administrado. Un experimento se emprendió utilizando una unidad de sangre completamente fresca. La sangre se dividió en alícuotas de 1 0 mi a algunas de las cuales se agregó citrato de tri-sodio (1 % en peso) y dexametasona (ya sea 250 o 500^g/ml). Las muestras se incubaron por 96 horas con submuestras siendo tomadas en 2 horas, 24 horas, 48 horas y 96 horas después de la adición de GC. Las submuestras se sometieron a un conteo de sangre completo (CBC) y conteos diferenciales de células blancas. En puntos recientes el conteo blanco tota! (WBC) pareció variar un poco de submuestra a submuestra. De cualquier manera, el diferencial de célula blanca reveló un incremento aparente en Iinfocitos en comparación con neutrofilos en 2 horas. Por 48 horas hubo un incremento dramático en neutrofilos (actualmente un incremento en la proporción de neutrofilo a linfocito). Este cambio fue incluso más pronunciado por 96 horas cuando muy pocos Iinfocitos podrían incluso ser encontradas en la mancha de la sangre. El incremento aparente en Iinfocitos en puntos recientes fue probablemente debido a la facilidad con la que dichos linfocitos degenerativos (aquellos que sufren apóptosis) puede ser confundidos con granulocitos polimorfonucleares (neutrofilos). El control de submuestras mostró un WBC de 4,500 células/µ?. La proporción aproximada de neutrofilos a linfocitos fue de 60/30. En los niveles más altos de dexametasona hubo una caída de 25% en WBC a 48 hrs. Al mismo tiempo la proporción de neutrofilo/linfocito cambió a 80/20. Con la adición de ya sea 0.6 o 1 % de citrato el conteo WBC disminuyo 30% con la concentración más baja de dexametasona. La proporción cambió a 87/8. Con la concentración más alta de dexametasona, el WBC también disminuyó a cerca de 0% pero la proporción fue de 90/5. Ya que la meta es disminuir los linfocitos tanto como sea posible con lo menos de GC posible, es aparente que concentraciones moderadas de citrato puedan resultar en conteos de linfocitos más bajos en concentraciones más bajas de GC. El efecto del citrato en las células linfoide es incluso más pronunciado cuando se utiliza como una estirpe de linfoide neoplástico como el objetivo. Nuevamente las concentraciones de citrato de tri-sodio utilizaron una concentración de entre 0.6 y 1 % (peso por volumen). En experimentos, las muestras de varias estirpes se pre-expusieron al citrato por dos horas antes de ser cultivadas en la presencia o ausencia de GC (dexametasona). Las varias soluciones de citrato se ajustaron al pH así todas ellas mostraron un pH neutral. Las células cultivadas se examinaron por citometría de flujo utilizando Annexin-V marcada de manera fluorescente para visualizar la superficie interior de la membrana del plasma de células apoptóticas degeneradas y yoduro de propidio (Pl) para visualizar el ácido nucleico. La viabilidad de la célula además se determino con un hemocitometro siguiendo las manchas con tripan azul. Además los sobrenadantes se analizaron para dehidrogenasa de lactato (LDH) que se libera por las células que están muriendo. La morfología de la célula también se evaluó en las manchas tradicionales tratadas con colorante de Wright. Las siguientes estirpes humanas se sometieron a el protocolo experimental: CE , H9 y Jurkat (Células T), Raji y WIL2-NS (Células B), K562 (células linfoblásticas), U937 (células histiociticas) y HL-60 (células promielocíticas). Todas las estirpes probaron ser muy sensibles a dexametasona con 8 pg/ml siendo suficiente para matar virtualmente todas las células. De cualquier manera, la concentración más baja de dexametasona, tal como 4 pg tuvo poco efecto en las células. La apóptosis se confirmó por citometría de flujo, pero la morfología del colorante de Wright y coloración con tripan azul también detectó la degeneración de la células y la muerte. Las medidas de LDH se correlacionaron con la muerte celular. Una dosis efectiva de dexametasona liberó 500-600 unidades internacionales/ml de LDH. Significativamente el pretratamiento con 0.6 a 1 % de citrato (las soluciones se ajustaron para evitar cambios de pH) rendiría un 80% o más muerte con solo 4 ig/ \ de dexametasona (una concentración inefectiva sin citrato). Mientras que 8pg/ml de dexametasona liberaron algunas 600 unidades internacionales/ml de LDH, 4 pg/ml de dexametasona liberaron arriba de 800 unidades internacionales/ml de LDH cuando se utilizo para tratar la células preexpuestas a 0.6% de tri-sodio de citrato.

Efectos de Dexametasona y citrato en células Jurkat (24 horas de exposición al citrato y retiro de citrato antes de la adición de dexametasona) Efectos de Dexametasona y citrato en células Jurkat (24 horas de exposición antes de la adición de dexametasona) El citrato parece tener sensibilidad o efecto primario en las células neoplásticas. El citrato no tiene que estar presente durante el tratamiento actual de GC. Las pruebas además demuestran que mientras la viabilidad de células normales no se afectada por exposición aún relativamente alta transitoria para el citrato, las células neoplásticas muestran disminuciones en la proliferación y viabilidad siguiendo la exposición del citrato. Esto eleva la posibilidad de utilizar el citrato para aumentar el GC y otros agentes neoplásticos utilizados en el tratamiento de neoplasmas linfocíticos. Parece probable que el citrato puede ser utilizado para incrementar la sensibilidad de células neoplásticas a medicamentos sin un impacto significativo en células normales. Es tentador imaginar que existe una ruta unificada que explica todos los efectos del citrato. De cualquier manera es muy difícil ver que esto puede ser. El ácido cítrico es una parte importante de la ruta del ácido tricarboxílico del metabolismo oxidado. Es conocido que el citrato es generalmente metabolizado rápidamente. Tal vez con las bacterias el exceso de citrato resulta en algún tipo de desequilibrio metabolico que hace a las bacterias especialmente susceptibles a los antibióticos y tintes desinfectantes. También, la mayoría de las bacterias tienen sistemas de transporte de membrana activa para llevar los metabolismos tal como el citrato. Tal vez el mismo proceso de transporte que lleva el citrato resulta en una acumulación de antibióticos, tintes o productos vegetales (como los polifenoles del vino) en la célula. Esto pude explicar el efecto del citrato en los microorganismos resistentes a los antibióticos. Cualquiera que sea el mecanismo el efecto de ácido carboxílico debería ser un don para el tratamiento de infecciones resistentes al medicamento y extender la vida de las fracciones de la sangre tales como las plaquetas. El mejoramiento del citrato de antibióticos puede funcionar intravenosamente aunque los efectos quelantes así como el rápido metabolismo del citrato pueden evitar este uso. De cualquier manera el citrato es ideal para utilizarlo en procedimientos de diálisis para prevenir la infección accidental. El mejoramiento del citrato es también ideal para el uso en ungüentos y otras aplicaciones comunes de agentes antiinfecciosos. El mejoramiento del citrato de antibióticos deberá probar ser especialmente efectivo como lavados antibacteriales para pacientes quemados. Con biológicos tales como la sangre y los productos de la sangre el exceso de citrato puede ser prontamente removido por intercambio de iones o calcio suplemental que puede ser agregado para superar la quelación. En combinación con yodo mezclado/columnas de captura resina, el citrato proporcionan una mejora dramática en la destrucción de virus contaminantes mientras se tiene un efecto insignificante en las proteínas débiles. Parece probable que el mejoramiento de poderes eliminadores se atribuye a la adición del citrato que permitirá la inactivación de priones y otros aún misteriosos patógenos. La presente invención se describe en términos de "citrato" o ácidos dicarboxílicos. El mecanismo exacto de la presente invención no se ha entendido aún. El efecto no parece extenderse a todos los ácidos dicarboxílicos ya que el ácido tartárico parece ser relativamente inefectivo. Otros ácidos carboxílicos análogos tales como el ácido ¡socítrico están siendo investigados. Las siguientes reivindicaciones son así para ser entendidas para incluir lo que es específicamente ilustrado y descrito arriba, lo que es conceptualmente equivalente, lo que puede ser obviamente sustituido y también lo que esencialmente incorpora la idea esencial de la invención. Aquellos expertos en la materia, agradecerán que diversas adaptaciones y modificaciones de la modalidad preferida apenas descrita pueden configurarse sin apartarse del alcance de la invención. La modalidad ilustrada ha sido establecida solo para propósitos de ejemplo y no deberá ser tomada como limitante de la invención. Por consiguiente, es para ser entendido que dentro del alcance de las reivindicaciones añadidas, la invención puede ser practicada diferente a como específicamente se describe aquí.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para mejorar la efectividad de agentes antimicrobianos comprendiendo el paso de combinar el agente antimicrobiano, una cantidad de ácido cítrico y o sales o ácido cítrico dando una concentración de citrato equivalente a 1 % a 1 5% de citrato de tri-sodio en peso. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque el agente antimicrobiano es seleccionado del grupo que consiste de antibióticos, yodo de povidona, yodo, polifenoles de origen vegetal y tintes orgánicos desinfectantes. 3. El método según la reivindicación 2, caracterizado porque los tintes orgánicos desinfectantes son seleccionados del grupo consistente de azul de metileno y violeta cristalino. 4. Un método para extender la vida de un concentrado de plaqueta y prevenir la multiplicación de bacterias en el mismo comprendiendo el paso de agregar citrato a los concentrados de plaqueta equivalente a una concentración de entre 1 y 15% en peso de citrato de tri-sodio. 5. El método según la reivindicación 4, comprendiendo además el paso de remover el citrato. 6. El método según la reivindicación 4, comprendiendo además el paso de agregar un agente antimicrobiano al concentrado de plaqueta. 7. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque el agente antimicrobiano es seleccionado del grupo que consiste de antibióticos, yodo de povidona, yodo, polifenoles de origen vegetal y tintes orgánicos desinfectantes. 8. El método según la reivindicación 7, caracterizado porque los tintes orgánicos desinfectantes son seleccionados del grupo que consiste de azul de metileno y violeta cristalino. 9. Un método para desinfectar soluciones conteniendo glóbulos rojos de la sangre comprendiendo el paso de agregar citrato a una concentración equivalente a entre 1 y 15% en peso de citrato de tr¡ sodio a la solución. 10. El método según la reivindicación 9, comprendiendo además el paso de remover el citrato. 1 1 . El método según la reivindicación 9, comprendiendo además el paso de agregar un agente antimicrobiano a la solución. 12. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque el agente antimicrobiano es seleccionado del grupo que consiste de antibióticos, yodo de povidona, yodo, polifenoles de origen vegetal y tintes orgánicos desinfectantes. 13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque los tintes orgánicos desinfectantes son seleccionados del grupo que consiste de azul de metileno y violeta cristalino. 14. Una preparación tópica comprendiendo un agente antimicrobiano y una concentración de citrato suficiente para mejorar una acción antimicrobiano del agente antimicrobiano. 15. La preparación según la reivindicación 14, caracterizada porque el agente antimicrobiano es seleccionado del grupo que consiste de antibióticos, yodo de povidona, yodo, polifenoles de origen vegetal y tintes orgánicos desinfectantes. 16. La preparación según la reivindicación 15, caracterizada porque los tintes orgánicos desinfectantes son seleccionados del grupo que consiste de azul de metileno y violeta cristalino. 17. Un método para incrementar la apóptosis de células linfocíticas comprendiendo el paso de exponer las células a una concentración de citrato equivalente a por lo menos 0.6% en peso de citrato de tri sodio. 18. El método según la reivindicación 18 comprendiendo además el paso de exponer la célula a una hormona glucocorticoide.